איתור של הפעילות תלויה pH של
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

Cite this Article

Copy Citation

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חיידקים נחשפים לעתים קרובות לשינויים סביבתיים, כגון שינויים ב- pH, טמפרטורה, מצב חיזור, חשיפה לאור או כוח מכני. הרבה מהמקרים האלה לגרום חלבון התגלגלות בתא ויש להם השפעה מזיקה על ההישרדות של האורגניזם. קבוצת מלווים שאינם קשורים, מולקולריים ספציפי לחץ הוכחה לשחק תפקידים חיוניים להישרדותה של תנאי הלחץ הללו. בעוד מקופל מלא מלווה-פעיל לפני לחץ, החלבונים האלה להתפתח במהירות ולהיות מלווה-פעיל בתנאי קיצון ספציפי. הופעל פעם אחת, מלווה סדר המותנה אלה נקלטות על ידי מספר רב של חלבוני צבירה נוטה שונים, למנוע הצבירה שלהם במישרין או בעקיפין להקל חלבון refolding עם שיבת תנאים שאינם מתח. הגישה העיקרית להשגת הבנה מפורטת יותר על המנגנון של הכרת הפעלת הלקוח שלהם כרוכה הטיהור subsequenאפיון t של חלבונים אלו באמצעות מבחני מלווה במבחנה. מעקב מבחני לחץ vivo חיוני לחלוטין כדי לאשר את שהושג באופן עצמאי בתוצאות חוץ גופייה.

פרוטוקול זה מתאר במבחנה שיטות vivo לאפיין את הפעילות המלווה של E. coli HdeB, גידול מלווה חומצה מופעלת. מדידות פיזור אור שמשו לקריאה מתוך נוח הקיבולת של HdeB למנוע צבירה הנגרמת חומצה של חלבון לקוח המודל הוקם, MDH, במבחנה. ניסויי ultracentrifugation אנליטית יושמו לחשוף היווצרות מורכבת בין HdeB ו LDH חלבון הלקוח שלה, כדי לשפוך אור לתוך גורל חלבוני לקוח עם שובי תנאים שאינם מתח. מבחני הפעילות האנזימטית של חלבוני הלקוח נערכו במטרה לפקח על תופעות של HdeB על איון הלקוח הנגרמת pH ו מחדש. לבסוף, מחקרים הישרדות שימשו Monitor השפעת פונקצית in vivo המלווה של HdeB.

Introduction

סביבה טבעית משותפת שבה פתוגנים חיידקים לחוות תנאי התגלגלות חלבון חומצה הנגרמת היא בבטן היונקת (טווח pH 1-4), אשר pH חומצי משמש מחסום יעיל נגד פתוגנים שמקורן במזון 1. חלבון התגלגלות ומקבצים, אשר נגרם על ידי protonation שרשרת הצד של חומצות אמיניות, משפיעים תהליכים ביולוגיים, מבנים הסלולר ניזקים ולבסוף גורם מוות של תאי 1,2. מאז ה- pH של periplasm חיידקי equilibrates כמעט מיידי עם pH הסביבתי עקב דיפוזיה החופשית של פרוטונים דרך הממברנה החיצונית הנקבובית, חלבונים בממברנה periplasmic והפנימיים של חיידקי גרם שליליים הם מרכיבים התאיים הפגיעים ביותר בתנאי חומצה-מתח 3. כדי להגן proteome שלהם periplasmic מפני נזק חומצה בתיווך מהירה, חיידקים גראם שליליים לנצל את המלוות periplasmic המופעל חומצה HdeA ו HdeB. HdeA הוא מלווה מופרע על תנאים 6,7. הפעלת HdeA דורש שינויים מבניים עמוקים, כולל ניתוק שלה לתוך מונומרים, ואת חלקי התגלגלות של מונומרים 6-8. הופעל פעם אחת, HdeA נקשר לחלבונים הנפרשות בתנאים חומציים. זה מונע ביעילות הצבירה שלהם הוא במהלך הדגירה ב- pH הנמוך, כמו גם על נטרול pH. עם שובו ל- pH 7.0, HdeA מקל על refolding של חלבוני הלקוח שלו בצורה ATP-עצמאית וממיר בחזרה לתוך קונפורמציה שלה dimeric, בת הלוויה-פעיל 9. באופן דומה, HdeB המלווה ההומולוגי הוא גם לוויה-פעיל ב- pH 7.0. בניגוד HdeA, לעומת זאת, פעילות המלווה של HdeB מגיע המקסימלית שלה לכאורה ברמה של 4.0 pH, התנאים שבהם HdeB עדיין מקופלת ברובו dimeric 10. יתר על כן, עוד הורדת קאוס pHes איון של HdeB. תוצאות מראות כי למרות ההומולוגיה הנרחבת שלהם, HdeA ו HdeB שונים במצב שלהם הפעלה פונקציונלית ומאפשרת להם מכסי מגוון רחב pH עם פונקצית המלווה המגנה שלהם. מלווה אחר אחת כי היה מעורב התנגדות החומצה של E. coli הוא Hsp31 cytoplasmic, המופיע לייצב חלבוני הלקוח פרש עד משוחזרים תנאי נייטרלי. המצב המדויק של הפעולה של Hsp31, לעומת זאת, נותר 12 חידתי. בהתחשב בכך חיידקים וחיידק אחרים כגון סלמונלה חסרים את אופרון hdeAB, סביר מאוד כי מלוות periplasmic בלתי מזוהים אחרים אבל בכל זאת עלולים להתקיים כי הם מעורבים התנגדות חומצה של חיידקים אלה 11.

הפרוטוקולים שהוצגו כאן מאפשרים לפקח על הפעילות המלווה תלוי pH של HdeB במבחנה ובחי 10 וניתן להחיל לחקור מלווים אחריםכגון Hsp31. לחלופין, הרשת המורכבת של גורמי שעתוק השולטות ביטוי hdeAB יכולה להיחקר באופן פוטנציאלי על ידי assay מתח vivo. כדי לאפיין את תפקודם של חלבונים המלווים in vivo, setups הניסיוני השונה ניתן ליישם. מסלול אחד הוא ליישם בתנאי עקה התגלגלות חלבון phenotypically לאפיין זנים מוטנטים כי גם ביטוי יתר של הגן של עניין או לבצע מחיקה של הגן. ניתן לבצע מחקרי proteomic לזהות אילו חלבונים כבר לא המצרפי בתנאי קיצון כאשר המלווה הוא הווה, או את ההשפעה של מלווה על אנזים מסוים יכולה להיקבע במהלך בתנאי עקה באמצעות מבחני האנזימטית 14-16. במחקר זה, בחרנו overexpress HdeB ב זן מחיקת rpoH, אשר חסר את גורם סיגמא הלם חום 32. RpoH שולט הביטוי של כל א הגדולה מלווה coli והמחיקה שלו ידועה להגדיל sensitivity לתנאי עקה סביבתיים הגורמים חלבון התגלגלות 15. פעילות המלווה vivo של HdeB נקבע על ידי ניטור יכולתה לדכא את רגישות ה- pH של זן Δ rpoH. בסך הכל, הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק גישה מהירה וישירה לאפיין את הפעילות של מלווה חומצה מופעלת במבחנה וכן בהקשר vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ביטוי טיהור 1. של periplasmic HdeB

הערה: HdeB התבטאה E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10, וטיהר מן periplasm על תמוגה polymyxin.

  1. הכן תרבות לילה של E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10 ב 30 מ"ל LB המכיל 200 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (AMP LB). לחסן ארבעה 1 תרבויות L של LB Amp לגדל אותם על 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד עד OD 600nm של 0.7 הוא הגיע. לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרומטר IPTG להשרות את הביטוי של HdeB ולהפחית את הטמפרטורה הצמיחה עד 30 מעלות צלזיוס.
  2. אחרי 5 שעות של ביטוי חלבון ב 30 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  3. שטפו את תא גלולה עם 100 מ"ל חיץ (50 מ"מ טריס / HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5) ו צנטריפוגות שוב התאים ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C A.
  4. בהמשך לכך, גלולהתא גלול ב 80 מיליליטר הצפה, המכילה 1 מ"ג / סולפט polymyxin מיליליטר. עבור שיבוש יעיל של הממברנה החיצונית, בעדינות מערבבים את ההשעיה עבור שעה 1 ב 4 ° C.
  5. כדי להסיר את חלק cytoplasmic ופסולת תאית, צנטריפוגה ההשעיה עבור 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. התוצאה היא ~ 60 מיליליטר supernatant המכיל את HdeB המסיס.
  6. Dialyze את supernatant המכיל את תמצית periplasmic לילה נגד נפח 150x של חיץ B (20 מ"מ טריס / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) באמצעות קרום דיאליזה עם 6 kDa MW חתוכים. לרכז את החלבונים עד 15 מ"ל באמצעות יחידות צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. סנן את פתרון החלבון באמצעות מסנן נקבובי 0.2 מיקרומטר.
  7. החל את החלבון על טור כרומטוגרפיה אניוני (נפח עמודה 5 מ"ל) כי כבר equilibrated עם B חיץ 5 כרכים עמודה עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min. לאחר החלבון נטען על הטור, לשטוף את העמודה עם החיץ B במשך 10 דקות בשיעור תזרים של 2.5 מ"ל / דקה. Elute HdeB עם שיפוע ליניארי 0 כדי 0.5 M NaCl חיץ B על פני פרק זמן של 50 דקות עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min 6.
  8. לזהות שברים המכילים HdeB באמצעות SDS-PAGE 15%. מערבבים 20 מדגם μl עם 5 μl 5x חיץ טעינת מופחת SDS. טען 10 μl על ג'ל ולהפעיל חיץ טריס-גליצין (גליצין 14.4 גר '/ ל, 2.9 גר' / ל טריס, 1 גר '/ ל סולפט dodecyl נתרן, pH 8.3). הפעל את הג'ל על 150 V עד להקת bromophenol העבירה קרובה לתחתית הג'ל (~ 45 דקות).
  9. בריכת כל שברים HdeB המכילים, דיאליזה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 למאגר אחסון L HdeB (50 מ"מ טריס / HCl, 200 מ"מ NaCl, pH 8.0), ולהתרכז החלבון לכ 300 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. קבע את הריכוז של HdeB ב 280 ננומטר באמצעות 280nm ε מקדם הכחדה = 15,595 M -1 cm -1. כן 100 aliquots μl ופלאש ללאZE את aliquots בחנקן נוזלי.
    הערה: HdeB ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.

2. Assay פעילות הורה מלווה שימוש תרמית התגלגלות dehydrogenase Malate (MDH)

הערה: השפעת HdeB מטוהר על צבירת תרמית התגלגלות dehydrogenase malate המיטוכונדריה החזירית (MDH) בערכי pH שונים הייתה פיקוח כמפורט להלן. כל ריכוזי חלבון המפורטים מתייחסים ריכוז מונומר.

  1. כדי להכין MDH, dialyze MDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 C חיץ L (פוספט אשלגן 50 מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ 100 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa.
    הערה: דיאליזה זהירות של MDH נדרשת MDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט.
  2. כדי להסיר אגרגטים, בצנטריפוגה חלבון במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז MDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ε <sub> 280 ננומטר = 7,950 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של MDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון.
  3. מניחים קובט קוורץ 1 מ"ל לתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי מצויד מחזיקי מדגם מבוקר טמפרטורה בוחש. הגדר לשעבר λ / em ל -350 ננומטר.
  4. להוסיף כרכים המתאים של טרום התחמם (43 ° C) חיץ D (150 פוספט אשלגן מ"מ, 150 מ"מ NaCl) על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) כדי קובט וערכת הטמפרטורה של בעל קובט ל -43 מעלות צלזיוס. ההיקף הכולל הוא 1,000 μl.
  5. להוסיף 12.5 מיקרומטר HdeB (או לחילופין באותו נפח של למאגר אחסון HdeB על בקרת חיץ) למאגר, ואחריו תוספת של MDH 0.5 מיקרומטר. מתחיל בבקרת פיזור אור. דגירת התגובה עבור 360 שניות כדי לאפשר מספיק התגלגלות של MDH.
  6. הרם את pH עד 7 על ידי הוספת נפח 0.16-0.34 מ -2 K unbuffered M 2 HPO 4 ולהמשיך מחדשcording פיזור אור עבור 440 אחר שניות.
  7. הגדר את מידת הצטברות MDH כי נרשמה בהעדר המלווה בנקודת זמן מוגדרת לאחר הנטרול (כאן אחרי 500 שניות, כאשר פיזור אור המקסימאלי של MDH נצפה) ל -100%. לנרמל פעילות HdeB לאות פיזור אור של MDH בהעדר HdeB בכל ערך pH מצוין.

3. איתור של גיבוש קומפלקס HdeB-LDH ידי אנליטית ultracentrifugation (AUC)

הערה: ניסויים מהירות שקיעה של HdeB לבד או בקומפלקס עם תרמית התגלגלות לקטט דהידרוגנאז (LDH) בוצעו באמצעות ultracentrifuge אנליטי.

  1. כדי להכין LDH, dialyze LDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 L חיץ C (50 פוספט אשלגן מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ -200 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa.
    הערה: דיאליזה זהירות של LDH נדרשת LDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט.
  2. כדי להסיר אגרגטים, LDH צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז LDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ננומטר = ε 280 43,680 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של LDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון.
  3. דגירה 3 LDH מיקרומטר בנוכחות והיעדר HdeB 30 מיקרומטר במאגר D (pH 4 ו -7, בהתאמה) במשך 15 דקות ב 41 מעלות צלזיוס.
    הערה: דגירה של LDH לתוצאות טמפרטורות גבוהות ב הצבירה המוחלטת שלה, ואין שפעה מלווה של HdeB ניתן לצפות.
  4. תנו דגימות להתקרר לטמפרטורת החדר. ואז, דגימות עומס לתוך התאים המכילים במגזר סטנדרטי בצורת 2 ערוצים מסידורי עם 1.2 ס"מ אורך הדרך. טען את התאים לתוך ultracentrifuge לאזן ל -22 מעלות צלזיוס למשך לפני 1 שעה לפחות כדי שקיעה.
  5. ספין דגימות ב 22 ° C ו- 167,000 XG ב הרוטור בהתאמה במשך 12 שעות, ולנטר את sedimentation של חלבון ברציפות ב 280 ננומטר. כפי שתואר קודם לכן, יחס האות לרעש הוא השתפר כאשר עוצמת האור המועברת של כל ערוץ נמדדת ולא ספיג. זה גם משפר את איכות הולם נתונים עקב.
  6. לבצע ניתוח נתונים עם SEDFIT (15.01b גרסה, דצמבר 2015), באמצעות ג הרציף מודל ההפצה (הים) 17. הדרכה המתאר כיצד להשתמש SEDFIT ניתן למצוא התייחסות 18.
    1. הגדר את רמת הביטחון להסדרת ME (מקסימום אנטרופיה) 0.7.
  7. חישוב צפיפות חיץ וכן צמיגות באמצעות SEDNTERP 19. כדי לאמוד את כמות חלבון הלקוח מצטבר, השווה את אינטגרלים של LDH משקע ב pH 4 ל- pH 7 כהפניה.
    הערה: שילוב של מגרשי הפצת השקיעה יכול להיעשות ישירות SEDFIT. תוכנות חלופיות כדי לנתח נתונים מהירים שקיעה ניתן למצוא בביקורתם אחרונה 20. </ Li>

4. ניטור MDH איון והפעלה מחדש בנוכחות HdeB

הערה: השפעת HdeB מטוהר על refolding של pH-פרש MDH נקבעה על ידי ניטור פעילות MDH על הניטרול.

  1. דגירה 1 MDH מיקרומטר במאגר D על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) במשך שעה 1 ב 37 ° C בהעדר או בנוכחות HdeB 25 מיקרומטר. לאחר מכן, להעביר את הטמפרטורה ל 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: אין refolding MDH נצפתה אפילו בנוכחות של HdeB כאשר MDH הודגר בטמפרטורות גבוהות מ -37 מעלות צלזיוס.
  2. כדי ליזום refolding של MDH מפוגל חומצה, לנטרל את דגימות ה- pH 7 על ידי תוספת של נפח 0.13-0.42 של 0.5 M פוספט נתרן, pH 8.0.
  3. לאחר דגירה עבור שעה 2 ב 20 מעלות צלזיוס, לקבוע פעילות MDH על ידי ניטור ירידה של NADH ב 340 9 ננומטר.
    הערה: MDH מזרז את הירידה תלויה-NADH של oxaloacetate לתוך L-Malate. מערבבים 50 μl של התגובה הדגירה עם 950 μl של חיץ assay (פוספט נתרן 50 מ"מ, pH 8.0, 1 מ"מ oxaloacetate, ו -150 מיקרומטר NADH).
    הערה: הריכוז הסופי של MDH למאגר assay צריך להיות 44 ננומטר.
  4. לפקח על השינוי ספיג באמצעות ספקטרופוטומטר, מצויד בלוק בקרת טמפרטורת פלטייה מוגדר 20 ° C.
  5. דווח על יחסי פעילות MDH ל -44 ננומטר יליד MDH כי נשמר ב- pH 7.0.

5. השפעת HdeB התבטאות יתר על E. coli הישרדות תחת מתח חומצה

הערה: E. coli MG1655 הדנ"א הגנומי היה מבודד באמצעות פרוטוקול שפורסם 21.

  1. להגביר hdeB מ E. MG1655 coli על ידי PCR באמצעות hdeB פריימרים - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT GTC CAA ATT CGG ו hdeB - Ecor I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC ג
  2. הגדר את תגובת PCR ב 50 μl כדלקמן: 10 μl חיץ פולימראז 5x, 200 מיקרומטר dNTPs, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD2, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD5, 150 ng MG1655 הדנ"א הגנומי, 0.5 DNA פולימרז μl, להוסיף DDH 2 O עד 50 μl.
  3. בצע הגברה של hdeB כדלקמן: שלב 1: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 1 מחזור; צעד 2: 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים; שלב 3: 10 דק 'ב 72 מעלות צלזיוס.
  4. Clone וכתוצאה מכך שבר PCR לתוך האתרים Ecor אני BamH לי של פלסמיד pBAD18 באמצעות שיטות סטנדרטיות עבור שיבוט אתר הגבלה. לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד פי הוראות היצרן. בדוק את הפלסמיד שהתקבל על ידי רצף 10.
  5. להפוך את הפלסמיד להביע HdeB או pBAD18 בקרת וקטור ריק לתוך BB7224 זן (Δ rpoH) (גנוטיפ: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / [r6; (argF-לאק) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 ארד + rpoH :: kan +; 16) באמצעות תאים מוסמכים כימי.
    הערה: זן זה הוא רגיש לטמפרטורה.
  6. לאחר 45 שניות-הלם חום על 42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד. בצע פס-outs מושבה אחת של שיבוטים חיובי דגירה לילה בשעה 30 ° C. הכן תרבות הלילה ב 50 מ"ל LB Amp ולטפח את התאים ב 200 סל"ד ו -30 מעלות צלזיוס.
  7. לדלל תרבויות לילה פי 40 ל -25 מ"ל LB Amp ולגדול החיידקים בנוכחות 0.5% arabinose (Ara) על 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד ל 600nm OD = 1.0 להשרות ביטוי חלבון HdeB.
  8. עבור ניסויי משמרת pH, השתמש LBAmp + ערה לדלל את התאים OD 600nm של 0.5 ולהתאים לערכי pH בהתאמה (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0) על ידי הוספת כמויות מתאימות של 5 M HCl.
  9. לאחר שהוחלט על נקודות זמן המצוינות (pH 2, 1 דקות; pH 3, 2.5 דקות, pH 4, 30 דק '), לנטרל את התרבויות על ידי תוספת של הכרכים המתאימים של 5 M NaOH.
  10. לפקח על הצמיחה של התרבויות לנטרל בתרבות הנוזלית במשך 12 שעות ב 30 ° C באמצעות מדידות OD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA ו HdeB הם הומולוגיים E. חלבונים coli, ידוע להגן חלבונים periplasmic נגד בתנאי עקה חומצה 10. העבודה שלנו גילתה כי בדומה HdeA, HdeB מתפקד גם בתור חומצה מופעלת מלווה מולקולרי. עם זאת, בניגוד HdeA, פונקציות HdeB ב- pH כי הוא עדיין פוטנציאל bactericidal, אך גבוה משמעותית מאשר אופטימלית pH של HdeA 6,9,10,22. כדי לחקור את אופטימלית pH של פעילות המלווה של HdeB במבחנה, יליד MDH דוללה לתוך מחומם מראש (43 ° C) החיץ של pH המצוין קיומו או אי קיומו של HdeB. לאחר 360 שניות של דגירה, תגובת הדגירה נוטרלה. נטרול זה מעורר צבירה של MDH ב -43 ° C 9. נציג התוצאות מראות כי האות-פיזור אור של MDH בהעדר HdeB מגדיל באופן דרמטי על נטרול עקב צבירה של MDH (איור 1, blקו ack בכל pH). בנוכחות HdeB, האות פיזור האור הוא ירד באופן משמעותי על נטרול מ -4 pH או pH 5 המציין HdeB מונע הצטברות של MDH (איור 1, pH 4 ו- pH 5). לעומת זאת, עם זאת, על נטרול מ pH 2 ו- pH 3, MDH אגרגטים במהירות באותה מידה עצמאית של קיומו או אי קיומו של HdeB (איור 1, pH 2 ו- pH 3), המציין כי אופטימלית pH לפעילות המלווה של HdeB הוא בין pH 4 ו 5. למאגר אחסון HdeB לא הייתה השפעה על אגרגציה MDH (איור 1, שליטת חיץ), המציין כי אות אור הפיזור המופחתת של MDH בנוכחות HdeB ב- pH 4 נובע הפונקציה המלווה שלה. HdeA הוא הלוויה של פעיל בצורה monomeric ופרש שלו ב- pH 2-3 אבל לא מראה פעילות או מעל pH 4 10. תוצאות אלו מצביעות כי HdeB יש פעילות המלווה האופטימלי שלה סביב pH 4 10.

t = "איור 1" src = "/ files / ftp_upload / 54,527 / 54527fig1.jpg" />
איור 1:. פעילות הורה מלווה של HdeB ב- pH חומצי 0.5 מיקרומטר MDH הודגר ברה חיץ מראש חימם על pH המצוין היעדרותם ונוכחותם של 12.5 מיקרומטר HdeB עבור 360 שניות ב 43 מעלות צלזיוס. ה- pH של דגימות ואז הועלה ל pH 7 (כפי שצוין על ידי הכוכבית) על ידי תוספת של 0.16-0.34 נפח 2 K unbuffered M 2 4 HPO, צבירת MDH נמדדה במשך שניות נוספות 440 על ידי פיזור אור הניטור ב 350 ננומטר pH נייטרלי (רקע כחול). איור הוא שונה מן דאל et al. 10 מחקר .זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. דאל JU, Koldewey P, סלמון L, הורוביץ S, Bardwell JC, פונקציות HdeB U. Jakob בתור המלווה חומצה-מגן בחיידקים. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. כל הזכויות שמורות האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.s / ftp_upload / 54,527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי לתת מענה אם צורות HdeB מתחמים יציבים גם עם חלבוני לקוח אחרים, 3 מיקרומטר LDH נפרשו תרמית ב 41 מעלות צלזיוס בנוכחות או בהעדר 30 מיקרומטר HdeB בתנאי pH שונה. ניתוח של התנהגות שקיעה של דגימות אלה על ידי ultracentrifugation אנליטית נערך על 22 מעלות צלזיוס. כאשר LDH ו HdeB הודגרו יחד ב- pH 7 ו -41 מעלות צלזיוס, LDH נשאר בלעדי tetrameric (משקל מולקולרי של 120 KDA) ו HdeB נשאר dimeric. תוצאות אלו הצביעו על כך החלבונים אינם מהווים מתחמי יציבה ב- pH 7, ו LDH אינו עובר שינויים בלתי הפיכים oligomerization על דגירה 20 דק 'ב 41 ° C (איור 2, קו ירוק). באופן דומה, HdeB נשאר dimeric על הדגירה על 41 ° C ו- pH 4.0, המציין כי הדגירה pH נמוךשל HdeB אינו משפיע מדינת oligomerization שלה גם בתנאי הלם חום (איור 2, קו אדום). LDH כאשר מודגרות ב- pH 4 ו -41 מעלות צלזיוס בהעדר HdeB מצטברים במהירות כפי שצוין על ידי העובדה כי 40% של LDH משקעים לפני הסריקה הראשונה נרשמה (איור 2, כאמור בפינה הימנית העליונה). LDH נותר נראה משקע בעיקר כמו מונומר (איור 2, קו כחול). לעומת זאת, דגירה של LDH ו HdeB ב- pH 4 ו -41 ° C נגרמת על חלק גדול של שני חלבונים לשתף משקעים (C HdeB-LDH), ויצר מינים חדשים עם משקל מולקולרי של 134 kDa. מין זה סביר מייצג מורכב בין הדימרים HdeB תרמית התגלגלות LDH. יתר על כן, בנוכחות HdeB, אין צבירת LDH משמעותית לפני השקיעה נצפתה, אשר עולה בקנה אחד עם מדידות הצבירה במבחנה שלנו. תוצאות אלו מראות כי HdeB מפגין פעילות המלווה ב שלהטופס dimeric ב- pH 4.0. זאת בניגוד מוחלט HdeA, אשר בת הלוויה של פעיל בצורה monomeric שלה. עצם טבעו הדינמי של HdeB שמאפשר לו לעבור rearrangements מבנית בין pH 4 ו- pH 7 די סביר עבור הפעלה של פונקציית המלווה של HdeB 10.

איור 2
איור 2:. איתור של היווצרות המורכבים בין HdeB ו LDH פרש ב- pH 4 על ידי ultracentrifugation אנליטית 3 LDH מיקרומטר הודגר בנוכחות של HdeB עודף של 10 טוחנת במאגר D (150 מ"מ KHPO 4, 150 מ"מ NaCl) במשך 15 דקות ב 41 ° C ב- pH 7 או (קו ירוק) או pH 4 (קו שחור). לשם השוואה, LDH לבד (קו כחול) או HdeB לבד (קו אדום) הודגרו במשך 15 דקות ב 41 ° C ב- pH 4. מהירות שקיעת ultracentrifugation אנליטית שמשו לקביעה והרכב של HdeB, LDH, והמתחם שנוצר בין HdeB ו LDH ב DIFתנאי pH ferent. שים לב LDH ~ 40% מצטברים לפני הסריקה הראשונה כאשר מודגרות ב- pH 4 ו בהעדר HdeB (כפי שצוין בפינה הימנית העליונה). מוצג הוא מגרש חלוקה מקדמת שקיעה (ג (ים)) ונותח באמצעות תכנית SEDFIT. מכתבים מציינים את המצב oligomeric בהתאמה של LDH או HdeB, בהתאמה: HdeB D, דימר HdeB; M LDH, מונומר LDH, LDH T, tetramer LDH; HdeB-LDH C, קומפלקס HdeB-LDH. איור הוא שונה מן דאל et al. 10. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. דאל JU, Koldewey P, סלמון L, הורוביץ S, Bardwell JC, פונקציות HdeB U. Jakob בתור המלווה חומצה-מגן בחיידקים. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. כל הזכויות שמורות האגודה האמריקאית לביולוגיה ביוכימיה מולקולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול Verשיאון של נתון זה.

כדי לבדוק אם HdeB תומך refolding של חלבוני הלקוח על נטרול ההשפעה של HdeB על refolding של MDH pH-מפוגל נותח. תרמית המפוגל MDH הודגר בערכי pH שונים בנוכחות או בהעדר HdeB. לאחר דגירה pH נמוך, ה- pH נוטרל (אשר יוזם refolding MDH), ופעילות MDH נקבע לאחר 2 שעות. כפי שניתן לראות בתרשים 3, מחדש משמעותי MDH הושגה על נטרול מ pH 4 בנוכחות HdeB. אין פעילות MDH נקבעה כאשר HdeB נעדר מן דגירת pH הנמוכה.

איור 3
איור 3: HdeB מקל על refolding של חומצה מפוגל MDH למצב פעיל enzymatically 1 MDH מיקרומטר הודגר במאגר D על pH הצביעו עבור שעה 1 ב 37 ° C בהעדר או p.resence של 25 מיקרומטר HdeB. ואז, הטמפרטורה הועברה ל -20 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני הדגימות נוטרלו ל- pH 7 על ידי התוספת של 0.5 M Na 2 HPO 4. Aliquots נלקחו לאחר 2 שעות של דגירה על 20 ° C ו assayed לפעילות MDH. MDH פעילות על נטרול בהעדר (פסים לבנים) או הנוכחות של HdeB (פסים שחורים) מוצגת. סטיית התקן נגזרה לפחות 3 מדידות עצמאיות מוצגת. איור הוא שונה מן דאל et al. 10. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. דאל JU, Koldewey P, סלמון L, הורוביץ S, Bardwell JC, פונקציות HdeB U. Jakob בתור המלווה חומצה-מגן בחיידקים. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. כל הזכויות שמורות האגודה האמריקאית לביולוגיה ביוכימיה מולקולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.

נתונים במבחנה שלנו גילה כי HdeB נקשר חלבוני הלקוח מודל אחר ב- pH 4, מונע הצטברות שלהם ומקל הלקוח refolding פעם תנאי pH ניטרלי משוחזרים. כדי לחקור את ההשפעות של HdeB in vivo, מבחני הישרדות pH תלוי נערכו שימוש זן מחיקת rpoH רגיש לטמפרטורה. זן זה חסר ביותר מלוות ולכן רגיש יותר בטמפרטורה גבוהה, pH הנמוך או עקה חמצונית 15. התבטאות יתר של HdeB בתנאי pH ניטראליים לא הראתה כל השפעה על קצב הצמיחה של הזן, שגדל וזהוב גם לזן הבקרה מטפח את pBAD18 הווקטור הריק (איור 4, ללא טיפול). לעומת זאת, מצאנו הבדלים ברורים ביכולתם לחדש את הצמיחה על הטיפול pH 3 או pH 4 עם זן overexpressing HdeB מראה התאוששות משופרת reproducibly מן בגיד pH נמוךtment מאשר זן שליטה. בניגוד לנתונים במבחנה שלנו, לעומת זאת, נוכחות של HdeB הייתה גם השפעה מגנה משמעותי ב- pH 3. זה עשוי להיות בשל הריכוז הגבוה של HdeB בתא, אשר עשוי להסיט את מדינת oligomerization של HdeB כלפי הדימרים אפילו ב- pH 3. שימו לב הסטה לתאי pH 2 או pH 3 גרמה בעבר לתופעות מהר מאוד רעילות ביותר, בעוד לא הרג משמעותי כאשר תאים בם וטופחו על pH 4 9,10,22.

איור 4
איור 4: HdeB מגן E. coli נגד pH חומצי. HdeB (עיגולים אדומים) היה ביטוי יתר BB7224 (Δ rpoH) בנוכחות arabinose 0.5% ב 30 מעלות צלזיוס. תאי BB7224 מחסת pBAD18 הווקטור הריק שמשו כבקרה (עיגולים שחורים). הפאנל העליון השמאלי מציג צמיחה של שניהם stגשמים על 30 מעלות צלזיוס, pH 7. תאים הוזזו אל pH שמציינים הוספת 5 M HCl, וטופחו במשך 1 דקות ב pH 2 (לוח ימני עליון), 2.5 דקות ב pH 3 (פנל שמאלי תחתון) או 30 דקות ב pH 4 (להנמיך פאנל מימין). בהמשך לכך, תרבויות נוטרלו על ידי הוספת כמויות מתאימות של 5 M NaOH וצמיחה היה פיקוח בתקשורת נוזלי על 30 מעלות צלזיוס. איור הוא שונה מן דאל et al. 10. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. דאל JU, Koldewey P, סלמון L, הורוביץ S, Bardwell JC, פונקציות HdeB U. Jakob בתור המלווה חומצה-מגן בחיידקים. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. כל הזכויות שמורות האגודה האמריקאית לביולוגיה ביוכימיה מולקולרית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

על מנת ללמוד את המנגנון של הפעלה מלווה פונקציה של HdeB, כמויות גדולות של HdeB צריכים לבוא לידי ביטוי ו מטוהר. מספר מערכות וקטור ביטוי זמינים לייצור רמות גבוהות של חלבון המטרה, כולל וקטורים pTrc או pBAD, אשר שניהם שימשו במחקר זה. היזמים נגישים בקלות עבור E. RNA פולימראז coli ובכך ביטוי מאפשר שהוגבר בחום של HdeB בכל E. זן coli. היבט זה רלוונטי במיוחד עבור מחקר ביטוי יתר in vivo של HdeB בתנאי קיצון חומצה, שבו זן -deficient rpoH נוצל. זן זה חסר ביותר של מלוות ובכך הוא יותר רגיש כלפי גורמי לחץ שונים, לרבות טמפרטורה גבוהה, pH הנמוך חמצוני מתח 15. כחלופה לאפשרות זו, הישרדות מחקרים דומה לאלה שהוצגו כאן ניתן לבצע זנים מוטנטים חסרי הגן של עניין.

t "> עיצוב ניסיוני עבור כל פעילות המלווה או assay refolding חייבת להישקל בזהירות, הן לגבי סוג הלקוח, ריכוז החלבון הלקוח לבין התנאים חיץ. מבחני המלווה טיפוסי, חלבונים לקוח המודל, כגון synthase ציטרט, בלוציפראז, או dehydrogenase malate הם מפוגל בריכוזים גבוהים של אוריאה או guanidine HCl, ומדולל למאגר denaturant ללא להשרות צבירה 23,13. מדידות בנוכחות מלווים לחשוף את המידה שבה הם למנוע צבירה חלבון. לחלופין, הלקוחות הם תרמית פרשו ומקבצי חלבון מנוטרים. בשני המקרים, מדידות פיזור אור משמשות readout עבור צבירת חלבון. מלווה Active למנוע הצבירה של התגלגלות חלבוני לקוח, ובכך לגרום לירידת פיזור אור האות 6. שניהם ניתן לשלב של setups אלה הניסיונות עם דגירת pH נמוכה. בנוסף להערכת molפעילות מלווה ecular ידי ניטור יכל למנוע צבירה של חלבוני לקוח מסוימים, ההשפעה של מלווה על refolding הלקוח עם שיבת תנאים שאינם מתח יכולה להיבדק 24. הדבר נכון במיוחד פשוט כאשר חלבוני הלקוח בעלי פעילות אנזימטית, אשר יכול לשמש הודעת כמותיים האיון וההפעלה מחדש שלהם. בעוד refolding בתיווך מלווה הוא טבעי תהליך תלוי ATP, מלווה periplasmic כגון HdeA, HdeB ו מרגלים הוכח להקל לקוח refolding בצורה ATP-עצמאית, עולה בקנה אחד עם חוסר אנרגית 9,25 periplasm.

הלימוד אופטימלי pH של מלווה חומצה-מגן כגון HdeB הוא מאתגר בשל סיבות שונות: (i) התנהגויות צבירה של ומבוסס גם חלבונים המלווה-לקוח כגון synthase ציטראט שונות ב- pH חומצי; ו (ii) רק כמה מערכות חיץ לעבוד בטווח pH בין 2-5 והם סוישולחן הוא עבור מלווה ריבית לבין חלבון הלקוח. החלטנו להשתמש חיץ פוספט, למרות שאנו מודעים לכך הוא מערכת חיץ בלתי אידיאלית בתנאי pH חומצי. עם זאת, נמצא חיץ פוספט להיות מתאים היטב לאפיין HdeA כבן לוויה מופעלת חומצת 9,22. מדידות צבירה הם מאוד רגישות לגבי שינויים בתוכן טמפרטורה או חיץ. כדי לחסל תוצאות חיוביות שגויות, ולכן אנו ממליצים תמיד לבדוק את ההשפעה של למאגר אחסון המלווה על צבירת לקוח (איור 1, שליטת חיץ). לפעמים אגרגציה של חלבוני הלקוח מתרחש כל כך מהר שאפילו המלווה הטוב ביותר לא יכול להיות מסוגל להתחרות עם תהליך הצבירה. לכן חיוני לבצע בדיקות מוקדמות כדי למצוא את תנאי assay האופטימליים. דוגמא טובה למצב כזה ניתנת בניסויי ultracentrifugation שלנו שבו דגירה של LDH בטמפרטורות של> 42 ° C היא כל כך מהר שאפילונוכחות של עודף HdeB אינה מונעת צבירת LDH. בנוסף, המלווה / שיתוף המלווה יחס או יחס המלווה / הלקוח צריך להיקבע 23 בזהירות. התחלנו באמצעות HdeB גבוהה למדי: יחס MDH של 50: 1 בניסויים ראשוניים וזה עזר לנו בזיהוי pH 4 כמו החומציות האופטימלית לפעילות המלווה של HdeB. לאחר מכן, אנו המשכנו בניתוח HdeB: יחסי MDH בין 1: 1 ו -50: 1 ב- pH 4, זיהוי 25: 1 להיות היחס היעיל ביותר. לעומת זאת, HdeA מורחק צבירת MDH כמו 10: 1 מלווה: יחסי לקוח 6,9,10,22. לפיכך, אנו מסיקים כי HdeA, בהשוואת HdeB, הוא יעיל יותר בדיכוי צבירת MDH כבן לוויה תחתונה: יחסי הלקוח הספיקו כדי לדכא צבירת MDH לחלוטין. גישה נוספת לחקור דיכוי בתיווך מלווה של צבירת חלבון לערב מבחנים למטה ספין, שבו אגרגטים הלקוח יוסרו על ידי צנטריפוגה ו לכמת ידי עמוד SDS. גישה זו מתאימה גם עבור מ 'onitoring ההשפעה מלווה על הצטברות חלבון in vivo. זנים מוטנטים כי גם ביטוי יתר או חוסר מלווה עניין חשופים לתנאי לחץ התגלגלות חלבון. בהמשך לכך, התאים lysed ושברים מסיסים מצטברים מופרדים לכמת 15,16,26.

לגילוי של המתחם הלקוח המלווה, אנחנו מוחלים ultracentrifugation אנליטית. יוער כאן, כי על פי הגדרת הניסוי לא ניתן לכמת את הכמות ישירה של HdeB ו מונומרים LDH בכריכת מורכבת זו, כמו גם החלבונים לספוג ב 280 ננומטר. אם תרצה, והרכב של המתחם המלווה-לקוח יכול להיקבע בנפרד על ידי תיוג המלווה וחלבון הלקוח עם chromophore, מקסימום עירור ב'בובו בטווח הנראה. לחלופין, והרכב של לקוחות כדי המלוות בתוך מתחמים ניתן לקבוע באמצעות עמוד יליד יחד עם כתם מערבי כמותית. על ידי ביצוע הפרוטוקולים שהוצגו כאן, הצלחנו לאפיין שני מלווים מולקולריים, HdeA, ו HdeB 9,10,22. באופן כללי, מבחנים אלה יכולים לשמש גם כדי לחקור את התפקיד של מעכבי פוטנציאל של מלווים מולקולריים refolding חלבון במבחנת in vivo או ניתן ליישם לבדוק מלוות סינטטיים על יכולת למנוע צבירת לקוח תחת לחץ חומצה. בנוסף, הפרוטוקולים שהוצגו כאן ניתן להשתמש עבור ניתוחים של נקודה-מוטציות ו / או וריאציות קטועות של המלוות המופעל חומצה על מנת לשפוך אור לתוך מנגנון ההפעלה שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר קלאודיה Cremers עבור עצתה המועילה על מבחני מלווה. קן וואן הוא הודה לקבלת הסיוע הטכני שלו טיהור HdeB. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הרפואי של הווארד יוז (כדי JCAB) לבין המכון הלאומי לבריאות מענק RO1 GM102829 כדי JCAB ו UJJ-UD הוא נתמך על ידי מענק מחקר בתר-דוקטוריאלי מסופק על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20, (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37, (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280, (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290, (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21, (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73, (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72, (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40, (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78, (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271, (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53, (5), 689-699 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats