تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ذبابة فاكهة البحر الأبيض المتوسط (medfly) آفة Ceratitis الرؤيسية (فيدمان) (ذوات الجناحين: ذبابة منزلية) هو نوع من الآفات ذات الأهمية الزراعية مرتفعة للغاية. ومن المقرر أن سلوكها الإنجابي هذا: الإناث تلف السطح الخارجي من الفواكه والخضروات عندما تضع بيضها وتغذية اليرقات على لب بهم. البرية C. يتم التحكم في السكان الرؤيسية تقليديا من خلال رش مبيدات الحشرات و / أو النهج الصديقة للبيئة، والأكثر نجاحا يجري تقنية الحشرة العقيمة (SIT). تعتمد SIT على كتلة تربية والتعقيم القائم على الإشعاع وإطلاق المجال للذكور التي تحتفظ قدرتها على زميله ولكنها ليست قادرة على توليد ذرية خصبة. ظهور والتطور السريع لاحقة من أدوات التكنولوجيا الحيوية، جنبا إلى جنب مع توافر تسلسل الجينوم medfly، وعززت بشكل كبير من فهمنا للبيولوجيا من هذا النوع. هذا يفضل انتشار استراتيجيات جديدة للتلاعب الجينوم، الذي كاليفورنيان أن تطبق على التحكم في عدد السكان.

في هذا السياق، الجنين حقن مكروي يلعب دورا مزدوجا في توسيع الأدوات للسيطرة medfly. القدرة على تتداخل مع وظيفة الجينات التي تنظم العمليات الحيوية الأساسية، في الواقع، ويوسع فهمنا لآلية الجزيئية الكامنة وراء الغزو medfly. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تحقيق التحول خط الجرثومية تسهل إنتاج سلالات معدلة وراثيا المتعددة التي يمكن اختبارها للتطبيقات الميدانية في المستقبل في إعدادات SIT جديدة. في الواقع، والتلاعب الجيني يمكن أن تستخدم لإضفاء الصفات المرغوبة التي يمكن، على سبيل المثال، يمكن استخدامها لمراقبة أداء الذكور العقيمة في هذا المجال، أو التي يمكن أن تؤدي في وقت مبكر الفتك مرحلة الحياة. نحن هنا تصف طريقة لmicroinject الأحماض النووية في الأجنة medfly لتحقيق هذه الأهداف الرئيسيين.

Introduction

ذبابة فاكهة البحر المتوسط (medfly) آفة Ceratitis الرؤيسية هو نوع عالمية أن على نطاق واسع الأضرار الفواكه والمحاصيل الزراعية. وهو ينتمي إلى عائلة ذبابة منزلية، والتي تشمل عدة أنواع الآفات، مثل أولئك الذين ينتمون إلى أجناس Bactrocera وAnastrepha. وmedfly هي الأنواع الأكثر درس من هذه العائلة، وأصبح نموذجا ليس فقط لدراسة الغزوات الحشرات ولكن أيضا لتحسين استراتيجيات إدارة الآفات 2.

وmedfly هي الأنواع multivoltine التي يمكن أن تهاجم أكثر من 300 نوع من الحياة البرية والنباتات المزروعة 3،4. وسبب الضرر من قبل كل من البالغين ومراحل اليرقات: الإناث تزاوج تخترق سطح الفاكهة لوضع البيض، مما يسمح للميكروبات لتؤثر على نوعية التجارية الخاصة بهم، في حين أن تتغذى اليرقات على لب الفاكهة. بعد ثلاث مراحل اليرقات، تخرج اليرقات من المضيف وتخدر تصبح خادرة في التربة. آفة Ceratitisيعرض الرؤيسية التوزيع في جميع أنحاء العالم تقريبا، بما في ذلك أفريقيا والشرق الأوسط واستراليا الغربية والوسطى وأمريكا الجنوبية وأوروبا ومناطق من الولايات المتحدة 5.

الاستراتيجيات الأكثر شيوعا للحد من تفشي medfly تنطوي على استخدام المبيدات الحشرية (على سبيل المثال، الملاثيون، Spinosad) وصديقة للبيئة تقنية الحشرة العقيمة (SIT) 6. ويشمل هذا النهج الأخير لإطلاقها في البرية من مئات الآلاف من الذكور المقدمة عقيمة عن التعرض لأشعة المؤينة. التزاوج لهذه الذكور المعقمة للإناث البرية النتائج في أي ذرية، مما تسبب في انخفاض في حجم السكان، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى القضاء. على الرغم من أن SIT أثبت فعاليته في عدة حملات في جميع أنحاء العالم، وتشمل العوائق الرئيسية لارتفاع تكاليف تربية وتعقيم الملايين من الحشرات التي ستصدر. تمييز الأفراد الذين أطلق سراحهم من الضروري التمييز عقيمة من الحشرات البرية المأسورة في الميدان خلالرصد أنشطة وتحقيقه حاليا باستخدام مساحيق الفلورسنت. هذه الإجراءات مكلفة ولها آثار جانبية غير مرغوب فيها-7.

من أجل تحسين و / أو لوضع نهج أكثر فعالية لمكافحة هذه الآفة، تم استكشافها على نطاق واسع البيولوجيا البحر المتوسط ​​وذبابة علم الوراثة من قبل العديد من الباحثين في جميع أنحاء العالم. توافر تسلسل الجينوم medfly 8،9، سيسهل التحقيقات رواية على وظائف الجينات. تدخل الحمض النووي الريبي هو أداة قوية لمثل هذه الدراسات، وأنه يمكن أن يتحقق من خلال Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة (RNA المزدوج تقطعت بهم السبل) أو سيرنا (صغير التدخل RNA). وقد استخدمت هذه التقنية، على سبيل المثال، لإثبات أن سلسلة الجزيئية تحديد الجنس في C. يتم حفظها الرؤيسية إلا جزئيا فيما يتعلق بهذه ذبابة الفاكهة 10.

وضع بروتوكولات لmicroinject الأجنة medfly يسمح C. الرؤيسية ليكون أول غيرذباب -Drosophilid لتعديلها وراثيا. كما بيوضها مماثلة لتلك التي من ذبابة الفاكهة، سواء من حيث الشكل ومقاومة للجفاف 11، وبروتوكول لتقديم DNA البلازميد في الأجنة قبل الأريمة ضعت أول لد. البطن 12،13 تم تكييفها في البداية لاستخدامها في C. الرؤيسية. هذه التجارب الأولى سمحت medfly تحول خط الجرثومية والتى ترتكز على جين قافز مينوس 11. وفي وقت لاحق، تم تعديل النظام الأصلي 14 باستخدام النهج الأخرى القائمة على ينقول. هذا هو حال piggyBac من حرشفية الأجنحة Trichoplusia ني 15. بروتوكول منذ ذلك الحين أبعد الأمثل وهذا ما يسمح للتحول من الأنواع الأخرى tephritid 16-21 وكذلك غيرها الكثير من ذوات الجناحين 22-31. جميع هذه الأنظمة تعتمد على استخدام ناقلات / المساعد نظام التحول البلازميد ثنائي نموذجي: الاصطناعي، TRANSPO معيبيتم تجميع أبناء تحتوي على الجينات المطلوبة إلى البلازميد ودمجها في جينوم الحشرات من خلال تزويد انزيم ترانسبوزاز 32. تم إنشاء عدد من خطوط medfly المعدلة وراثيا، مع ميزات متعددة بما في ذلك سلالات يحمل الجينات القاتلة المهيمنة المشروط أن يدفع الفتك، من السلالات المنتجة للذكور فقط ذرية، وبالتالي لا تتطلب استراتيجيات سإكسينغ] إضافية، والتوترات مع الحيوانات المنوية الفلورسنت، الأمر الذي قد يعزز دقة من مرحلة المراقبة SIT 33-37. وعلى الرغم من الافراج عنه في البرية من الكائنات المعدلة وراثيا قد وقعت في الاختبارات التجريبية ضد البعوض فقط 38،39، شركة واحدة على الأقل وتقييم عدد من سلالات medfly المعدلة وراثيا لاستخدامها في مجال 40.

يمكن أن الجنين حقن مكروي مواتية أيضا لتطوير أدوات الجينوم تحرير جديدة، مثل النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPR) / كريسبر بروتين يرتبط 9 نوكلياز (Cas9) ونوكلياز داخلي مؤلف الجينات (HEGs)، مما سيمكن الدراسات التطورية والتنموية الجديدة، فضلا عن توسيع الأدوات التكنولوجية الحيوية المتاحة. يسمح النهج الجينوم التحرير بالفعل جيل من أنظمة الدفع الجينات في البعوض 41، ونقلهم إلى medfly بات وشيكا. نحن هنا وصف بروتوكول عالمي لmicroinjecting الأحماض النووية في الأجنة medfly التي يمكن أن تكون مفيدة لجميع التطبيقات المذكورة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التجريبية مجموعة المتابعة

  1. متطلبات Insectary
    1. الحفاظ على جميع C. مراحل الرؤيسية الحياة عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 65٪ و12/12 ساعة ضوء / الضوئية المعتمة.
    2. ضع حوالي 1،500-2،000 الشرانق medfly في قفص 6 L. استخدام قفص مع النحاس شبكة على جانب واحد مع فتحات صغيرة بما يكفي لتحفيز وضع البيض 42. إدراج قطاع الإسفنج من خلال فتحة صغيرة في قاعدة القفص لتوفير الذباب مع الماء عن طريق العمل الشعري. استخدام خليط الخميرة والسكر (01:10) كمصدر الغذاء للبالغين (الشكل 1A). زيادة كمية الخميرة (تصل إلى 1: 3، والخميرة: السكر) في حال فشل الإناث لوضع البيض.
    3. وضع لوحة مملوءة بالماء أسفل القفص لجمع البيض المودعة من خلال شبكة. كما الإناث البكر يمكن يسرأ، وانتظر حتى الذباب هي 6-7 أيام على الأقل القديمة قبل جمع البيض لتجارب حقن مكروي. وهذا يضمن أن الإناث سوف يكون تزاوجوالتي سيكون قد تم تخصيب البيض.
    4. جمع البيض من خلال تصفية المياه مع صافي مصفاة غرامة. نقل البيض من مصفاة في علبة بلاستيكية تحتوي على المواد الغذائية اليرقات قياسي (1.5 LH 2 O، 100 مل حمض الهيدروكلوريك 1٪، 5 ز اسع الطيف عامل مضاد للميكروبات حل في 50 مل ايثانول، و 400 غرام من السكر، 175 غرام خميرة البيرة المنزوعة، و1 كغ نخالة القمح اللين) باستخدام ماصة باستور.
    5. ضع كل مربع في وعاء شفاف مغلقة مع صافي غطاء للسماح للدوران الهواء وتحتوي على طبقة من نخالة لصالح التشرنق (الشكل 1B).
    6. بعد حوالي 10 أيام، للتحقق من 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات التي تخرج من المواد الغذائية اليرقات والقفز الى طبقة النخالة لالتشرنق.
    7. بعد 24 ساعة، وجمع الشرانق في فنجان صغير باستخدام فرشاة ناعمة ونقلها إلى قفص الكبار جديد. الكبار تظهر عادة بعد 10 يوما التشرنق. يستخدم الطيران الناشئة ptilinum، جيب نفخ تقع رأسا على عقب فوق القاعدة (ه) من الهوائيات، لإجبار قبالة نهاية puparium. بعد ظهور، وptilinum ينهار بشكل دائم إلى داخل الرأس.
  2. إعداد 1 لتر الغذاء ليرقات microinjected
    1. حل 2.5 غرام أجار في 300 مل H 2 O.
    2. دافئ 500 مل H 2 O على طبق من اثارة ساخنة وتذوب 4 ز بنزوات الصوديوم، 4.5 مل 37٪ حمض الهيدروكلوريك، 42 ز خلاصة الخميرة و 115 غرام من مسحوق الجزرة المجففة.
    3. إضافة إلى خليط محلول 2.86 غرام واسعة الطيف عامل مضاد للميكروبات المذاب في 10 مل ايثانول المطلق.
    4. توزيع المتوسطة في 15 سم جولة أطباق بتري والسماح لتبرد. إذا لزم الأمر، وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  3. إعداد الشرائح
    1. وضع شريط 2 سم من الشريط على الوجهين على شريحة المجهر (75 × 26 مم 2)، وعلامة على حواف مع علامة الصين، لمنع انتشار النفط ويترتب على ذلك من جفاف الأجنة المحقونة.
  4. عزل DNA البلازميد باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا 34. يعجل البلازميد باستخدام الإيثانول واعادة تعليق في المخزن حقن (0.1 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4، 5 ملي بوكل) في التركيز المطلوب.
  5. تنقية في المختبر synthetized طويلة الرنا المزدوج الجديلة باستخدام الفينول كلوروفورم، يعجل باستخدام الأيزوبروبانول واعادة تعليق في المخزن حقن 43.

2. الأجنة إعداد

  1. وضع علبة مملوءة بالماء تحت قفص يحتوي على 6-7 يوم البالغين من العمر.
  2. السماح للإناث ليسرأ لمدة 30 دقيقة ثم جمع الأجنة عن طريق تصفية المياه باستخدام مصفاة دقيقة. احتفظ مصفاة في الماء لتجنب الجفاف من الأجنة.
  3. Dechorionate الأجنة التي كتبها immerging مصفاة لمدة 5 ثانية في 50٪ من محلول التبييض التجارية.
  4. غسل الأجنة بعناية من قبل immerging مرارا مصفاة في الماء عالى النقاء نظيفة (على الأقل4-5 مرات). وأخيرا، وضع مصفاة في الماء عالى النقاء نظيفة. استخدام الأجنة خلال مدة لا تجاوز 2 ساعة.
    ملاحظة: توقيت حقن مكروي يرتبط إلى ضرورة حقن في الأجنة قبل الأريمة، خلال مرحلة من الانقسامات النووية قبل cellularization. وهذا يسمح للالحمض النووي حقن الواجب اتخاذها المتابعة إلى نوى، وتحديدا في نوى الخلايا الجرثومية البدائية التي سوف تنشأ الأمشاج. في ذبابة الفاكهة، cellularization في الخلايا القطب يبدأ في حوالي 90 دقيقة بعد الإخصاب (عند 25 ° C)، مع تشكيل الأريمة تحدث بعد حوالي 30 دقيقة 44، في حين أنه في cellularization medfly يقام بين 9 و 12 ساعة 45،46.
  5. توجه الجنين في صفوف
    1. باستخدام الفرشاة الجميلة، وجمع حوالي 50 الأجنة ووضعها على قرص من ورق الترشيح السوداء ينقع بالماء.
    2. تحت مجهر تشريحي تشريح، وترتيب الأجنة في صف واحد على السطح العلوي من الشريط على الوجهين علىالشريحة المجهر باستخدام الفرشاة الجميلة (000) (الشكل 1C).
      ملاحظة: محاذاة الأجنة كلها في نفس الاتجاه، كما يتم تنفيذ الحقن في القطب الخلفي، حيث خط الجرثومية سوف تنشأ. القطب الخلفي هو الآخر إلى المنطقة بويب.
    3. تغطية الأجنة مع طبقة من النفط chlorotrifluoroethylene التأكد من أن النفط لا تمتد الصين حدود علامة (انظر 1.3).
      ملاحظة: قبل أن تغطي الأجنة مع النفط، خطوة أخرى يمكن أن يؤديها: الأجنة يمكن المجفف لبضع دقائق لتقليل محتواها السائل، وبالتالي تسهيل دخول محلول الحمض النووي حقن. هذا قد يساعد في تجنب الجنين انفجار أثناء الحقن أو تسرب المفرط من الحل حقن، نتيجة لضغط السائل عالية.

3. الأجنة حقن مكروي

  1. شغل الإبرة (1-2 ميكرولتر) مع DNA البلازميد أو حل الرنا المزدوج الجديلة (1-2 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام micropipette.
  2. أداء حقن مكروي تحت مجهر تشريحي، وذلك باستخدام micromanipulator لمراقبة تحركات من الإبرة (الشكل 1D). استخدام المسرح المجهر لتحريك الشريحة.
    1. وضع الشريحة على مرحلة من مراحل النطاق.
    2. إدراج غيض من الإبرة في القطب الخلفي للجنين (الشكل 1E).
    3. حقن محلول من خلال تفعيل نظام حقن مكروي مع دواسة. السائل المحقون يدفع زيادة في الضغط الداخلي، مما أدى إلى حركة بسيطة للجنين.
    4. الإفراج عن دواسة وعلى الفور، ولكن بلطف، وإزالة الإبرة من الجنين.
    5. مراقبة تسرب حشوية قليلا في موقع الحقن.
      ملاحظة: للتمييز بين الآثار المميتة المحتملة من الحمض النووي / الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا وفيات بسبب حقن مكروي المواليةcedure نفسه، يجب إجراء تجارب السيطرة. تتكون هذه الحقن من العازلة فقط، أو، في حالة من التجارب علم الوراثة العكسية من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -derived RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة GFP)، أو سيرنا.
  3. بعد حقن احتضان الأجنة عند 25 درجة مئوية.

4. إجراءات ما بعد حقن

  1. بعد يومين من الحقن، والتحقق من الشرائح لاليرقات (الشكل 1F) تحت مجهر تشريحي. اليرقات يمكن أن تتحرك في مجال النفط ولكن الحاجة إلى أن يتم تحويلها إلى المواد الغذائية اليرقات في أقرب وقت ممكن. لهذا السبب، والتحقق من الشرائح عدة مرات في اليوم.
  2. باستخدام الفرشاة الجميلة (000)، ونقل بلطف اليرقات على الغذاء اليرقات القائم على الجزر. نقل ما يصل إلى حد أقصى قدره 200 اليرقات في كل طبق بتري.
  3. احتضان اليرقات في 65٪ الرطوبة (25 درجة مئوية). تأكد من أن غطاء لا عصا إلى الطبق، إضعاف تبادل الهواء.
  4. الحفاظ على أطباق بتري مع غطاءأغلقت معظمها بحيث لا يزال هناك تدفق الهواء إلى اليرقات. لتجنب جفاف المفرط، والتحقق من الأطباق يوميا، وإذا لزم الأمر، إضافة الماء لتعويض التبخر.
  5. وضع أطباق بتري في وعاء واضحة مغلقة من قبل الصافية للغطاء وتحتوي على طبقة من نخالة لصالح التشرنق. أما بالنسبة للتربية insectary الروتينية، 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات القفز من الطعام اليرقات وتخدر تصبح خادرة في نخالة.
  6. جمع الشرانق ووضعها في قفص صغير لتربية الكبار والفرز (وهذا هو الجيل 0، G0). الخلفي ذرية على الغذاء اليرقات القياسية.
  7. في حالة تجارب التحول خط الجرثومية، لفحص إمكانية الأفراد تحولت في الجيل القادم (G1)، كأفراد حقن وعادة ما تكون الوهم. الأحداث والتحول، في الواقع، ربما تكون قد حدثت في أي من نوى مخلى الجنينية، التي ستشكل إما خط الجرثومية أو سوما.
    1. بعد ظهور قريبا، تخدير الأفراد G1 باستخدام ثاني أكسيد الكربون (2) والتحقق من وجود transfأحداث ormation الوقود النووي تحت مجهر تشريحي epifluorescence. للكشف عن وجود مضان أحمر، استخدم مرشح DsRedwide (تحويلة 546/12... عمانويل 605/75)، في حين أن الشاشة لمخضر استخدام فلتر EYFP (تحويلة 500/20... عمانويل 535/30) .
    2. وضع الأفراد تحولت في قفص صغير مع من النوع البري البالغين من الجنس الآخر، وتنشأ من جديد، في البداية متخالف، سلالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا تقرير طلبين من حقن مكروي الجنين الموجهة إلى توصيف وظيفي للالجين (الحالة 1)، وفي توليد سلالات معدلة وراثيا (الحالة 2)، على التوالي.

تسليم الرنا المزدوج الجديلة في أجنة لكشف وظيفة الجين.

الجين innexin 5 بترميز فجوة تقاطع أنه في الحشرات، وأعرب عن تحديدا في الذكور والإناث الغدد التناسلية 43،47،48. واستنادا إلى المعلومات المتوفرة لوثيقي الصلة، وكان من المتوقع أن يؤدي إلى الاجتثاث من خط الجرثومية medfly الإناث والذكور في إسكات الجينات التي يسببها الرنا المزدوج الجديلة. تم حقن عدد 2400 الأجنة مع 2 ميكروغرام / ميكرولتر خليط الرنا المزدوج الجديلة، والتي من 548 اليرقات ونجا 216 البالغين (بيانات غير منشورة). في حوالي 75٪ من البالغين، الخصيتين والمبيضين على ما يبدو إما تحت develoإدخال رقم التعريف الشخصي أو غائبة تماما (الشكل 2). وأكد الكمي لinnexin 5 نسخة وفرة في البطن من الأفراد من كلا الجنسين التعبير أقل بكثير من هذا الجين، بالمقارنة مع الضوابط.

جيل من السلالات المعدلة وراثيا مع الحيوانات المنوية الفلورسنت.

Medfly تم إنشاؤها السلالات المعدلة وراثيا مع الحيوانات المنوية fluorescently المسمى من قبل سكولاري وزملاؤه 34 عن طريق حقن الأجنة مع البلازميد. خليط يحتوي على اثنين من البلازميدات مختلطة في النسب المئوية النسبية الثابتة: واحد، و"مساعد البلازميد"، ترميز ترانسبوزاز piggyBac. الآخر، و"البلازميد المانحة"، تضمن ينقول الاصطناعي وقام اثنين من علامات الفلورسنت، واحدة وأعرب في سوما من الذكور والإناث، والآخر على وجه التحديد في الخصيتين. المروج بيتا الجين 2 تويولين، مسؤولة عن رالتعبير إستيس محددة، وتنصهر في ATG مع تسلسل ترميز البروتينات الفلورية turboGFP (بناء # 1260) أو DsRedExpress (بناء # 1261)، على التوالي. تم حقن عدد إجمالي من 821 الأجنة، والتي من 205 اليرقات ونجا 37 من البالغين. تم انشاء 9 إناث و 8 المعابر الذكور و 6 من الذي أعطى ذرية الفلورسنت 34 (رخصة لإعادة هذه البيانات التي تم الحصول عليها من إلسفير - رقم الرخصة 3796240759880). أدى التحول الناجح لتطوير سلالات مع الخصيتين الفلورية الخضراء والحمراء، على التوالي (الشكل 3).

شكل 1
الشكل 1. المعدات Insectary والأجنة. (A) معيار تربية قفص يحتوي على 1،500-2،000 البالغين. الإناث تضع بيضها من خلال النحاس شبكة في الجزء الأمامي من القفص. يتم جمع البيض في الماء. على اليسارجانب من القفص، ومصفاة تستخدم لتصفية البيض مرئيا. (ب) اثنين من صناديق القياسية الغذائية اليرقات التي تحتوي على يرقات. يتم وضع صناديق في أكبر صندوق من البلاستيك الشفاف التي تحتوي على النخالة لتسهيل التشرنق. تمت إزالة الشبكة التي تغطي منطقة الجزاء. (C) الأجنة مرتبة في صفوف. تميزت حواف شريط مزدوج المغلفة على الشريحة مع علامة الصين البيضاء. وسيتم تغطية البيض الانحياز على الشريط مع زيت chlorotrifluoroethylene. جهاز (D) حقن مكروي (يسار) متصلا مجهر تشريحي مجهزة micromanipulator (يمين). (E) القطبين الأجنة. يشير السهم الأحمر القطب الخلفي (موقع الحقن)، في حين يشير السهم الأسود القطب الأمامي (حيث يقع بويب). شريط مقياس = 500 ميكرون. (F) يرقة فقست تتحرك في مجال النفط. شريط مقياس = 500 ميكرون. نداءحد ذاته انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الذكور والإناث مع الغدد التناسلية المتخلفة أنثى (يسار) والذكور (يمين) تشريح مساحات الإنجابية. أعلاه: من النوع البري الأفراد مع الغدد التناسلية العادية. أدناه: تدخلت الأفراد مع الغدد التناسلية المتخلفة. أكواب: ذكر الاكسسوار الغدد. س: spermathecae. مقياس شريط = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المعدلة وراثيا الذكور مع الخصيتين الفلورسنت والحيوانات المنوية. الذكور الكبار تحولت مع بناء # 1260 و # 1261، على التوالي. تشير الأسهم في فلووالخصيتين rescent. تظهر # 1260 ذكور الجسم والخضراء الخصيتين الحمراء، في حين تظهر # 1261 من الذكور الخصيتين الحمراء والهيئات الخضراء. شريط مقياس = 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microinjection من الأحماض النووية في الأجنة الحشرات هي تقنية عالمية تسهل كل من تحليل وظيفة الجين والتطبيقات التكنولوجية الحيوية.

نشر مؤخرا من تسلسل الجينوم من عدد متزايد من أنواع الحشرات يؤدي إلى الحاجة الملحة لأدوات لتوصيف وظيفي من الجينات وظيفة غير معروف حتى الآن. وقد ثبت الحمض النووي الريبي التدخل لتكون واحدة من الطرق الأكثر قيمة للاستدلال وظائف الجزيئية 49 والجنين حقن مكروي يسهل هذه الدراسات.

حقن البلازميد يمكن استخدامها لتعديل جينوم الحشرات باستخدام الإدراج الجينات بوساطة ترانسبوزاز، ومؤخرا، أدوات الجينوم التحرير (على سبيل المثال، TALEN، كريسبر / Cas9، HEGs). وقد سمحت هذه التقنيات بالفعل تطوير سلالات من أنواع الحشرات المتعددة التي يمكن استخدامها لبرامج مكافحة الآفات، والتي تهدف على حد سواء في القضاء أو في استبدال السكان البرية ثإيث الحشرات مع السمات البيولوجية المعدلة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة الأمثل ل microinjection الجنين medfly مع أي DNA البلازميد أو الرنا المزدوج الجديلة.

توافر راسخة وشبه الجافة اليرقات سيلة لتربية medfly، فضلا عن المعلومات الجزيئية واسعة تحقق على مدى سنوات من قبل الباحثين الذين يدرسون في تحديد الجنس وعملية cellularization في هذا النوع فعالة من حيث التكلفة، يسهل إلى حد كبير على إنشاء موثوقة بروتوكول حقن مكروي الجنين. على وجه الخصوص، وقد تم تحسين البروتوكول تربية لضمان أقصى قدر من الخصوبة وحيوية الأجنة. وهذا أمر مهم لتحقيق أقصى قدر من احتمال الحصول الكبار قابلة للحياة مع أقل عدد من الأجنة المحقونة الممكنة. هي بروتوكولات مختلفة متاحة للتربية medfly، مثل الطعام اليرقات على أساس الجزرة التي وصفنا إلى الخلف اليرقات حقن. ومع ذلك، وهذه الطريقة هي أكثر تكلفة وإعداده أكثر تستغرق وقتا طويلا منوسائل الإعلام الأخرى المستخدمة لتربية الروتينية.

عائقا كبيرا لاستخدام حقن مكروي هو ضرر غير محدد الناجمة عن التلاعب الميكانيكية من الأجنة. وهذا يشمل متغيرات متعددة التأثير على بقاء الأجنة، مثل ثقب في الأغشية الجنين مع الفرشاة تستخدم لتوجيه الأجنة، وكميات حقن، موقع الحقن والعازلة، ونوع الإبرة المستخدمة 50. وقد تم تحسين بعض من هذه المعلمات، مثل وحدات التخزين وحقن المخزن المؤقت. في حالة من الإبر، ويمكن أيضا أن تنتج في المنزل باستخدام مجتذب، وهذا يتطلب خطوة الأمثل لتحديد بروتوكول المثالي.

ومن بين العوائق الرئيسية في إجراء حقن مكروي أيضا dechorionation: على الرغم من أن هذه الخطوة ضرورية لجعل البيض أسهل للمعالج (أي أقل الزلقة) وتسهيل الحقن، والتعرض لفترات طويلة للالتبييض يمكن أن تؤثر بشكل كبير حيوية الجنينية. فوص هذا السبب، فإن البروتوكول وصفنا هنا تقارير استخدام وقت قصير جدا dechorionation (5 ثانية)، التي أنشئت بوصفها حلا توفيقيا بين إزالة معدل المشيمه والبقاء على قيد الحياة.

البروتوكولات المستخدمة لالخلفية مسرح الحياة اللاحقة أيضا ذات الصلة. اليرقات من الأجنة المحقونة لا بد من إزالتها من النفط في أقرب وقت ممكن. النفط هو في الواقع ضروري لمنع جفاف الأجنة، ولكن يمكن أن تكون ضارة لليرقات. الطريقة المستخدمة لإزالة اليرقات، والوقت الذي يقضيه في النفط، ونوع من المواد الغذائية المستخدمة هي كل المتغيرات الهامة التي تحتاج إلى النظر فيها لأنها يمكن أن تؤثر سلبا على معدل البقاء على قيد الحياة النهائي.

عند فحص الكبار واليرقات، ويمكن للطرق تجميد أمرا أساسيا. الكبار Medfly يمكن يجمد باستخدام كريم أو CO ولكن التعرض لفترات طويلة قد تكون ضارة للبقاء الكبار. كبديل للحقن مكروي الجنين، وقد ثبت تسليم عن طريق الفم لتكون وسيلة أقل الغازية ويحتمل أن تكون الإنتاجية العالية لأداء فحوصات رني. ويمكن أن يكون فعالا بشكل خاص في الأنواع التي هي غير قابلة للحقن مكروي، فضلا عن مكافحة الآفات بوساطة رني في السكان المجال.

في هذه الورقة، تم الإبلاغ عن حالتين كأمثلة من التطبيقات الممكنة لبروتوكول وصف: أولا، التحول الناجح من خلال إدخال الجين بوساطة ترانسبوزاز من الجينوم medfly، الأمر الذي أدى إلى إنشاء سلالات متعددة مع الخصيتين الفلورسنت. باستخدام إجراء حقن مكروي مماثل، فمن الممكن أيضا أن حقن الرنا المزدوج الجديلة، مع آثار ضربة قاضية يجري مرئية حتى مرحلة البلوغ.

إنشاء بروتوكول حقن مكروي موثوق للأجنة medfly فتح الطريق للنظر السلالات المعدلة وراثيا كأداة للسيطرة على الذباب في البرية، واستراتيجيات بديلة أو مكملة للمناهج التقليدية، بما في ذلك الحشرة العقيمةتقنية. وأخيرا، قد التطورات الحديثة في تكنولوجيا ل microinjection الآلي في أجنة سمك الزرد يحتمل أن تساعد في تطوير نظم تسليم إنتاجية عالية مع أهمية هامة لخلق سلالات معدلة وراثيا من البحر المتوسط وذبابة الآفات الأخرى ذات الصلة 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats