Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

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Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

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Abstract

Die Säuger Herz ist ein großer Verbraucher von ATP und erfordert eine ständige Energiezufuhr für Substrate Kontraktion. Es überrascht nicht, Veränderungen der myokardialen Stoffwechsel wurden zur Entwicklung der Kontraktions Dysfunktion und Herzinsuffizienz verknüpft. Daher sollte auf einige der Mechanismen beleuchten den Zusammenhang zwischen Stoffwechsel und Kontraktion entwirren Herz Anpassung oder Fehlanpassung bei Krankheitszuständen regeln. Die isolierte Rattenherz arbeitet Zubereitung kann folgen verwendet werden, gleichzeitig und in Echtzeit, Herzkontraktionsfunktion und Energiefluß Substrate in oxidativen Stoffwechselwege bereitstellt. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Puffern für die quantitative Messung der Geschwindigkeiten der Oxidations für Glukose und Fettsäuren zur Verfügung zu stellen, der Hauptenergiesubstrate des Herzens bereitstellt. Die Verfahren zur Probenanalyse und Dateninterpretation verwendet werden ebenfalls diskutiert.Kurz gesagt, ist die Technik , die auf die Lieferung von 14 C- radiomarkierten Glucose und einem 3 H radioaktiv markierten Fettsäure langkettige zu einem ex vivo schlagendes Herz über normothermic kristalloider Perfusion. 14 CO 2 und 3 H 2 O, Ende Nebenprodukte die enzymatischen Reaktionen in der Nutzung dieser Energie liefert Substrate beteiligt sind, werden dann quantitativ aus dem koronaren Ausflusses gewonnen. Bei Kenntnis der spezifischen Aktivität der radiomarkierten Substraten verwendet wird, ist es dann möglich, individuell auf den Fluss von Glukose und Fettsäure in der Oxidationswege quantifizieren. Kontraktionsfunktion des isolierten Herz kann mit dem entsprechenden Aufnahmegeräte und direkt korreliert metabolischen Flusswerte parallel bestimmt werden. Die Technik ist sehr nützlich, um den Stoffwechsel / Kontraktionsverhältnis in Antwort auf verschiedene Stressbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in pre und nach der Belastung und Ischämie zu untersuchen, ein Medikament oder ein circulating Faktor oder Produkt nach der Veränderung der Expression eines Gens.

Introduction

Klinische Relevanz

Im Säugerherz, gibt es eine starke positive Beziehung zwischen dem Fluß von Substraten durch oxidativen Stoffwechselwege, ATP Erzeugungs- und Herzarbeit 1. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich die Untersuchung der komplizierten Verbindung zwischen Herz-Stoffwechsel und Funktion führte zu erkennen , dass Veränderungen in der Herzstoffwechsel eine Ursache für die Kontraktions Dysfunktion sind und möglicherweise pathologischen strukturellen Umbau bei der Festlegung der verschiedenen Arten von Herzerkrankungen 2-4. daher wird erwartet , dass unser Verständnis der Mechanismen metabolischen Umbau des belasteten Herzleitungs wird zur Vorbeugung oder Behandlung von Herzinsuffizienz 5-7 zur Identifizierung therapeutischer Targets führen. Die jüngste Veröffentlichung einer wissenschaftlichen Erklärung der American Heart Association zum Thema "Beurteilung der Herz Metabolism", betont das wachsende Interesse der wissenschaftlichen Gemeinschaft für tsein Forschungsgebiet 8. Doch während die technologischen Fortschritte in der Herzbildgebung jetzt für eine schnelle und genaue Bewertung der kardialen Morphologie und Funktion zu ermöglichen, die in - vivo - Studie von Herz-Stoffwechsel bleibt begrenzt und beschwerlich: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spektroskopie und Positronen - Emissions - Tomographie (PET) Bildgebung kann werden verwendet , um Herzenergiereichen Phosphatstoffwechsel und Krebs - Zyklus - Aktivität, aber diese Techniken sind geplagt durch hohe Betriebskosten und durch ihre Unfähigkeit zur Bestimmung des Beitrags der verschiedenen Substrate zu oxidativen Stoffwechsel in stationären Bedingungen 9 .To diesem Zeitpunkt der ex vivo verfolgen Herz Vorbereitung Arbeits stellt die einzige und einzigartige Technik zur Verfügung, gleichzeitig zu studieren und in Echtzeit, Kontraktionsfunktion und Fluss von Substraten in oxidativen Stoffwechselwege 7,9. Das folgende Protokoll zielt darauf ab, Richtlinien für die Herstellung und Verwendung von Reagenzien zu schaffen, verwendet die Ratte zu bestimmen,es von Substraten Nutzung in der isolierten Arbeitsrattenherz.

Die isolierte Arbeits Nagetier-Herz-Apparat

Obwohl die Technik Hälfte ist fast ein Jahrhundert alt, bleibt die isolierte Arbeitsrattenherz Vorbereitung eine Methode der Wahl für Herz-Kreislauf-Forschung. Wie bei der Langendorff-Herz der Zubereitung bietet das Arbeits rodent Herz eine relativ einfache, zuverlässige und kostengünstige Möglichkeit, eine Vielzahl von Herzparameter unabhängig von den verwirrenden Effekte anderer Organe, neurohormonal und andere zirkulierende Faktoren zu messen. Aber im Gegensatz zu dem Langendorff perfundierten Herzen, das Arbeits Herz weiterhin nahezu physiologischen Herzarbeit, eine Voraussetzung für die Bildung von oxidativen metabolischen Flusses auf ein Niveau durchzuführen , die zu in vivo - Bedingungen relevant sind. Dies wird durch die Bereitstellung der Perfusionspuffer mit dem linken Ventrikel (LV) über eine Kanüle mit dem linken Vorhof erreicht, und da der LV füllt und Verträge, diePuffer wird durch die Aorten-Leitung gegen einen entschlossenen Nachbelastung hydrostatischem Druck ausgestoßen. Das Design der Perfusionsapparatur beschrieben ursprünglich von Neely und Kollegen 10 wurde anschließend durch Taegtmeyer verbessert, Säume und Krebs 11, hat aber nur sehr wenig verändert seitdem. Wie in der ursprünglichen Gerät beschrieben, kann Kontraktionsfunktion durch Bestimmung der Herzleistung beurteilt werden, nicht mehr als Messzylinder mit und eine Stoppuhr Aorten zu messen und koronare fließt 10,11. Mehrere Hersteller bieten nun komplette Arbeits Nagetier Herz Perfusionssystemen. Diese kommerziell erhältlichen Vorrichtung kann mit flowprobes, Druckwandler erfaßt werden, ein Druck-Volumen-Katheter und die gesamte Ausrüstung, die für Herzfunktionsdatenerfassung und -analyse. Die Hersteller bieten eine umfangreiche Dokumentation und Schulungen den neuen Benutzer mit ihrer Ausrüstung vertraut zu machen. Einige Übersichten auch Detail-Protokolle auf dem Arbeits Herz instrumentation und über die Verwendung von Kathetern , Herzfunktion in Nagetieren 12-15 zu messen. Aus diesem Grund werden wir nur kurz auf die Set-up des Perfusionsgerät erwähnen und dem Aufnahmegerät. Das vorliegende Protokoll vielmehr soll die bereits vorhandenen Informationen mit einer Beschreibung der Methoden zu ergänzen, die gleichzeitig durchgeführt werden können, um die Raten der Glukose und langkettigen Fettsäureoxidation, die beiden großen Energie liefert Substrate in der normalen Herz messen. Wir beschreiben hier all die Schritte bei der Verwendung von radiomarkiertem Energiesubstrate für die Beurteilung der myokardialen oxidativen Metabolismus, aus der Herstellung von Reagenzien und Puffer zur Gewinnung und Verarbeitung von Proben, zur Datenanalyse.

Prinzipien des Verfahrens

Kardiomyozyten erzeugen den größten Teil ihrer Energie für die Kontraktion von der oxidative Phosphorylierung von Fettsäuren (hauptsächlich langkettige Fettsäuren) und Kohlenhydrate (glucose und Laktat). Das Herz hat eine begrenzte sehr energisch Reserven und stützt sich auf eine ständige Zufuhr dieser Energie liefert Substrate aus dem Kreislauf. Der Katabolismus von Glucose durch den glykolytischen Weg ergibt Pyruvat, das dann durch die Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex von der inneren Mitochondrienmembran decarboxyliert wird. Langkettige Fettsäuren, extrahiert aus Triglyceriden Albumin oder Lipoprotein Zirkulieren werden zuerst in Acyl-CoA-Molekülen in das Cytosol aktiviert und anschließend in der mitochondrialen Matrix durch die Carnitin-Shuttle transportiert, um die beta-Oxidationswegs ein. Die Acetyl-CoA - Molekülen durch den Katabolismus von Glucose und Fettsäuren , die den Krebs - Zyklus Kraftstoff die Reduktionsäquivalente (NADH und FADH 2) , die durch die Elektronentransportkette , verwendet werden zur Erzeugung der Protonen-Antriebskraft über die innere Mitochondrienmembran zu bauen und ATP durch die Aktivität der ATP-Synthase erzeugen. Wasser und Kohlendioxid sind die End-Nebenproduktedie enzymatischen Reaktionen im Inneren des Krebs-Zyklus stattfindet. Die Lieferung von 14 C- und H- 3 radiomarkierte Substrate (wie beispielsweise 14 C-radioaktiv markiertem Glukose und 3 H-radiomarkierten Ölsäure) zum isolierten Arbeits Herz wird folglich für die Produktion von 14 CO 2 und 3 H 2 O führen, wo quantitativ aus dem koronaren Abwasser zurückgewonnen werden. Die Sammlung von 14 CO 2 wird durch Halten der isoliert perfundierten Herzen in eine abgedichtete Kammer und durch sofortiges Gewinnen des koronaren Abflusses durchgeführt , wie es das Herz verlässt. Eine kleine Anionenaustauschsäule verwendet 3 H 2 O aus dem koronaren Ausfluß zu trennen und zu gewinnen. Die Radioaktivität aus den verarbeiteten Proben wird mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen und mit Kenntnis der spezifischen Aktivität der radiomarkierten Substraten verwendet, ist es dann möglich, den Fluss von Glukose und Fettsäure in der individuell QuantifizierenOxidationswege 16,17.

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Protocol

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden nach der NIH Public Health Service Politik durchgeführt auf der Human Care und Verwendung von Tieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt. Alle Verfahren, die die Verwendung von Radioisotopen beteiligt sind, wurden genehmigt und erfolgt nach den Richtlinien der Strahlenschutzstelle der Universität von Mississippi Medical Center eingestellt.

1. Herstellung von Stammpufferlösungen und Reagenzien

  1. Krebs-Henseleit (KH) Puffer-Stammlösungen
    1. Bereiten 2 L eines 20fach konzentrierten Salzstammlösung enthält (in mol / L) 2,37 NaCl, 0,0948 KCl, 0,0236 KH 2 PO 4, und 0,0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filter auf einem 0,45 um Porengröße Filtrationseinheit und bei Raumtemperatur lagern bis zu 1 Monat.
    2. Bereiten 2 L eines 20fach konzentrierten (0,5 mol / l) Lösung von NaHCO 3. Die Lösung kann seinbei Raumtemperatur für eine unbestimmte Zeit gespeichert.
    3. Bereiten 250 ml einer 1 mol / L Stammlösung von CaCl 2. Filter auf einem 0,45 um Porengröße Filtrationseinheit und bei Raumtemperatur lagern bis zu 1 Monat.
  2. Umwandlung von Anionenaustauscherharz aus dem Chlorid-Form zur Hydroxidform
    1. Waschen des Anionenaustauscherharzes, indem sie es in 1 L Reinstwasser Resuspendieren. Lassen Sie das Harz absetzen und das überschüssige Wasser abgießen. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 weitere Male.
    2. Gießen Sie das Harz in einem Glas-Mikroanalyse Vakuumfilterhalter auf einem Filterkolben angebracht war.
    3. Wandeln das Harz in die Hydroxidform durch langsames bis 22 Volumina 1 N NaOH geben. Mischen Sie den Brei intermittierend mit einem Spatel aus rostfreiem Stahl.
    4. Das Harz wird mit Reinstwasser, bis der pH-Wert unter 9,0 sinkt. Den pH-Wert regelmäßig von einem pH-Teststreifen in der Nähe der Oberfläche des Harz Aufschlämmung eintaucht. Decken Sie und speichern Sie das Harz mit Reinstwasser in einem borosilicate Glasflasche und vor Licht schützen. Nicht in das Harz vor der Verwendung zu trocknen.
      HINWEIS: Bei korrekter Lagerung wird das Harz mindestens 3 Monate dauern.
  3. Oleic Acid-Albumin 8x konzentrierte Stammlösung
    1. In einem 4 - Kolben-Erlenmeyer, mischen 200 ml des 20fach konzentrierten Salzstammlösung und 200 ml des 20fach konzentrierten NaHCO3 - Lösung mit 3,6 l Reinstwasser.
    2. Verwendung eines Gasdispersionsrohr mit einem Frittenzylinder, Gas die Lösung 15 min mit einer Mischung aus Kohlendioxid und 5% Sauerstoff 95% den pH-Wert zu stabilisieren.
    3. Gießen 470 ml in einem 1 L Becherglas puffern. In 8,75 ml der 1 mol / l CaCl 2 Stammlösung zu dem 3530 ml Puffer noch in der 4 L Erlenmeyerkolben und beiseite stellen .
    4. In 40 g fettsäurefreies BSA zum 1 L Becherglas und rühren Sie mit einem Rührstab, bis es gelöst.
    5. In einem 15 ml konischen Röhrchen, Herstellung von 4 ml einer 50% (v: v) Ethanollösung in Reinstwasser. In 487 mg sodium Oleat und Wirbel, bis das Pulver vollständig gelöst hat.
      HINWEIS: Einige Forscher verwenden Palmitinsäure anstelle von Ölsäure in der Perfusions-Puffer. A Palmitinsäure-Albumin-Stammlösung kann nach demselben Verfahren hergestellt werden. Es wird jedoch empfohlen, die Lösung bei 70 ºC erwärmen vollständige Solubilisierung von Natriumpalmitat zu erreichen.
    6. Fügen Sie die Oleat Lösung tropfenweise zu der fettsäurefreies BSA-Lösung unter konstantem Rühren und warten weitere 10 min für die Ölsäure-BSA-Komplex zu bilden.
      HINWEIS: Die Lösung sollte eine hellgelbe Farbe haben und von sichtbaren Partikeln frei sein. Vorhandensein eines Präzipitats oder unlösliche Teilchen zeigen unvollständige Konjugation der Fettsäure an BSA. Wenn dies geschieht, sollte die Lösung verworfen und der Prozess gestartet neuem.
      HINWEIS: Palmitate ausfällt, wenn es erlaubt ist, in eine Pipette zu sitzen und nicht tropfenweise hinzugefügt werden können. Die gerührte Lösung von BSA kann bei 37 ºC erwärmt werden, um zu erleichtern Binding Palmitinsäure. Nicht überhitzen, da diese Denaturierung und Aggregation von BSA verursachen kann.
      ACHTUNG: Die nächsten Schritte dieses Protokolls betreffen die Manipulation von radioaktivem Material. Tragen Sie geeignete PSA und befolgen Sie die Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften festgelegt durch das Strahlenschutzamt Institution.
    7. Hinzufügen , 160 ul (0,8 mCi) [9,10- 3 H] Ölsäure zu der gerührten Lösung von Ölsäure-BSA zu und rührt weitere 10 min.
    8. In 2,5 ml der 1 mol / l CaCl 2 Stammlösung zu der gerührten Lösung von Ölsäure-BSA.
    9. Schneiden Sie ca. 1,2 m Dialysemembran Schlauch und spülen Sie sowohl innen als auch außen mit Leitungswasser. Scrub die Dialyseschlauch kräftig unter Leitungswasser für 10 bis 15 min die Glycerinschicht der Membran zu entfernen. Alternativ nehmen Sie die Beschichtung durch den Dialyseschlauch in warmem Wasser für 1 Stunde vor dem Gebrauch Einweichen. Fertig durch die Dialyseschläuche mit Reinstwasser wate Spülenr.
    10. Sicher ein Ende des Dialyseschlauch abbinden. Füllen Sie mit der Ölsäure-BSA-Lösung und binden das andere Ende des Dialyseschlauch ab.
    11. Legen Sie die gefüllte Dialyseschlauch in den 4 L Erlenmeyerkolben von KH Puffer und ermöglichen über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren mit einem Rührstab Dialysieren.
    12. Am nächsten Tag, entfernen Sie die 8-fach konzentrierte Ölsäure-BSA-Lösung aus dem Dialyseschlauch. Verwenden Sie die Ölsäure-BSA-Lösung sofort für die Perfusion oder aliquoten und bei -20 ° C. Gefrorene Aliquots werden für mindestens 2 Monate stabil. Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen, da dies die Löslichkeit der Ölsäure-BSA-Komplex beeinträchtigen kann.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur Reinstwasser (spezifischer Widerstand von 18,2 MΩ.cm bei 25 ºC, gesamter organischer Kohlenstoff <10 ppb, Mikroorganismen ≤ 1 KBE / ml, Partikel mit einer Größe von über 0,22 um ≤1 / ml) die Reagenzien und Puffer zur Vorbereitung für Herzperfusion verwendet. Umwandlung des Anionenaustauscherharzes aus seiner Chloridm auf der Hydroxid - Form kann durch den direkten Kauf von der Hydroxid - Form zu einem zusätzlichen Aufwand (siehe Materialien Tabelle) vermieden werden. Neben Oleat oder Palmitat, jede andere Art von natürlich vorkommende Fettsäure kann auch verwendet werden, solange eine tritiierten Version der Fettsäure vorhanden ist ihre Oxidation zu folgen.

2. Herstellung des Perfusionspuffer

  1. In einem 4 - Kolben-Erlenmeyer, mischen 200 ml des 20fach konzentrierten Salzstammlösung und 200 ml des 20fach konzentrierten NaHCO3 - Lösung mit 3,6 l Reinstwasser. Gas durch die Lösung für 15 min mit einer Mischung aus Kohlendioxid 5% und 95% Sauerstoff, und fügen Sie dann 10 ml der 1 mol / l CaCl 2 Stammlösung die Konzentration an freien Ca 2+ bei 2,5 mmol / l eingestellt werden .
    ACHTUNG: Die folgenden Schritte, um die Manipulation von radioaktivem Material beinhalten. Tragen Sie geeignete PSA und befolgen Sie die Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften festgelegt durch die RA Institutionstrahlung Sicherheit Büro.
  2. Übertragen 1.750 L KH Puffer in einen 2 l Glasflasche. Nach Eintragen von 250 ml des 8 - fach konzentrierten Glucose Ölsäure-BSA - Lösung, 1,802 g D-Glucose, 400 & mgr; l Insulin bei 0,4 U / ml, und 200 ul (0,2 mCi) [U- 14 C]. Invert Flasche zu mischen. Dies gibt 2 l vollständigen Perfusionspuffer Ölsäure (0,4 mmol / L), D-Glucose (5 mmol / l) enthält, und Insulin (40 & mgr; U / ml).
    HINWEIS: Ein Volumen von 2 L ist ausreichend für mindestens 60 min ein Arbeits erwachsenen Rattenherz in nicht-rezirkulierenden Bedingungen zu perfundieren.
  3. Verwenden Sie einige der nicht-radioaktiven KH Puffer zwei Dissektion Gerichte zu füllen und auf Eis zu kühlen.

3. Herstellung der Perfusionsgerät

HINWEIS: Die Ermittler können wählen , eine maßgeschneiderte Perfusionsgerät zu verwenden , wie die von Taegtmeyer, Hems und Krebs 11 beschrieben, oder eine der im Handel erhältlichen Systeme. Perfusions-Systeme sind in der Regel von der zusammengesetztElemente in Figur 1 unten beschrieben. Neben dem Schlauch und Glaswaren, ist der Rest des Kontrollgeräts optional und deren Nutzung auf die Prüfer Bedürfnisse hängen die experimentelle Frage aufgefordert zu werden. Dennoch empfehlen wir die Verwendung von Sauerstoff - Mikroelektroden die O 2 -Konzentration in der Puffer Ein- und Aussteigen das Herz - Kreislauf- (Abbildung 1) zu bestimmen. Dadurch wird der Prüfer Steuer helfen, die das Herz mit einer geeigneten Menge an Sauerstoff zugeführt wird, und dass die Sauerstoffzufuhr variiert nicht zwischen den Experimenten. Darüber hinaus kann die Bestimmung der "arteriovenöse" oxygen Differenz verwendet werden 16,18 myokardialen Sauerstoffverbrauch und kardialen Effizienz zu berechnen.

  1. Schalten Sie das zirkulierendes Wasserbad und eingestellt bei 37 ºC die Perfusionsgerät aufzuwärmen.
  2. Schalten Sie den Computer und das Datenerfassungssystem das wirdwerden verwendet, die Herzfunktion zu messen.
  3. Schließen Sie die Aufnahmegeräte (Druckkatheter, Druck-Volumen - Katheter, Sauerstoff - Mikroelektroden, Durchflussmesser, etc.) an das Datenerfassungssystem und führen Sie eine Kalibrierung der Instrumente den Anweisungen des Herstellers folgen.
  4. Füllen Sie den Pufferbehälter mit Reinstwasser. Schalten Sie die peristaltische Pumpe und spülen das Wasser durch alle Schläuche und Glaswaren, das System zu spülen. Drehen Sie die peristaltische Pumpe aus und stellen Sie sicher, dass kein Wasser bleibt in der Rohrleitung und / oder Glas, da dies die Konzentration des Perfusionspuffer beeinflussen und das Herz Vorbereitung.
  5. Verbinden eines neuen 1,0 & mgr; m-Glasfaserfilter auf das System. Verbinden den Gastank eine Mischung aus Kohlendioxid und 5% Sauerstoff 95% auf der Sauerstoffanreicherungskammer enthält.
    ACHTUNG: Die folgenden Schritte, um die Manipulation von radioaktivem Material beinhalten. Tragen Sie geeignete PSA und befolgen Sie die Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften von der Institution festgelegt'S Strahlensicherheit Büro.
  6. Füllen Sie den Pufferbehälter mit Perfusionspuffer. Schalten Sie die Pumpe und gewährleisten Füllung aller Schläuche und Glas mit dem Perfusions-Puffer. Führen Sie die Perfusionspuffer durch die Perfusionsapparatur im Umluftbetrieb und Oxygenat für mindestens 30 min vor der Verwendung.
  7. Dicht befestigen das Rohr einer 20 ml Spritze unterhalb der Herzkammer des koronaren Ausflusses zu erholen. Verbinden Sie die Spitze der Spritze an die Spitze eines Dreiwegehahn. Schließen Sie den Seitenarm mit einem 3-ml-Spritze. Verbinden Sie den unteren Arm über einen Schlauch in einen Behälter für flüssige radioaktive Abfälle.
    HINWEIS: Wenn die Säure-BSA-Komplex Fett verwenden, die Sauerstoffversorgung des Puffer Perfusion kann nicht mit einem Gasdispersionsrohr durch direkte Blubbern durchgeführt werden, da dies eine übermäßige Schaumbildung der Lösung führen wird. Verwenden Sie einen Oxygenator (Abbildung 1) oder eine Blattflusssauerstoffanreicherungskammer zu diesem Zweck. Es ist sehr, dass ein angemessenes Niveau o, um zu überprüfen empfohlenf die Sauerstoffversorgung wird , indem ein Sauerstoff - Mikroelektrode im Perfusionskreislauf (Figur 1) erreicht.

4. Rattenherz Isolation und Kanülierung

  1. Wiegen Ratte auf einer Skala.
  2. Bereiten Sie eine Spritze mit Betäubungsmittel Dosis von 150 mg / kg Thiobutabarbital Natriumsalz-Hydrat und ein Tuberkulin-Spritze mit 200 USP-Einheiten Heparin.
  3. Injizieren Thiobutabarbital IP und warten, bis das Tier das Bewusstsein verlieren. Andere Induktionsmittel können verwendet werden , solange dies nicht mit dem Zweck des Experiments stören (siehe Wahl des Anästhetikums in der Diskussion weiter unten).
  4. Überprüfen Sie für angemessene Höhe der Anästhesie durch den Mangel an toe Prise Reflex bestätigt. Achten Sie darauf, die richtige Tiefe der Anästhesie zu halten, um sicherzustellen, dass das Tier keine Schmerzen während des Verfahrens fühlt.
  5. Einmal ist die Ratte vollständig bewusstlos und reagiert nicht auf die Zehen Prise, legen Sie es auf dem Rücken auf dem Operationstisch und sure Gliedmaßen mit Klebeband oder Stifte.
  6. Befestigen Sie den Bauch frei von Haaren und führen Sie einen Mittelschnitt des Bauches. noch nicht die Brusthöhle an dieser Stelle öffnen. Bewegen Sie den Magen und Darm zur Seite der unteren Hohlvene zu offenbaren. Spritzen Sie das Heparin direkt in die untere Hohlvene und warten Sie 5 bis 10 Sekunden, bevor Sie fortfahren.
  7. Mit einer Schere schneiden Sie die Blende und die Seiten des Brustkorbs, den Inhalt der Brusthöhle zu belichten.
  8. greifen Zart das Herz zwischen Daumen, Zeige- und Mittelfinger und Verbrauch sowohl Herz und Lunge zusammen. Schneiden Sie auf der Ebene der absteigenden Aorta, wobei darauf geachtet, nicht den Aortenbogen und aufsteigende Aorta in den Prozess nicht zu beschädigen. Unmittelbar übertragen Herz und Lunge zu einer der Dissektion Gerichte mit eiskaltem KH Puffer gefüllt.
  9. Nachdem das Herz aufhört zu schlagen, Transfer in die Schale zweite Dissektion und schneiden Sie die große Stücke von Lungengewebe ab angebracht, während das Herz in eiskaltem KH Puffer unter Wasser zu halten. Schneiden Sie den Abstieging Aorta direkt über dem Aortenbogen.
    ACHTUNG: Die folgenden Schritte, um die Manipulation von radioaktivem Material beinhalten. Tragen Sie geeignete PSA und befolgen Sie die Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften festgelegt durch das Strahlenschutzamt Institution.
  10. Spülen Sie die Aorten-Linie der Perfusionsgerät die Aortenkanüle mit warmem Puffer zu füllen und um Wasser oder Luft zu beseitigen, die noch in der Röhre vorhanden sein können. Erlauben es dem Perfusionspuffer aus der Aortenkanüle tropft die Möglichkeit des Luftembolien zu der Zeit zu minimieren, das Herz an der Kanüle befestigt ist.
  11. Die Verwendung von zwei Mikro Dissektionszangen vorsichtig die Aorta öffnen und das Herz nach oben auf die Aortenkanüle gleiten. Sichern Sie die Aorta an der Kanüle mit einem Mikro-Clip und Langendorff-Perfusion des Herzens einzuleiten. Beachten Sie das Herz beginnen wieder zu schlagen und zu vertreiben das ganze Blut in die Koronargefäße in den verbleibenden Sekunden nach Beginn der Perfusion.
    HINWEIS: Es ist sehr wichtig, Schritte auszuführen, 4.6 bis 4,10 so schnell wie möglich irreversible ischämische Schädigung des Herzens zu verhindern. Mit der Erfahrung sollte das gesamte Verfahren zwischen 1 und 2 Minuten dauern. Wenn die Aorta an der Kanüle gleitend nach oben, darauf achten, nicht die Aortenwurzel zu passieren, wie dies in myokardiale Hypoperfusion und Schäden an der Aortenklappe führen kann.
  12. Binden Sie die Aorta in die Aortenkanüle mit einer 3-0 Seidennaht und entfernen Sie den Mikro-Clip. Suchen Sie die Lungenvenen. Es kann notwendig sein, die nicht-kardialen Gewebe zu schneiden, es zu finden, aber nicht zu viel schneiden der nicht-Herzgewebe, wie sie den linken Vorhof in die Kanüle zu binden dienen.
  13. Spülen Sie das linke Vorhofleitung der Perfusionsgerät die atriale Kanüle mit warmem Puffer zu füllen und um Wasser oder Luft zu beseitigen, die noch in der Röhre vorhanden sein können. Seien Sie besonders vorsichtig jede Luftblase aus dem Gerät zu entfernen, die Möglichkeit von Luftembolien zu der Zeit zu minimieren, das Herz an der Kanüle befestigt ist.
  14. Die Verwendung von zwei Mikro Sezieren forceps zart die Öffnung der Pulmonalvene greifen und das Herz nach oben auf die atriale Kanüle gleiten. Es kann notwendig sein, um das Herz zu positionieren, indem Sie vorsichtig die atriale und / oder Aortenkanüle Drehen Sie diesen Schritt zu erreichen. In jedem Fall ist sicherzustellen, dass das Verfahren nicht übermäßige Belastung für das Herz und verursachen erlegt der Aorta zu biegen. Binden Sie den linken Vorhof in die Vorhof Kanüle mit einem 3-0 Seidennaht.
  15. Öffnen Sie die atriale Leitung und gleichzeitig schalten die Aorten-Linie von der Langendorff-Modus in den Arbeitsmodus. Wenn Puffer entweicht aus dem linken Vorhof, schließen Sie die atriale Leitung, schalten Sie die Aorten-Linie Langendorff-Perfusion zurück, und verwenden Sie ein anderes 3-0 Seidennaht den linken Vorhof mehr sicher an der Kanüle zu binden.

5. Messung der Herzfunktion und Probenentnahme

HINWEIS: Die Bestimmung der metabolischen Flüsse wird die Kenntnis des Koronarflusses (CF) erfordern. Wie unten beschrieben, können koronare Flusswerte sein,mit der einfachen Verwendung einer Stoppuhr erhalten. Darüber hinaus wird die Messung der Aortafluss (AF) mit dem gleichen Verfahren die Bestimmung der Herzleistung (CO = CF + AF) erlauben, die dann verwendet werden können, Herzleistung (CP) als allgemeines Maß für die Herzfunktion zu berechnen, indem die Formel CP = CO (m 3 / s) * Nachlast (Pa). Ein anderes Verfahren für die Bewertung der Herzfunktion beruht auf Echtzeitmessung des Pulsdruck mit einem Druckwandler (3 und 4). Obwohl optional, die präzise und detaillierte Messungen der Herzkontraktionsfunktion und die Hämodynamik, einschließlich der Bestimmung der linksventrikulären systolischen und diastolischen Funktionen, werden mit der Verwendung eines Druck-Volumen (PV) Konduktanz Katheter erreicht werden. Dieser Abschnitt beschreibt kurz die Katheterisierung des isolierten Herzens. Weitere Informationen über die Kalibrierung von PV-Katheter und Datenanalyse mit statistischer Software kann seinin Referenzen 14,15 gefunden.
ACHTUNG: Die folgenden Schritte, um die Manipulation von radioaktivem Material beinhalten. Tragen Sie geeignete PSA und befolgen Sie die Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften festgelegt durch das Strahlenschutzamt Institution.

  1. Wenn das Experiment direkte Messung der LV-Funktion mit einem Katheter enthält, durchstechen die LV-Apex mit einer 26 G-Nadel und den Katheter über den Einstich einzuführen.
  2. Wenn ein Druck-Volumen-Katheter, sorgfältig den Katheter zu positionieren, so daß seine Welle mit der LV Längsachse ausgerichtet ist, wobei die distale Elektrode direkt unterhalb der Aortenklappe und angrenzend an die endokardiale Grenze und die proximale Elektrode gerade innerhalb der Ventrikelwand.
  3. Dichten Sie das Herz in die Wassermantel Herzkammer und zu überwachen Herzfunktionsparameter mit der Datenerfassungssoftware. Starten Sie die Aufnahme nach der Ausgangs-Herz Parameter stabil gewesen sein für mehr als 5 min.
  4. Bestimmen Sie die koronare Fluss durch measuring die Zeit benötigt, um die 20-ml-Spritze Rohr unterhalb der Herzkammer angebracht zu füllen. Nach der Messung öffnen Sie das Dreiwegehahn der koronaren Abwasser in die radioaktive Abfallbehälter zu leeren.
    HINWEIS: Strömungsmessungen können auch einen Durchflußmesser und flowprobes durchgeführt werden.
  5. Verwenden Sie die 3 ml Spritze mit dem Seitenarm des Absperrhahns Dreiwege angebracht ~ 2 ml koronaren Ausflusses zu erholen, wie es das Herz verlässt. Übertragen Sie 0,5 ml der koronaren Abwasser in ein 2 ml deckellosen Mikrozentrifugenröhrchen und sofort gehen Sie mit der Bestimmung der Raten der Glukoseoxidation (Abschnitt 6).
  6. Übertragen Sie den Rest der koronaren Abwasserprobe (~ 1,5 ml) in einem entsprechend gekennzeichneten Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5,4-5,6 in regelmäßigen Abständen (zB alle 5 oder 10 min) bis zum Ende der Perfusion Experiments.
  8. Wenn ein Druck-Volumen-Katheter, injizieren einer 10 ul-Bolus von hypertonischen Salzlösung (15%)in die atriale Leitung und direkt vor der Vorhof Kanüle vor dem Experiment abzuschließen. Verwenden Sie dieses Bolusinjektion die Parallelleitfähigkeit (V p) zu berechnen, die für eine genaue Bestimmung des Herzvolumens 15 kritisch ist.
  9. der Herzkammer entsiegeln und der Katheter aus dem LV entfernen, wenn man in dem Experiment verwendet wurde. Gewinnen Sie das Herz einer der folgenden Optionen:
    1. Wenn keine Notwendigkeit besteht, bestimmte Bereiche des Herzens für den Downstream-Analysen zu isolieren, und wenn die Perfusionsapparatur ermöglicht es, in der Nähe sowohl Vorhof- und aortic Linien und sofort das Herz auf der Kanülen verwenden Wollenberger Zange vorgekühlt in flüssigem Stickstoff gefrier festzuklemmen.
    2. Alternativ schneiden das Herz aus den Kanülen und in eiskaltes KH Puffer fallen. trocknen schnell das Herz auf einem Papiertuch und messen seine Nassgewicht. Das Herz kann dann für bestimmte Messungen präpariert und Gewebeproben gesammelt werden. Frieren Sie das verbleibende Gewebe mit tong Wollenbergers vorgekühlten in flüssigem Stickstoff.
  10. Lagern Sie das gefrorene Herzgewebe bei -80 ° C bis zur Bestimmung des Trockengewichts (siehe Abschnitt 8. Berechnungen).

6. Bestimmung der myokardialen Glukoseoxidationsraten

HINWEIS: Das Verfahren besteht in der quantitativen Rückgewinnung von 14 CO 2 aus dem koronaren Ausflusses mit einem Trapping - Lösung von Hydroxid von Hyamin. Die 14 CO 2 gelöst als 14 H CO3- folgende Versauerung des Puffers mit Perchlorsäure gewonnen wird. Proben sollten unmittelbar nach ihrer Gewinnung als passive Diffusion von Gas zwischen der Luft und der Probe verarbeitet werden in einem Verlust von 14 CO 2 im Laufe der Zeit führen. Die Szintillationsgefäße werden sollten eng mit den Gummimanschette Stopfen verschlossen , den Verlust von 14 CO 2 zu verhindern , nachdem Perchlorsäure hinzugefügt wird . Falls erforderlich, können Parafilm verwendet werden, um die Gummihülse Stoppern zu der zu sichernFläschchen (Abbildung 2).

  1. 1 ml 10-fach konzentrierten Hydroxid von Hyamin zu Szintillationsrährchen aus Glas (ein Fläschchen pro Probe + zwei zusätzliche Fläschchen zur Bestimmung der Hintergrundaktivität).
    ACHTUNG: Hydroxid von Hyamin ist hochgiftig und verursacht schwere Verätzungen. Konsultieren Sie die Produkt SDB für sachgemäßer Handhabung und Lagerung.
  2. Mit einer Pinzette vorsichtig übertragen Sie die 2 ml deckellosen Mikrozentrifugenröhrchen, die 0,5 ml koronarer Abwasserprobe in ein Fläschchen vorgefüllt mit dem Hydroxid von Hyamin enthält. Verwenden 0,5 ml Perfusionspuffer zur Bestimmung der Hintergrundaktivität.
  3. Verschließen Sie die Fläschchen mit einer Gummimanschette Stopper. Parafilm kann verwendet werden, Abdichtung der Ampulle zu sichern. Unter Verwendung einer 1 ml Spritze und einer 23 G lange Nadel injizieren 200 ul Perchlorsäure (60% w: w%) durch die Gummihülse Topfen und direkt in die deckellosen 2 ml Röhrchen.
    HINWEIS: Die koronare Abwasser sollte weiß werden durch die Ausscheidung von BSA.
  4. Lassen Sie die Fläschchen ses über Nacht.
    ACHTUNG: Perchloric Säure ist stark ätzend, kann wirken als Oxidationsmittel und / oder verursachen eine Explosionsgefahr. Konsultieren Sie die Produkt SDB für sachgemäßer Handhabung und Lagerung.
  5. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Gummimanschette Stopfen. je 2 ml deckellosen Rohr mit einer Pinzette vorsichtig abzurufen und den Boden des Röhrchens auf der Oberseite der offenen Ampulle mit 1 ml Szintillationscocktail waschen alle der Hydroxid von Hyamin abzurufen. Entsorgen Sie die deckellosen Rohr in einem entsprechend radioaktiven Abfallbehälter markiert.
  6. Fügen Sie eine weitere 9 ml Szintillationscocktail pro Fläschchen. 0,5 ml Perfusionspuffer direkt an zwei mit 10 ml flüssigem Szintillationscocktail befüllten Vials zur Bestimmung der spezifischen Aktivität. Schütteln Sie die Fläschchen kräftig von Hand und warten Sie mindestens 6 Stunden Luftblasen zu ermöglichen, vor der Messung in einem Flüssigszintillationszähler zu zerstreuen in geeigneter Weise für Dual-Label Experimente eingerichtet.
    HINWEIS: Verwenden Sie klare Glasfläschchen, die ne zu visualisierenedle, wenn Durchstechen der Gummimanschette Stopfen. Nicht Perchlorsäure in das Hydroxid von Hyamin fallen, da dies die Reaktion ruinieren. Das Hinzufügen der Perchlorsäure löst die 14 CO 2 aus dem koronaren Abwasser in die Luft. Obwohl die Fläschchen sollten dicht verschlossen werden und alle der 14 CO 2 sollte in die Hyamin von Hydroxid gefangen werden, wird empfohlen , diesen Test unter dem Abzug durchzuführen.

7. Bestimmung der myokardialen Oleate Oxidationsraten

HINWEIS: Die Methode basiert auf der quantitativen Abtrennung und Gewinnung von 3 H 2 O aus dem koronaren Abflusses ein starkes Anionenaustauscherharz verwendet wird . Anders als bei der Rückgewinnung von 14 CO 2, gibt es keine Probenstabilitätsproblem und der koronaren Abwasser kann vor dem Test in der Tiefkühltruhe auf Eis oder lagern.

  1. Bereiten Sie Anionenaustauscherharz Spalten (eine Spalte pro Probe + two zusätzliche Spalten zur Bestimmung der Hintergrundaktivität) durch die Spitze von 3 ml Spritze Röhrchen mit Glaswolle gefüllt wird. Fügen Sie die Harz / Wasser-Schlamm mit einer Transferpipette, bis das Harz die 2-ml-Markierung auf dem Spritzenrohr erreicht.
  2. Das Harz 2 ml Reinstwasser durch die Säule, indem. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
  3. Legen Sie offen Szintillationsgefäße unter den Säulen und laden 0,5 ml koronarer Abwasser pro Säule. Last 0,5 ml Perfusionspuffer zur Bestimmung der Hintergrundaktivität.
  4. Waschen Sie die Spalten nacheinander mit 0,5, 1 und 2 ml Reinstwasser. Sobald die Elution durchgeführt wird, entsorgen Sie die Spalten in einem entsprechend radioaktiven Abfallbehälter markiert.
  5. In 13 ml Flüssigkeit Szintillationscocktail pro Szintillationsphiole. 0,5 ml Perfusionspuffer direkt an zwei mit 13 ml Flüssigkeit Szintillationscocktail befüllten Vials zur Bestimmung der spezifischen Aktivität. Schütteln Sie die Fläschchen kräftig und warten Sie mindestens 6 Stunden, bevor sie in einem flüssigen sci Messntillation Zähler passend für Dual-Label Experimente eingerichtet.

8. Calculations

  1. Falls noch nicht geschehen, das Nassgewicht des gesamten perfundierten Herzen bestimmen.
    HINWEIS: Lassen Sie das gefrorene Gewebe aufzutauen, wenn molekularen und biochemischen Analysen werden anschließend auf dem verbleibenden Gewebe durchgeführt werden.
  2. Bestimmen Sie das Nassgewicht einer Gewebeprobe aus dem gesamten perfuse-Herz (verwenden Sie etwa 15 bis 30% des gesamten Herzens). Legen Sie die Gewebeprobe in einem Ofen bei 50 ° C eingestellt über Nacht und messen sein Trockengewicht. Verwenden Sie das Nassgewicht / Trockengewichtsverhältnis der Gewebeprobe das Trockengewicht des ganzen Herzens in Gramm zu bestimmen (g Trockengewicht.).
  3. Für jedes x Zeitpunkt den Wert der koronaren Fluss CF x in ml / min auszudrücken.
  4. Bestimmung der Rate der Glukoseoxidation
    1. Der Mittelwert der beiden Zerfall / min (dpm) für die Hintergrundaktivität von 14 C Messwerte Bestimne der Korrekturfaktor 14C dpm ba.
    2. Bestimmen Sie die 14 C - Wert der spezifischen Aktivität 14C dpm sa gemittelt.
    3. Bestimmen Sie die spezifische Radioaktivität von Glucose in dpm / & mgr; Mol (F Glu) durch Anwendung der Formel
      Gleichung 1
      ANMERKUNG: wo n Glu (& mgr; mol) = C Glu (umol / L) * Probenvolumen (L) = 2,5 , wenn die Glucose in 5 mmol / L und eine 0,5 ml Probe verwendet wird .
    4. Bestimmen Sie für jeden Zeitpunkt x die Geschwindigkeit der Produktion von 14 CO 2 in dpm / min (A) durch Anwendung der Formel
      Gleichung 1
      HINWEIS: Wo Vol x (ml) = 0,5
    5. Teilen A durch den ermittelten Wert von trockenem Herzgewicht der normalisierten Produktionsrate von 14 CO 2 (A - Norm zu erhalten
    6. Tragen Sie die Formel GO = A Norm / F Glu die Rate der Glukoseoxidation (GO) in & mgr; mol Glucose / min pro g Trockengewicht zu erhalten.
  5. Die Bestimmung der Rate von Oleate Oxidation
    1. Der Mittelwert der beiden Zerfall / min (dpm) Werte für die Hintergrundaktivität von 3 H gemessen , um den Korrekturfaktor 3H dpm ba zu bestimmen.
    2. Bestimmen Sie die 3 H - Wert der spezifischen Aktivität 3H dpm sa gemittelt.
    3. Bestimmen Sie die spezifische Radioaktivität von Oleat in dpm / & mgr; Mol (F Ol e) durch Anwendung der Formel
      Gleichung 1
      ANMERKUNG: wo n Ole (umol) = C Ole (umol / L) * Probenvolumen (L) = 0,2 , wenn Oleat bei 0,4 mmol / L und eine 0,5 ml Probe verwendet wird .
    4. Bestimmen Sie für jeden time - Punkt x die Geschwindigkeit der Produktion von 3 H 2 O in dpm / min (B) durch Anwendung der Formel
      Gleichung 1
      HINWEIS: Wo Vol x (ml) = 0,5
    5. Teilen B von dem ermittelten Wert von trockenem Herzgewicht der normalisierten-Produktionsrate von 3 H 2 O (B - Norm) in dpm / min pro g Trockengewicht zu erhalten.
    6. Tragen Sie die Formel OO = B Norm / F Ole die Rate der Oleat Oxidation (OO) in & mgr; mol Oleat / min pro g Trockengewicht zu erhalten.

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Representative Results

Zwei repräsentativen Experimente sind in den Figuren unten beschrieben ist. In beiden Fällen wurde das Herz eines 16 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten isoliert und in den Arbeitsmodus mit KH-Puffer nach dem vorhergehenden Vorschrift hergestellt perfundiert. In jedem Experiment wurde das Herz mit einem Spannungszustand unterworfen Herzarbeit zu beeinflussen. Herzkontraktionsfunktion wurde durch kontinuierliche Aufzeichnung von Pulsdruck durch Einsetzen eines Druckwandlers in der Aortaleitung und durch Bestimmung der Herzleistung beurteilt. Die Folgen der einzelnen Spannungszustand auf der Nutzung von Energie liefert Substrate wurden durch Messung der Geschwindigkeiten von Glukose und Oleat Oxidation gleichzeitig bestimmt.

Im ersten Experiment wurde ein akuter Anstieg der Arbeitsbelastung nach 20 min Perfusion bei nahezu physiologischen Arbeitsbelastung simuliert wurde durch die Nachlast um 40% erhöhte (erreicht durch manuellesErhöhung der aortalen Überlaufkammer) und Epinephrin (1 & mgr; mol / L) zu dem Perfusionspuffer (3A) hinzugefügt wird . Herzfrequenz, die durch Messen des Intervalls zwischen den systolischen Spitzendruckwerte auf der Pulsdruckkurve bestimmt werden kann, erhöht sofort um mehr als 50% bei workjump Induktion (3B). Herzleistung um mehr als 40% bei workjump, die durch eine Zunahme in beiden Raten von Glucose und Oleat Oxidation (3C) begleitet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass unter dem Druck einer akuten Anstieg der Arbeitsbelastung, schnell das Herz passt sich sowohl für die Kontraktion der Energieerzeugung zu erhöhen aus Glukose und Fettsäureoxidation. Jedoch war die relative Zunahme der Oxidationsrate wichtiger für Glukose (~ 2,8-fach), als es für Oleat (~ 1,3-fach) war. Erhöhte Abhängigkeit von Kohlenhydraten Oxidation mit der zusätzlichen Arbeitsbelastung zu bewältigen ist ein typisches Merkmal der drucküberlastet Säugetier Herz 18

In dem zweiten Experiment wurde das Herz unter Ausgangsbedingungen perfundiert für 20 min mit 15 min Gesamt gefolgt, global, Normothermie Ischämie (induziert durch sowohl die atrialen und aortic Linien schließen) und 30 min Reperfusion (4A). Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde zwischen 2 und 3 min nach dem Beginn der Reperfusion (4B) eine nahezu normale Pulsdruck wiederhergestellt. Herzleistung über den vor der Ischämie - Werte während der ersten 10 Minuten der Reperfusion schnell erhöht , bevor sie in der Nähe von -Ausgangswerte (4C) zurückzufallen. Im Vergleich zum Ausgangswert erhöhte sich die Rate der Oleat Oxidation während der Reperfusion, während schnell Glukoseoxidation vorab ischämischen Niveau zurückgekehrt. Durch die gleichzeitige Kontraktionsfunktion und beide Raten von Substratoxidation Messung kann man deutlich erkennen, dass in den vorliegenden experimentellen Bedingungen, die Variation in den Sätzen der Fettsäure OXIDation ist die wichtigste Determinante bei Reperfusion erzeugt für Änderungen in der Menge der Arbeit. Je höher Schalter in Richtung Fettsäure Nutzung Post Ischämie ist ein gut estalished Merkmal des reperfundiertem Herz 19.

Abbildung 1
Abb . 1: Vereinfachtes Schema der isolierten Arbeitsrattenherz Apparatur Die Krebs-Henseleit - Puffer mit der Fettsäure-BSA - Lösung ergänzt wird , indem sie durch eine Membran - Oxygenator mit Sauerstoff angereichert. Typische Herz Vor- und Nachlast Werte für ein Rattenherz in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchblutet sind angegeben. Die Einstellungen können durch Einstellen der Höhen der atrial Reservoir und aortic Überlaufkammer verändert werden. Die Rohre abgestufter Spritzen wurden unterhalb der Herzkammer und die Aorta-Überlaufkammer zu messen, um Koronarflusses und Aortenfluß jeweils angeordnet. Der Fluss vonPuffer gestoppt werden kann oder umgeleitet (wenn die Aorten- und koronaren Ströme Messung) durch den Einsatz von Drei-Wege-Absperrhähne (von der Langendorff in die Arbeitsmodusschalt). Rote Pfeile zeigen die optimale Positionierung für die in-line Sauerstoff microlelectrodes die "arteriovenöse" oxygen Differenz zu bestimmen. In-line Strömungssonden und Drucksensoren können in den Vor- und Nachlast Linien platziert werden sowohl atriale und Aorten-Flussraten und Drücke (grüne Pfeile) zu messen. Linksventrikulärer Druck und Volumen können auch mit einem PV-Katheter durch die Spitze des linken Ventrikels eingeführt aufgezeichnet werden. Nicht auf dem Bild gezeigt wird, ist der Wassermantel umgeben, alle Gläser Elemente und den Infusionsschlauch in der dunkelblauen Farbe. Diese Wassermantel Elemente sind alle seriell über einen Schlauch mit einem zirkulierenden Wasserbad bei 37 ° C eingestellt verbunden. Bitte hier klicken , um eine größere Version von t anzuzeigenseine Figur.

Figur 2
Abbildung 2:. Darstellung der verschiedenen Schritte , die beim Setup des CO 2 Trap (A) 1 ml 10 - fach konzentrierten Hydroxid von Hyamin. (B) In einer 0,5 ml Probe in einem deckellosen Röhrchen enthielt. (C) Verschließen Sie das Fläschchen. (D) Inject 200 ul Perchlorsäure (60% w: w%). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse eines Workjump Experiment (A) Kontinuierliche Aufzeichnung von Pulsdruck.. (B) Short invall Aufzeichnung der Änderung der Pulsdruck zum Zeitpunkt der Initiierung workjump darstellt. (C) Herzraten von Glucose - Oxidation (rote Kurve mit Kreisen) und Oleat Oxidation (blaue Kurve mit Quadraten) wurden durch Analyse des koronaren Abwasser in einem 5 - Minuten - Intervall bestimmt. Herzleistung (schwarze Kurve mit Dreiecke) durch Messung der Herzleistung bei gleichzeitig die Herzkranzabwasserproben wurden gewonnen wurde bestimmt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse eines Ischemia-Reperfusion Experiment (A) Kontinuierliche Aufzeichnung von Pulsdruck.. (B) Kurzintervallaufnahme die Erholung der Kontraktionsfunktion darstellt duRing der ersten 5 Minuten der Reperfusion. (C) Herzraten von Glucose - Oxidation (rote Kurve mit Kreisen) und Oleat Oxidation (blaue Kurve mit Quadraten) wurden durch Analyse des koronaren Abwasser in einem 5 - Minuten - Intervall bestimmt, außer während der ersten 5 Minuten der Reperfusion , wo Analysen an durchgeführt wurden ein 1 Minuten-Intervall. Herzleistung (schwarze Kurve mit Dreiecke) durch Messung der Herzleistung bei gleichzeitig die Herzkranzabwasserproben wurden gewonnen wurde bestimmt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Der vorstehende Protokoll beschreibt die Methoden, um gleichzeitig den Fluss des Substrats durch Glucose-Oxidation und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherzen zu quantifizieren. Die Messungen können dann auf die aufgezeichneten Herzfunktionsparameter überlagert werden , um die Beziehung zwischen den Substraten Stoffwechsel und Herzarbeit unter der Basislinie und Belastungsbedingungen (Veränderung der Arbeitsbelastung, Ischämie-Reperfusion, etc ...) zu bestimmen. Es ist auch möglich, zu beurteilen, wie der Stoffwechsel / Kontraktion Verhältnis von bereits existierenden Bedingungen wie Herzinsuffizienz und Diabetes betroffen ist. Darüber hinaus kann das Herz eines genetisch modifizierten Nagern verwendet werden, um die Wirkung eines spezifischen Proteins auf den Herzstoffwechsels und der Funktion zu befragen. Schließlich kann die Wirkung von Medikamenten und anderen zirkulierende Faktoren auf diese Parameter einzeln zu prüfen. Weil der Fluß von Glukose durch Glykolyse nicht immer mit der Rate der Glucose-Oxidation korrelieren, kann es sein Informative die Raten der Glukosefluß durch beide Pfade in einem einzigen experimentellen Einstellung zu folgen.

Die Raten der Glykolyse kann durch Zugabe von [5- 3 H] Glucose zu dem Perfusionspuffer bestimmt werden, da die Freisetzung von 3 H 2 O durch die Aktivität des Enolase Schritt der Glykolyse 20 bestimmt wird. Alternativ [2- 3 H] Glucose, die an der Phosphoglucoseisomerase Schritt des glykolytischen Weg zur Produktion von 3 H 2 O führt, kann verwendet werden , um die Raten der Glukose - Aufnahme durch den Herzmuskel 16,17,21 abzufragen. Die Möglichkeit von mehreren radiomarkierten Tracern zu wählen, das Schicksal von Glucose auf verschiedenen Ebenen der Katabolismus ist ein weiteres Beispiel für die Vielseitigkeit des Verfahrens zu untersuchen. Da jedoch alle Flussmessungen verlassen sich auf die quantitative Rückgewinnung von entweder 3 H 2 O oder 14 CO 2 aus dem koronaren Ausfluß nur zwei Radiomarkierungsed Tracern (ein 3 H-markiertes und die andere mit 14 C markiert) zu einem Zeitpunkt in dem Perfusionspuffer verwendet werden.

Methodische Überlegungen

Es gibt einige inhärente Beschränkungen auf die Messung des Herz metabolischen Flusses und Funktion dieses Protokoll verwenden. Obwohl die Verwendung von KH Puffer für eine Gesamtsteuerung über die Zusammensetzung des Perfusat ermöglicht, kann die physiologische Relevanz dieser Versuchsanordnung fraglich sein. Zuerst wird die Verwendung einer kristalloiden Lösung über Blut bekannt negativ 22,23 kardialen Hämodynamik und Beständigkeit gegen Ischämie zu beeinflussen. Zweitens haben wir die Perfusionspuffer beschreiben fehlt eine Vielzahl von Hormonen und Nährstoffe, die direkt Herz Stoffwechsel modulieren können und damit das Herz der Reaktion auf einen simulierten Spannungszustand auswirken. Tatsächlich ist die Säugetier-Herzen ein metabolischer Allesfresser und kann neben Glukose und Fettsäuren, verwenden andere Substrate fulfill seinen Energiebedarf (Lactat, Pyruvat, Ketonkörper, verzweigtkettige Aminosäuren). Es gibt immer mehr Beweise dafür , dass einige dieser Substrate 24,25 eine wichtige Rolle bei der metabolischen Umbau des kranken Herzens spielen. Es ist durchaus möglich , dass die Ermittler diese Substrate auf den Perfusionspuffer hinzufügen, deren Konzentration modulieren , um enger unterschiedlichen physiologischen Bedingungen (zB gefütterten Zustand im Vergleich zu nüchternen Zustand) oder Krankheitszuständen zu imitieren, und ihre Rate der Oxidation folgen die Verwendung entsprechenden radioaktiv markierten Tracern 26,27. Der Metabolismus von Triglyceriden können auch zurückgeführt werden, und in diesem Fall wird empfohlen, die Verwendung von Heparin vor der Exzision des Herzens zu vermeiden, da dies die Freisetzung von Lipoprotein-Lipase aus dem Endothel induziert und signifikant die Gewinnung von Triglycerid aus dem Puffer zu verringern 28. Mit einer sorgfältigen Auswahl der radiomarkierten Tracern, den Einbau von Radioaktivität in various Gewebe Metaboliten können auch nach Perfusion gemessen werden , um zu bestimmen Parameter wie de novo Triglyzeridsynthese, Glykogen Umsatz oder Raten der Proteinsynthese 18,29,30. Mit anderen Worten kann der Ermittler arbeiten mit einer Vielzahl von Substraten / Hormone Kombinationen und Konzentrationen. Die Wahl der Pufferzusammensetzung wird meist auf den Zielen des Experiments abhängt. Da diese kontrollierten Pufferbedingungen eine "vereinfachte" physiologischen Modell zu erstellen, ergibt sich aus ex vivo Arbeits Experimente Herzperfusion sollten mit Vorsicht interpretiert werden , und wenn möglich sollten die Daten weiter in vivo validiert werden.

Wahl des Anästhetikums

Die Narkose verwendeten Ratten vor der Exzision des Herzens vorsichtig auf die bekannten Auswirkungen auf die Herz-Lungen-Funktion und den Stoffwechsel auf Basis gewählt werden sollte, um sicherzustellen, dass dies nicht mit dem Experiment stören zu führened. Beide injizierbaren und Inhalationsanästhetika schnell Hyperglykämie und variable Grade Glukoseintoleranz induzieren , die Herz-Stoffwechsel während der Perfusion 31,32 beeinflussen können. Im Vergleich zu anderen Mitteln, die kurzfristigen Wirkungen von Barbituraten (Pentobarbital und Thiobutabarbital) auf Glukose - Homöostase sind relativ unbedeutend 31. Allerdings hat die intraperitoneale Pentobarbital - Anästhesie vor Herz Exzision worden Herzleistung gezeigt zu verringern, linksventrikulärer Funktion beeinträchtigen, und in einem ex vivo - Protokoll von Ischämie-Reperfusion 33 myokardiale Laktat Freisetzung erhöhen. Die negative inotrope Wirkung , dass Pentobarbital am isolierten Rattenherz aufweist , wird vorgeschlagen , durch Gewebeakkumulation des Medikaments 34 verursacht werden. Umgekehrt wird die Verwendung von Inhalationsanästhetika, die schneller ausgewaschen werden aus dem Herzgewebe, ist mit besseren kontraktilen Funktion zugeordnet ex vivo 33. Volatile Anästhetika können vorsehen, tatsächlich cardioprotection während der Ischämie-Reperfusion durch einen Mechanismus , um die Öffnung der mitochondrialen K ATP -Kanäle beteiligt und erhöht von Hexokinase Bindung 32 an Mitochondrien. Zusammenfassend Anästhetikum die Art der in einem isolierten Arbeits Herzperfusion Protokoll ist eine signifikante Variable bei der Beurteilung der sowohl funktionelle und metabolische Parameter, die direkt die Ergebnisse des Experiments auswirken. Daher sollte die Art und die Dosis des Anästhetikums immer verwendet, in dem Abschnitt Verfahren eines Experiments berichtet werden, und diese Parameter nicht zwischen den Experimenten verändert werden, die verglichen werden sollen.

Radioisotopen in Herzperfusion

Alle Flussmessungen mit dem vorstehenden Protokoll durchgeführt werden , in dem nicht-umlaufenden Modus durchgeführt, was bedeutet , dass der koronaren Ausflusses verworfen wird , anstatt zu dem Pufferbehälter (1) zurückgeführt wird. Der Prüfer kann eherwählen die Perfusionsapparatur im Umlaufmodus zu verwenden, die den Vorteil erfordert einen viel kleineren Volumen an Puffer und damit die Radioaktivität zu bedienen hat. Jedoch Recycling des koronaren Ausflusses kompromittiert die stationäre Zusammensetzung des Perfusionspuffer durch Rückgewinnung von Nebenprodukten aus der metabolischen Aktivität des Herzens Ursprung (einschließlich Lactat, sondern auch 3 H 2 O und 14 H CO3-), die die Bestimmung von verkompliziert metabolische Flüsse und kann sogar die Herzfunktion im Laufe der Zeit 35 ändern. Diese Probleme werden in dem nicht-rezirkulierenden Modus verhindert. Aufgrund der Menge an Radioaktivität und das große Volumen des Puffers in einem einzigen Experiment verwendeten Perfusion, sollte der Prüfer besonders vorsichtig, wenn Sie die Arbeitsrattenherzens in metabolischen Flussanalysen verwenden. Wenn eine Perfusionsgerät zum ersten Mal verwenden, ist es empfehlenswert, mehrere mock Versuche mit nicht-radioaktiven Puffer zur Durchführung mit dem vertraut zu werdenverschiedene Schritte des Protokolls und den Sicherheitsverfahren. Die Montage des Herzens auf die Kanülen ist ein besonders sensibler Schritt, da sie einen engen Kontakt mit der Vorrichtung und weil Puffer von einem können auslaufen oder schießen aus dem Herzen abgetrennter Blutgefäße erfordert etablieren. Die Perfusionsapparatur beschrieben von Taegtmeyer und Kollegen 11 hat den Vorteil , einschließlich einer Langendorff - Vorratsbehälter, der vollständig unabhängig von dem Rest der Perfusionsapparatur ist, und kann daher mit nicht-radioaktiven KH Puffer gefüllt werden Verschüttungen von radioaktivem Material während des Herzens Kanülierung zu verhindern . Unabhängig von dem System verwendet wird, sollten die Versuche in einem speziellen Bereich durchgeführt werden, mit beschränktem Zugang. Der Raum sollte ein Waschbecken und eine Versorgung mit Reinstwasser umfassen Puffer Vorbereitung und Reinigung von kontaminierten Geräten im gleichen Gebiet durchzuführen. Die Ermittler sollten eng mit den Strahlenschutz Büro ihre Institution arbeiten zu etablieren specific Eindämmung, Kontrolle und Dekontaminationsverfahren.

Die Reinigung der Perfusionsgerät

Die postexperimentellen Reinigung der Perfusionsgerät ist ein entscheidender Schritt, der zu oft übersehen wird, und, wenn sie nicht sorgfältig ausgeführt werden, verantwortlich für die meisten der zu einer schlechten experimentellen Reproduzierbarkeit Fragen. Die nährstoffreichen Perfusionspuffer und die hohe Temperatur des Perfusionssystem ideale Bedingungen für Bakterien- und Pilzwachstum. Die Verwendung von Proteinen (Insulin, BSA) und Fettsäuren in dem Perfusionspuffer fügt eine weitere Komplexitätsgrad zu dem Reinigungsverfahren, da diese Verbindungen an der Oberfläche des Schlauchs und Glaswaren haften, so dass sie Fest der Vorrichtung zu spülen. Die Verwendung von Radioisotopen werden auch zusätzliche Beschränkungen auferlegen, wie die Schaffung eines eigenen Sperrgebiets im Labor für die Manipulation des kontaminierten Geräten und Entsorgung von festen eind flüssige radioaktive Abfälle. Daher wird die ausreichende Reinigungsverfahren meist auf hängen sowohl die Zusammensetzung des Perfusionspuffer und von der Art der Perfusionsapparatur verwendet. Wenn eine kommerzielle Gerät verwenden, überprüfen Sie die Website des Herstellers oder den Kundendienst Informationen darüber zu erhalten, wie Reinigung durchzuführen, ohne dass die Komponenten der Vorrichtung zu beschädigen. Generell sind alle Glas- und Kunststoffteile können mit einer breiten Palette von Seifen gewaschen werden. Enzymaktiven angetriebene Detergenzien sind besonders nützlich, Fettsäure-BSA-Rest zu entfernen. Die meisten Verunreinigungen werden auch durch Ausführen von 0,1 M HCl oder 0,1 M HNO 3 durch die Vorrichtung für mehrere Stunden entfernt werden. Wir erhalten zufriedenstellende Reinigungsergebnisse, indem das System zuerst mit 0,1 M HCl gespült, dann mit einer frischen 1% (w: v) Lösung von enzymaktiven angetriebene Reinigungsmittel in warmem Wasser hergestellt, und schließlich durch das System mit ultrareinem Wasser gespült. Bei der Verwendung eines speziell angefertigten Perfusionsgerät als ursprünglich described von Taegtmeyer und Kollegen 11 kann es einfacher und effektiver sein , die Vorrichtung vollständig am Ende eines jeden Versuchstag zu demontieren. Die Gläser wird durch eine 15 min Eintauchen in eine konzentrierte Bad aus einer Chromsäure und Schwefelsäure-Gemisch gereinigt. Die Kunststoffteile und der PVC-Schlauch mit einem rückstandsfreien Waschmittels gewaschen werden. Wir fanden es tatsächlich schneller und zuverlässiger täglich den PVC-Schlauch vollständig zu ersetzen, da es die Manipulation von Material durch Radiochemikalien kontaminierten begrenzt und weil es verhindert, dass hinter Rückstände von Reinigungsmitteln zu hinterlassen. In jedem Fall sollte der Prüfer gelten die folgenden Regeln: 1- Reinigen Sie das Perfusionsgerät und alle verschmutztes Gerät unmittelbar nach dem Perfusions-Experiment abgeschlossen. Warten wird nur die Reinigung schwieriger und zeitraubend machen. 2- Überprüfen Sie den zirkulierenden Bad des Wassermantelsystem regelmäßig auf Verunreinigungen. Die Verwendung eines Wasseranlage wird das Intervall zwischen c erhöhengelehnt des Wasserbades. 3- Nach der Reinigung gründlich alle Gläser und Schläuche mit Leitungswasser mehrmals wiederholen und mit Reinstwasser spülen Rückstände von Reinigungsmitteln zu entfernen. 4- Zwei Herzpräparationen andernfalls nacheinander, wenn die Dissektion sorgfältig durchgeführt wurde und die Perfusionspuffer sorgfältig vorbereitet wahrscheinlich eine Verschmutzung der Vorrichtung (entweder durch Bakterien oder durch Lösungsmittelreste) anzuzeigen. Wenn dies geschieht, sollte die Wasch- und Spülvorgänge vollständig wiederholt werden.

Skalierung bis auf die Maus Herz

Obwohl die vorhergehende Protokoll zur Bestimmung der Stoffwechselrate in einem isolierten Rattenherz Arbeits konzentriert, können die gleichen Verfahren 36 zur Perfusionsapparatur und Datenerfassungsgeräte mit wenigen Modifikationen an der Maus Herz angewendet werden. Aufgrund seiner geringeren Größe ist das isolierte Arbeits Maus Herz technisch anspruchsvoll, aber wegen seiner deutlichniedrigere Strömungsgeschwindigkeit hat es den Vorteil eines wesentlich geringeren Volumen Perfusionspuffer erfordern. Die große Anzahl von genetisch veränderten Mausmodellen, die bereits verfügbar sind, macht auch die isolierte Arbeits Maus Herz sehr attraktiv die Funktion eines einzelnen Gens Produkt auf Herz-metabolischen und funktionellen Umbau zu studieren. Allerdings schließen die jüngsten technologischen Fortschritte in der Genombearbeitung und einem schnell wachsenden Katalog von transgenen und Knockout-Ratten rasch die Lücke zwischen den beiden Nagetieren. Darüber hinaus hat die Ratte lange als überlegenes Tiermodell gelobt Herz - Kreislauf- Erkrankungen zu untersuchen , weil seine Pathophysiologie eng menschlichen Bedingungen 37 nachahmt. Aus diesen Gründen glauben wir, dass die isolierte Arbeitsrattenherz noch einen wichtigen Platz in der modernen Ära der kardiovaskulären Forschung halten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 ml Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 ml HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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