के पीएच निर्भर गतिविधि का पता लगाने
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

इस अध्ययन अम्लीय पीएच की शर्तों के तहत कोलाई HdeB की निगरानी गतिविधि को चिह्नित करने के लिए, biophysical जैव रासायनिक और आणविक तकनीक का वर्णन है। इन विधियों सफलतापूर्वक ऐसी HdeA के रूप में अन्य एसिड सुरक्षात्मक chaperones के लिए लागू किया गया है और अन्य chaperones और तनाव की स्थिति के लिए काम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Cite this Article

Copy Citation

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

जीवाणु अक्सर इस तरह के पीएच में परिवर्तन, तापमान, redox स्थिति, प्रकाश जोखिम या यांत्रिक शक्ति के रूप में पर्यावरण परिवर्तन, के संपर्क में हैं। इन स्थितियों के कई प्रोटीन कोशिका में खुलासा कारण और जीव के अस्तित्व पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है। असंबंधित, तनाव-विशिष्ट आणविक chaperones के एक समूह ने इन तनाव की स्थिति के अस्तित्व में आवश्यक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। पूरी तरह से मुड़ा और निगरानी-निष्क्रिय तनाव से पहले, ये प्रोटीन तेजी से प्रकट करना और विशिष्ट तनाव की स्थिति के तहत निगरानी सक्रिय हो जाते हैं। एक बार सक्रिय, इन सशर्त अव्यवस्थित chaperones अलग एकत्रीकरण की आशंका वाले प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के लिए बाध्य है, उनके एकत्रीकरण को रोकने और या तो सीधे या परोक्ष रूप से गैर-तनाव की स्थिति में लौटने पर refolding प्रोटीन की सुविधा। उनकी सक्रियता और ग्राहक मान्यता के तंत्र के बारे में अधिक विस्तृत समझ पाने के लिए प्राथमिक दृष्टिकोण शुद्धि और subsequen शामिलइन विट्रो निगरानी assays में उपयोग करते हुए प्रोटीन की टी विशेषता। विवो तनाव assays में अनुवर्ती स्वतंत्र रूप से इन विट्रो परिणामों में प्राप्त की पुष्टि करने के लिए जरूरी हैं।

इस प्रोटोकॉल इन विट्रो और इन विवो तरीकों में वर्णन की निगरानी गतिविधि को चिह्नित करने के लिए कोलाई HdeB, एक एसिड सक्रिय निगरानी। प्रकाश बिखरने माप इन विट्रो में, एक की स्थापना मॉडल ग्राहक प्रोटीन, MDH की एसिड प्रेरित एकत्रीकरण को रोकने के लिए HdeB की क्षमता के लिए एक सुविधाजनक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में इस्तेमाल किया गया। विश्लेषणात्मक ultracentrifugation प्रयोगों HdeB और उसके ग्राहक प्रोटीन LDH के बीच जटिल गठन प्रकट करने के लिए, गैर तनाव की स्थिति के लिए उनकी वापसी पर ग्राहक प्रोटीन के भाग्य में प्रकाश डाला करने के लिए लागू किया गया। ग्राहक प्रोटीन के enzymatic गतिविधि assays पीएच प्रेरित ग्राहक निष्क्रियता और पुनर्सक्रियन पर HdeB के प्रभाव पर नजर रखने के लिए आयोजित की गई। अंत में, अस्तित्व के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया monitoविवो में HdeB की निगरानी समारोह के प्रभाव आर।

Introduction

एक आम प्राकृतिक वातावरण में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों एसिड प्रेरित प्रोटीन खुलासा परिस्थितियों का अनुभव स्तनधारी पेट (पीएच रेंज 1-4), जिसका पीएच अम्लीय खाद्य जनित रोगजनकों 1 के खिलाफ एक प्रभावी बाधा के रूप में कार्य करता है। प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण, जो एमिनो एसिड पक्ष श्रृंखला protonation के कारण होता है, जैविक प्रक्रियाओं, नुकसान सेलुलर संरचनाओं को प्रभावित करता है और अंत में कोशिका मृत्यु 1,2 कारण बनता है। चूंकि जीवाणु periplasm का पीएच झरझरा बाहरी झिल्ली के माध्यम से प्रोटॉन की मुक्त प्रसार के कारण पर्यावरण पीएच के साथ लगभग तुरंत equilibrates, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की periplasmic और भीतर की झिल्ली प्रोटीन एसिड तनाव की स्थिति 3 के तहत सबसे कमजोर सेलुलर घटक हैं। तेजी से एसिड की मध्यस्थता क्षति के खिलाफ उनकी periplasmic proteome की रक्षा करने के लिए, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया एसिड सक्रिय periplasmic chaperones HdeA और HdeB का उपयोग। HdeA एक सशर्त बेक़ायदा निगरानी है 6.7 सक्रिय है। HdeA के एक्टिवेशन monomers में अपनी हदबंदी सहित गहरा संरचनात्मक परिवर्तन, और आंशिक monomers 6-8 का खुलासा आवश्यकता है। एक बार सक्रिय, HdeA प्रोटीन है कि अम्लीय परिस्थितियों में प्रकट करने के लिए बांधता है। इसे प्रभावी ढंग से दोनों कम पीएच पर ऊष्मायन के दौरान के रूप में अच्छी तरह से पीएच निराकरण पर उनके एकत्रीकरण रोकता है। पीएच 7.0 में लौटने पर, HdeA एक एटीपी स्वतंत्र ढंग से अपने ग्राहक प्रोटीन की refolding की सुविधा और इसकी dimeric, निगरानी-निष्क्रिय रचना 9 में वापस धर्मान्तरित। इसी तरह, मुताबिक़ निगरानी HdeB भी निगरानी-निष्क्रिय पीएच 7.0 पर है। HdeA विपरीत, तथापि, HdeB की निगरानी गतिविधि इसकी स्पष्ट अधिकतम पीएच 4.0 पर, जिन स्थितियों HdeB अभी भी काफी हद मुड़ा और dimeric 10 तक पहुँचता है। इसके अलावा, आगे पीएच caus घटानेतों HdeB की निष्क्रियता। इन परिणामों का सुझाव है कि उनके व्यापक अनुरूपता के बावजूद, HdeA और HdeB कार्यात्मक सक्रियण उन्हें उनकी सुरक्षा निगरानी समारोह के साथ एक व्यापक पीएच रेंज को कवर करने के लिए अनुमति के अपने मोड में मतभेद है। एक अन्य निगरानी कि का एसिड प्रतिरोध में फंसाया गया है कोलाई cytoplasmic Hsp31, जो सामने आया ग्राहक प्रोटीन स्थिर करने के लिए जब तक तटस्थ की स्थिति बहाल कर रहे हैं प्रकट होता है। Hsp31 की कार्रवाई की सटीक विधा है, हालांकि, रहस्यपूर्ण 12 रह गया है। यह देखते हुए कि इस तरह के साल्मोनेला बैक्टीरिया के रूप में अन्य enteropathogenic hdeAB operon की कमी है, यह बहुत संभावना है कि अन्य अभी तक अज्ञात periplasmic chaperones मौजूद हो सकता है कि इन जीवाणुओं 11 की एसिड प्रतिरोध में शामिल हो रहा है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन विट्रो और इन विवो 10 में HdeB का पीएच निर्भर निगरानी गतिविधि पर नजर रखने के लिए अनुमति देते हैं और अन्य chaperones जांच करने के लिए लागू किया जा सकताHsp31 के रूप में इस तरह के। वैकल्पिक रूप से, प्रतिलेखन कारक है कि hdeAB की अभिव्यक्ति को नियंत्रित के जटिल नेटवर्क संभवतः इन विवो तनाव परख द्वारा जांच की जा सकती है। विवो में प्रोटीन की निगरानी समारोह को चिह्नित करने के लिए, विभिन्न प्रयोगात्मक setups के लिए लागू किया जा सकता है। एक मार्ग प्रोटीन खुलासा तनाव की स्थिति लागू करने के लिए और phenotypically उत्परिवर्ती उपभेदों है कि या तो ब्याज की जीन overexpress या जीन की एक विलोपन ले जाने के लिए चिह्नित है। प्रोटिओमिक पढ़ाई के तनाव की स्थिति के तहत कुल जो प्रोटीन की पहचान करने के लिए नहीं रह गया है जब निगरानी मौजूद है आयोजित किया जा सकता है, या एक विशेष एंजाइम पर एक निगरानी के प्रभाव तनाव की स्थिति एंजाइमी assays 14-16 उपयोग करने के दौरान निर्धारित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम एक rpoH विलोपन तनाव है, जो गर्मी के झटके सिग्मा कारक 32. RpoH सभी प्रमुख की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता अभाव में HdeB overexpress करने के लिए चुना कोलाई chaperones और उसके विलोपन Sens बढ़ाने के लिए जाना जाता हैपर्यावरण के तनाव की स्थिति का कारण है कि प्रोटीन खुलासा करने के लिए 15 itivity। HdeB के vivo निगरानी गतिविधि Δ rpoH तनाव का पीएच संवेदनशीलता को दबाने के लिए अपनी क्षमता की निगरानी के द्वारा निर्धारित किया गया था। कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक तेजी से और सीधा विट्रो में और साथ ही इन विवो संदर्भ में एक एसिड सक्रिय निगरानी की गतिविधि को चिह्नित करने के लिए दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. अभिव्यक्ति और periplasmic HdeB की शुद्धि

नोट: HdeB में व्यक्त की गई थी कोलाई कोशिकाओं polymyxin सेल पर periplasm से प्लाज्मिड pTrc- hdeB 10, और शुद्ध शरण।

  1. की एक रात संस्कृति तैयार कोलाई कोशिकाओं 30 मिलीलीटर लेग में प्लाज्मिड pTrc- hdeB 10 को शरण 200 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन (पौंड एम्प) युक्त। पौंड एएमपी के चार 1 एल संस्कृतियों टीका लगाना और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने और 200 आरपीएम तक 0.7 के आयुध डिपो 600nm तक पहुँच जाता है। फिर, HdeB की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित और 30 डिग्री सेल्सियस के विकास तापमान कम करने के लिए 300 माइक्रोन IPTG जोड़ें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन अभिव्यक्ति की 5 घंटे के बाद, कोशिकाओं centrifugation द्वारा 8000 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फसल।
  3. 100 के साथ सेल गोली धो लें मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8000 XG पर कोशिकाओं को फिर से एक (50 मिमी Tris / एचसीएल, 50 मिमी NaCl, पीएच 7.5) और सेंट्रीफ्यूज बफर।
  4. बाद में, resuspend80 में सेल गोली मिलीलीटर एक बफर, 1 मिलीग्राम / एमएल polymyxin सल्फेट युक्त। बाहरी झिल्ली के कुशल विघटन के लिए, धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए निलंबन हलचल।
  5. cytoplasmic अंश और सेल मलबे को हटाने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 XG पर 20 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र। इस में ~ 60 मिलीलीटर घुलनशील HdeB युक्त सतह पर तैरनेवाला परिणाम है।
  6. बफर बी (20 मिमी Tris / एचसीएल, 0.5 मिमी EDTA, 8.0 पीएच) 6 केडीए मेगावाट के साथ एक डायलिसिस झिल्ली का उपयोग करने का 150x मात्रा के खिलाफ रात भर periplasmic निकालने युक्त सतह पर तैरनेवाला Dialyze कट ऑफ। 3 केडीए के एक आणविक वजन कट ऑफ के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग कर 15 मिलीलीटर के लिए प्रोटीन ध्यान लगाओ। प्रोटीन समाधान के लिए एक 0.2 माइक्रोन ताकना फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर।
  7. एक आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी स्तंभ (स्तंभ मात्रा 5 एमएल) कि 2.5 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर के साथ 5 स्तंभ की मात्रा बफर बी के साथ equilibrated कर दिया गया है पर प्रोटीन को लागू करें। एक बार प्रोटीन स्तंभ पर लोड किया जाता है, पर 10 मिनट के लिए बफर बी के साथ स्तंभ धो लें2.5 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर। एक रेखीय 2.5 मिलीग्राम / मिनट 6 के प्रवाह की दर के साथ 50 मिनट की एक समय अवधि में बफर बी में 0.5 एम NaCl से 0 से ढाल के साथ Elute HdeB।
  8. एक 15% एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर HdeB युक्त भिन्न पहचानें। 5 μl 5x कम हो एसडीएस लोड हो रहा है बफर के साथ 20 μl नमूना मिक्स। लोड जेल पर 10 μl और Tris ग्लाइसिन बफर (14.4 ग्राम / एल ग्लाइसिन, 2.9 जी / एल Tris, 1 ग्राम / एल सोडियम dodecyl सल्फेट, पीएच 8.3) में चलाते हैं। 150 वी पर जेल चला जब तक bromophenol बैंड जेल (~ 45 मिनट) के नीचे के करीब चले गए है।
  9. पूल सभी HdeB युक्त भिन्न, 4 एल HdeB भंडारण बफर के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर dialyze (50 मिमी Tris / एचसीएल, 200 मिमी NaCl, पीएच 8.0), और एक आणविक वजन के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग लगभग 300 माइक्रोन के लिए प्रोटीन ध्यान कट ऑफ 3 केडीए की। 280 एनएम पर HdeB की एकाग्रता का निर्धारण विलुप्त होने के गुणांक ε 280nm = 15595 मीटर का उपयोग -1 -1 सेमी। 100 μl aliquots और फ्लैश मुक्त तैयारतरल नाइट्रोजन में aliquots ज़ी।
    नोट: HdeB कम से कम 6 महीने के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. निगरानी गतिविधि परख Thermally Malate डिहाइड्रोजनेज खुलासा का उपयोग करना (MDH)

नोट: thermally अलग पीएच मान पर सुअर का mitochondrial Malate डिहाइड्रोजनेज (MDH) खुलासा के एकत्रीकरण पर शुद्ध HdeB के प्रभाव के रूप में नीचे वर्णित नजर रखी थी। सभी सूचीबद्ध प्रोटीन सांद्रता मोनोमर एकाग्रता को देखें।

  1. MDH तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर MDH dialyze 4 एल बफर सी (50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, 50 मिमी NaCl, 7.5 पीएच) के खिलाफ रातोंरात और 30 के एक आणविक वजन कट ऑफ के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग लगभग 100 सुक्ष्ममापी प्रोटीन ध्यान केडीए।
    नोट: जैसा MDH अमोनियम सल्फेट समाधान के रूप में दिया जाता है MDH की सावधानी से डायलिसिस की आवश्यकता है।
  2. समुच्चय को दूर करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 XG पर 20 मिनट के लिए प्रोटीन अपकेंद्रित्र। 280 एनएम पर absorbance द्वारा MDH एकाग्रता का निर्धारण (ε <उप> 280 एनएम = 7950 के एम -1 सेमी -1)। MDH के 50 μl aliquots तैयार और भंडारण के लिए aliquots फ्लैश फ्रीज।
  3. 1 मिलीलीटर क्वार्ट्ज क्युवेट एक प्रतिदीप्ति तापमान नियंत्रित नमूना धारकों और दोषी के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें। Λ पूर्व सेट / उन्हें 350 एनएम के लिए।
  4. क्युवेट और सेट करने के लिए: वांछित पीएच मान (पीएच 2.0, पीएच 3.0, पीएच 4.0, और 5.0 पीएच यहाँ) पर पूर्व गर्म (43 डिग्री सेल्सियस) बफर डी (150 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, 150 मिमी NaCl) की उचित मात्रा मे 43 डिग्री सेल्सियस के लिए क्युवेट धारक में तापमान। कुल मात्रा 1,000 μl है।
  5. बफर करने के लिए 12.5 माइक्रोन के HdeB (या वैकल्पिक रूप से बफर नियंत्रण के लिए HdeB भंडारण बफर के समान मात्रा), 0.5 माइक्रोन के MDH के अलावा द्वारा पीछा जोड़ें। प्रकाश बिखरने की निगरानी शुरू। 360 सेकंड के लिए प्रतिक्रिया सेते MDH का खुलासा पर्याप्त अनुमति देने के लिए।
  6. 2 एम unbuffered कश्मीर 2 की 0.16-0.34 मात्रा जोड़ने HPO 4 से 7 पीएच को बढ़ाने के लिए और फिर से जारी रखने के लिएएक और 440 सेकंड के लिए रोशनी बिखरने मुताबिक।
  7. MDH एकत्रीकरण कि निराकरण के बाद एक निर्धारित समय बिंदु पर निगरानी के अभाव में दर्ज की गई है की हद तक सेट करने के लिए 100% (यहाँ 500 सेकंड, जब MDH का अधिक से अधिक रोशनी बिखरने के बाद मनाया गया)। प्रत्येक संकेत दिया पीएच मान पर HdeB के अभाव में MDH की रोशनी बिखरने संकेत करने के लिए HdeB की गतिविधि मानक के अनुसार।

3. विश्लेषणात्मक ultracentrifugation द्वारा HdeB-LDH जटिल गठन की जांच (नीलामी)

नोट: HdeB अकेले या thermally लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) खुलासा के साथ परिसर में की अवसादन वेग प्रयोगों एक विश्लेषणात्मक ultracentrifuge का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया।

  1. LDH तैयार, 4 एल बफर सी (50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, 50 मिमी NaCl, 7.5 पीएच) के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर LDH dialyze रातोंरात और 30 के एक आणविक वजन कट ऑफ के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग लगभग 200 माइक्रोन के लिए प्रोटीन ध्यान करने के लिए केडीए।
    नोट: LDH की सावधानी से डायलिसिस एलडी के रूप में की आवश्यकता हैएच अमोनियम सल्फेट समाधान के रूप में दिया जाता है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 XG पर 20 मिनट के लिए समुच्चय, सेंट्रीफ्यूज LDH निकालने के लिए। 280 एनएम पर absorbance द्वारा LDH एकाग्रता का निर्धारण (ε 280 एनएम = 43680 एम -1 सेमी -1)। LDH के 50 μl aliquots तैयार और भंडारण के लिए aliquots फ्लैश फ्रीज।
  3. 41 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बफर डी में उपस्थिति 30 माइक्रोन के HdeB की अनुपस्थिति (पीएच 4 और 7, क्रमशः) में 3 सुक्ष्ममापी LDH सेते हैं।
    नोट: इसके पूरा एकत्रीकरण में उच्च तापमान के परिणाम पर LDH की ऊष्मायन, और HdeB की कोई निगरानी प्रभाव देखा जा सकता है।
  4. नमूने कमरे के तापमान को ठंडा होने दें। फिर, मानक सेक्टर युक्त कोशिकाओं में लोड नमूने 1.2 सेमी पथ की लंबाई के साथ 2-चैनल centerpieces आकार का है। ultracentrifuge में कोशिकाओं लोड और कम से कम 1 अवसादन के लिए पहले घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस के लिए संतुलित करना।
  5. 22 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन नमूने और 12 घंटे के लिए संबंधित रोटर में 167,000 XG, और sed की निगरानीप्रोटीन 280 एनएम पर लगातार की imentation। पहले से प्रदर्शन किया, शोर अनुपात करने के लिए संकेत है जब प्रत्येक चैनल के लिए प्रेषित प्रकाश की तीव्रता के बजाय absorbance से मापा जाता है, सुधार हुआ है। यह भी बाद में डेटा फिटिंग की गुणवत्ता में सुधार।
  6. SEDFIT (संस्करण 15.01b, दिसंबर 2015) के साथ आचरण डेटा विश्लेषण, निरंतर सी (एस) के वितरण मॉडल 17 का उपयोग कर। एक ट्यूटोरियल वर्णन कैसे SEDFIT का उपयोग करने के संदर्भ में 18 में पाया जा सकता है।
    1. 0.7 ME (अधिकतम एन्ट्रापी) नियमितीकरण के लिए आत्मविश्वास के स्तर सेट करें।
  7. बफर घनत्व के साथ ही चिपचिपाहट SEDNTERP 19 का उपयोग कर की गणना। एकत्रित ग्राहक प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए एक संदर्भ के रूप में 7 पीएच पीएच 4 में sedimented LDH की integrals की तुलना करें।
    नोट: अवसादन वितरण भूखंडों की एकता सीधे SEDFIT में किया जा सकता है। अवसादन वेग डेटा का विश्लेषण करने के लिए वैकल्पिक सॉफ्टवेयर हाल ही में एक समीक्षा 20 में पाया जा सकता है। </ Li>

4. निगरानी MDH निष्क्रियता और पुनर्सक्रियकण HdeB की उपस्थिति में

नोट: पीएच-सामने आया MDH की refolding पर शुद्ध HdeB के प्रभाव के निराकरण पर MDH गतिविधि की निगरानी के द्वारा निर्धारित किया गया था।

  1. अभाव या 25 माइक्रोन के HdeB की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए: वांछित पीएच मान (पीएच 2.0, पीएच 3.0, पीएच 4.0, और 5.0 पीएच यहाँ) में बफर डी में 1 माइक्रोन MDH सेते हैं। फिर, 10 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान पाली।
    नोट: कोई MDH refolding भी HdeB की उपस्थिति में मनाया गया था जब MDH 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर incubated था।
  2. एसिड विकृत MDH की refolding आरंभ करने के लिए, 0.5 एम सोडियम फास्फेट, 8.0 पीएच की मात्रा 0.13-0.42 के अलावा द्वारा 7 पीएच के लिए नमूने बेअसर।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, 340 एनएम 9 में NADH की कमी की निगरानी के द्वारा MDH गतिविधि का निर्धारण।
    नोट: MDH एल Malate में oxaloacetate की NADH निर्भर कमी उत्प्रेरित। परख बफर के 950 μl (50 मिमी सोडियम फास्फेट, पीएच 8.0, 1 मिमी oxaloacetate, और 150 माइक्रोन के NADH) के साथ ऊष्मायन प्रतिक्रिया के 50 μl मिक्स।
    नोट: परख बफर में MDH के अंतिम एकाग्रता 44 एनएम होना चाहिए।
  4. एक Peltier तापमान 20 डिग्री सेल्सियस नियंत्रण करने के लिए सेट ब्लॉक से लैस एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग absorbance में परिवर्तन, मॉनिटर।
  5. रिपोर्ट है कि पीएच 7.0 पर रखा गया है 44 एनएम मूल निवासी MDH को MDH गतिविधि रिश्तेदार।

5. पर HdeB overexpression का प्रभाव एसिड तनाव के तहत कोलाई जीवन रक्षा

नोट: ई कोलाई MG1655 जीनोमिक डीएनए में प्रकाशित एक प्रोटोकॉल 21 का उपयोग कर अलग किया गया था।

  1. से hdeB बढ़ाना BamH मैं-फिरना GGT GGT CTG GGA टीसीसी TTA एटीटी CGG CAA जीटीसी एटीटी और hdeB - - ECOR मैं-परिवार कल्याण GGT जीसीसी GAA टीटीसी AGG AGG CGC ATG AAT एटीटी टीसीए TCT सीटीसी सी पीसीआर प्राइमरों hdeB का उपयोग करके कोलाई MG1655
  2. 50 μl में पीसीआर प्रतिक्रिया के रूप में इस सेट अप: 10 μl 5x पोलीमर्स बफर, 200 माइक्रोन के dNTPs, 0.5 माइक्रोन के प्राइमर JUD2, 0.5 माइक्रोन के प्राइमर JUD5, 150 एनजी जीनोमिक डीएनए MG1655, 0.5 μl डीएनए पोलीमरेज़, DDH 2 हे से 50 μl जोड़ें।
  3. इस प्रकार के रूप hdeB के प्रवर्धन प्रदर्शन करना: चरण 1: 95 डिग्री सेल्सियस, 1 चक्र पर 5 मिनट; चरण 2: 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस, 40 चक्र पर 30 सेकंड; चरण 3: 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
  4. प्रतिबंध साइट क्लोनिंग के लिए मानक तरीकों का उपयोग कर प्लाज्मिड pBAD18 की ECOR मैं और BamH मैं साइटों में पीसीआर टुकड़ा जिसके परिणामस्वरूप क्लोन। प्लाज्मिड निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध। अनुक्रमण 10 से जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड की जाँच करें।
  5. प्लाज्मिड HdeB या तनाव BB7224 में खाली वेक्टर नियंत्रण pBAD18 (Δ rpoH) (जीनोटाइप व्यक्त रूपांतरण: एफ -, λ - E14 - [araD139] बी आर / [6, (argF-एलएसी) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (एस आर) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: तमिलनाडु 10 (टीसी एस) suhX401 deoC1 अरद + rpoH :: कान + 16) रासायनिक सक्षम कोशिकाओं का उपयोग कर।
    ध्यान दें: इस तनाव तापमान के प्रति संवेदनशील है।
  6. बाद 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड गर्मी सदमे और चढ़ाना करने से पहले, 30 डिग्री सेल्सियस और 200 rpm पर कोशिकाओं सेते हैं। सकारात्मक क्लोन की एक कॉलोनी लकीर बहिष्कार प्रदर्शन और रात भर में 30 डिग्री सेल्सियस सेते हैं। 50 मिलीलीटर लेग एम्प में एक रात संस्कृति को तैयार है और 200 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं खेती।
  7. रात भर संस्कृतियों पतला 25 मिलीलीटर लेग amp में 40 गुना और 30 डिग्री सेल्सियस और एक आयुध डिपो 600nm के लिए 200 आरपीएम = 1.0 में 0.5% arabinose (आरा) की उपस्थिति में बैक्टीरिया बढ़ने HdeB प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए।
  8. पीएच पारी प्रयोगों के लिए, पौंड का उपयोगएम्प + आरा 0.5 के आयुध डिपो 600nm के लिए कोशिकाओं को कमजोर और संबंधित पीएच मान (यहाँ: पीएच 2.0, पीएच 3.0, और पीएच 4.0) को समायोजित करने के लिए 5 एम एचसीएल की उचित मात्रा जोड़कर।
  9. संकेत समय अंक (पीएच 3, 2.5 मिनट, पीएच 2, 1 मिनट पीएच 4, 30 मिनट) के बाद, 5 एम NaOH की उचित मात्रा के अलावा द्वारा संस्कृतियों बेअसर।
  10. निष्प्रभावी संस्कृतियों के आयुध डिपो माप का उपयोग कर 30 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए तरल संस्कृति में विकास की निगरानी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA और HdeB मुताबिक़ हैं ई कोलाई प्रोटीन, एसिड तनाव की स्थिति में 10 के खिलाफ periplasmic प्रोटीन की रक्षा के लिए जाना जाता है। हमारा काम का पता चला HdeA के समान है, HdeB भी कार्य करता है कि के रूप में एक एसिड आणविक निगरानी सक्रिय है। हालांकि, एक पीएच अभी भी संभावित जीवाणुनाशक, लेकिन HdeA 6,9,10,22 का पीएच इष्टतम तुलना में काफी अधिक है कि कम से HdeA, HdeB कार्यों के विपरीत। इन विट्रो में HdeB की निगरानी गतिविधि का पीएच इष्टतम जांच करने के लिए, देशी MDH पूर्व गर्म (43 डिग्री सेल्सियस) की उपस्थिति या HdeB के अभाव में संकेत पीएच के बफर में पतला था। ऊष्मायन के 360 सेकंड के बाद, ऊष्मायन प्रतिक्रिया निष्प्रभावी किया गया था। यह निराकरण 43 डिग्री सेल्सियस 9 में MDH के एकत्रीकरण से चलाता है। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि HdeB के अभाव में MDH की रोशनी बिखरने संकेत MDH के एकत्रीकरण के कारण निराकरण पर नाटकीय रूप से बढ़ जाती है (चित्रा 1, बीएलप्रत्येक पीएच पर एसीके लाइन)। HdeB की उपस्थिति में, प्रकाश बिखरने संकेत काफी पीएच 4 या 5 पीएच से निराकरण पर कमी आई है यह दर्शाता है कि HdeB MDH (चित्रा 1, पीएच 4 और 5 पीएच) के एकत्रीकरण से बचाता है। इसके विपरीत, तथापि, पीएच 2 और पीएच 3 से निराकरण करने पर, MDH तेजी से उसी हद उपस्थिति या HdeB (चित्रा 1, पीएच 2 और पीएच 3) के अभाव के स्वतंत्र करने के लिए, समुच्चय का संकेत HdeB की निगरानी गतिविधि के लिए पीएच इष्टतम है कि पीएच बीच 4 और 5 HdeB भंडारण बफर यह दर्शाता है कि पीएच 4 में HdeB की उपस्थिति में MDH की कम प्रकाश बिखरने संकेत अपनी निगरानी समारोह की वजह से है, MDH एकत्रीकरण (चित्रा 1, बफर नियंत्रण) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। HdeA पीएच 2-3 से अपने monomeric और सामने आया फार्म में सक्रिय निगरानी लेकिन कम या पीएच 4 से 10 के ऊपर कोई गतिविधि से पता चलता है। इन परिणामों का सुझाव है कि HdeB पीएच 4 से 10 के आसपास अपने इष्टतम निगरानी गतिविधि है।

टी = "चित्रा 1" src = "/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
चित्रा 1:। अम्लीय पीएच पर HdeB की निगरानी गतिविधि 0.5 माइक्रोन के MDH 43 डिग्री सेल्सियस पर अनुपस्थिति या 360 सेकंड के लिए 12.5 माइक्रोन के HdeB की उपस्थिति में संकेत पीएच पर पूर्व गर्म बफर डी में incubated था। नमूने के पीएच फिर 7 पीएच (के रूप में तारांकन द्वारा इंगित) 0.16-0.34 मात्रा 2 एम unbuffered कश्मीर के अलावा 2 4 HPO द्वारा करने के लिए उठाया गया था, MDH एकत्रीकरण एक अतिरिक्त 440 सेकंड के लिए निगरानी प्रकाश बिखरने से 350 एनएम पर मापा गया था तटस्थ पीएच (नीले रंग की पृष्ठभूमि)। चित्रा डाहल एट अल। 10 .इस शोध से संशोधित मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था। डाहल जू, Koldewey पी, सामन एल, Horowitz एस, Bardwell जे.सी., बैक्टीरिया में एक एसिड सुरक्षात्मक निगरानी के रूप में जेकब यू HdeB कार्य करता है। जम्मू बॉय रसायन। 2015, 290 (1): 65-75। डोई: 10.1074 / jbc.M114.612986। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी।एस / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संबोधित करने के लिए है कि क्या अन्य ग्राहक प्रोटीन के साथ HdeB रूपों स्थिर परिसरों भी 3 सुक्ष्ममापी LDH thermally 41 डिग्री सेल्सियस पर उपस्थिति या 30 माइक्रोन के HdeB के अभाव अलग पीएच की स्थिति में सामने आया था। विश्लेषणात्मक ultracentrifugation द्वारा इन नमूनों के अवसादन व्यवहार के विश्लेषण से 22 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया गया। जब LDH और HdeB पीएच 7 और 41 डिग्री सेल्सियस पर एक साथ incubated रहे थे, विशेष रूप से LDH tetrameric (120 केडीए की आणविक वजन) बने रहे और HdeB dimeric बने रहे। इन परिणामों से संकेत दिया है कि प्रोटीन 7 पीएच पर स्थिर परिसरों फार्म नहीं है, और LDH 41 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2, ग्रीन लाइन) पर एक 20 मिनट ऊष्मायन पर oligomerization में किसी भी अपरिवर्तनीय परिवर्तन से गुजरना नहीं है। इसी तरह, HdeB 41 डिग्री सेल्सियस और 4.0 पीएच पर ऊष्मायन पर dimeric बने रहे, यह दर्शाता है कि कम पीएच ऊष्मायनके HdeB भी गर्मी सदमे की स्थिति (चित्रा 2, लाल रेखा) के तहत अपने oligomerization राज्य को प्रभावित नहीं करता। LDH जब HdeB के अभाव तेजी से एकत्रित रूप में तथ्य यह है कि LDH के 40% से पहले पहले स्कैन (चित्रा 2, ऊपरी दाहिने कोने में कहा गया है) दर्ज किया गया था sedimented ने संकेत में 4 पीएच और 41 डिग्री सेल्सियस पर incubated। शेष LDH मोनोमर (चित्रा 2, नीली रेखा) के रूप में मुख्य रूप से तलछट के लिए दिखाई दिया। इसके विपरीत, 4 पीएच और 41 डिग्री सेल्सियस पर LDH और HdeB के ऊष्मायन दो प्रोटीन के लिए सह-तलछट (HdeB-LDH सी) का एक बड़ा हिस्सा वजह से, 134 केडीए के एक आणविक वजन के साथ एक नई प्रजाति के गठन। इस प्रजाति की संभावना HdeB dimers और thermally खुलासा LDH के बीच एक जटिल प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, HdeB की उपस्थिति में, अवसादन करने से पहले कोई महत्वपूर्ण LDH एकत्रीकरण मनाया गया, जो हमारे इन विट्रो एकत्रीकरण माप के साथ संगत है। ये परिणाम बताते हैं कि HdeB में निगरानी गतिविधि दर्शाती अपनेपीएच 4.0 पर dimeric फार्म। इस HdeA है, जो अपनी monomeric रूप में सक्रिय निगरानी कर रहा है के विपरीत में है। कि यह 4 पीएच और पीएच 7 के बीच संरचनात्मक rearrangements गुजरना करने के लिए अनुमति देता है HdeB की बहुत गतिशील प्रकृति की संभावना HdeB की निगरानी समारोह 10 की सक्रियता के लिए पर्याप्त है।

चित्र 2
चित्रा 2:। विश्लेषणात्मक ultracentrifugation द्वारा पीएच 4 में HdeB और सामने आया LDH के बीच जटिल गठन की जांच 3 सुक्ष्ममापी LDH बफर डी 15 मिनट के लिए (150 मिमी KHPO 4, 150 मिमी NaCl) में एक 10-दाढ़ अतिरिक्त HdeB की उपस्थिति में incubated था या तो पीएच 7 (ग्रीन लाइन) में 41 डिग्री सेल्सियस या 4 पीएच (काला लाइन) पर। तुलना के लिए, LDH लड़का (नीली रेखा) या अकेले HdeB (लाल रेखा) 15 मिनट के लिए 41 डिग्री सेल्सियस पर पीएच पर LDH incubated रहे थे 4. विश्लेषणात्मक ultracentrifugation अवसादन वेग HdeB के stoichiometry निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और जटिल HdeB के बीच का गठन और अलग से LDHअलग पीएच की स्थिति। ध्यान दें कि ~ 40% LDH पहले स्कैन करने से पहले एकत्रित जब पीएच 4 में और HdeB के अभाव में incubated (के रूप में ऊपरी दाहिने कोने में नोट)। दिखाया गया है अवसादन एक गुणांक वितरण साजिश है (ग (s)) कार्यक्रम SEDFIT का उपयोग विश्लेषण। पत्र LDH या HdeB के संबंधित oligomeric राज्य का संकेत मिलता है, क्रमश: HdeB डी, HdeB डिमर; LDH एम, LDH मोनोमर, LDH टी, LDH टेट्रामर; HdeB-LDH सी, HdeB-LDH जटिल। चित्रा डाहल एट अल। 10 से संशोधित किया गया है। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। डाहल जू, Koldewey पी, सामन एल, Horowitz एस, Bardwell जे.सी., बैक्टीरिया में एक एसिड सुरक्षात्मक निगरानी के रूप में जेकब यू HdeB कार्य करता है। जम्मू बॉय रसायन। 2015, 290 (1): 65-75। डोई: 10.1074 / jbc.M114.612986। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी। देखें एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा के सायन।

कि क्या HdeB निराकरण पर ग्राहक प्रोटीन का समर्थन करता है refolding परीक्षण करने के लिए, पीएच-विकृत MDH की refolding पर HdeB के प्रभाव का विश्लेषण किया गया था। Thermally विकृत MDH उपस्थिति या HdeB के अभाव में अलग पीएच मान पर incubated था। कम पीएच ऊष्मायन के बाद, पीएच निष्प्रभावी किया गया था (जो MDH refolding शुरू की), और MDH गतिविधि 2 घंटे के बाद निर्धारित किया गया था। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, MDH के महत्वपूर्ण पुनर्सक्रियन HdeB की उपस्थिति में पीएच 4 से निराकरण पर हासिल की थी। कोई MDH गतिविधि चुना गया जब HdeB कम पीएच ऊष्मायन से अनुपस्थित था।

चित्र तीन
चित्रा 3: HdeB एसिड की refolding एक enzymatically सक्रिय राज्य के लिए MDH विकृत की सुविधा 1 माइक्रोन MDH बफर डी में अभाव या पी में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए संकेत दिया पीएच पर incubated था।25 माइक्रोन के HdeB की resence। फिर, तापमान 10 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिया गया था इससे पहले नमूने 0.5 एम ना 2 के अलावा HPO 4 से 7 पीएच को निष्प्रभावी कर रहे थे। Aliquots 20 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 2 घंटे के बाद लिया गया है और MDH गतिविधि के लिए यत्न कर रहे थे। अनुपस्थिति (सफेद सलाखों) या HdeB की उपस्थिति (काली सलाखों) में निराकरण पर MDH गतिविधि दिखाया गया है। मानक विचलन कम से कम 3 स्वतंत्र माप से प्राप्त होता दिखाया गया है। चित्रा डाहल एट अल। 10 से संशोधित किया गया है। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। डाहल जू, Koldewey पी, सामन एल, Horowitz एस, Bardwell जे.सी., बैक्टीरिया में एक एसिड सुरक्षात्मक निगरानी के रूप में जेकब यू HdeB कार्य करता है। जम्मू बॉय रसायन। 2015, 290 (1): 65-75। डोई: 10.1074 / jbc.M114.612986। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।

हमारे इन विट्रो डेटा से पता चला है कि HdeB पीएच 4 में अलग अलग मॉडल ग्राहक प्रोटीन बांधता है, उनके एकत्रीकरण रोकता है और refolding एक बार तटस्थ पीएच की स्थिति बहाल कर रहे हैं ग्राहक की सुविधा। विवो में HdeB के प्रभाव की जांच करने के लिए, पीएच-निर्भर अस्तित्व assays के तापमान के प्रति संवेदनशील rpoH विलोपन तनाव का उपयोग आयोजित की गई। इस तनाव सबसे chaperones का अभाव है और इसलिए ऊंचा तापमान, कम पीएच या ऑक्सीडेटिव तनाव से 15 अतिसंवेदनशील है। तटस्थ पीएच की शर्तों के तहत HdeB की overexpression तनाव की विकास दर है, जो नियंत्रण तनाव है कि खाली वेक्टर pBAD18 (चित्रा 4, इलाज) बंदरगाहों के लिए तुलनात्मक रूप में अच्छी तरह से बढ़ी है पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया। इसके विपरीत, हम करने के लिए अपनी क्षमता में स्पष्ट अंतर पाया गया कम पीएच Trea से reproducibly बेहतर वसूली दिखा HdeB overexpressing तनाव के साथ पीएच 3 या 4 पीएच उपचार पर विकास को फिर से शुरूनियंत्रण तनाव से tment। हमारे इन विट्रो डेटा के विपरीत, तथापि, HdeB की उपस्थिति भी 3. पीएच पर एक काफी सुरक्षात्मक प्रभाव इस सेल में HdeB के उच्च एकाग्रता की वजह से हो सकता है, जो पीएच पर भी dimers की ओर HdeB की oligomerization राज्य बदलाव हो सकता था 3. ध्यान दें कि 2 पीएच या पीएच 3 के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण बहुत तेजी से और अत्यधिक विषाक्त प्रभाव में हुई है, जबकि कोई महत्वपूर्ण हत्या जब कोशिकाओं जहां पीएच 4 9,10,22 में incubated मनाया गया।

चित्रा 4
चित्रा 4: HdeB की रक्षा अम्लीय पीएच के खिलाफ कोलाई। HdeB (लाल हलकों) 30 डिग्री सेल्सियस पर 0.5% arabinose की उपस्थिति में BB7224 (Δ rpoH) में overexpressed था। BB7224 खाली वेक्टर pBAD18 शरण कोशिकाओं नियंत्रण (काला हलकों) के रूप में इस्तेमाल किया गया। ऊपरी बाएं पैनल दोनों सेंट की वृद्धि को दर्शाता है30 डिग्री सेल्सियस पर बारिश, पीएच 7. 3 कोशिकाओं पीएच (निचले बाएं पैनल) या पर 30 मिनट पर 2.5 मिनट 5 एम एचसीएल जोड़कर संकेत दिया पीएच को स्थानांतरित कर दिया गया, और 2 पीएच (ऊपरी सही पैनल) पर 1 मिनट के लिए incubated रहे थे, पीएच 4 (सही पैनल कम)। बाद में, संस्कृतियों 5 एम NaOH की उचित मात्रा जोड़कर निष्प्रभावी रहे थे और वृद्धि 30 डिग्री सेल्सियस पर तरल मीडिया में नजर रखी थी। चित्रा डाहल एट अल। 10 से संशोधित किया गया है। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। डाहल जू, Koldewey पी, सामन एल, Horowitz एस, Bardwell जे.सी., बैक्टीरिया में एक एसिड सुरक्षात्मक निगरानी के रूप में जेकब यू HdeB कार्य करता है। जम्मू बॉय रसायन। 2015, 290 (1): 65-75। डोई: 10.1074 / jbc.M114.612986। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सक्रियण और HdeB की निगरानी समारोह की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए, HdeB की बड़ी मात्रा में व्यक्त की और शुद्ध किया जाना है। अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणालियों के एक नंबर एक लक्ष्य प्रोटीन का उच्च स्तर, pTrc या pBAD वैक्टर, जो दोनों के इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया सहित उत्पादन के लिए उपलब्ध हैं। प्रमोटरों के लिए आसानी से सुलभ हैं कोलाई आरएनए पोलीमर्स और किसी भी में HdeB की इस प्रकार की अनुमति दें सशक्त अभिव्यक्ति upregulated कोलाई तनाव। इस पहलू एसिड तनाव की स्थिति है, जहां rpoH -deficient तनाव उपयोग किया गया था के तहत HdeB के vivo overexpression अध्ययन के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। इस तनाव chaperones के सबसे अभाव है और इस प्रकार ऊंचा तापमान, कम पीएच और oxidative तनाव 15 सहित विभिन्न तनाव, के प्रति और अधिक संवेदनशील है। विकल्प के रूप में अस्तित्व यहाँ प्रस्तुत उत्परिवर्ती उपभेदों कि ब्याज की जीन की कमी में किया जा सकता है लोगों के लिए इसी तरह के अध्ययन।

टी "> किसी भी निगरानी गतिविधि के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन या refolding परख ग्राहक के प्रकार, ग्राहक प्रोटीन की एकाग्रता और बफर की स्थिति के संबंध में दोनों, ध्यान से विचार किया जाना है। इस तरह के रूप में विशिष्ट निगरानी assays, मॉडल ग्राहक प्रोटीन, में साइट्रेट synthase, luciferase, या Malate डिहाइड्रोजनेज यूरिया या guanidine एचसीएल की उच्च सांद्रता में विकृत कर रहे हैं, और एकत्रीकरण 23,13 प्रेरित करने के लिए denaturant मुक्त बफर में पतला। chaperones की उपस्थिति में माप किस हद तक वे प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने के लिए प्रकट करते हैं। वैकल्पिक रूप से, ग्राहकों thermally सामने आया हैं और प्रोटीन एकत्रीकरण नजर रखी है। दोनों ही मामलों में, प्रकाश बिखरने माप प्रोटीन एकत्रीकरण के लिए readout के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। एक्टिव chaperones ग्राहक प्रोटीन खुलासा, जिससे रोशनी बिखरने संकेत 6 में कमी के कारण के एकत्रीकरण को रोकने के। दोनों इन प्रयोगात्मक setups के मोल का आकलन करने के लिए कम पीएच ऊष्मायन के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावाecular निगरानी गतिविधि विशेष रूप से ग्राहक प्रोटीन का एकत्रीकरण को रोकने के लिए अपनी क्षमता की निगरानी के द्वारा, गैर तनाव की स्थिति में लौटने पर ग्राहक refolding पर chaperones के प्रभाव के 24 परीक्षण किया जा सकता है। यह विशेष रूप से सीधा जब ग्राहक प्रोटीन enzymatic गतिविधि है, जो उनकी निष्क्रियता और पुनर्सक्रियन के लिए मात्रात्मक readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के अधिकारी। जबकि निगरानी की मध्यस्थता refolding स्वाभाविक रूप से एक एटीपी निर्भर प्रक्रिया है, ऐसे HdeA, HdeB और जासूस के रूप में periplasmic chaperones एक एटीपी स्वतंत्र फैशन में refolding ग्राहक, periplasm 9,25 में ऊर्जा की कमी के साथ लगातार की सुविधा के लिए दिखाया गया है।

ऐसे HdeB के रूप में एक एसिड सुरक्षात्मक निगरानी के पीएच इष्टतम का अध्ययन विभिन्न कारणों से चुनौतीपूर्ण है: (i) एकत्रीकरण ऐसे साइट्रेट synthase के रूप में भी अच्छी तरह से स्थापित निगरानी ग्राहक प्रोटीन के व्यवहार अम्लीय पीएच पर भिन्न होते हैं; और (ii) केवल कुछ बफर सिस्टम 2-5 के बीच पीएच रेंज में काम करते हैं और सुई हैंदोनों के हित की निगरानी और ग्राहक प्रोटीन के लिए मेज। हम, फॉस्फेट बफर का उपयोग करने के लिए हालांकि हम जानते हैं कि इस अम्लीय पीएच परिस्थितियों में एक गैर आदर्श बफर सिस्टम है फैसला किया। हालांकि, फॉस्फेट बफर एसिड सक्रिय निगरानी 9,22 के रूप में HdeA चिह्नित करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होना पाया गया। एकत्रीकरण माप तापमान या बफर सामग्री में परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं। झूठी सकारात्मक परिणाम को खत्म करने के लिए, इसलिए हम हमेशा ग्राहक एकत्रीकरण पर निगरानी भंडारण बफर के प्रभाव (चित्रा 1, बफर नियंत्रण) परीक्षण करने के लिए सलाह देते हैं। कभी कभी ग्राहक प्रोटीन का एकत्रीकरण इतनी जल्दी है कि यहां तक ​​कि सबसे अच्छा निगरानी एकत्रीकरण की प्रक्रिया के साथ प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम नहीं हो सकता है तब होती है। इसलिए यह इष्टतम परख की स्थिति पता लगाने के लिए प्रारंभिक परीक्षणों का संचालन करने के लिए आवश्यक है। ऐसी स्थिति के लिए एक अच्छा उदाहरण हमारे ultracentrifugation प्रयोगों में दी गई है, जहां> 42 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर LDH के ऊष्मायन इतनी तेज है कि और भीHdeB की एक अतिरिक्त की उपस्थिति LDH एकत्रीकरण को रोकने नहीं है। इसके अलावा, निगरानी / सह निगरानी अनुपात या संरक्षिका / ग्राहक अनुपात को ध्यान से 23 निर्धारित किया गया है। प्रारंभिक प्रयोगों में 1 और कहा कि हमें HdeB की निगरानी गतिविधि के लिए इष्टतम पीएच के रूप में पीएच 4 की पहचान करने में मदद मिली: हम एक काफी उच्च HdeB उपयोग शुरू कर दिया: 50 के अनुपात MDH। के बीच 1 MDH अनुपातों: 1 और 50: हम तो HdeB का विश्लेषण करने के लिए जारी रखा पीएच 4 में 1, 25 की पहचान: 1 अनुपात सबसे प्रभावी होने के लिए। इसके विपरीत, HdeA 10 के रूप में MDH एकत्रीकरण दबा: 1 निगरानी: ग्राहक अनुपातों 6,9,10,22। इस प्रकार, हम निष्कर्ष है कि HdeA, HdeB की तुलना में, कम निगरानी के रूप में MDH एकत्रीकरण दबाने में अधिक प्रभावी है: ग्राहक के अनुपात में पूरी तरह से MDH एकत्रीकरण को दबाने के लिए पर्याप्त थे। एक और दृष्टिकोण प्रोटीन एकत्रीकरण की निगरानी की मध्यस्थता दमन की जांच करने के लिए स्पिन नीचे assays, जिसमें ग्राहक समुच्चय centrifugation द्वारा हटा दिया है और एसडीएस पृष्ठ द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे शामिल है। यह दृष्टिकोण भी मीटर के लिए अनुकूल हैविवो में प्रोटीन एकत्रीकरण पर chaperones के प्रभाव onitoring। उत्परिवर्ती उपभेदों है कि या तो overexpress या ब्याज की निगरानी की कमी प्रोटीन खुलासा तनाव की स्थिति से अवगत कराया जाता है। बाद में, कोशिकाओं lysed रहे हैं और घुलनशील और एकत्रित अंशों अलग कर दिया और 15,16,26 मात्रा निर्धारित कर रहे हैं।

ग्राहक-निगरानी परिसर का पता लगाने के लिए, हम विश्लेषणात्मक ultracentrifugation लागू होता है। यहां यह ध्यान दिया जाएगा कि प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर यह सीधे HdeB की राशि और LDH monomers इस परिसर में बंधे यों तो संभव नहीं है, दोनों के रूप में प्रोटीन 280 एनएम पर अवशोषित। अगर वांछित, निगरानी ग्राहक परिसर के stoichiometry अलग से एक क्रोमोफोर, जिसका उत्तेजना अधिकतम दिखाई रेंज के भीतर झूठ के साथ निगरानी और ग्राहक प्रोटीन लेबलिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, परिसरों के भीतर chaperones करने के लिए ग्राहकों के stoichiometry मूल निवासी पृष्ठ मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा के साथ युग्मित का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन करके, हम दो आणविक chaperones, HdeA, और HdeB 9,10,22 को चिह्नित करने में सक्षम थे। सामान्य तौर पर, इन assays भी इन विट्रो में और vivo में प्रोटीन refolding में आणविक chaperones की क्षमता अवरोधकों की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एसिड तनाव के तहत ग्राहक एकत्रीकरण को रोकने के लिए उनकी क्षमता के लिए सिंथेटिक chaperones परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल क्रम में बिंदु उत्परिवर्तन और / या एसिड सक्रिय chaperones का छोटा वेरिएंट के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उनके सक्रियण के तंत्र में प्रकाश डाला।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

हम निगरानी assays पर उसे उपयोगी सलाह के लिए डॉ क्लाउडिया Cremers धन्यवाद। केन वान HdeB शुद्धि में अपने तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार किया है। इस काम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (JCAB के लिए) और JCAB और UJJ उद स्वास्थ्य अनुदान RO1 GM102829 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) द्वारा उपलब्ध कराए गए एक postdoctoral शोध फैलोशिप द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20, (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37, (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280, (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290, (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21, (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73, (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72, (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40, (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78, (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271, (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53, (5), 689-699 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats