Nachweis des pH-abhängige Aktivität von
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten.

Cite this Article

Copy Citation

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakterien werden häufig auf Umweltveränderungen ausgesetzt ist, wie beispielsweise Veränderungen in pH, Temperatur, Redox-Status, Lichtexponierung oder mechanische Kraft. Viele dieser Bedingungen verursachen Proteins in der Zelle entfaltet und nachteilige Auswirkungen auf das Überleben des Organismus. Eine Gruppe von unabhängigen, Stress spezifische molekulare Chaperone gezeigt wesentliche Rolle für das Überleben dieser Stressbedingungen wurden spielen. Während vollständig gefaltet und Chaperon-inaktiv vor Stress, diese Proteine ​​schnell entfalten und werden Chaperon-aktiv unter bestimmten Stressbedingungen. Einmal aktiviert, wobei diese bedingt ungeordneten Chaperone binden an eine Vielzahl von unterschiedlichen aggregationsanfällig Proteine, verhindern ihre Aggregation und entweder direkt oder indirekt Protein bei der Rückkehr in Nichtstressbedingungen Rückfaltungs erleichtern. Der primäre Ansatz ein detaillierteres Verständnis über den Mechanismus ihrer Aktivierung und Client-Erkennung für die Gewinnung umfasst die Reinigung und subsequent Charakterisierung dieser Proteine in vitro - Assays unter Verwendung von Chaperon. Follow-up - in - vivo - Stress - Tests sind absolut notwendig , um unabhängig die in - vitro - Ergebnisse bestätigt werden können .

Dieses Protokoll beschreibt in vitro und in vivo - Verfahren der Chaperon - Aktivität von E. Charakterisierung coli HdeB, ein säureaktivierter Chaperon. Lichtstreuungsmessungen wurden als bequeme Auslese für HdeB Fähigkeit verwendet , um säureinduzierte Aggregation eines etablierten Modell Client Protein, MDH, in vitro zu verhindern. Analytische Ultrazentrifugation Experimente wurden angewandt, um die Komplexbildung zwischen HdeB und ihrem Kunden Protein LDH zeigen, Licht in das Schicksal von Client-Proteine ​​nach ihrer Rückkehr in Nicht-Stress-Bedingungen zu vergießen. Die enzymatische Aktivität Assays der Client-Proteine ​​wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von HdeB auf pH-induzierte Client-Inaktivierung und Reaktivierung zu überwachen. Schließlich wurden die Überlebensstudien verwendet monitor den Einfluss von Chaperon - Funktion des HdeB in vivo.

Introduction

Eine gemeinsame natürliche Umgebung , in der mikrobiellen Krankheitserregern Entfaltungsbedingungen Säure-induzierte Protein erleben , ist die Säugetier-Magen (pH - Bereich 1-4), deren sauren pH - Wert dient als eine wirksame Barriere gegen Krankheitserreger in Lebensmitteln 1. Proteinentfaltung und Aggregation, die durch Aminosäure-Seitenkette Protonierung verursacht wird, beeinflusst biologische Prozesse, Schäden Zellstrukturen und letztendlich verursacht Zelltod 1,2. Da der pH - Wert der bakteriellen Periplasma fast augenblicklich mit dem Umwelt pH äquilibriert durch die freie Diffusion von Protonen durch die poröse äußere Membran periplasmatische und inneren Membranproteine von Gram-negativen Bakterien sind die empfindlichsten Zellkomponenten unter sauren Stressbedingungen 3. Um ihre periplasmatischen Proteom gegen eine schnelle Säure-vermittelte Schädigung, Gram-negative Bakterien verwenden, um die säureaktivierten periplasmatischen Chaperonen HdeA und HdeB schützen. HdeA ist eine bedingt ungeordnet Chaperon 6,7. Die Aktivierung von HdeA erfordert grundlegenden strukturellen Veränderungen, einschließlich der Dissoziation in Monomere, und die teilweise der Monomere Entfaltung 6-8. Einmal aktiviert, bindet HdeA an Proteine, die unter sauren Bedingungen entfalten. Es verhindert effektiv ihre Aggregation sowohl bei der Inkubation bei niedrigem pH-Wert sowie bei pH Neutralisation. Nach der Rückkehr auf pH 7,0, erleichtert HdeA die Neufaltung seiner Client - Proteine in einem ATP-unabhängige Art und Weise und wandelt wieder in seine dimere, Chaperon-inaktive Konformation 9. In ähnlicher Weise ist die homologe Chaperon HdeB auch Chaperon-inactive bei pH 7,0. Im Gegensatz HdeA jedoch erreicht HdeB die Chaperonaktivität seine scheinbare Maximum bei pH 4,0, Bedingungen , unter denen HdeB noch weitgehend gefaltet und dimeren 10. Außerdem senken, ferner mit den pH-Wert causes die Inaktivierung von HdeB. Diese Ergebnisse legen nahe, dass trotz ihrer umfangreichen Homologie, HdeA und HdeB in der Art ihrer funktionellen Aktivierung unterscheiden und ihnen so einen breiten pH-Bereich mit ihren Schutz Chaperon-Funktion zu decken. Einem anderen Chaperon, die in der Säurebeständigkeit von E. beteiligt ist coli ist die zytoplasmatischen Hsp31, die wiederhergestellt werden entfaltete Client - Proteine bis neutralen Bedingungen zu stabilisieren scheint. Die genaue Art der Hsp31-Aktion hat sich jedoch blieb rätselhaft 12. Da die anderen enteropathogenen Bakterien, wie Salmonella , die hdeAB Operon fehlt, ist es sehr wahrscheinlich , dass andere noch nicht identifizierte periplasmatischen Chaperonen könnte existieren , die in der Säurebeständigkeit dieser Bakterien 11 beteiligt sind.

Die Protokolle hier vorgestellten erlauben die pH-abhängige Aktivität von Chaperon HdeB in vitro und in vivo 10 zu überwachen und angewendet werden kann , andere Chaperone zu untersuchenwie Hsp31. Alternativ kann das komplexe Netzwerk von Transkriptionsfaktoren, die die Expression steuern hdeAB potentiell durch den Assay in vivo Stress untersucht werden. Um die Chaperon - Funktion von Proteinen in vivo verschiedene Versuchsanordnungen charakterisieren können angewendet werden. Ein Weg ist die Proteinentfaltungsstressbedingungen anzuwenden und phänotypisch mutante Stämme zu charakterisieren, die entweder das interessierende Gen überexprimieren oder eine Deletion des Gens tragen. Proteom - Studien können durchgeführt werden , um festzustellen , welche Proteine nicht mehr Aggregat unter Stressbedingungen , wenn das Chaperon vorhanden ist, oder der Einfluss eines Chaperons auf einem bestimmten Enzym kann bei Stress - Bedingungen unter Verwendung von enzymatischen Assays 14-16 bestimmt werden. In dieser Studie haben wir uns für HdeB in einer rpoH Deletionsstamms überexprimiert, die den Hitzeschock - Sigma - Faktor 32 fehlt RpoH den Ausdruck aller wichtigen E. steuert coli Chaperone und deren Löschung ist bekannt sens zu erhöhenitivity auf Umweltstressbedingungen , die Proteinentfaltung 15 verursachen. Die in - vivo - Chaperon - Aktivität von HdeB wurde durch Überwachung ihrer Fähigkeit bestimmt , den pH - Empfindlichkeit des Δ rpoH Stamm zu unterdrücken. Insgesamt ist die hier vorgestellten Protokolle einen schnellen und einfachen Ansatz liefern die Aktivität eines säureaktivierten Chaperon in vitro als auch in der in vivo - Kontext zu charakterisieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Expression und Reinigung von periplasmatischen HdeB

HINWEIS: HdeB wurde in E. ausgedrückt coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB 10 und gereinigt aus dem Periplasma auf Polymyxin Lyse beherbergen.

  1. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von E. coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB 10 in 30 ml LB , enthaltend 200 ug / ml Ampicillin (LB Amp) beherbergt. Beimpfen von vier 1 l - Kulturen von LB Amp wachsen und sie bei 37 ° C und 200 rpm bis OD 600nm von 0,7 erreicht ist. Dann fügen 300 uM IPTG die Expression von HdeB zu induzieren und die Wachstumstemperatur auf 30 ° C ab.
  2. Nach 5 h Proteinexpression bei 30 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C.
  3. Wasche das Zellpellet mit 100 ml die Zellen erneut bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) und zentrifugieren puffern.
  4. Anschließend resuspendierendas Zellpellet in 80 ml Puffer A, enthaltend 1 mg / ml Polymyxin-Sulfat. Für eine effiziente Zerstörung der äußeren Membran, rühren Sie vorsichtig die Suspension für 1 Stunde bei 4 ° C.
  5. Zentrifuge die cytoplasmatische Fraktion und Zelltrümmer zu entfernen, die Suspension für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C. Dies resultiert in ~ 60 ml Überstand mit dem löslichen HdeB enthält.
  6. Dialysieren des Überstandes des periplasmatischen Extrakt über Nacht gegen 150x Volumen Puffer B enthält (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0), um eine Dialysemembran mit 6 kDa MW mit cut-off. Konzentriere die Proteine ​​auf 15 ml unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 3 kDa. Filtern die Proteinlösung eine 0,2 um Porenfilter.
  7. Anwenden, die das Protein auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule (Säulenvolumen 5 ml), die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min mit 5 Säulenvolumina Puffer B äquilibriert wurde. Sobald das Protein auf die Säule geladen wird, Waschen der Säule mit Puffer B für 10 min beieine Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min. Elute HdeB mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Puffer B über einen Zeitraum von 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min 6.
  8. Identifizieren Fraktionen, die HdeB 15% SDS-PAGE Mischen Sie 20 ul Probe mit 5 ul 5x reduziert SDS-Ladepuffer. Last 10 ul auf das Gel, und führen in Tris-Glycin-Puffer (14,4 g / l Glycin, 2,9 g / L Tris, 1 g / L Natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Führen Sie das Gel bei 150 V, bis der Bromphenol Band nahe dem Boden des Gels (~ 45 min) gewandert ist.
  9. Pool aller HdeB enthaltenden Fraktionen, bei 4 ° C dialysiert über Nacht gegen 4 L HdeB Aufbewahrungspuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) und konzentriert, um das Protein zu etwa 300 & mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht cut-off von 3 kDa. Bestimmen Sie die Konzentration von HdeB bei 280 nm unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε 280nm = 15.595 M -1 cm -1. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und gratfreiezie die Aliquots in flüssigem Stickstoff.
    HINWEIS: HdeB kann für mindestens 6 Monate bei -70 ° C gelagert werden.

2. Chaperone Aktivitätstest Thermisch Mit Ausklappen Malatdehydrogenase (MDH)

HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Aggregation von thermisch porcine mitochondriale Malat-Dehydrogenase (MDH) bei verschiedenen pH-Werten wurde Entfalten überwacht, wie weiter unten beschrieben. Alle aufgelisteten Proteinkonzentrationen beziehen sich auf die Monomer-Konzentration.

  1. Zur Herstellung von MDH, dialysieren MDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 100 & mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa.
    HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von MDH ist erforderlich, da MDH als Ammoniumsulfatlösung geliefert wird.
  2. Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren Sie das Protein für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen MDH-Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7.950 M -1 cm -1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von MDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung.
  3. Platz 1 ml Quarzküvette in ein Fluoreszenz-Spektralphotometer mit temperaturgesteuerten Probenhalter und Rührer ausgestattet war. Set λ ex / em bis 350 nm.
  4. Fügen geeignete Volumina von vorgewärmten (43 ° C) Puffer D (150 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl) zu den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) in die Küvette und set die Temperatur in den Küvettenhalter bis 43 ° C. Das Gesamtvolumen beträgt 1,000 & mgr; l.
  5. Hinzufügen 12,5 uM HdeB (oder alternativ das gleiche Volumen an HdeB Speicherpuffer für den Puffersteuerung) zu dem Puffer, gefolgt von der Zugabe von 0,5 uM MDH. Beginnen Lichtstreuung zu überwachen. Inkubieren Sie die Reaktion für 360 sec ausreicht, damit der MDH Entfaltung.
  6. Erhöhen Sie den pH - Wert auf 7 durch Zugabe von 0,16-0,34 Volumen von 2 M ungepufferte K 2 HPO 4 und weiterhin reCording Lichtstreuung für eine weitere 440 sec.
  7. Gesetzt, das Ausmaß der MDH-Aggregation, die in Abwesenheit des Chaperons an einem definierten Zeitpunkt nach der Neutralisation aufgenommen wird (hier nach 500 sec, wenn die maximale Lichtstreuung von MDH beobachtet wurde) auf 100%. Normalisieren HdeB Aktivität zu dem Lichtstreuungssignal von MDH in Abwesenheit von HdeB bei jeder angegebenen pH-Wert.

3. Nachweis von HdeB-LDH-Komplexbildung durch Analytische Ultrazentrifugation (AUC)

HINWEIS: Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente von HdeB allein oder im Komplex mit thermisch Lactatdehydrogenase Entfaltung (LDH) wurden einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt werden.

  1. Zur Herstellung von LDH, dialysieren LDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 200 & mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa.
    HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von LDH als LD erforderlichH wird als Ammoniumsulfat-Lösung zugeführt.
  2. Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren LDH für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen LDH - Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M -1 cm -1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von LDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung.
  3. Inkubieren 3 uM LDH in Gegenwart und Abwesenheit von 30 uM HdeB in Puffer D (pH 4 bzw. 7) für 15 min bei 41 ° C.
    HINWEIS: Die Inkubation von LDH bei höheren Temperaturen führt zu seiner vollständigen Aggregation und keine Chaperon Wirkung HdeB beobachtet werden.
  4. Lassen Sie die Proben abkühlen auf Raumtemperatur. Dann laden Proben in Zellen mit einem Standard-Sektor 2-Kanal-Mittelstücke mit 1,2 cm Weglänge. Laden der Zellen in der Ultrazentrifuge und Äquilibrieren auf 22 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Sedimentation.
  5. Spin-Proben bei 22 ° C und 167.000 xg in dem jeweiligen Rotor für 12 h und überwachen die Sedimentation des Proteins kontinuierlich bei 280 nm. Wie zuvor gezeigt, wird das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, wenn das übertragene Lichtintensität jedes Kanals gemessen wird, anstatt Extinktion. Dies verbessert auch die Qualität der nachfolgenden Datenanpassung.
  6. Führen Sie die Datenanalyse mit SEDFIT (Version 15.01b Dezember 2015), mit der kontinuierlichen c (n) Verteilungsmodell 17. Ein Tutorial beschreibt , wie SEDFIT verwenden können in Bezug 18 zu finden.
    1. Stellen Sie das Konfidenzniveau für die ME (Maximum Entropy) Regularisierung bis 0,7.
  7. Berechnen Puffer Dichte sowie die Viskosität unter Verwendung SEDNTERP 19. Zur Abschätzung der Menge von aggregiertem Protein Client, Vergleichen der Integrale von sedimentierten LDH in pH 4 bis pH 7 als Referenz.
    HINWEIS: Die Integration der Sedimentationsverteilungsmuster Plots können direkt in SEDFIT erfolgen. Alternative Software Sedimentationsgeschwindigkeits Daten analysieren kann in einer aktuellen Bewertung 20 gefunden werden. </ Li>

4. Überwachung MDH Inaktivierung und Reaktivierung in Gegenwart von HdeB

HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Neufaltung von ungefalteten pH-MDH wurde durch Überwachung MDH-Aktivität bei Neutralisation bestimmt.

  1. Inkubieren 1 uM MDH in Puffer D bei den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) für 1 h bei 37 ° C in Abwesenheit oder Anwesenheit von 25 uM HdeB. Dann verschieben sich die Temperatur auf 20 ° C für 10 min.
    NOTE: No MDH Neufaltung wurde in Gegenwart von HdeB beobachtet, selbst wenn MDH bei Temperaturen höher als 37 ° C inkubiert.
  2. Zur Rückfaltung von denaturiertem Säure MDH, neutralisieren die Proben auf pH 7 durch Zugabe von 0,13-0,42 Volumen von 0,5 M Natriumphosphat, pH 8,0 initiieren.
  3. Nach Inkubation für 2 h bei 20 ° C, MDH - Aktivität zu bestimmen durch Überwachung der Abnahme von NADH bei 340 nm 9.
    HINWEIS: MDH katalysiert die NADH-abhängige Reduktion von Oxalacetat zu L-Malat. Mischungs 50 ul der Inkubation der Reaktion mit 950 & mgr; l Assaypuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 1 mM Oxalacetat und 150 & mgr; M NADH).
    HINWEIS: Die Endkonzentration des MDH in dem Assaypuffer sollte 44 nm betragen.
  4. Überwachen Sie die Änderung der Absorption mit einem Spektralphotometer, ausgestattet mit einem Steuerblock Peltier Temperatur auf 20 ° C.
  5. Bericht des MDH-Aktivität im Vergleich zu 44 nM nativem MDH, die bei pH 7,0 gehalten wurde.

5. Wirkung von HdeB Überexpression auf E. coli Überleben unter Säurestress

HINWEIS: E. coli MG1655 genomische DNA wurde mit einem veröffentlichten Protokoll 21 isoliert.

  1. Amplify hdeB von E. coli MG1655 durch PCR - Primer hdeB mit - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT und hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. Eingerichtet , um die PCR - Reaktion in 50 ul wie folgt: 10 & mgr; l 5x - Polymerase - Puffer, 200 uM dNTPs, 0,5 uM Primer JUD2, 0,5 uM Primer JUD5, 150 ng genomische DNA MG1655, 0,5 ul DNA - Polymerase, fügen ddH 2 O auf 50 & mgr; l.
  3. Führen Amplifikation hdeB wie folgt: Schritt 1: 5 min bei 95 ° C, 1 Zyklus; Schritt 2: 30 sec bei 95 ° C, 30 sec bei 55 ° C, 30 sec bei 72 ° C, 40 Zyklen; Schritt 3: 10 min bei 72 ° C.
  4. Klon resultierende PCR - Fragment in die EcoR I und BamH I - Stellen des Plasmids pBAD18 Verwendung von Standardverfahren für Restriktionsstelle Klonen. Man reinige das Plasmid ein Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Überprüfen Sie die resultierende Plasmid durch Sequenzierung 10.
  5. Transformieren Sie das Plasmid, das HdeB oder die leeren Vektorkontrolle pBAD18 in den Stamm BB7224 (Δ rpoH) (Genotyp: F -, λ -, e14 - [araD139] B / r [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan +; 16) unter Verwendung von chemisch kompetenten Zellen.
    HINWEIS: Dieser Stamm ist temperaturempfindlich.
  6. Nach 45 sec Hitzeschock bei 42 ° C und vor der Beschichtung, Inkubation Zellen bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. Führen Sie einzelne Kolonie Streifen-outs der positiven Klone und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur in 50 ml LB - Amp und pflegen die Zellen bei 200 Umdrehungen pro Minute und 30 ° C.
  7. Verdünnte Nacht - Kulturen 40-fach in 25 ml LB Amp und wachsen die Bakterien in Gegenwart von 0,5% Arabinose (Ara) bei 30 ° C und 200 rpm bis zu einer OD 600nm = 1,0 bis HdeB Proteinexpression induzieren.
  8. Für die pH-Verschiebung Experimenten verwenden LBDurch Zugabe geeigneter Mengen von 5 M HCl: Amp + Ara die Zellen zu OD 600 nm von 0,5 und passen sich den jeweiligen pH - Werte (pH 2,0, pH 3,0 und pH 4,0 hier) zu verdünnen.
  9. Nach den angegebenen Zeitpunkten (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), um die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Mengen von 5 M NaOH neutralisiert.
  10. Überwachen des Wachstums der neutralisierten Kulturen in Flüssigkultur für 12 Stunden bei 30 ° C unter Verwendung von OD-Messungen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA und HdeB sind E. homolog coli - Proteine, bekannt periplasmatische Proteine gegen Säurestressbedingungen 10 zu schützen. Unsere Arbeit ergab, dass ähnlich wie HdeA, HdeB fungiert auch als eine Säure molekularen Chaperon aktiviert. Jedoch im Gegensatz zu HdeA, HdeB Funktionen bei einem pH, der noch potentiell bakterizide, aber deutlich höher als der pH - Optimum von HdeA 6,9,10,22. Um den pH - Optimum von HdeB der Chaperon - Aktivität in vitro zu untersuchen, nativer MDH wurde in vorgewärmten (43 ° C) Puffer des angegebenen pH - Wert in Gegenwart oder Abwesenheit von HdeB verdünnt. Nach 360 sec Inkubation wurde die Inkubation Reaktion neutralisiert. Diese Neutralisation löst die Aggregation von MDH bei 43 ° C 9. Repräsentative Ergebnisse zeigen , dass das Lichtstreuungssignal von MDH in Abwesenheit von HdeB dramatisch bei Neutralisation erhöht aufgrund der Aggregation von MDH (Abbildung 1, black Linie bei jedem pH-Wert). In Gegenwart von HdeB das Lichtstreuungssignal verringert wird signifikant bei Neutralisation von pH 4 oder pH 5 anzeigt , dass HdeB die Aggregation von MDH verhindert (Abbildung 1, pH 4 und pH 5). Im Gegensatz dazu jedoch bei der Neutralisation von pH 2 und pH 3, aggregiert MDH schnell im gleichen Maße unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von HdeB (Abbildung 1, pH 2 und pH 3), was darauf hinweist , dass das pH - Optimum für die Aktivität HdeB des Chaperon zwischen pH 4 und 5. die HdeB Speicherpuffer hatte keine Wirkung auf die Aggregation MDH (Abbildung 1, Puffersteuerung), was darauf hinweist , dass die reduzierte Lichtstreuungssignal von MDH in Gegenwart von HdeB bei pH 4 wegen seiner Chaperon - Funktion ist. HdeA ist Chaperon aktiv in seine monomeren und entfalteten Form bei pH 2-3, zeigt aber keine Aktivität bei oder über pH 4 10. Diese Ergebnisse legen nahe , dass HdeB um pH seine optimale Chaperon - Aktivität hat 4 10.

t = "1" src = "/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
Abb . 1: Chaperone Aktivität von HdeB bei saurem pH 0,5 uM MDH wurde in vorgewärmten Puffer D bei dem angegebenen pH - Wert in Abwesenheit oder in Gegenwart von 12,5 uM HdeB für 360 sec bei 43 ° C inkubiert. Der pH - Wert der Proben dann auf pH 7 erhöht wurde (wie durch das Sternchen gekennzeichnet) durch Zugabe von 0,16 bis 0,34 Volumen 2 M ungepufferte K 2 HPO 4 wurde MDH Aggregation für eine weitere 440 sec durch die Überwachung der Lichtstreuung bei 350 nm gemessen bei neutralen pH-Wert (blauer Hintergrund). Abbildung modifiziert von Dahl et al. 10 .Dieses Forschung wurde im Journal of Biological Chemistry ursprünglich veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Anzusprechen, ob HdeB bildet stabile Komplexe auch mit anderen Client-Proteine, 3 uM LDH thermisch bei 41 ° C in Gegenwart oder Abwesenheit von 30 uM HdeB bei verschiedenen pH-Bedingungen entfaltet wurde. Analyse des Sedimentationsverhaltens dieser Proben durch analytische Ultrazentrifugation wurde bei 22 ° C durchgeführt. Wenn LDH und HdeB bei pH zusammen inkubiert wurden 7 und 41 ° C blieb LDH ausschließlich tetrameren (Molekulargewicht von 120 kDa) und HdeB blieb dimere. Diese Ergebnisse zeigten , dass die Proteine bilden keine stabilen Komplexe bei pH 7 und LDH erleidet keine irreversiblen Veränderungen in Oligomerisierung bei einer 20 min Inkubation bei 41 ° C (Abbildung 2, grüne Linie). In ähnlicher Weise blieb HdeB dimeren bei Inkubation bei 41 ° C und pH 4,0, was anzeigt, daß niedrige pH-Inkubationvon HdeB beeinflussen Staat seine Oligomerisierung nicht einmal unter Hitzeschockbedingungen (Abbildung 2, rote Linie). LDH , wenn sie bei pH inkubiert 4 und 41 ° C in Abwesenheit von HdeB rasch aggregiert , wie durch die Tatsache angezeigt , dass 40% der LDH sedimentiert , bevor die erste Abtastung aufgezeichnet wurde (Abbildung 2, in der oberen rechten Ecke angegeben). Der verbleibende LDH erschien überwiegend als Monomer (Abbildung 2, blaue Linie) zu sedimentieren. Im Gegensatz dazu ist die Inkubation von LDH und HdeB bei pH 4 und 41 ° C verursacht einen großen Anteil an den beiden Proteinen zusammen Sediment (HdeB-LDH C), eine neue Spezies mit einem Molekulargewicht von 134 kDa bildet. Diese Art stellt wahrscheinlich einen Komplex zwischen HdeB Dimere und thermisch Entfaltung LDH. Darüber hinaus wird in der Gegenwart von HdeB keine signifikante LDH Aggregation vor der Sedimentation beobachtet, was mit unseren in vitro Aggregationsmessungen konsistent ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass HdeB Chaperon-Aktivität zeigt in seinerdimere Form bei pH 4,0. Dies steht in krassem Gegensatz zu HdeA, das in seiner monomeren Form aktiven Chaperon ist. Die sehr dynamischen Natur HdeB dass es strukturelle Umlagerungen zwischen pH 4 und pH 7 wahrscheinlich ausreichend für die Aktivierung von HdeB des Chaperon - Funktion 10 unterzogen werden können.

Figur 2
Abb . 2: Nachweis der Komplexbildung zwischen HdeB und ungefalteten LDH bei pH 4 durch analytische Ultrazentrifugation 3 uM LDH wurde in Gegenwart eines 10-molaren Überschuß HdeB in Puffer D (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) für 15 min inkubiert , bei 41 ° C entweder bei pH 7 (grüne Linie) oder pH 4 (schwarze Linie). Zum Vergleich, LDH allein (blaue Linie) oder HdeB allein (rote Linie) wurden für 15 min bei 41 ° C bei pH 4. Analytische Ultrazentrifugation Sedimentationsgeschwindigkeit wurde die Stöchiometrie von HdeB, LDH, und der gebildete Komplex zu bestimmen, zwischen HdeB inkubiert verwendet und LDH bei difdene pH-Bedingungen. Man beachte, dass ~ 40% LDH aggregiert vor der ersten Abtastung, wenn sie bei pH 4 und bei Abwesenheit von HdeB inkubiert (wie in der oberen rechten Ecke angegeben). Dargestellt ist eine Sedimentationskoeffizientenverteilung Verteilungskurve (c (n)) analysiert das Programm SEDFIT verwenden. Letters zeigen den jeweiligen oligomeren Zustand von LDH oder HdeB jeweils: HdeB D, HdeB Dimer; LDH M, LDH - Monomer, LDH T, LDH Tetramer; HdeB-LDH C, HdeB-LDH - Komplex. Abbildung von Dahl et al modifiziert. 10. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern version von dieser Figur.

Um zu testen, ob HdeB die Rückfaltung von Client-Proteine ​​nach der Neutralisierung unterstützt wurde HdeB Einfluss auf die Rückfaltung von pH-denaturierten MDH analysiert. Thermisch denaturiert MDH wurde bei verschiedenen pH-Werten in Gegenwart oder Abwesenheit von HdeB inkubiert. Nach dem niedrigen pH der Inkubation wurde der pH-Wert neutralisiert (die initiiert MDH Neufaltung) und MDH-Aktivität wurde nach 2 h bestimmt. Wie in 3 gezeigt, signifikante Reaktivierung von MDH wurde nach der Neutralisierung von pH 4 in Gegenwart von HdeB erreicht. Keine MDH-Aktivität wurde bestimmt, wenn HdeB abwesend aus dem niedrigen pH-Inkubation war.

Figur 3
Abbildung 3: HdeB erleichtert die Rückfaltung von Säure MDH zu einem enzymatisch aktiven Zustand denaturiert 1 uM MDH wurde in Puffer D bei dem angegebenen pH inkubiert für 1 Stunde bei 37 ° C in Abwesenheit oder p.räsenz von 25 uM HdeB. Dann wurde die Temperatur für 10 min auf 20 ° C verschoben , bevor die Proben auf pH 7 durch Zugabe von 0,5 M Na 2 HPO 4 neutralisiert wurden. Aliquots wurden bei 20 ° C nach 2 h Inkubation entnommen und auf MDH-Aktivität getestet. MDH-Aktivität bei Neutralisation in Abwesenheit (weiße Balken) oder Gegenwart von HdeB (schwarze Balken) gezeigt. Standardabweichung von mindestens 3 unabhängigen Messungen abgeleitet gezeigt. Abbildung von Dahl et al modifiziert. 10. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehenZahl.

Unsere In - vitro - Daten zeigten , dass HdeB verschiedene Modell - Client - Proteine bei pH bindet 4, verhindert deren Aggregation und erleichtert die Client einmal neutralen pH - Bedingungen Neufaltung wiederhergestellt werden. Um zu untersuchen , wurden die Wirkungen von HdeB in vivo, pH-abhängigen Überlebens - Assays durchgeführt , die temperaturempfindliche rpoH Deletionsstamm verwenden. Dieser Stamm fehlt den meisten Chaperone und daher anfälliger gegenüber erhöhter Temperatur, niedriger pH - Wert oder oxidativer Stress 15. Die Überexpression von HdeB unter neutralen pH - Bedingungen zeigte keine Wirkung auf die Wachstumsrate des Stammes, die vergleichsweise gut mit dem Kontrollstamm wuchs, die den leeren Vektor pBAD18 (Abbildung 4, unbehandelt). Im Gegensatz birgt, fanden wir deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit, wieder aufnehmen Wachstum bei pH 3 oder pH 4 Behandlung mit dem HdeB überexprimierenden Stamm reproduzierbar verbesserte Erholung von niedrigem pH-Wert trea zeigttment als der Kontrollstamm. Im Gegensatz zu unseren in vitro - Daten jedoch Gegenwart HdeB hatte auch eine deutlich schützende Wirkung bei pH 3 dies aufgrund der hohen Konzentration von HdeB in der Zelle sein könnte, die die Oligomerisierung Zustand HdeB Richtung Dimere selbst bei pH - Verschiebung kann 3. Beachten Sie, dass die Zellen auf pH 2 oder pH 3 führte sehr schnell und hochtoxische Effekte, während keine signifikante Abtötung beobachtet wurde Verschiebung , wenn die Zellen , wo 4 9,10,22 bei pH inkubiert.

Abbildung 4
Abbildung 4: HdeB schützt E. coli gegen sauren pH. HdeB (rote Kreise) wurde in BB7224 (Δ rpoH) in Gegenwart von 0,5% Arabinose bei 30 ° C überexprimiert. BB7224 Zellen, die leeren Vektor pBAD18 beherbergen, wurden als Kontrolle (schwarze Kreise) verwendet. Obere linke Tafel zeigt das Wachstum sowohl von stRegen bei 30 ° C, pH 7. Die Zellen wurden mit dem angegebenen pH verschoben durch Zugabe von 5 M HCl und für 1 min bei pH 2 (oberes rechtes Feld), 2,5 min bei 3 pH inkubiert (untere linke Tafel) oder 30 min bei pH 4 (rechts senken). Anschließend wurden die Kulturen durch Zugabe geeigneter Mengen von 5 M NaOH neutralisiert und das Wachstum wurde in flüssigen Medien bei 30 ° C überwacht. Abbildung von Dahl et al modifiziert. 10. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um den Mechanismus der Aktivierung und Chaperon-Funktion HdeB große Mengen HdeB zu studieren muss exprimiert und gereinigt werden. Eine Anzahl von Expressionsvektorsysteme sind für die Herstellung von großen Mengen eines Zielproteins, einschließlich pTrc oder pBAD-Vektoren zur Verfügung, von denen beide in dieser Studie verwendet wurden. Die Promotoren sind leicht zugänglich für E. coli - RNA - Polymerase und somit HdeB stark upregulated Ausdruck erlauben in jedem E. coli - Stamm. Dieser Aspekt ist besonders relevant für die in vivo - Überexpression Studie von HdeB unter sauren Stressbedingungen, in denen die rpoH defizienten Stamm verwendet wurde. Dieser Stamm fehlt den meisten der Chaperone und somit ist empfindlicher gegenüber verschiedenen Stressoren, einschließlich erhöhter Temperatur, niedrigem pH - Wert und oxidativen Stress 15. Als alternative, studiert Überleben ähnlich den hier vorgestellten können in Mutantenstämmen, die das Gen von Interesse fehlt, durchgeführt werden.

t "> Das experimentelle Design für jede Chaperon-Aktivität oder Rückfaltungs Assay muss sorgfältig in Betracht gezogen werden, sowohl in Bezug auf die Art von Client, die Konzentration des Client-Protein und der Pufferbedingungen. In typischen Chaperon Assays, Modell Client Proteine, wie Citratsynthase, Luciferase, Malatdehydrogenase oder in hohen Konzentrationen von Harnstoff oder Guanidin-HCl denaturiert, und in Denaturierungsmittel-freie Puffer verdünnt Aggregations 23,13 zu induzieren. die Messungen in Gegenwart von Chaperonen zeigen das Ausmaß , in dem sie die Proteinaggregation verhindern. Alternativ werden die Clients thermisch aufgeklappten und Proteinaggregation überwacht wird. in beiden Fällen Lichtstreuungsmessungen als Anzeige für Proteinaggregation verwendet werden. Aktive Chaperone die Aggregation von Entfaltungs Client - Proteine verhindern, wodurch eine Abnahme in der Signallichtstreuung verursacht 6. beide dieser Versuchsaufbauten kann mit niedrigen pH Inkubation kombiniert werden. Zusätzlich zu den mol Beurteilungecular Chaperon - Aktivität durch ihre Fähigkeit , die Aggregation von bestimmten Client - Proteine zu verhindern , die Überwachung der Einfluss von Chaperonen auf Client - Umfaltung bei der Rückkehr in Nichtstressbedingungen können 24 getestet werden. Dies ist besonders einfach, wenn die Client-Proteine ​​enzymatische Aktivität besitzen, die als quantitative Anzeige für die Inaktivierung und Reaktivierung verwendet werden kann. Während Chaperon-vermittelte Rückfaltungs natürlich ein ATP-abhängiger Prozess ist, wurden periplasmatische Chaperone wie HdeA, HdeB und Spy worden Client angezeigt zu erleichtern in einem ATP-unabhängigen Art und Weise in Übereinstimmung mit dem Mangel an Energie in das Periplasma 9,25 Neufaltung.

Untersuchung der pH-Optimum eines Säureschutz Chaperon wie HdeB ist anspruchsvoll aus verschiedenen Gründen: (i) Aggregation Verhalten sogar etablierte Chaperon-Client-Proteine ​​wie Citratsynthase bei saurem pH unterscheiden; und (ii) nur wenige Puffersysteme arbeiten im pH-Bereich zwischen 2-5 und sind suifür Tisch sowohl das Chaperon von Interesse und dem Client-Protein. Wir entschieden uns, Phosphatpuffer zu verwenden, obwohl wir wissen, dass dies ein nicht-idealen Puffersystem unter sauren pH-Bedingungen. Jedoch wurde Phosphatpuffer sein , gut geeignet zu charakterisieren HdeA als Säure aktiviert Chaperon 9,22 gefunden. Aggregation Messungen sind sehr empfindlich gegenüber Änderungen der Temperatur oder Pufferinhalt. Zur Beseitigung falsch-positive Ergebnisse empfehlen wir daher immer prüfen , um den Einfluss von Chaperon - Speicherpuffer auf den Client - Aggregation (Abbildung 1, Puffer - Steuerung). Manchmal Aggregation des Client-Protein tritt so schnell, dass selbst die beste Chaperon nicht in der Lage sein könnte, mit dem Aggregationsprozess konkurrierender. Es ist daher wesentlich Vorversuche durchzuführen, um die optimalen Testbedingungen zu finden. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist in unserer Ultrazentrifugation Experimenten gegeben, in dem die Inkubation von LDH bei Temperaturen von> 42 ° C schnell ist, so dass auch derGegenwart eines Überschusses von HdeB nicht LDH Aggregation verhindern. Darüber hinaus hat das Chaperon / Co-Chaperon - Verhältnis oder Chaperon / Client - Verhältnis sorgfältig 23 bestimmt werden. Wir begannen eine ziemlich hohe HdeB mit: MDH-Verhältnis von 50: 1 in Vorversuchen und das half uns pH 4 als optimale pH-Wert für die Chaperon-Aktivität von HdeB bei der Identifizierung. Wir setzten dann HdeB Analyse: MDH-Verhältnisse zwischen 1: 1 und 50: 1 bei pH 4, Identifizierung 25: 1 am wirksamsten Verhältnis zu sein. Im Gegensatz dazu unterdrückt HdeA MDH Aggregation als 10: 1 Chaperon: Client - Verhältnisse 6,9,10,22. Daraus schließen wir, dass HdeA, im Vergleich zu HdeB, effektiver bei der Unterdrückung der MDH-Aggregation als untere Chaperon ist: Client-Verhältnisse ausreichend waren, um vollständig MDH Aggregation unterdrücken. Ein weiterer Ansatz Chaperon-vermittelte Unterdrückung der Proteinaggregation beteiligt Spin-down-Assays zu untersuchen, in dem Client-Aggregate werden durch Zentrifugation entfernt und durch SDS PAGE quantifiziert. Dieser Ansatz wird auch für m geeignetonitoring den Einfluss von Chaperonen auf Proteinaggregation in vivo. Mutantenstämme, die entweder überexprimiert oder fehlt das Chaperon von Interesse sind Proteinentfaltung Stressbedingungen ausgesetzt. Anschließend werden die Zellen lysiert , und die löslichen und aggregierten Fraktionen werden getrennt und 15,16,26 quantifiziert.

Zur Erfassung des Client-Chaperon-Komplexes, angewendet wir analytische Ultrazentrifugation. Es soll hier angemerkt, dass auf der Grundlage des experimentellen Aufbaus ist es nicht möglich, direkt die Menge an HdeB und LDH Monomere in diesem Komplex gebunden zu quantifizieren, da beide Proteine ​​bei 280 nm absorbieren. Falls gewünscht, kann die Stöchiometrie des Chaperon-Client-Komplex durch getrenntes Etikettieren Chaperon und Client-Protein mit einem Chromophor, dessen Anregungsmaximum liegt im sichtbaren Bereich bestimmt werden. Alternativ kann die Stöchiometrie von Kunden Chaperone innerhalb Komplexe durch Verwendung nativer PAGE mit quantitative Western-Blot gekoppelt bestimmt werden. Indem Sie die hier vorgestellten Protokolle konnten wir zwei molekulare Chaperone zu charakterisieren, HdeA und HdeB 9,10,22. Im Allgemeinen können diese Assays auch die Rolle von potentiellen Inhibitoren der molekularen Chaperone in Proteinrückfaltungs in vitro zu untersuchen , verwendet werden , und in vivo oder können synthetische Chaperone angewandt werden auf ihre Fähigkeit zu testen Client Aggregation unter Säurebeanspruchung zu verhindern. Darüber hinaus können die hier vorgestellten Protokolle können für Analysen von Punktmutationen und / oder verkürzten Varianten der säureaktivierten Chaperone, um Licht in den Mechanismus ihrer Aktivierung Schuppen verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Claudia Cremers für ihre hilfreiche Ratschläge auf Chaperon-Assays. Ken Wan ist für seine technische Unterstützung bei HdeB Reinigung anerkannt. Diese Arbeit wurde von der Howard Hughes Medical Institute (zu JCAB) und den National Institutes of Health Zuschuss RO1 GM102829 zu JCAB und UJJ-UD unterstützt wird von einem Postdoc-Stipendium gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20, (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37, (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280, (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290, (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21, (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73, (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72, (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40, (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78, (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271, (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53, (5), 689-699 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats