Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Cite this Article

Copy Citation

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De bacteriën worden vaak blootgesteld aan veranderingen in de omgeving, zoals veranderingen in pH, temperatuur, redox status belichting of mechanische kracht. Veel van deze aandoeningen veroorzaken eiwitontvouwende in de cel en hebben nadelige invloed op de overleving van het organisme. Een groep van onafhankelijke, stress-specifieke moleculaire chaperones is aangetoond dat essentiële rol spelen bij de overleving van deze stresscondities. Terwijl volledig gevouwen en chaperonne-inactief voor stress, deze eiwitten snel ontvouwen en worden chaperone-actief onder specifieke stress-condities. Eenmaal geactiveerd, deze conditioneel wanordelijke chaperones binden aan een groot aantal verschillende aggregerende eiwitten voorkomen dat hun aggregatie en proteïne hervouwing bij terugkeer naar niet-stressomstandigheden direct of indirect vergemakkelijken. De primaire benadering voor het verkrijgen van een meer gedetailleerd begrip van het mechanisme van de activatie en client erkenning omvat de zuivering en subsequent karakterisering van deze eiwitten toepassing van in vitro assays chaperon. Follow-up in vivo stress-tests zijn absoluut essentieel om zelfstandig te bevestigen de in vitro resultaten.

Dit protocol beschrijft in vitro en in vivo methoden om de chaperone activiteit van E. karakteriseren coli HdeB een zuur geactiveerde chaperonne. Lichtverstrooiingsmetingen werden gebruikt als geschikte uitlezing capaciteit HdeB om zuur-geïnduceerde aggregatie van een gevestigd model client eiwit, MDH voorkomen in vitro. Analytische ultracentrifugatie-experimenten werden toegepast op complexvorming tussen HdeB en haar opdrachtgever eiwit LDH onthullen, om licht te werpen op het lot van de cliënt eiwitten op hun terugkeer naar non-stress-condities. Enzymatische activiteit assays van de cliënt eiwitten werden uitgevoerd om de effecten van HdeB op pH geïnduceerde client inactivatie en reactivering controleren. Ten slotte werden de overleving studies gebruikt om Monitor de invloed van HdeB's chaperone functie in vivo.

Introduction

Een gemeenschappelijke natuurlijke omgeving waarin microbiële ziekteverwekkers ervaren zuur-geïnduceerde eiwit ontvouwen omstandigheden is het zoogdier maag (pH 1-4), waarvan de zure pH fungeert als een effectieve barrière tegen voedsel overgedragen pathogenen 1. Eiwitontvouwende en aggregatie, die wordt veroorzaakt door aminozuurzijketen protonering, beïnvloedt biologische processen, schade celstructuren en uiteindelijk leidt tot celdood 1,2. Aangezien de pH van het bacteriële periplasma in evenwicht vrijwel onmiddellijk de pH van het milieu door de vrije diffusie van protonen door de poreuze buitenste membraan periplasmische en binnenste membraan eiwitten van Gram-negatieve bacteriën zijn de meest kwetsbare cellulaire componenten onder zure-stressomstandigheden 3. Om hun periplasmische proteoom tegen snelle-zuur bemiddelde schade te beschermen, Gram-negatieve bacteriën maken gebruik van de zuur geactiveerde periplasmatische chaperones HdeA en HdeB. HdeA is een voorwaardelijk ontregeld chaperonne 6,7. Activering van HdeA vereist ingrijpende structurele veranderingen, inclusief de dissociatie in monomeren en de gedeeltelijke ontvouwing van de monomeren 6-8. Eenmaal geactiveerd HdeA bindt aan eiwitten die zich ontvouwen onder zure omstandigheden. Het voorkomt effectief hun aggregatie, zowel tijdens de incubatie bij lage pH alsmede op pH neutralisatie. Bij terugkeer naar pH 7,0, HdeA vergemakkelijkt het opnieuw vouwen van zijn cliënt eiwitten in een ATP-onafhankelijke wijze en zet terug in zijn dimeer, chaperonne-inactieve conformatie 9. Ook de homologe chaperon HdeB ook chaperone-inactief bij pH 7,0. In tegenstelling tot HdeA echter HdeB's chaperone activiteit bereikt haar ogenschijnlijke maximum bij pH 4,0, onder welke voorwaarden HdeB is nog grotendeels gevouwen en dimeer 10. Bovendien verdere verlaging van de pH causes de inactivatie van HdeB. Deze resultaten suggereren dat ondanks hun uitgebreide homologie, HdeA en HdeB verschillen in hun wijze van functionele activatie waarbij zij een breed pH-traject met hun beschermende chaperone functie dekken. Een andere chaperone die is betrokken bij de zuurbestendigheid van E. coli is de cytoplasmatische Hsp31, die lijkt te ongevouwen client eiwitten te stabiliseren tot neutrale omstandigheden worden hersteld. De precieze werkingsmechanisme Hsp31's, echter, is raadselachtig 12 gebleven. Aangezien andere enteropathogene bacteriën zoals Salmonella niet de hdeAB operon, is het zeer waarschijnlijk dat andere ongeïdentificeerde periplasmatische chaperons kunnen bestaan die betrokken zijn bij zuurbestendigheid van deze bacteriën 11 zijn.

De protocollen die hier laat de pH-afhankelijke chaperone activiteit van HdeB controleren in vitro en in vivo 10 en kunnen worden toegepast op andere chaperons onderzoekenzoals Hsp31. Als alternatief, het complex netwerk van transcriptiefactoren die de expressie van hdeAB controle kan mogelijk worden onderzocht door de spanning in vivo assay. Om de chaperone functie van eiwitten in vivo te karakteriseren, kan verschillende experimentele opstellingen worden toegepast. Een route naar eiwitontvouwende stressomstandigheden toepassing en fenotypische karakterisatie van mutante stammen die hetzij overexpressie het gen van belang of een bij deletie van het gen. Proteomics studies kunnen worden uitgevoerd om eiwitten te identificeren die niet langer aggregaat stressomstandigheden als de chaperonne aanwezig is, of de invloed van een chaperonne op een specifiek enzym kan tijdens stressomstandigheden middels enzymatische assays 14-16 bepaald. In deze studie hebben we ervoor gekozen om HdeB overexpressie in een rpoH deletie stam, die de warmte shock sigma factor 32. rpoH de expressie van alle belangrijke E. controleert ontbeert coli chaperones en de deletie bekend sens vergrotenItivity ecologische stress omstandigheden die eiwitontvouwende 15 veroorzaken. De in vivo activiteit van chaperone HdeB werd bepaald door het volgen zijn vermogen om de pH gevoeligheid van de Δ rpoH stam onderdrukken. In totaal protocollen die hier zorgen voor een snelle en eenvoudige benadering om de activiteit van een zuur geactiveerde chaperone karakteriseren in vitro als in in vivo context.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Expressie en zuivering van Periplasmatische HdeB

OPMERKING: HdeB werd tot expressie gebracht in E. coli-cellen die het plasmide pTrc- HdeB 10 en gezuiverd uit het periplasma van polymyxine lysis.

  1. Bereid een overnachting cultuur van E. coli-cellen die het plasmide pTrc- HdeB 10 in 30 ml LB met 200 ug / ml ampicilline (LB Amp). Inoculeer vier cultures 1 L LB Amp en ze groeien bij 37 ° C en 200 rpm, tot OD 600 nm van 0,7 wordt bereikt. Voeg vervolgens 300 pM IPTG om de expressie van HdeB induceren en de kweektemperatuur tot 30 ° C te verlagen.
  2. Na 5 h eiwitexpressie bij 30 ° C, verzamel de cellen door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  3. Was de celpellet met 100 ml de cellen opnieuw buffer A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) en gecentrifugeerd bij 8000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  4. Vervolgens resuspendeerde celpellet in 80 ml buffer A, bevattende 1 mg / ml polymyxine sulfaat. Voor een efficiënte verstoring van het buitenmembraan, Roer de suspensie gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  5. De cytoplasmatische fractie en celresten te verwijderen, centrifuge de suspensie gedurende 20 min bij 15.000 xg bij 4 ° C. Dit leidt tot ~ 60 ml supernatant die de oplosbare HdeB.
  6. Dialyseer het supernatant overnacht met de periplasmatische extract tegen 150x volume buffer B (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) onder toepassing van een dialysemembraan met 6 kDa MW cut-off. Concentreer de eiwitten 15 ml middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 3 kDa. Filtreer de eiwitoplossing met een 0,2 um porie filter.
  7. Breng het eiwit op een anion uitwisseling chromatografie kolom (kolomvolume 5 ml) die is geëquilibreerd met 5 kolomvolumes buffer B met een stroomsnelheid van 2,5 ml / min. Zodra het eiwit op de kolom geladen, wassen van de kolom met buffer B gedurende 10 min bijeen stroomsnelheid van 2,5 ml / min. Elueer HdeB met een lineaire gradiënt 0-0,5 M NaCl in buffer B gedurende een periode van 50 min met een stroomsnelheid van 2,5 ml / min 6.
  8. Identificeer fracties die HdeB met een 15% SDS-PAGE Meng 20 pl monster met 5 pi 5x gereduceerd SDS laadbuffer. Belasting 10 pl op de gel en uitgevoerd in Tris-glycinebuffer (14,4 g / l glycine, 2,9 g / l Tris, 1 g / l natriumdodecylsulfaat, pH 8,3). Voer de elektroforese bij 150 V totdat de broomfenolblauw band dicht is gemigreerd naar de onderkant van de gel (~ 45 minuten).
  9. Pool alle HdeB-bevattende fracties, dialyseren bij 4 ° C overnacht tegen 4 L HdeB opslagbuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) en concentreer het eiwit tot ongeveer 300 uM middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 3 kDa. Bepaal de concentratie van HdeB bij 280 nm met behulp van de extinctiecoëfficiënt ε 280 nm = 15.595 M -1 cm -1. Bereid 100 ul aliquots en flash-vrijZé de monsters in vloeibare stikstof.
    OPMERKING: HdeB kan ten minste 6 maanden worden bewaard bij -70 ° C.

2. Chaperone Activity Assay Met behulp Thermisch Unfolding malaatdehydrogenase (MDH)

OPMERKING: De invloed gezuiverd HdeB op de aggregatie van thermisch ontvouwen varkens mitochondriaal malaatdehydrogenase (MDH) bij verschillende pH-waarden werd gevolgd zoals hierna beschreven. Alle vermelde eiwitconcentraties verwijzen naar de monomeerconcentratie.

  1. Om MDH bereiden dialyseren MDH bij 4 ° C overnacht tegen 4 liter buffer C (50 mM kaliumfosfaat, 50 mM NaCl, pH 7,5) en concentreer het eiwit ongeveer 100 uM middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 30 kDa.
    OPMERKING: Zorgvuldige dialyse van MDH is vereist als MDH wordt geleverd ammoniumsulfaatoplossing.
  2. Om aggregaten te verwijderen, centrifugeer het eiwit gedurende 20 min bij 20.000 xg bij 4 ° C. Bepaal MDH concentratie door absorptie bij 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7950 M-1 cm-1). Bereid 50 pi fracties van MDH en flash-bevriezing van de monsters voor opslag.
  3. Plaats 1 ml kwartscuvette in een fluorescentie spectrofotometer uitgerust met temperatuurgestuurde monster houders en roerder. Stel λ ex / em tot 350 nm.
  4. Voeg juiste volumes voorverwarmde (43 ° C) buffer D (150 mM kaliumfosfaat, 150 mM NaCl) en het gewenste pH-waarden (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 en pH 5,0) aan de cuvet en set de temperatuur van de cuvettehouder tot 43 ° C. Het totale volume 1.000 III.
  5. Voeg 12,5 pM HdeB (of als alternatief hetzelfde volume HdeB opslagbuffer voor de buffer) om de buffer, gevolgd door toevoeging van 0,5 uM MDH. Begin bewaken lichtverstrooiing. Incubeer het reactiemengsel gedurende 360 ​​seconden voldoende om ontvouwen van MDH.
  6. Breng de pH op 7 door toevoeging van 0,16-0,34 volume van 2 M gebufferd K 2 HPO 4 en blijven regens lichtverstrooiing voor nog eens 440 sec.
  7. Stel de mate van aggregatie MDH welke is genoteerd in afwezigheid van de chaperonne op een bepaalde tijdstip na neutralisatie (hier na 500 sec, bij maximale lichtverstrooiing van MDH waargenomen) tot 100%. Normaliseren activiteit HdeB om de lichtverstrooiing signaal MDH in afwezigheid van HdeB op elk aangegeven pH.

3. Detectie van HdeB-LDH Complex Vorming door Analytical Ultracentrifugatie (AUC)

OPMERKING: sedimentatiesnelheid experimenten HdeB alleen of in complex met thermisch ontvouwen lactaat dehydrogenase (LDH) werden uitgevoerd met een analytische ultracentrifuge

  1. LDH bereiden dialyseren LDH bij 4 ° C overnacht tegen 4 liter buffer C (50 mM kaliumfosfaat, 50 mM NaCl, pH 7,5) en concentreer het eiwit tot ongeveer 200 uM middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 30 kDa.
    OPMERKING: Zorgvuldige dialyse van LDH vereist LDH wordt geleverd als ammoniumsulfaatoplossing.
  2. Aggregaten, centrifuge LDH verwijderen gedurende 20 min bij 20.000 xg bij 4 ° C. Bepaal LDH concentratie door absorptie bij 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M-1 cm-1). Bereid 50 pi fracties van LDH en flash-bevriezing van de monsters voor opslag.
  3. Incubeer 3 uM LDH in de aanwezigheid en afwezigheid van 30 uM HdeB in buffer D (pH 4 en 7, respectievelijk) gedurende 15 minuten bij 41 ° C.
    OPMERKING: Incubatie van LDH bij hogere temperaturen resulteert in de volledige aggregatie en geen chaperonne effect HdeB kan worden waargenomen.
  4. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur. Vervolgens load monsters in cellen met standaard sector gevormde 2-kanaals centerpieces met een lengte van 1,2 cm pad. Laad de cellen in de ultracentrifuge en equilibreren tot 22 ° C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan sedimentatie.
  5. Spin monsters bij 22 ° C en 167.000 x g in de respectieve rotor gedurende 12 uur, en controleren sedimentation van het eiwit continu bij 280 nm. Zoals eerder aangetoond, wordt de signaal-ruisverhouding verbeterd wanneer de doorgestraalde lichtintensiteit van elk kanaal wordt gemeten in plaats van absorptie. Dit verbetert ook de kwaliteit van de volgende gegevensveld fitting.
  6. Voeren data-analyse met SEDFIT (versie 15.01b, december 2015), met behulp van de continue c (s) distributiemodel 17. Een tutorial die beschrijven hoe SEDFIT gebruik kan worden gevonden in referentie 18.
    1. Stel het betrouwbaarheidsniveau van de ME (Maximum Entropy) regularisatie tot 0,7.
  7. Bereken buffer dichtheid en viscositeit met behulp SEDNTERP 19. Om de hoeveelheid geaggregeerd eiwit te schatten client vergelijken integralen gesedimenteerde LDH in pH 4 tot pH 7 als referentie.
    LET OP: Integratie van de sedimentatie distributie plots kunnen direct worden gedaan in SEDFIT. Alternatieve software om sedimentatie snelheid data te analyseren kan worden gevonden in een recente beoordeling 20. </ Li>

4. Monitoring MDH inactivatie en Reactivering in de tegenwoordigheid van HdeB

OPMERKING: De invloed gezuiverd HdeB op de hervouwing van pH-ongevouwen MDH werd bepaald door het volgen MDH activiteit voor neutralisatie.

  1. Incubeer 1 uM MDH in buffer D op de gewenste pH-waarden (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 en pH 5,0) gedurende 1 uur bij 37 ° C in afwezigheid of aanwezigheid van 25 uM HdeB. Vervolgens verschuift de temperatuur tot 20 ° C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Geen MDH opnieuw vouwen werd zelfs in aanwezigheid van HdeB waargenomen wanneer MDH werd geïncubeerd bij temperaturen boven 37 ° C.
  2. Om hervouwing zuur gedenatureerd MDH inleiding monsters neutraliseren tot pH 7 door toevoeging van 0,13-0,42 volume 0,5 M natriumfosfaat, pH 8,0.
  3. Na incubatie gedurende 2 uur bij 20 ° C, bepaalt MDH activiteit door het volgen van de afname van NADH bij 340 nm 9.
    LET OP: MDH katalyseert de NADH-afhankelijke reductie van oxaalacetaat in de L-malaat. Meng 50 pl van de incubatie reactie met 950 pl testbuffer (50 mM natriumfosfaat, pH 8,0, 1 mM oxaalacetaat en 150 uM NADH).
    OPMERKING: De eindconcentratie van MDH in de testbuffer moet 44 nM.
  4. Registreren de absorptie met een spectrofotometer, uitgerust met een Peltier blok voor de temperatuurregeling ingesteld op 20 ° C.
  5. Rapporteren de MDH activiteit ten opzichte van 44 nM inheemse MDH die bij een pH van 7,0 heeft gehouden.

5. Effect van HdeB overexpressie op E. coli Survival onder Acid Stress

LET OP: E. coli MG1655 genomisch DNA werd geïsoleerd met behulp van een gepubliceerd protocol 21.

  1. Amplify HdeB van E. coli MG1655 door PCR met behulp van primers HdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT en HdeB - EcoRI-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. Stel de PCR reactie in 50 gl als volgt: 10 pl 5x polymerase buffer, 200 uM dNTPs, 0,5 uM primer JUD2, 0,5 pM primer JUD5, 150 ng genomisch DNA MG1655, 0,5 pl DNA polymerase, voeg DDH 2 O tot 50 pl.
  3. Voer amplificatie van HdeB als volgt: Stap 1: 5 min bij 95 ° C, 1 cyclus; stap 2: 30 s bij 95 ° C, 30 sec bij 55 ° C, 30 sec bij 72 ° C, 40 cycli; Stap 3: 10 min bij 72 ° C.
  4. Kloon resulterende PCR fragment in de EcoRI en BamHI plaatsen van plasmide pBAD18 toepassing van standaardmethoden voor restrictieplaats klonen. Zuiver het plasmide met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Controleer het verkregen plasmide door sequentiebepaling 10.
  5. Transformeer de plasmide dat HdeB of de lege vector controle pBAD18 in stam BB7224 (Δ rpoH) (genotype: F -, λ -, E14 - [araD139] B / r [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: Kan +; 16) met behulp van chemisch competente cellen.
    LET OP: Deze soort is temperatuurgevoelig.
  6. Na 45 sec warmteschok bij 42 ° C en voorafgaand aan het plateren, incubeer cellen bij 30 ° C en 200 rpm. Voer enkele kolonie streak-outs van de positieve klonen en incubeer overnacht bij 30 ° C. Bereid een kweek gedurende de nacht in 50 ml LB Amp en cultiveren van de cellen bij 200 rpm en 30 ° C.
  7. Verdun overnachtkweken 40-voudig in 25 ml LB Amp en groeien de bacteriën in aanwezigheid van 0,5% arabinose (Ara) bij 30 ° C en 200 rpm tot een OD 600 nm = 1,0 tot HdeB eiwitexpressie induceren.
  8. Voor de pH-shift experimenten, gebruik LBAmp + Ara aan de cellen verdund tot OD 600 nm van 0,5 en aan te passen aan de respectievelijke pH-waarden (hier: pH 2,0, pH 3,0 en pH 4,0) door toevoeging van voldoende hoeveelheden van 5 M HCl.
  9. Na de aangegeven tijdspunten (pH 2, 1 minuut, pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutraliseren de kweken door toevoegen van de geschikte volumes 5 M NaOH.
  10. Bewaken van de groei van de geneutraliseerde cultures in vloeibare kweek gedurende 12 uur bij 30 ° C middels OD metingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA en HdeB homoloog E. coli eiwitten bekend periplasmatische eiwitten te beschermen tegen zure stressomstandigheden 10. Ons werk blijkt dat vergelijkbaar HdeA, HdeB functioneert ook als een zure moleculaire chaperon geactiveerd. In tegenstelling tot HdeA, HdeB functies op een pH die potentieel nog bactericide, maar aanzienlijk hoger dan het pH optimum van HdeA 6,9,10,22. Om het pH optimum van HdeB's chaperone activiteit in vitro te onderzoeken, werd natieve MDH verdund in voorverwarmde (43 ° C) buffer van de aangegeven pH in de aanwezigheid of afwezigheid van HdeB. Na 360 sec incuberen werd de incubatie reactiemengsel geneutraliseerd. Deze neutralisatie leidt tot samenvoeging van MDH bij 43 ° C 9. Representatieve resultaten tonen aan dat de lichtverstrooiende signaal MDH in afwezigheid van HdeB sterk verhoogd na neutralisatie door aggregatie van MDH (figuur 1, black lijn bij elke pH). In aanwezigheid van HdeB, is het lichtverstrooiende signaal significant af na neutralisatie van pH 4 of pH 5 aangeeft dat HdeB voorkomt aggregatie van MDH (figuur 1, pH 4 en pH 5). In tegenstelling echter na neutralisatie van pH 2 en pH 3, MDH snel aggregaten in dezelfde mate onafhankelijk van de aanwezigheid of afwezigheid van HdeB (figuur 1, pH 2 en pH 3), wat aangeeft dat het pH optimum voor chaperone activiteit HdeB is tussen pH 4 en 5. de HdeB opslagbuffer had geen effect op MDH aggregatie (figuur 1, bufferbesturing), wat aangeeft dat de verlaagde lichtverstrooiende signaal MDH in aanwezigheid van HdeB bij pH 4 is vanwege de chaperone functie. HdeA chaperonne is actief in de monomere en ongevouwen vorm bij pH 2-3, maar vertoont geen activiteit bij of boven pH 4 10. Deze resultaten suggereren dat HdeB heeft een optimale activiteit rond een pH chaperone 4 10.

t = "Figuur 1" src = "/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
Figuur 1:. Chaperone activiteit van HdeB bij zure pH 0,5 pM MDH werd geïncubeerd in voorverwarmde buffer D bij de aangegeven pH in de afwezigheid of aanwezigheid van 12,5 uM HdeB voor 360 sec bij 43 ° C. De pH van de monsters werd vervolgens verhoogd tot pH 7 (zoals aangegeven door het sterretje) door toevoeging van 0,16-0,34 volume 2 M gebufferd K 2 HPO 4, werd MDH aggregatie gemeten gedurende nog 440 sec door het monitoren lichtverstrooiing bij 350 nm bij neutrale pH (blauwe achtergrond). Cijfer is gewijzigd ten opzichte van Dahl et al. 10 .Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Zalm L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB functioneert als een zuur-beschermende chaperone in bacteriën. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanpakken of HdeB vormt ook stabiele complexen met andere cliënt eiwitten, werd 3 pM LDH thermisch ontvouwen bij 41 ° C in aanwezigheid of afwezigheid van 30 uM HdeB bij verschillende pH-omstandigheden. Analyse van het sedimentatiegedrag van deze monsters door analytische ultracentrifugatie werd uitgevoerd bij 22 ° C. Wanneer LDH en HdeB samen bij pH 7 en 41 ° C werden geïncubeerd, LDH bleef alleen tetramere (molecuulgewicht van 120 kDa) en dimere HdeB bleef. Deze resultaten gaven aan dat de eiwitten niet stabiel complexen bij pH 7 en LDH geen onomkeerbare veranderingen in oligomerisatie na een 20 min incubatie bij 41 ° C (Figuur 2, groene lijn) ondergaan. Evenzo bleef HdeB dimere na incubatie bij 41 ° C en pH 4,0, hetgeen aangeeft dat lage pH incubatievan HdeB heeft geen invloed op de oligomerisatie staat zelfs onder heat shock omstandigheden (figuur 2, rode lijn). LDH wanneer geïncubeerd bij pH 4 en 41 ° C in afwezigheid van HdeB snel samengevoegd zoals aangegeven door het feit dat 40% van LDH gesedimenteerd vóór de eerste scan werd opgenomen (Figuur 2, vermeld in de rechterbovenhoek). De resterende LDH bleek overwegend sediment als monomeer (Figuur 2, blauwe lijn). Daarentegen incubatie van LDH en HdeB bij pH 4 en 41 ° C veroorzaakt een groot deel van de twee eiwitten samen te sediment (HdeB LDH-C), waardoor een nieuw soort met een molecuulgewicht van 134 kDa. Deze soort waarschijnlijk vertegenwoordigt een complex tussen HdeB dimeren en thermisch ontvouwen LDH. Bovendien, in aanwezigheid van HdeB geen significante aggregatie LDH voor de sedimentatie waargenomen, hetgeen consistent is met onze in vitro aggregatie metingen. Deze resultaten tonen dat HdeB vertoont chaperone activiteit in dedimere vorm bij pH 4,0. Dit staat in schril contrast met HdeA, die in zijn actieve monomere vorm wordt chaperonne. De zeer dynamische aard van HdeB waardoor deze kan structurele herschikkingen tussen pH 4 en pH 7 ondergaat waarschijnlijk voldoende is voor de activering van de HdeB chaperone functie 10.

Figuur 2
Figuur 2:. Detectie van complexvorming tussen HdeB en uitklapbaar LDH bij pH 4 door analytische ultracentrifugatie 3 pM LDH werd geïncubeerd in aanwezigheid van een 10-molaire overmaat HdeB in buffer D (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) gedurende 15 min bij 41 ° C op een van beide pH 7 (groene lijn) of pH 4 (zwarte lijn). Ter vergelijking, LDH alleen (blauwe lijn) of HdeB alleen (rode lijn) werden gedurende 15 minuten bij 41 ° C bij pH 4. Analytische ultracentrifugatie sedimentatiesnelheid werd gebruikt om de stoichiometrie van HdeB bepalen LDH en het gevormde complex tussen HdeB en LDH bij diflende pH-omstandigheden. Merk op dat ~ 40% LDH geteld alvorens de eerste scan wanneer geïncubeerd bij pH 4 en in afwezigheid van HdeB (zoals in de rechter bovenhoek). Getoond wordt een sedimentatiecoëfficiënt verdelingsgrafiek (c (en)) geanalyseerd met het programma SEDFIT. Letters geven de respectievelijke oligomere toestand van LDH of HdeB respectievelijk: HdeB D, HdeB dimeer; LDH M, LDH monomeer, LDH T, LDH tetrameer; HdeB-LDH C, HdeB-LDH complex. Figuur is gemodificeerd door Dahl et al. 10. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Zalm L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB functioneert als een zuur-beschermende chaperone in bacteriën. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Klik hier om een grotere ver te bekijkending van dit cijfer.

Om te testen of HdeB ondersteunt de hervouwing van de cliënt eiwitten na neutralisatie, HdeB's invloed op de hervouwing van pH gedenatureerd MDH werd geanalyseerd. Thermisch gedenatureerd MDH werd geïncubeerd bij verschillende pH-waarden in de aanwezigheid of afwezigheid van HdeB. Na lage pH incubatie werd de pH geneutraliseerd (die MDH hervouwing initieert) en MDH activiteit werd bepaald na 2 uur. Zoals getoond in figuur 3, werd significante reactivering van MDH bereikt na neutralisatie van pH 4 bij aanwezigheid van HdeB. Geen MDH activiteit werd bepaald wanneer HdeB afwezig was van de lage pH incubatie.

figuur 3
Figuur 3: HdeB vergemakkelijkt het opnieuw vouwen van gedenatureerde zuur MDH tot een enzymatisch actieve toestand 1 uM MDH werd geïncubeerd in buffer D bij de aangegeven pH voor 1 uur bij 37 ° C in afwezigheid of p.resence van 25 uM HdeB. Vervolgens werd de temperatuur verschoven naar 20 ° C gedurende 10 min voor de monsters op pH 7 geneutraliseerd door toevoeging van 0,5 M Na 2 HPO 4. Aliquots werden genomen na 2 uur incuberen bij 20 ° C en geanalyseerd op MDH activiteit. MDH activiteit voor neutralisatie in de afwezigheid (witte staven) of aanwezigheid van HdeB (zwarte staven) getoond. Standaarddeviatie afgeleid van ten minste 3 onafhankelijke metingen weergegeven. Figuur is gemodificeerd door Dahl et al. 10. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Zalm L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB functioneert als een zuur-beschermende chaperone in bacteriën. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

Onze in vitro gegevens blijkt dat HdeB bindt ander model client eiwitten bij pH 4, voorkomt de aggregatie en vergemakkelijkt client opnieuw vouwen zodra neutrale pH-omstandigheden worden hersteld. Om de effecten van HdeB in vivo te onderzoeken werden pH-afhankelijke overleving assays uitgevoerd met het temperatuurgevoelige rpoH deletiestam. Deze stam mist meest chaperones en is daarom gevoelig voor verhoogde temperatuur, lage pH of oxidatieve stress 15. Overexpressie van HdeB onder neutrale pH-omstandigheden toonde geen effect op de groei van de stam, die relatief goed groeide uit tot de controle stam die de lege vector pBAD18 (Figuur 4, onbehandeld) herbergt. In tegenstelling, vonden we duidelijke verschillen in hun vermogen om hervatten de groei van de pH 3 of pH 4 behandeling met de HdeB overexpressie stam waaruit reproduceerbaar verbeterd herstel van lage pH treatment dan de controle stam. In tegenstelling tot onze in vitro data echter aanwezig HdeB hadden ook een significant beschermend effect bij een pH van 3. Dit kan te wijten zijn aan de hoge concentratie van HdeB in de cel, waarbij de oligomerisatie toestand van HdeB zelfs bij pH kan verschuiven naar dimeren 3. Merk op dat de verschuiving cellen tot pH 2 en pH 3 resulteerde in zeer snelle en uiterst toxische effecten, maar geen significante doding waargenomen wanneer cellen wanneer geïncubeerd bij pH 4 9,10,22.

figuur 4
Figuur 4: HdeB beschermt E. coli tegen zure pH. HdeB (rode cirkels) werd tot overexpressie gebracht in BB7224 (Δ rpoH) in aanwezigheid van 0,5% arabinose bij 30 ° C. BB7224 cellen die de lege vector pBAD18 werden gebruikt als controle (zwarte cirkels). Linker paneel toont groei van zowel stregen bij 30 ° C werden pH 7. Cellen verschoven naar de aangegeven pH door toevoeging van 5 M HCl en gedurende 1 min bij pH 2 (bovenste rechterpaneel), 2,5 min bij pH 3 (linker paneel) of 30 minuten bij pH 4 (lagere rechter paneel). Vervolgens werden de kweken geneutraliseerd door toevoeging van voldoende hoeveelheden van 5 M NaOH en de groei werd gevolgd in vloeibaar medium bij 30 ° C. Figuur is gemodificeerd door Dahl et al. 10. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Zalm L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB functioneert als een zuur-beschermende chaperone in bacteriën. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om het mechanisme van activering en chaperone functie van HdeB bestuderen, grote hoeveelheden HdeB moet expressie gebracht en gezuiverd. Verschillende expressie vectorsystemen zijn beschikbaar voor de productie van hoge niveaus van een doelwiteiwit, waaronder pTrc of pBAD vectoren, die beide werden gebruikt in deze studie. De promotors zijn gemakkelijk toegankelijk zijn voor E. coli RNA polymerase en laten dan sterk opgereguleerd expressie van HdeB in een E. coli stam. Dit aspect is bijzonder relevant voor in vivo studie van overexpressie HdeB onder zure stressomstandigheden, waarbij het rpoH deficiënte stam werd gebruikt. Deze stam mist meeste chaperones en dus is gevoelig voor verschillende stressoren, zoals verhoogde temperaturen, lage pH en oxidatieve stress 15. Als alternatief overlevingsstudies vergelijkbaar met degene die hier kunnen worden uitgevoerd mutante stammen die het gen van belang missen.

t "> De experimentele opzet voor chaperone activiteit of hervouwing assay zorgvuldig worden overwogen, zowel met betrekking tot het soort cliënt, de concentratie van de cliënt eiwit en bufferomstandigheden. In typische chaperon assays model client eiwitten, zoals citraat synthase, luciferase of malaatdehydrogenase gedenatureerd in hoge concentraties van ureum of guanidine-HCI en verdund in denatureringsmiddel vrije buffer om aggregatie te induceren 23,13. Metingen in aanwezigheid van chaperones onthullen de mate waarin zij voorkomen eiwitaggregatie. als alternatief kan de klant thermisch ontvouwen en eiwitaggregatie wordt gevolgd. in beide gevallen worden lichtverstrooiingsmetingen als uitlezing voor eiwitaggregatie. Actieve chaperones voorkomen aggregatie van ontvouwen client eiwitten, waardoor een verlaging van de lichtverstrooiing signaal 6 veroorzaken. beide deze experimentele opstellingen kunnen worden gecombineerd met lage pH incubatie. Naast beoordeling van de molecular chaperone activiteit door het volgen van hun vermogen om aggregatie van bepaalde cliënt eiwitten te voorkomen, kan de invloed van chaperones op client hervouwing bij terugkeer naar niet-stress-condities worden getest 24. Dit is bijzonder duidelijk wanneer de cliënt eiwitten hebben enzymatische activiteit, welke kan worden gebruikt als kwantitatieve uitlezing voor de inactivering en heractivering. Terwijl de chaperonne gemedieerde hervouwing van nature een ATP-afhankelijk proces, hebben periplasmatische chaperons zoals HdeA, HdeB en Spy aangetoond client hervouwing in een ATP-onafhankelijke manier, in overeenstemming met het gebrek aan energie in het periplasma 9,25 vergemakkelijken.

Het bestuderen van de pH-optimum van een zuur-beschermende chaperone zoals HdeB uitdagend om verschillende redenen: (i) aggregatie gedrag zelfs gevestigde chaperone-eiwitten client zoals citraat synthase verschillen bij zure pH; en (ii) in enkele buffersystemen werken in het pH-traject tussen 2,5 en zijn suitabel voor zowel de chaperonne van de rente en de klant eiwit. We besloten om fosfaatbuffer gebruiken, hoewel we weten dat dit een niet-ideale buffersysteem onder zure pH-omstandigheden. Echter werd fosfaatbuffer bevonden goed geschikt voor HdeA karakteriseren zuur geactiveerde chaperonne 9,22. Aggregatie metingen zeer gevoelig voor veranderingen in temperatuur of bufferinhoud. Om vals-positieve resultaten te elimineren, we adviseren daarom om altijd de invloed van chaperonne opslagbuffer op client aggregatie (figuur 1, buffer controle) te testen. Soms aggregatie van de cliënt eiwit voorkomt zo snel dat zelfs de beste chaperonne niet kunnen concurreren met de aggregatie zou kunnen zijn. Het is daarom essentieel voorlopige proeven de optimale testomstandigheden te vinden. Een goed voorbeeld van zo'n situatie wordt gegeven in onze ultracentrifugatie experimenten waarbij incubatie van LDH bij temperaturen> 42 ° C zo snel dat zelfs deaanwezigheid van een overmaat HdeB niet belet LDH aggregatie. Bovendien, de chaperon / co-verhouding chaperonne of chaperon / client verhouding moet zorgvuldig 23 bepalen. We zijn begonnen met een vrij hoge HdeB: MDH-verhouding van 50: 1 in voorlopige experimenten en dat hielp ons bij het identificeren van pH 4 als de optimale pH voor de chaperone activiteit van HdeB. Wij dan verder analyseren HdeB: MDH verhoudingen tussen 1: 1 en 50: 1 bij pH 4, herkennen 25: 1 de meest effectieve verhouding. In tegenstelling HdeA onderdrukt MDH aggregatie als 10: 1 chaperonne: client verhoudingen 6,9,10,22. Derhalve concluderen wij dat HdeA, vergeleken met HdeB, is effectief in het onderdrukken MDH aggregatie lagere chaperone: client verhoudingen volstonden om volledig onderdrukken MDH aggregatie. Een andere benadering van chaperonne-gemedieerde suppressie van eiwit aggregatie onderzoeken omvatten gaat draaien assays, waarin client aggregaten worden verwijderd door centrifugatie en gekwantificeerd door middel van SDS PAGE Deze aanpak is ook geschikt voor mMonitoring van de invloed van chaperones op proteïne aggregatie in vivo. Mutante stammen die hetzij overexpressie of niet de chaperon plaats blootgesteld aan eiwitontvouwende stresscondities. Vervolgens worden de cellen gelyseerd en de oplosbare en geaggregeerde fracties worden gescheiden en gekwantificeerd 15,16,26.

Voor detectie van de client-chaperone complex, pasten we analytische ultracentrifugatie. Zij worden opgemerkt dat op het experimentele opstelling is het niet mogelijk om de hoeveelheid HdeB en LDH monomeren gebonden complex direct kwantificeren, aangezien beide eiwitten geabsorbeerd bij 280 nm. Desgewenst kan de stoichiometrie van de chaperone-client complex worden bepaald door het afzonderlijk labelen chaperonne en client eiwit met een chromofoor, waarvan excitatiemaximum zich in het zichtbare gebied. Als alternatief kan de stoichiometrie van klanten chaperones binnen complexen worden bepaald via natieve PAGE gekoppeld aan kwantitatieve Western blot. Door het volgen van de protocollen hier gepresenteerde, waren we in staat om twee moleculaire chaperones, HdeA en HdeB 9,10,22 karakteriseren. In het algemeen kunnen deze assays worden gebruikt om de rol van mogelijke remmers van moleculaire chaperonnes in proteïne hervouwing in vitro en in vivo en kan worden toegepast op synthetische chaperones testen op hun vermogen aggregatie cliënt onder zure spanning te voorkomen. Bovendien kunnen de protocollen die hier worden gebruikt voor analyses punt-mutaties en / of afgeknotte varianten van het zuur-geactiveerd chaperones om licht te werpen op het mechanisme van de activatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Claudia Cremers voor haar nuttig advies over chaperon assays. Ken Wan is erkend voor zijn technische bijstand in HdeB zuivering. Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute (tot JCAB) en de National Institutes of Health subsidie ​​RO1 GM102829 om JCAB en Ujj-UD wordt ondersteund door een postdoctoraal research fellowship van de Duitse Research Foundation (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20, (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37, (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280, (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290, (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21, (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73, (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72, (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40, (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78, (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271, (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53, (5), 689-699 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats