Beredning av Oblique ryggmärgs skivor för ventrala Root Stimulering

1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi visar hur man förbereder sneda skivor av ryggmärgen hos unga möss. Denna beredning möjliggör för stimulering av de ventrala rötter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation. J. Vis. Exp. (116), e54525, doi:10.3791/54525 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektrofysiologiska inspelningar från ryggmärgsskivor har visat sig vara en värdefull teknik för att undersöka ett brett spektrum av frågor, från cellulär till nätverksegenskaper. Vi visar hur man förbereder livskraftiga sneda skivor av ryggmärgen av unga möss (P2 - P11). I denna beredning, de motoneuroner behålla sina axoner kommer ut från de ventrala rötter i ryggmärgen. Stimulering av dessa axoner framkallar back-förökningsaktionspotentialer invaderar motoneuron SOMAS och spännande det motoneuron säkerheter i ryggmärgen. Inspelning av antidromic aktionspotentialer är en omedelbar, definitiva och elegant sätt att karakterisera motoneuron identitet, som överträffar andra metoder för identifiering. Vidare stimulerar motoneuron säkerheter är ett enkelt och tillförlitligt sätt att excitera de kollaterala målen för motoneuroner i ryggmärgen, såsom andra motoneuroner eller Renshaw celler. I detta protokoll presenterar vi antidromic inspelningar från motoneuron SOMAS liksom Renshaw cell excitation följd av ventrala roten stimulering.

Introduction

Historiskt sett har motoneuron inspelningar med skarpa elektrod genomfördes in vivo på stora djur, såsom katter eller råttor 1 eller på en isolerad hela ryggmärgen hos möss 2. Framväxten av patch-clamp inspelning teknik under 1980-talet, som kallas för direkt tillgång till motoneuron SOMAS som tätning krävs uppnås under visuell vägledning. Sålunda har ryggmärgen slice förberedelse varit lätt uppnås sedan början av 1990-talet tre. Men tidigt skiva beredning ofta inte tillåta stimulering av ventrala rötter. Så vitt vi vet har endast två studier rapporterade framgångsrik stimulering av ventrala rötter i tvärgående skivor, och ingen erhölls från möss 4,5.

I den här artikeln presenterar vi en teknik för att uppnå livskraftiga ryggmärgs skivor neonatala möss (P2 - P11), i vilken motoneuron poolen behåller sina ventrala roten avgår axoner. Ventileraral rot stimulering utlöser antidromic aktionspotential tillbaka till SOMAS i motoneuron poolen ut från samma ventrala roten. Det exciterar också de motoneuron säkerheter mål, andra motoneurons 6-10 och Renshaw-celler 11-13. Eftersom endast motoneuroner skicka sina axoner ner ventrala rötter, använder vi inspelning av antidromic aktionspotentialer som en enkel och definitiv sätt att physiologicaly identifiera motoneuroner 10.

Förutom att använda potentiellt icke-inclusive eller vilseledande elektrofysiologiska och morfologiska criterions att bekräfta motoneuron identitet, nya studier på ryggmärgen motoneuroner åberopade även tråkiga och tidskrävande efterhand färgningar 16. Sådan identifiering utförs vanligtvis endast på ett urval av de inspelade celler. Andra strategier för identifiering förlitar sig på mus linjer där motoneuroner uttrycker endogena fluorescens 1,2,20,21. Under optimala förhållanden, kunde vi framkalla antidromic aktionspotentialer från praktiskt taget alla inspelade motorneuron.

Dessutom kan ventrala roten stimulering användas för att tillförlitligt excitera andra motoneuroner 22,23 eller deras mål. de Renshaw-celler 10,24,25. Vi presenterar här tillämpningar av den ventrala roten stimulering i form av antidromic aktions potentiella inspelningar från motoneuron SOMAS, samt excitering av Renshaw-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimenten har utförts i enlighet med EU-direktiv (86/609 / EEG och 2010-63-UE) och fransk lagstiftning, och godkändes av Paris Descartes University etisk kommitté den.

1. Ryggmärgs Slice Förberedelser

  1. Bered följande lösningar dagligen eller en dag i förväg. Om de hålls över natten, bubbla med 95% O2 och 5% CO2 och hålla i kylskåp i tätt förslutna flaskor.
    1. Förbereda Låg Na + artificiell cerebrospinalvätska (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mM sackaros, 26 mM NaHCOs 3, 0,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 25 mM glukos, 0,4 mM askorbinsyra, 1 mM Na-kynurenat, 2 mM Na-pyruvat. Bubbla med 95% O2 och 5% CO2 (pH 7,4). Eftersom Na-kynurenat är ofta svårt att lösa, se till att köpa en som anges i tabellen material.
    2. Förbered K-glukonat lösningartion: 130 mM K-glukonat, 15 mM KCl, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM glukos, 1 mM Na-kynurenat, 2 mM Na-pyruvat, justerades till pH 7,4 med KOH.
    3. Förbereda ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCOs 3, 25 mM glukos, 0,4 mM askorbinsyra, 2 mM Na-pyruvat. Bubbla med 95% O2 och 5% CO2 (pH 7,4).
    4. Före början av dissektion, lös 2% agar i 80 ml K-glukonat lösning, och hålla sig varm vid 60 ° C.
  2. intrakardiell perfusion
    1. Utför detta preparat på kvinnliga och manliga möss, i åldrarna från P2 till P11.
    2. Söva musen med en intraperitoneal injektion av 0,1 ml av 25 mM pentobarbitalnatrium (50 mg / kg).
    3. Att använda nålar eller tejp, immobilisera musen på rygg på en stor petriskål fylld med kisel. Använd en dissekera mikroskope för resten av dissekering.
    4. Håll spetsen av bröstbenet, lyft bröstet och skär membranet med fina sax. Öppna sedan bröstet på båda sidor genom att skära igenom revbenen för att exponera hjärtat.
    5. Skär höger förmak innan punktering vänster kammare med en 27G nål.
    6. BEGJUTA med iskall låg Na + ACSF. Efter 30 sek, bör låg Na + ACSF ses som strömmar ut ur atrium. Små mängder av natrium förhindra cellerna från spiking och minska celldöd under dissekering.
    7. Fortsätt att hålla nålen i hjärtat under dissektionsmikroskop tills levern blir gul när blodet tappas.
  3. Ryggmärgs dissektion
    1. Halshugga djuret och satte den på sin mage.
    2. Snabbt ta bort huden på ryggen (figur 1A1). Gör två skär genom axlarna och går ner på bröstet bur (Figur 1A2). Skär sedan sladden som low som möjligt i den kaudala avsnitt i syfte att isolera den vertebrala kolonnen med början av ribborna från den nedre delen av djuret. Vänd djuret igen och ta bort inälvorna fortfarande sitter revbenen.
    3. Överför ryggraden till en annan, mindre kisel fyllda petriskål och använda 4 insekt stift för att hålla det ryggsidan uppåt (Figur 1A).
    4. Kontinuerligt BEGJUTA djuret med karbogen-bubblade ACSF (vid ca 4 ° C) medan du utför en laminektomi av ryggsidan, och exponera ryggmärgen från rostralt ände (Figur 1B). För att göra detta, in spetsen av fina saxar mellan benet och ryggmärgen och skär benet småningom från rostralt slutet, och se till att hålla sig borta från den vita substansen. Omväxlande på vardera sidan medan du använder pincett för att hålla undan bandet av ben redan skär (Figur 1B1).
    5. Med hjälp av minsta tillgängliga våren sax och pincett, lyft dura och skärpå båda sidor medan du håller den lösa delen av dura för att undvika skador på ryggmärgen med saxen. Skär längs rostro-caudal axeln.
      OBS: dura är en semi transparent kontinuerlig membran; vid denna ålder pia mater är alltför skör och går sönder under dissekering och skivning (figur 1B2).
    6. När dura avlägsnas användning en trubbig glas eller plast tips till försiktigt trycka sladden på den vänstra sidan av spåret som bildas av den halv-cut ryggraden, och skär ventrala och dorsala rötter på höger sida, med början från den rostral sida , längst bort från där de kommer in i sladden (några mm åtminstone figur 1B2).
    7. Upprepa på vänster sida, alltid kommer från rostralt till stjärtfenan. Om vänsterhänt, börja från vänster sida och sedan flytta till höger.
  4. Ingjutning i agar
    1. Glida sladden ur ryggraden. Använd en mindre insekt stift till stift nersladden med ryggsidan uppåt och fint avlägsna ett stycke membran fortfarande fäst vid den (Figur 1C1).
    2. När rengöras, trimma båda ändar (Figur 1C2). Sätt en böjd insekt stift i den främre delen av linan för att manipulera sladden och notera dess orientering (pilen i figur 1C2). Sedan överföra ryggmärgen till en iskall K-glukonat lösning.
      OBS: Denna lösning efterliknar den intracellulära sammansättning GSR och kommer att hindra cellerna från att dö av osmotisk chock när motoneuroner kommer att minska 26.
    3. När ryggmärgen är inom det intra-cellulära lösningen, ta ur bägaren med agar ut ur den torra bad och kyla ner den på en blandning av is och vatten.
    4. Håll omrörning medan mätning av temperaturen. När temperaturen når 38 ° C fördjupa ryggmärgen, håller den insekten stift och placera den rostrala sidan nedåt. Se till att ryggmärgen är som straight som möjligt, bort från väggarna, caudal del något uppåt (figur 1D1).
    5. Lämnar bägaren i blandning av is och vatten för att göra det möjligt för agar stelna så snabbt som möjligt. Se till att den sitter på plats och att sladden är så rak som möjligt (Figur 1D1).
  5. skiv~~POS=TRUNC
    1. Efter stelning, skär agar blocket innehåller ryggmärgen på ett sådant sätt att basen av blocket befinner sig vid en 35 ° vinkel med den lumbala delen av sladden (pilen i figur 1D2). Ryggens yta ska vara vänd bort från basen (Figur 1D2).
      OBS: Detta är ett kritiskt steg i förfarandet för att bibehålla kontinuiteten i motoneuron pooler att de ventrala rötter som de kommer ut.
    2. Limma blocket in i kammaren av vibratome med hjälp av cyanoakrylatlim. Doppa den i K-glukonat lösning och tillsätt uppslagna fryst K-glukonat lösning för att upprätthållabadet kylda (under 2 ° C).
    3. Skär 350 - 400 pm tjocka skivor av ländryggen (identifierbara genom sin krökning och större diameter). I dess rätta orientering (se 1.4.1.), Använd kniven för att skära från rygg till ventrala ytan och göra skivor kontinuerligt mer rostral. Vanligtvis finns det 4-5 lämpliga skivor med ventrala rötter som sträcker sig 2 mm eller mer. Använd följande parametrar: 10 ° vinkel, 70 Hz Vibrations frekvens och 10 mm / min hastighet av skiv.
  6. Inkubation
    1. Överföra skivorna till ACSF vid 34 ° C. Efter ca 30 min, kyla skivorna ned till RT och påbörja inspelningen.

Figur 1
Figur 1. Dissektion
A1:. Borttagning av huden på ryggen för att exponera rygg kolumnen A2:Kapning av axlarna och revben för att frigöra rygg kolumnen B1. Ryggrad nålas på kisel fyllda petriskål (ryggsidan uppåt, svans sida till vänster) B2. Samma med ryggmärgen exponeras och dissekeras C1. Ryggmärgs isolerade . (rostralt sidan till vänster) C2: Ryggmärgen redo att bäddas (ventrala sida upp, rostralt sidan till vänster). Notera mindre insekt stift på rostralt sidan D1.. Ryggmärgs i agar bägaren (rostralt sidan dow, ventrala sida som vetter mot botten) D2: Klippt agar blocket med den inbäddade ryggmärgen. Notera 35 ° vinkel ryggmärgen former med basen av blocket och utvidgningen ländryggen (pil). Skala barer 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Placera skiva i kammaren

OBS: Ventral rötter är av varierande storlek.

  1. Förbered en låda med olika pipetter med spets diametrar 40-170 pm i förväg. För att förbereda sug pipetter, förbereda många pipetter med en lång kona. Med hjälp av en diamant kniv, gör ett snitt vid olika positioner. Sedan under ett dissektionsmikroskop, bryta det genom att trycka spetsen med pincett.
  2. Ta bort kammaren från inspelningen mikroskop och placera den under ett dissektionsmikroskop.
  3. Välj ett segment som innehåller en ventral roten av tillräcklig längd (2 mm eller mer) för att monteras på en suganstimuleringselektrod. Välj rätt orientering av skivan med ventrala rötterna uppåt (figur 2A) och fint skära agar runt ventrala rötter medan resten av agar runt slice (Figur 2B).
    OBS! Eftersom ägarn är fastare än den skiva, kommer detta att göra det möjligt för gängorna på slice ankare för att vila på ägarn snarare än på skiva och därmed ennchor skadar inte vävnaden. Se till att gängorna på skiva ankare är ovanför motoneuron pool (visas i rött i figur 2C).
  4. Montera kammaren tillbaka på mikroskop och kontinuerligt BEGJUTA inspelningen kammaren med ACSF med en hastighet av 1 - 2 ml / min, vid RT. Med hjälp av en glaspipett fylld med ACSF och ansluten till en spruta, suga en av den ventrala roten (pilen i figur 2C). För att uppnå god stimulering av den ventrala roten, måste pipettspetsen för att vara tätt runt den ventrala roten. En pol bör vara i den stimulerande elektroden och den andra en i badet (eller ansluten till patch-klämelektrod referens).
  5. Uppnå patch-clamp inspelning av den önskade celltypen och registrera effekten av den ventrala roten stimulering såsom beskrivs previsouly 10.
    1. Här använder en förstärkare för datainsamling. Filter helcells-inspelningar på 3 kHz. Digitalisera på 10 kHz. Kompensera bryggmotstånd i Current-klämläge.

figur 2
Figur 2. Ventral Root Förberedelse
A: Lumbar ryggmärg skiva inbäddad i agar med den ventrala roten uppåt B:. Lumbar ryggmärg skiva med ventrala rötter som frigjorts från agar C. Lumbar ryggmärg skiva med en stimulerande elektrod tätt placerade runt ventrala rötter (pil) . Notera placeringen av Renshaw celler som uttrycker röd fluorescens i chrna2-Cre mus 28 korsas med musen reportern R26 Tom 17. Skalstrecken en mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bekräftelse av motoneuron identitet med hjälp av Antidromic aktionspotentialer

cellinriktning

Motoneuroner finns i det ventrala hornet (synligt i rött i figur 2C). Utgå från bunten av axoner som bildar den ventrala roten och gå fram bunten sprider helt och man börjar se stora celler (lång soma axel, över 20 pm). Uppnå helcells-inspelning av en rund friska letar cell med användning av en elektrod av initialt motstånd av 3-4 MQ. Den inre lösningen som användes innehöll: 140 mM K-glukonat, 6 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na 2 GTP. Justera pH till 7,3 med KOH, och osmolariteten till 285-295 mOsm genom tillsats av destillerat vatten.

När helcells-inspelning uppnås, tillämpa en enda tvåfasig stimulering av den ventrala roten (1-50 V, 0,1-0,3 ms) för att framkalla en antidromic aktionspotential i de inspelade celler i den ventrala sladd Figurerna 3A1 och 3A2 visar antidromic åtgärder. potentialer i spänning-klämma eller strömklämma, respektive. Vid ökning av stimuleringsintensiteten 1-5 V (figur 3A1) och från 10 till 15 V (figur 3A2) den antidromic aktionspotentialen visas i en allt-eller-inget sätt med en fördröjning på 0,9 ms och 1,1 ms, respektive. Med tanke på att endast motoneuroner skicka sina axoner genom ventrala rötter, är det antidromic aktionspotentialen ett bevis på cellidentiteten.

I en minoritet av motoneuroner (ca 10%), misslyckades ventrala roten stimulering för attframkalla antidromic aktionspotential utan framkallade orthodromic aktionspotentialer. Figurerna 3B1 och 3B2 visar orthodromic aktionspotentialer i spänning-klämma eller strömklämma, respektive. Vid ökning av stimuleringen från 20 till 30 V (figur 3B1) och från 25 till 40 V (figur 3B2), visas en aktionspotential, efter en tidigare excitatorisk postsynaptisk ström (epsc) eller excitatorisk postsynaptisk potential (EPSP). De latenser av aktionspotentialer är längre (5,1 ms och 5,3 ms, respektive). I dessa två celler, stimulera ventrala roten framkallade en frammatnings excitation (motoneuroner skicka axon säkerheter för sig själva och andra motoneuroner) som var tillräckligt stark för att framkalla en orthodromic aktionspotential. I sådana celler, underlåtenheten att framkalla en antidromic aktionspotential (kännetecknas av sin allt-eller-inget sätt och en fördröjning kortare än 5 ms) inte tillåter oss att dra slutsatsen att dessa celler ar e motoneuroner. Notera att den erforderliga stimuleringsintensiteten att framkalla feed-forward excitation är högre än den som behövs för att framkalla ett antidromic aktionspotential. Alla stimuleringar som visas här är 0,1 ms men ibland längre stimulering (upp till 0,3 ms) kan krävas för att framkalla en antidromic aktionspotential.

Figur 3
Figur 3. motoneuron Svaren till Ventral Root Stimulering
A1: 1 V (röd spår) och 5 V (svart spår) stimuli A2.. 10 V (röd spår) och 15 V (svart spår) stimuli B1: 20 V (röd spår) och 30 V (svart spår) stimuli . B2: 25 V (röd spår) och 40 V (svart spår) stimuli. Svarta punkter anger stimulans timing. Dubbla pilspetsar betona skillnaden i latenser mellan orto- och antidromic spikar.m / filer / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Renshaw Cell Stimulering

cellinriktning

Renshaw celler finns i det ventrala hornet 27,28. Visualisera axon buntar med differential interferens kontrast (DIC) avbildning med en 20X och en 63x mål. Utgå från bunten av axoner som bildar den ventrala roten och gå fram till axoner börjar skingra men är fortfarande urskiljbara (Figur 4A, pilar). Sikta på cellerna av medelstorlek (ca 10 till 15 pm i diameter, figur 4A, pilspetsar). Uppnå helcells-inspelning av en rund fräschare cell med användning av en elektrod av initialt motstånd av 5-7 MQ. Beroende på försöket använde vi eiTher Cs + -baserad eller K + -baserade interna lösningar 10. Cs-baserad lösning förhindrade stora kaliumströmmar som var synliga runt -45 mV. I vissa experiment har vi lagt även 5 mM QX-314 att blockera natriumkanaler som ansvarar för tillsatta i den inspelade cellen. Cs + -baserad lösning innehåller: 125 mM Cs-glukonat, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP och 0,4 mM Na-GTP, varvid pH-värdet justerades till 7,3 med CsOH. K + baserad lösning bör användas för att analysera både spännings- och strömklämma, de Renshaw-cellsvar till ventrala roten stimulering under förhållanden som närmar så mycket som möjligt fysiologiska sådana. Denna lösning innehåller: 125 mM K-glukonat, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0,4 mM Na-GTP, med pH justerat till 7,3 med KOH. Stimulusintensitet varierade mellan 10 och 100 V och dess varaktighet varierade mellan 50 och 300 ps. Bipo nande pulser användes i samtliga fall.

Svar av Renshaw celler till ventrala roten stimulering

Stimulering av den ventrala roten utlöser corelease av glutamat och acetylkolin från motoneuron säkerheter på Renshaw celler 10. Feed-forward inhibition förmedlad av GABA och glycin också rekryterat Figur 4B 10. Visar svar på en enda stimulering av den ventrala roten. Cellen registrerades i en spännings-clamp-läge med cesium-baserad lösning, och hölls vid en spänning av -45 mV. QX-314 i den intracellulära lösningen hindrade cell från bränning och GABA och glycin svar blockerades med 3 | iM gabazine och en iM stryknin, respektive. Den inåtriktade synaptisk ström i Figur 4B är summan av den glutamaterga och nikotin strömmar.

nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 4
Figur 4. Renshaw Cell stimulering från Ventral Root
A: Bilder av Renshaw cellpoolen förvärvats med hjälp en sned kondensor på samma skiva tas vid två olika förstoringar (20X och 40X mål). Notera motoneuron axoner samgående i den ventrala roten (pil). Förmodade Renshaw celler indikeras med pilar. Skala barer: 100 nm i A1, 50 pm i A2 B:. Spänning-clamp inspelningar av en Renshaw cell efter stimulering av den ventrala roten (svart prick). Den röda kurvan är medelvärdet av de grå. Håller spänningen var satt till -45 mV. QX-314 i den intracellulära lösningen hindrade cell från bränning och GABA och glycin svar blockerades med 3 | iM gabazine och en iM stryknin, respektive. Svart prick indikerar stimulans timing.com / filer / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sned skivning av ryggmärgen är viktigt eftersom det gör det möjligt för ensidig stimulering av motoneuron pooler och Renshaw celler vid en enda vertebral segment på ett tillförlitligt, heltäckande och specifikt sätt. Dessutom gör det möjligt för en snabb, elegant och icke-tvetydig identifiering av inspelade motoneuroner. Därefter kommer vi att lyfta fram fördelarna med denna teknik jämfört med andra metoder skiva beredning, och då kommer vi att betona de vanligaste fallgropar att undvika när de utför denna procedur.

De flesta studier med tvärgående skivor baserar sin identifiering på inneboende elektriska egenskaper 3,14,15,29. Men dessa varierar kraftigt mellan motoneuron pooler samt mellan motoneuron subtyper inom en viss pool (alfa-, beta- och gamma-motoneuroner 30). Därför studier med storleksparametrar sannolikt att utesluta mindre gamma-motoneuroner. Å andra sidan, Cooper och Sherrington dbeskrivningen i 1940 en grupp av stora nervceller i ventro-laterala grå substansen i ländryggen ryggmärgen hos apor och katter som hade korsat stigande axoner 31,32. Förutom att vara nära motoneuron SOMAS, noterade de att de verkade histologiskt omöjlig att skilja från motoneuroner. En artikel nyligen bekräftade förekomsten av sådana celler i musen 33. På grund av den stora storleken på dessa celler och deras placering, de kunde ha varit av misstag i tidigare studier. Vår identifieringskriterium utesluter förmodade spinal gränsceller, eftersom deras axon inte skjuter i den ventrala roten, samtidigt som tillförlitlig identifiering av alla motoneuroner oavsett storlek. Vidare analys av de inneboende elektriska egenskaperna, (t.ex., ingångsmotstånd), är mer tidskrävande än den enkla observationen av en antidromic aktionspotential.

Förutom att använda inneboende elektriska egenskaper, en del studies användning av tvärgående skivor, bekräfta att identifiera genom att utföra post hoc-analys av den molekylära markör för motoneuroner (såsom Islet-1/2 16) eller genom att visualisera morfologi med hjälp av biocytin labelings 14,17. Sådana identifieringar är dock omständlig och ger inte en direkt identifiering. De är därför utförs sällan systematiskt.

Vissa studier har försökt att använda sig av musen som uttrycker en genetiskt kodad motoneuron fluorescerande markör (Hb9-GFP mus linje 18, chatt-EGFP transgena möss, som uttrycker EGFP i kolinerga celler inklusive motoneuroner 19 eller G85R SOD1-YFP transgena möss, som starkt uttrycka YFP fusionsprotein i motoneuroner 17). Emellertid, därför att den genetiska markören uttrycket vanligen rade i tid och eftersom skivorna tas vanligen från embryon eller unga exemplar kan expressionen av markören vara olämpliga vid en ålder av study utförs. Andra studier har använt retrograd agent injektion för att visualisera motoneuron pool 34. Vi gjorde också koleratoxin beta injektioner i soleus eller EDL (personlig observation). Sådana märkningstekniker är av stort värde för att märka en viss motoneuron pool men kräver tråkiga operation några dagar före försöket. Dessutom ung ålder vid vilken skiva experiment görs, gör det betydligt svårare att specifikt rikta musklerna. Slutligen finns det en verklig oro för att störa motoneuron genom att injicera en exogen agent.

Under optimala förhållanden vi kunde få antidromic aktionspotentialer i praktiskt taget alla inspelade motorneuron. 35 ° vinkel som används är avgörande för att få ventrala rötter tillräcklig längd. Sammanfattningsvis erbjuder den sneda skiva beredning ett snabbt och tillförlitligt sätt att identifiera varje motoneuron, som är överlägsen andra metoder för identifiering.

Som nämnts i inledningen, rapporterade endast två studier framgångsrik stimulering av ventrala rötter i tvär skivor. Den första studien registreras livmoderhalscancer neuroner i råtta och stimulerade den vita substansen där den ventrala roten stubben framträder fyra. De inducerade framgångsrikt antidromic aktionspotential i 85% av de inspelade nervceller. Vi tror att deras goda resultat förlitat sig på det faktum att hals nivå, axonerna och SOMAS av motoneuroner är på samma plan. Detta är inte fallet i mer caudal skivor. Även på cervikal nivå, bara deras tvär skivor behöll stubbar av ventrala rötter, som är mindre tillförlitliga för att stimulera. Den andra studien stimulerade kycklingembryo kotlettrad segmentet 5. Emellertid använde de spänningskänsligt färgämne upptagningen, som saknade den rumsliga upplösningen för att indikera framgång för att inducera en antidromic aktionspotentialer vid den enda cellnivå.

Vår bit Förberedelsejon erbjuder också ett överlägset sätt att stimulera Renshaw celler som anges i en nyligen papper 28. Med hjälp av sneda skivor, kunde de spela monosynaptic Renshaw celler svar i 46% av fallen, vilket var en stor förbättring från framgång 10% stött med hjälp av tvärgående skivor 35. Även om vi inte kunde hitta en liknande jämförelse för stimulering av motoneuron pooler, denna observation i Renshaw cell leder oss att tro att motoneuroner behålla även fler anslutningsmöjligheter.

Sned skivning av ryggmärgen är en mycket krävande teknik som kräver mycket övning innan tillförlitligt erhålla en beredning från vilken man kan spela in. Använda mycket fina och skarpa pincett och mikro-sax är viktigt. Tiden dissekera kan vara ganska lång (upp till en timme) så länge som hela proceduren sker i kyld carbogen-bubblade dissektion medium. Medan vissa författare inte erkänner någon fördel av intrakardiell perfusion vid framställning av skivor 36, bestämde vi oss för att behålla detta steg av förfarandet. Det är svårt att objektivt mäta nyttan av intrakardiell perfusion för kvaliteten på inspelningarna, särskilt eftersom det varierar med åldern.

Den mest kritiska faktorn är musen ålder. Vi framgångsrikt spelats in från möss mellan P2 och P11 med hjälp av ovanstående protokoll. Förbi denna ålder, blir ryggmärgen myelin alltför tät och de största cellerna (de motoneuroner) dör före skivning, troligtvis på grund av syrebrist. Efter det fönstret, fann vi det allt svårare att få friska skivor. På senare tid har nya tekniker har rapporterats att få friska skivor i äldre djur 17,36. De använde extra tillsatser till deras dissekera och inspelningsmedium såsom kompletterande energikällor (etyl-pyruvat), lägre Na + och Cl - koncentrationer för att förhindra oncosis av cellerna 37,38 och polyetylenglykol för att begränsa effjekt av de omfattande membran transections som uppstår under skivning. Med sådana förbättringar, kunde de spela in från upp till sex månader gamla djur.

I framtiden skulle det vara intressant att försöka sneda skiva förberedelser hos vuxna djur att kombinera fördelarna med de två teknikerna. Genom att kombinera de två protokollen skulle visa sig relativt lätt och ger ett pålitligt verktyg för att bekräfta motoneuron identitet och studera befolkningen måltavla axon säkerheter av motoneuroner hos vuxna möss. Dessutom kan man försöka få sneda skivor i embryot musen. Anmärkningsvärt, våra förberedelser behåller också de dorsala rötter, som kan stimuleras att studera aktiveringen monosynaptic jag en innervation till motoneuroner, liksom aktiveringen av dorsala ryggmärgsneuronpopulationer. Sammanfattningsvis, ventrala roten stimuleringar erbjuder ett pålitligt verktyg för att bekräfta motoneuron identitet och för att studera befolkningen måltavla motoneuron Axon säkerheter. </ P>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Författarna tackar Marin Manuel och Olivia Goldman-Szwajkajzer för deras hjälp att ta fotografier. Författarna tackar också Arjun Masukar och Tobias Bock för korrekturläsning manuskriptet. Finansiellt stöd tillhandahölls av Agence Nationale pour la Recherche (hyper MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), NIH-NINDS (R01NS077863), den Thierry Latran Foundation (OHEX Project), den franska föreningen för myopati ( licensnummer 16026) och Target ALS är tacksamma. Felix Leroy var mottagare av ett "Contrat Doctoral" från Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na-kynurenate ABCAM ab120256 dissolves better then other brands
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma P5655
sucrose  Sigma S9378
NaHCO3  Sigma S6014
CaCl2  G Biosciences R040
MgCl2  Quality Biological 351-033-721
glucose  Sigma G5767
ascorbic acid  Sigma A5960
Na-pyruvate  Sigma P2250
K-gluconate  Sigma P1847
EGTA  Sigma E3889
HEPES  Sigma H4034
NaCl Sigma S9888
Agar Sigma A9799
QX-314 Alomone Q150
Mg-ATP Sigma A9187
CsOH Sigma 232041
Na-GTP Sigma 51120
gluconic acid Sigma G1951
Cesium hydroxide solution Sigma 232041
KOH Sigma P5958
Vannas Spring Scissors - 2.5mm  FST 15000-08 only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones
Stimulator A-M Systems Isolated Pulse Stimulator Model 2100
Vibratome Campden Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13, (1), 9-38 (1950).
  2. Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25, (2), 451-459 (2007).
  3. Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
  4. Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112, (2), 185-191 (2001).
  5. Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2, (5), e417 (2007).
  6. Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308, (1), 196-199 (1984).
  7. Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132, (1), 1-10 (1977).
  8. Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272, (3), 755-767 (1977).
  9. Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31, (3), 179-187 (1998).
  10. Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28, (52), 14121-14131 (2008).
  11. Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
  12. Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5, (1 Pt 2), 86 (1946).
  13. Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
  14. Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102, (6), 3627-3642 (2009).
  15. Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589, (Pt 9), 2245-2260 (2011).
  16. Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
  17. Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (47), 16883-16888 (2014).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, (3), 385-397 (2002).
  19. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27, (3), 391-397 (2006).
  20. Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29, (36), 11246-11256 (2009).
  21. Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112, (9), 2302-2315 (2014).
  22. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
  23. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114, (3), 1963-1973 (2015).
  24. Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86, (8), 1114-1121 (2013).
  25. Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32, (24), 8413-8423 (2012).
  26. Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25, (28), 6490-6498 (2005).
  27. Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26, (51), 13297-13310 (2006).
  28. Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41, (7), 889-900 (2015).
  29. Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79, (5), 2485-2502 (1998).
  30. Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53, (5), 1323-1344 (1985).
  31. Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
  32. Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26, (3-4), 371-396 (1951).
  33. Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220, (5), 2997-3009 (2015).
  34. Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549, (Pt 1), 21-36 (2003).
  35. Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87, (6), 3117-3125 (2002).
  36. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107, (2), 728-741 (2012).
  37. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5, (6), 1483-1489 (1985).
  38. Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65, (1), 65-71 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics