Доставка нуклеиновых кислот через Эмбрион микроинъекции в во всем мире насекомых-вредителей сельского хозяйства,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Средиземноморская плодовая муха (Medfly) Ceratitis capitata (Видеман) (Diptera: Tephritidae) является видов вредителей с чрезвычайно высокой сельскохозяйственной значимости. Это связано с его репродуктивном поведении: женщины повредить внешнюю поверхность фруктов и овощей, когда они откладывают яйца и вылупившихся личинки питаются их мякотью. Дикий С. популяции capitata традиционно контролируется с помощью распыления инсектицидов и / или экологически чистые подходы, наиболее успешным является стерильных насекомых (МСН). SIT полагается на массового разведения, радиационной стерилизации на основе и выпуска поля самцов, которые сохраняют свою способность к спариванию, но не в состоянии генерировать плодородную потомство. Появление и последующее быстрое развитие биотехнологических инструментов, вместе с доступностью Medfly последовательности генома, значительно повысили наше понимание биологии этого вида. Это способствовало распространению новых стратегий для манипулирования генома, что сап применяться для контроля населения.

В этом контексте, эмбрион микроинъекции играет двойную роль в расширении набора инструментальных средств для Medfly контроля. Способность влиять на функции генов, которые регулируют основные биологические процессы, действительно, расширяет наше понимание молекулярных механизмов, лежащей в основе Medfly инвазивность. Кроме того, способность достичь трансформации зародышевой линии облегчает получение нескольких трансгенных линий, которые могут быть проверены для будущих приложений на местах в новых установках SIT. Действительно, генетические манипуляции могут быть использованы для придания желательных качеств, которые могут, например, использоваться для мониторинга стерильную производительности мужчин в этой области, или, что может привести к ранней стадии жизни летальности. Здесь мы опишем метод microinject нуклеиновых кислот в Medfly эмбрионов для достижения этих двух основных целей.

Introduction

Средиземноморская плодовая муха (Medfly) Ceratitis capitata является космополитическим видов , которые экстенсивно повреждает плоды и пропашных культур. Она принадлежит к семейству Tephritidae, которая включает в себя несколько видов вредителей, таких как те , которые принадлежат к роду Bactrocera и Anastrepha. Medfly является наиболее изученным видов этого семейства, и он стал образцом не только для изучения нашествий насекомых - 1, но и для оптимизации стратегии борьбы с вредителями 2.

Medfly является multivoltine видов , которые могут атаковать более 300 видов диких и культурных растений 3,4. Ущерб причинен как на взрослых, так и личиночных стадий: вязка самки прокалывают поверхность плодов для яйцекладки, позволяя микроорганизмов влиять на их товарное качество, в то время как личинки питаются на плодовой мякоти. После трех личиночной стадии, личинки выходят из хозяина и окукливаются в почве. Ceratitiscapitata отображает почти распространение во всем мире, в том числе Африки, Ближнего Востока, Западной Австралии, Центральной и Южной Америке, Европе и районах Соединенных Штатов 5.

Наиболее распространенные стратегии для ограничения Medfly инвазии предусматривают использование инсектицидов (например, малатион, Спинозад) и экологически чистых стерильных насекомых (SIT) 6. Последний подход предполагает выпуск в дикую природу сотен тысяч мужчин стерилизуют под воздействием ионизирующего излучения. Спаривание таких стерилизованных самцов диких самок приводит к отсутствию потомства, что приводит к уменьшению численности населения, в конечном итоге приводит к ликвидации. Хотя SIT доказала свою эффективность в нескольких кампаниях по всему миру, ее основные недостатки включают высокие затраты на выращивание и стерилизовать миллионы насекомых, которые будут освобождены. Маркировка освобожденных лиц необходимо отличать стерильными от диких насекомых, захваченных в поле во времямониторинг деятельности и в настоящее время достигается с использованием флуоресцентных порошков. Эти процедуры являются дорогостоящими и имеют нежелательные побочные эффекты 7.

В целях оптимизации и / или разработки более эффективных подходов к борьбе с этим вредителем, Medfly биология и генетика были широко изучены многочисленными исследователями по всему миру. Наличие Medfly последовательности генома 8,9, будет способствовать новые исследования по генных функций. РНК-интерференция является мощным инструментом для таких исследований, и это может быть достигнуто с помощью микроинъекции дцРНК (двухцепочечной РНК) или миРНК (малых интерферирующих РНК). Эта техника была использована, например, чтобы показать , что определение пола молекулярный каскад в C. capitata лишь частично сохраняется относительно у Drosophila 10.

Разработка протоколов к microinject Medfly эмбрионов позволили С. capitata , чтобы быть первым-Drosophilid Видов мух, чтобы быть генетически модифицированы. Как его яйца аналогичны таковым у Drosophila, как с точки зрения морфологии и устойчивости к высыханию 11, протокол для доставки плазмидной ДНК в предварительно бластодермой эмбрионов впервые разработаны для D. MELANOGASTER 12,13 первоначально был адаптирован для использования в C. capitata. Эти первые опыты позволила Medfly трансформации зародышевой линии , основанной на элементе Миноса транспозируемого 11. Впоследствии, исходная система была изменена 14 с использованием других подходов транспозона основе. Это случай PiggyBac от чешуекрылых Trichoplusia п 15. Протокол с тех пор был дополнительно оптимизирован , и это позволило преобразование других видов tephritid 16-21 , а также многих других двукрылых 22-31. Все эти системы основаны на использовании типичного бинарного вектора / хелперов системы трансформации плазмидами: искусственный, дефектного TRANSPOсыновья , содержащие желаемых генов собраны в плазмидной ДНК , и интегрированы в геном насекомого путем подачи транспозаза фермента 32. Ряд трансгенных Medfly линий были сформированы, с множеством функций, включая штаммы, несущие условный доминантный летальный ген, который вызывает летальность, штаммы, продуцирующие только для мужчин потомства и, таким образом, не требуя дополнительных стратегий Sexing, и штаммы с флуоресцентным спермы, что может повысить точность фазы мониторинга МСН 33-37. Хотя выпуск в дикой природе трансгенных организмов произошло в пилотных испытаниях против комаров только 38,39, по крайней мере , одна компания оценивает ряд трансгенных Medfly штаммов , используемых для их использования в полевых условиях 40.

Эмбрион микроинъекции может также способствовать развитию новых инструментов генома редактирования, такие как активатор транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс), сгруппированных регулярно interspaced короткие палиндромных повторами (CRИСПИ) / CRISPR белок, ассоциированный с 9 нуклеазы (cas9) и самонаведения эндонуклеаз генов (HEGs), что позволит новые эволюционные и развития исследований, а также расширение доступного биотехнологического набор инструментов. Геном редактирования подходов уже позволило поколение генно-приводных систем в комаров 41, и их передача в Medfly неизбежна. Здесь мы опишем универсальный протокол для microinjecting нуклеиновых кислот в Medfly эмбрионов, которые могут быть полезны для всех указанных выше применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Экспериментальная установка

  1. инсектарий требования
    1. Поддерживать все C. capitata Этапы жизни при 25 ° C, влажности 65% и 12/12 ч свет / темнота фотопериод.
    2. Поместите около 1500-2000 Medfly куколок в 6 л клетке. Используйте клетку с латунной сеткой на одной стороне с отверстиями достаточно малы , чтобы стимулировать яйцекладку 42. Вставьте губку полосу через небольшое отверстие в базе клетке, чтобы обеспечить мух с водой с помощью капиллярного действия. Используйте смесь дрожжей и сахара (1:10) в качестве источника питания для взрослых (Рис . 1А) Увеличение количества дрожжей (вплоть до 1: 3, дрожжи: сахар) должны самки не в состоянии откладывать яйца.
    3. Поместите тарелку, наполненную водой ниже клетки, чтобы собирать яйца, депонированные через сетку. Как девственные самки могут откладывают яйца, подождать, пока мухи не по крайней мере 6-7 дней перед сбором яиц для экспериментов микроинъекции. Это гарантирует, что женщины будут вязкаи что яйца были оплодотворены.
    4. Сбор яиц путем фильтрации воды с тонкой чистой ситечко. Передача яйца из сетчатого фильтра в пластиковой коробке , содержащей стандартный личиночного корма (1,5 LH 2 O, 100 мл HCl , 1%, 5 г широкого спектра противомикробного агента , растворенного в 50 мл этанола, 400 г сахара, 175 г дрожжей деминерализованной пивные, 1 кг мягкого пшеничных отрубей) с помощью пипетки Пастера.
    5. Поместите каждую коробку в прозрачный контейнер закрыт с чистой крышкой , чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и содержащую слой отрубей в пользу окукливание (рис 1B).
    6. Примерно через 10 дней, проверить на 3 - й возрастной стадии личинок , которые выходят из личиночной пищи и спрыгните в отруби слой для окукливания.
    7. 24 часа в сутки позже, собирать куколок в маленькой чашке с помощью мягкой щетки и перенести их в новую взрослую клетку. Взрослые обычно появляются через 10 дней после окукливания. Возникающее муха использует ptilinum, надувной карман , расположенный на голову выше йе основание усиков, чтобы заставить от конца пупария. После появления, то ptilinum постоянно разрушается назад внутри головы.
  2. Приготовление 1 л пищи для личинок микроинъецировали
    1. Растворить 2,5 г агара в 300 мл H 2 O.
    2. Теплый 500 мл H 2 O на горячей плите для перемешивания и растворения 4 г бензоата натрия, 4,5 мл 37% HCl, 42 г дрожжевого экстракта и 115 г порошка обезвоженной моркови.
    3. Добавить в смесь раствор 2,86 г широкого спектра противомикробного агента, растворенного в 10 мл абсолютного этанола.
    4. Распределить среду в 15 см круглых чашек Петри и дайте ему остыть. При необходимости хранить при температуре 4 ° С.
  3. подготовка слайдов
    1. Поместите 2 см полосу двухсторонней ленты на предметное стекло микроскопа (75 х 26 мм 2) и отметьте края с посудной маркером, чтобы предотвратить распространение нефти и последующее высыхание инжектированных эмбрионов.
  4. Изолировать плазмидной ДНК с использованием коммерчески доступных наборов 34. Осадить плазмиды с использованием этанола и повторно приостанавливать в инъекционной буфере (0,1 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, 5 мМ KCl) в нужной концентрации.
  5. Очищают в пробирке синтезировали длинные дцРНК с использованием фенола-хлороформа, осаждения с использованием изопропанола и повторно приостанавливать в инъекции буфера 43.

2. Эмбрион Приготовление

  1. Поместите поддон, заполненный водой под клеткой, содержащей 6-7 суточных взрослых.
  2. Разрешить самки к откладывают яйца в течение 30 мин, а затем собирают эмбрионов путем фильтрации воды с помощью тонкой сетчатого фильтра. Всегда держите сетчатый фильтр в воде, чтобы избежать высыхание эмбрионов.
  3. Dechorionate эмбрионов путем immerging сетчатого фильтра в течение 5 сек в коммерческой 50% -ного раствора хлорной извести.
  4. Вымойте эмбрионов тщательно повторно immerging сетчатый фильтр в чистой сверхчистой воды (по крайней мере,В 4-5 раз). Наконец, поместите сетчатый фильтр в чистой сверхчистой воды. Использование эмбрионов в течение максимум 2 часов.
    Примечание: Выбор времени микроинъекции связан с необходимостью вводить в предварительно бластодермой эмбрионов, во время фазы ядерных делений до cellularization. Это позволяет впрыскивают ДНК должны быть приняты меры в ядра, в частности, в изначальных ядер зародышевых клеток, которые происходят гаметы. У Drosophila, cellularization в полюсе клеток начинается около 90 мин после оплодотворения (при 25 ° C), с образованием бластодермой происходит приблизительно через 30 мин 44, в то время как в Medfly cellularization происходит от 9 до 12 часов 45,46.
  5. Ориентация Эмбрион в строках
    1. Использование тонкой кистью, собрать около 50 эмбрионов и поместить их на диск черной фильтровальной бумаги, пропитанной водой.
    2. Под рассекает стереомикроскопа, устройте эмбрионов в ряд на верхней поверхности двухсторонней ленты настекло микроскопа , используя тонкую кисть (000) (рис 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Совместите эмбрионов все в той же ориентации, как инъекция выполняется в заднем полюсе, где зародышевой линии будет исходить; задний полюс находится напротив области микропиле.
    3. Накройте эмбрионов слоем хлортрифторэтилен масла, убедившись, что масло не перетечет фарфора маркера границы (см 1.3).
      Примечание: Перед покрытием эмбрионов с маслом, еще один шаг может быть выполнен: эмбрионы могут быть высушенной в течение нескольких минут, чтобы уменьшить их содержание жидкости и, таким образом, облегчить вхождение введенного раствора ДНК. Это может помочь избежать эмбриона разрывать во время инъекции или чрезмерной утечки введенного раствора, как следствие высокого давления жидкости.

3. Эмбрион Микроинъекция

  1. Наполните иглу (1-2 мкл) ДНК плазмиды или раствором дсРНК (1-2 мкг / мкл) с использованием микропипетки.
  2. Выполните микроинъекции под стереомикроскопа, используя микроманипулятора для контроля движения иглы (рис 1D). Используйте столик микроскопа, чтобы переместить слайд.
    1. Поместите слайд на сцене сферы.
    2. Вставьте кончик иглы в заднем полюсе эмбриона (рис 1E).
    3. Вводят раствор путем активации системы микроинъекции с педалью. Вводили жидкость вызывает увеличение внутреннего давления, что приводит к небольшому перемещению эмбриона.
    4. Отпустите педаль и немедленно, но осторожно, удалить иглу из эмбриона.
    5. Заметим, немного цитоплазматический утечки в месте инъекции.
      Примечание: Для того, чтобы различать потенциальных летальных эффектов ДНК / дсРНК / миРНК и смертности в связи с микроинъекции процедуру себя, должны быть выполнены контрольные эксперименты. Они включают в себя инъекцию буфера только, или, в случае обратной генетики экспериментов, зеленого флуоресцентного белка (GFP) -derived двухцепочечную РНК (дцРНК-GFP), или миРНК.
  3. После инъекции инкубировать эмбрионов при 25 ° C.

4. Процедуры после инъекции

  1. Через два дня после инъекции, проверьте слайды для вылупившихся личинок (рис 1F) под стереомикроскопа. Личинки могут двигаться в масле, но должны быть переданы в личиночной пищу как можно скорее. По этой причине, проверьте слайды несколько раз в день.
  2. Использование тонкой кистью (000), аккуратно передать вылупившихся личинок на основе моркови личиночной пищи. Перенести до максимум 200 личинок на каждую чашку Петри.
  3. Выдержите личинок при 65% влажности (25 ° C). Убедитесь в том, что крышка не прилипает к блюду, ухудшая воздухообмен.
  4. Держите чашки Петри с крышкойв основном закрыты, так что есть еще поток воздуха к личинкам. Для того, чтобы избежать чрезмерного высыхания, проверьте посуду ежедневно, и, при необходимости, добавляют воду, чтобы компенсировать испарение.
  5. Поместите чашки Петри в прозрачный контейнер закрытой нетто-крышкой и содержащей слой отрубей в пользу окукливание. Что же касается обычного инсектарий выращивания, 3 - й возрастной стадии личинки выпрыгивают из личиночной пищи и окукливаются в отрубях.
  6. Соберите куколок и поместите их в маленькую клетку для взрослых разведению и скрининг (это поколение 0, G0). Задний потомством на стандартной личиночной пищи.
  7. В случае экспериментов по трансформации зародышевой линии, проверить наличие возможных трансформированных особей в следующем поколении (G1), а инъецированные особи обычно химеры. Транспозиции события, действительно, могло произойти в любом из ядер эмбриональных синцитий, которые будут образовывать либо зародышевой линии или сому.
    1. Вскоре после появления, обезболить G1 лиц с использованием CO 2 и проверьте элеменсобытия ormation под эпифлуоресцентной стереомикроскопа. Для скрининга на наличие красной флуоресценции, использовать DsRedwide фильтр (Ext 546/12;.. Эмм 605/75), а на экран для зеленой флуоресценции использовать EYFP фильтр (Ext 500/20;.. Эмм 535/30) ,
    2. Поместите трансформированных особей в маленькой клетке с диким типом взрослых противоположного пола и возникают новые, изначально гетерозиготную, процедить.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы сообщаем два приложения эмбриона микроинъекции, направленной на функциональную характеристику интересующего гена (случай 1), а также при генерации трансгенных линий (случай 2), соответственно.

Поставка дсРНК в эмбрионы распутать функции гена.

Ген innexin-5 кодирует гэп-соединение , что у насекомых, в частности , выражается в мужских и женских половых желез 43,47,48. На основе информации, доступной для близкородственных видов, дцРНК-индуцированных генов глушителей, как ожидается, приведет к абляции Medfly женской и мужской зародышевой линии. Общее количество 2.400 эмбрионов вводили 2 мкг / мкл смеси дцРНК, из которых 548 вылупились личинки и 216 взрослых выжила (неопубликованные данные). Примерно 75% взрослых, семенников и яичников оказались либо под-DeveloPED или полностью отсутствует (рисунок 2). Количественное innexin-5 стенограммы обилие в брюшке особей обоих полов подтвердили значительно более низкую экспрессию гена, по сравнению с контрольной группой .

Генерация трансгенных линий с люминесцентным сперматозоидами.

Medfly трансгенные штаммы с флуоресцентно меченных спермы были сгенерированы Сколари и его коллегами 34 путем введения эмбрионов с плазмидной ДНК. Смесь содержала двух плазмид , смешанных в фиксированных относительных процентах: одна, в "Helper" плазмиды, закодировал PiggyBac транспозазу; с другой стороны, "Донор плазмида", содержала искусственный транспозон и носил два флуоресцентных маркеров, один выраженный в сомы самцов и самок, а другой конкретно в семенниках. Промотор бета - гена 2-тубулина, ответственный за тЭстес-специфическая экспрессия, была слита с ATG кодирующих последовательностей флуоресцентных белков TurboGFP (построить # 1260) или DsRedExpress (построить # 1261), соответственно. впрыскивали Общее количество 821 эмбрионов, из которых 205 личинки вылупились и 37 взрослых выжили. 9 женщин и 8 мужских переходах установка, 6 из которых дал флуоресцентных Потомство 34 (Лицензия на многократное использование этих данных , полученных от Elsevier - Номер лицензии 3796240759880). Успешная трансформация привела к развитию штаммов с зелеными и красными флуоресцентными семенников, соответственно (рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. инсектарий оборудование и эмбрионы. (А) Стандартный выращивание клетку , содержащую 1500-2000 взрослых. Самки откладывают яйца через медные сетки на передней части клетки. Яйца собирают в воде. Налевостороне клетки, сетчатый фильтр используется для фильтрации яйца видна. (B) Две коробки стандартного личиночной пищи , содержащей личинки. Ящики помещают в большой прозрачной пластиковой коробке, содержащей отруби для облегчения окукливание; сеть покрытия ящик был удален. (С) Зародыши расположены рядами. Края двойной ленты с покрытием на слайде были отмечены белым маркером фарфора. Яйца выровненные на ленте будет покрыта хлортрифторэтилен маслом. (D) Микроинъекция аппарат (слева) , соединенный с стереомикроскопа , снабженного микроманипулятором (справа). (E) Эмбрион полюса; красная стрелка указывает на задний полюс (в месте инъекции), в то время как черная стрелка указывает на передний полюс (где находится микропиле). Шкала бар = 500 мкм. (F) Выклюнувшиеся личинка движется в масле. Шкала бар = 500 мкм. Мольбасе нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Мужчина и женщина с слаборазвитых гонад. Женский (слева) и мужской (справа) рассекали репродуктивная. Выше: дикого типа людей с нормальными половыми железами. Внизу: вмешивались люди с слаборазвитых гонад. MAGS: Мужской аксессуар желез; Sp: сперматеки. Шкала бар = 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Трансгенные самцы с люминесцентными семенников и спермы. Взрослые мужчины , трансформированных конструкцией # 1260 и # 1261, соответственно. Стрелки указывают Fluoфлуоресцентным семенников. # 1260 мужчин показывают красные тела и зеленые яички, в то время как # 1261 самцы показывают красные яички и зеленые тела. Шкала бар = 2 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микроинъекция нуклеиновых кислот у эмбрионов насекомых является универсальным методом, который облегчает как анализ функции гена и биотехнических применений.

Недавней публикации геномных последовательностей из большего числа видов насекомых приводит к острой необходимости инструментов для функциональной характеристике генов пока неизвестной функции. РНК-интерференция оказалась одним из наиболее ценных методов , чтобы вывести молекулярные функции 49 и эмбрион микроинъекции облегчает эти исследования.

Инъекция ДНК плазмиды могут быть использованы для модификации геномы насекомых с использованием вставки гена транспозаза-опосредованной, и, совсем недавно, геном-инструменты для редактирования (например, Talen, CRISPR / cas9, HEGs). Эти методы уже позволили разработать штаммы нескольких видов насекомых, которые могут быть использованы для осуществления программ по борьбе с вредителями, с целью как на ликвидации или замене популяции диких шIth насекомые с измененными биологическими особенностями. В этом протоколе, мы описываем оптимизированный метод Medfly эмбрионов микроинъекции либо с плазмидной ДНК или дцРНК.

Наличие устоявшихся и рентабельный полусухое личиночной среда для Medfly выращивания, а также обширной молекулярной информации, достигнутый на протяжении многих лет исследователи, изучающие определение пола и процесс cellularization у этого вида, в значительной степени способствовать созданию надежной протокол микроинъекции эмбрионов. В частности, протокол разведение был оптимизирован для обеспечения максимальной фертильности и жизнеспособности эмбрионов. Это важно, чтобы максимизировать вероятность получения жизнеспособных взрослых с наименьшим количеством инъецированных эмбрионов возможно. Различные протоколы доступны для Medfly разведению, такие как морковь на основе личиночной пищи, которую мы описываем, к задней впрыскиваемого личинок. Тем не менее, этот метод является более дорогим и его подготовка больше времени, чемдругие средства массовой информации, используемые для обычного выращивания.

Важным препятствием для использования микроинъекции является неспецифическое повреждение, вызванное механической манипуляции эмбрионов. Это включает в себя несколько переменных , влияющих на выживаемость эмбрионов, таких как пирсинг зародышевых оболочек с кисточкой , используемых сориентировать эмбрионов впрыскиваемая объемы, место инъекции и буфер, а тип иглы используются 50. Некоторые из этих параметров оптимизированы, например, инжектированных объемов и буфера. В случае игл, они также могут быть изготовлены в доме при помощи экстрактора, и это требует шага оптимизации, чтобы определить идеальный протокол.

Среди основных недостатков в процедуре микроинъекции также dechorionation: хотя этот шаг необходим , чтобы сделать яйца легче обработчиком (т.е. менее скользким) и для облегчения инъекции, длительное воздействие отбеливателя может сильно повлиять на эмбриональное жизнеспособность. Foг этой причине, протокол мы описываем здесь сообщает об использовании очень короткое время dechorionation (5 сек), который был создан как хороший компромисс между удалением хориона и выживаемость.

Протоколы, используемые для задней последующей стадии жизни также актуальны. Личинки вылупились из инъецированных эмбрионов, должны быть удалены из масла, как можно скорее. Нефть действительно необходима, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов, но может быть вредным для личинок. Метод, используемый для удаления личинок, время, проведенное в масло, а тип питания используются все важные переменные, которые необходимо учитывать, так как они могут поставить под угрозу конечный уровень выживаемости.

При скрининге взрослых и личинок, методы иммобилизации могут быть также имеет важное значение. Medfly взрослые могут быть иммобилизованы с использованием либо льда или CO 2, но длительное воздействие может быть вредным для взрослых выживания. В качестве альтернативы эмбрион микроинъекции, пероральной доставки, оказалось,быть менее инвазивными и потенциально высокой пропускной метод для выполнения RNAi анализов. Это может быть особенно эффективным у видов, которые не поддаются микроинъекции, а также для RNAi-опосредованной борьбы с вредителями в полевых популяций.

В данной работе, два случая были зарегистрированы в качестве примеров возможных применений протокола описано: во-первых, успешное преобразование через транспозазы-опосредованного введения гена в геном Medfly, что привело к созданию нескольких штаммов с люминесцентными семенников. С помощью аналогичной процедуры микроинъекции, также возможно вводить дцРНК, с эффектами нокдауна быть видимым до взрослой стадии.

Создание надежного протокола микроинъекции для Medfly эмбрионов открыло путь для рассмотрения генетически модифицированных штаммов в качестве инструмента для управления мух в дикой природе, в качестве альтернативных или дополнительных стратегий для классических подходов, в том числе стерильных насекомыхТехника. И, наконец, последние достижения в области технологии автоматизированного микроинъекции в зебры эмбрионов рыб потенциально могут помочь в разработке систем доставки с высокой пропускной способностью с важной значение для создания трансгенных штаммов Medfly и других соответствующих вредителей 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats