משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) הוא מין הדברה עם הרלוונטיות חקלאיות גבוהות מאוד. זאת בשל התנהגות הרבייה שלה: נקבות לפגום במשטח החיצוני של פרות וירקות כאשר הם מטילים ביצים ואת הזנת הזחלים בקעו על העיסה שלהם. Wild ג אוכלוסיות capitata נשלטות באופן מסורתי באמצעות דברת ריסוס ו / או גישות ידידותיות לסביבה, המצליחות ביותר להיות טכניקת חרקי סטרילי (SIT). לשבת מסתמך על-גידול המוני, עיקור מבוסס קרינה בתחום שחרור הזכרים שומרים ליכולתם להזדווג, אבל הם לא מסוגלים להפיק צאצאים פוריים. ההופעה ואת ההתפתחות המהירה הבאה של כלים ביוטכנולוגיים, יחד עם הזמינות של רצף הגנום medfly, שהגביר מאוד את הבנתנו את הביולוגיה של מין זה. זה העדיף ההתפשטות של אסטרטגיות חדשות עבור מניפולציה הגנום, אשר can להיות מיושם על שליטה באוכלוסייה.

בהקשר זה, microinjection העובר ממלא תפקיד כפול בהרחבת ארגז הכלים לבקרת medfly. היכולת להפריע לתפקוד של גנים המווסתים תהליכים ביולוגיים מפתח, אכן, מרחיב את הבנתנו את המנגנון המולקולרי שבבסיס הפולשנות medfly. יתר על כן, היכולת להשיג שינוי הניבט אונליין הופכת לפשוט את הייצור של זנים מהונדסים רבים שיכולים להיבדק עבור יישומים בתחום בעתיד במסגרות SIT רומן. אכן, ניתן להשתמש מניפולציה גנטית להעניק תכונות רצויות שיכולות, למשל, לשמש כדי לפקח על הביצועים זכר סטרילי בתחום, או שיכול לגרום הקטלניות החיים בשלב מוקדם. כאן אנו מתארים שיטה microinject חומצות גרעין לעוברי medfly להשיג שתי מטרות עיקריות אלה.

Introduction

זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata הוא מין קוסמופוליטי כי פירות נזקים בהרחבה וגידולים מעובדים. זה שייך למשפחת Tephritidae, הכוללת מינים מזיקים שונים, כגון השייכים לסוגים Bactrocera ו Anastrepha. Medfly הוא המין הנחקר ביותר של המשפחה הזו, והיא הפכה להיות דוגמא ומופת לא רק לחקר פלישות חרקי 1, אלא גם עבור אופטימיזציה של אסטרטגיות במזיקי 2.

Medfly הוא מין multivoltine שיכול לתקוף יותר מ -300 מינים של בר צמחי תרבות 3,4. הנזק נגרם על ידי שני מבוגרים בשלבים הזחל: הנקבות הזדווגו לחדור את פני השטח של הפרי עבור ההטלה, המאפשר מיקרואורגניזמים כדי להשפיע על איכות המסחרי שלהם, ואילו את ההזנה הזחלים על עיסת הפירות. לאחר שלושה שלבי זחל, זחלים יוצאים מן המארח pupate לתוך האדמה. Ceratitiscapitata מציג חלוקה כמעט כלל עולמי, כולל אפריקה, המזרח התיכון, מערב אוסטרליה, מרכז ודרום אמריקה, אירופה, ותחומי בארצות הברית 5.

האסטרטגיות הנפוצות ביותר להגביל מכת medfly כרוכה בשימוש חומר הדברה (למשל, malathion, Spinosad) ואת טכניקת סטרילית החרקים הידידותית לסביבה (SIT) 6. הגישה האחרונה כרוכה שחרור לטבע של מאות אלפי גברים שניתנו סטרילי על ידי חשיפה קרינה מייננת. ההזדווגות של זכרים מעוקרים כגון לנקבות בטבע התוצאה לא צאצאים, גרימת ירידה בגודל אוכלוסייה, המובילה בסופו של דבר לחיסול. למרות SIT הוכיח יעילות קמפיינים רבים מרחבי העולם, החסרונות העיקריים שלה כוללים את העלויות הגבוהות של גידול וטיהור מיליוני חרקים להשתחרר. סימון של אנשים שוחררו יש להבחין סטרילי מפני חרקים בטבע שנתפסו בשטח במהלךניטור פעילויות וזה מושג כיום באמצעות אבקות ניאון. נהלים אלה הם יקרים ויש לי 7 תופעות לוואי בלתי רצוי.

על מנת לייעל ו / או לפתח גישות יעילות יותר של השליטה על המזיק הזה, ביולוגיה והגנטיקה medfly נחקרו באופן נרחב על ידי חוקרים רבים ברחבי העולם. הזמינות של רצף הגנום medfly 8,9, תקל חקירות רומן על פונקציות גן. התערבות RNA הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים כאלה וזה יכול להיות מושגת באמצעות microinjection של dsRNA (RNA פעמיים תקועים) או siRNA (RNA התערבות קטנה). טכניקה זו נעשתה שימוש, למשל, על מנת להוכיח כי המפל המולקולרי קביעת הזוויג ב C. capitata נשמרת באופן חלקי בלבד ביחס לזה של תסיסנית 10.

הפיתוח של פרוטוקולי microinject עובר medfly מותר ג capitata להיות בלתי הראשוןמיני זבוב -Drosophilid להיות מהונדסים גנטי. כפי ביציו דומות לאלו של תסיסנית, הן מבחינת מורפולוגיה ועמידות בפני התייבשות 11, פרוטוקול להעביר דנ"א פלסמיד לעוברי טרום blastoderm הראשון שפותח עבור ד melanogaster 12,13 בתחילה הותאם לשימוש ב C. capitata. הניסויים הראשונים אפשרו טרנספורמציה נבט אונליין medfly מבוסס על טרנספוזון מינוס 11. בהמשך לכך, המערכת המקורית שונתה 14 תוך שימוש בגישות transposon מבוסס אחרים. זהו המקרה של piggyBac מן פרפראים Trichoplusia ni 15. הפרוטוקול מאז מותאם יותר וזה התיר טרנספורמציה של מיני tephritid אחרים 16-21 וגם של רבים אחרים Diptera 22-31. כל המערכות הללו מסתמכות על השימוש של מערכת טרנספורמציה פלסמיד וקטור / עוזר בינארי אופיינית: מלאכותי, transpo הפגוםבנים שיישאו את הגנים הרצויים הם התאספו לתוך ה- DNA פלסמיד והשתלבו הגנום של החרק על ידי אספקת האנזים transposase 32. מספר קווי medfly המהונדסים נוצר, עם תכונות רבות, כוללים זני נושאת גן קטלני דומיננטי מותנה שגרם קטלני, זנים בייצור צאצאים לגברים בלבד ובכך לא מחייב אסטרטגיות זיהוי מין באמצעים נוספות, זנים עם זרע פלורסנט, אשר עשוי לשפר את הדיוק שלב ניטור SIT 33-37. למרות שחרורו בטבע של האורגניזם מהונדס שחל בדיקות טייס נגד יתושים רק 38,39, לפחות חברה אחת בוחנת מספר זני medfly המהונדסים לשימושם בתחום 40.

microinjection העובר יכול גם לטובת פיתוח כלים הגנום עריכה חדשים, כגון nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs), חזרות palindromic קצר interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / CRISPR הקשורים nuclease חלבון 9 (Cas9) וגנים endonucleases ביות (HEGs), אשר יאפשר מחקרים האבולוציוניים וההתפתחותיים הרומן, כמו גם הרחבת ארגז הכלים ביוטכנולוגיים זמין. גישות הגנום עריכה כבר מותרות דור מערכות כונן גני יתושים 41, והעבירו אל medfly הוא קרוב. כאן אנו מתארים פרוטוקול אוניברסלי עבור microinjecting חומצות גרעין בעוברים medfly שיכול להיות שימושי עבור כל היישומים הנ"ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניסיוני Set-up

  1. דרישות insectary
    1. לשמור על כל ג חי capitata טיולים של 25 מעלות צלזיוס, לחות 65% ו 12/12 שעות אור / photoperiod הכהה.
    2. מניחים על 1,500-2,000 גלמים medfly בכלוב L 6. השתמש כלוב עם פליז רשת בצד אחד עם חורים קטנים מספיק כדי לעורר הטלה 42. הכנס רצועה ספוגה דרך פתח קטן בבסיס של הכלוב כדי לספק זבובים עם מים באמצעות כוח הנימיות. השתמש תערובת של שמרים וסוכר (1:10) כמקור מזון עבור המבוגרים (איור 1 א). להגדיל את כמות שמרים (עד 1: 3, שמרים: סוכר) צריכות הנקבות מצליחות להטיל ביצים.
    3. מניחים צלחת מלאה במים מתחת לכלוב לאסוף את הביצים שהופקדו מבעד לרשת. כמו נקבות בתולה יכולות oviposit, לחכות עד הזבובים לפחות בן 6-7 ימים לפני איסוף ביצים עבור ניסויי microinjection. פעולה זו תבטיח כי הנקבות הזדווגווכי הביצים תהיינה כבר מופרות.
    4. אסוף את הביצים על ידי סינון המים עם מסננת נטו בסדר. מעבירים את הביצים מן מסננת בקופסת פלסטיק המכיל מזון הזחל סטנדרטי (1.5 LH 2 O, 100 מ"ל HCl 1%, 5 גרם סוכן מומס מיקרוביאלית-קשת רחבה ב 50 מ"ל אתנול, 400 גרם סוכר, 175 גרם שמרי בירה demineralized, 1 קילו סובין חיטה רך) בעזרת פיפטה פסטר.
    5. מניחים כל תיבת במיכל שקוף סגור עם מכסה נטו לאפשר זרימת אוויר המכיל שכבת סובין להעדיף התגלמות (איור 1B).
    6. לאחר כ -10 ימים, לבדוק 3 rd instar זחלים העולות ממזון הזחל ולקפוץ למטה לתוך שכבת הסובין עבור התגלמות.
    7. 24 שעות מאוחר יותר, לאסוף את הגלמים בכוס קטנה בעזרת מברשת רכה ולהעבירם לכלוב בוגרים חדש. מבוגרים בדרך כלל מופיעים 10 ימים לאחר ההתגלמות. הזבוב מתעורר משתמש ptilinum, כיס מתנפח ממוקם על הראש מעל הבסיס הדואר של האנטנות, לכפות את סוף puparium. לאחר הופעתה, את ptilinum לצמיתות צונח לאחור בתוך הראש.
  2. הכנת 1 L מזון לזחלי microinjected
    1. ממיסים אגר 2.5 גרם ב 300 מ"ל H 2 O.
    2. מ"ל חם 500 H 2 O על פלטה חשמלית ערבוב להמיס 4 גרם נתרן בנזואט, 4.5 מ"ל 37% HCl, תמצית שמרים 42 גרם ו -115 גרם אבקת גזר מיובש.
    3. להוסיף לתערובת פתרון של 2.86 גרם סוכן מיקרוביאלית הספקטרום הרחב מומס ב 10 מ"ל אתנול אבסולוטי.
    4. הפץ את בינוניים 15 ס"מ עגולים צלחות פטרי להתקרר. במידת הצורך, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכנת שקופיות
    1. מניח רצועת 2 סנטימטר של סרט דו צדדי על שקופיות מיקרוסקופ (75 x 26 מ"מ 2) ולסמן את הקצוות עם סמן בסין, כדי למנוע את התפשטות נפט ההתייבשות הסוגרת של העוברים המוזרקים.
  4. לבודד פלסמיד דנ"א באמצעות 34 ערכות זמינות מסחרי. לזרז את הפלסמיד באמצעות אתנול מחדש להשעות במאגר הזרקה (חיץ פוספט 0.1 מ"מ pH 7.4, 5 KCl מ"מ) בריכוז הרצוי.
  5. לטהר במבחנה synthetized ארוך dsRNA באמצעות כלורופורם פנול, לזרז באמצעות isopropanol מחדש להשעות במאגר הזרקת 43.

2. עובר כנה

  1. מניחים מגש מלא במים תחת כלוב ובו מבוגרים ישנים 6-7 יום.
  2. אפשר הנקבות כדי oviposit למשך 30 דקות ולאחר מכן לאסוף את העוברים על ידי סינון המים באמצעות מסננת דקה. שמור תמיד את המסננת במים כדי למנוע התייבשות של העוברים.
  3. Dechorionate את העוברים על ידי immerging מסננת למשך 5 שניות בתמיסת אקונומיקה מסחרית 50%.
  4. לשטוף את העוברים בקפידה על ידי immerging מסננת שוב ושוב במי ultrapure נקיים (לפחות4-5 פעמים). לבסוף, הניח את המסננת במי ultrapure נקיים. השתמש עובר בתוך 2 שעות מקסימום.
    הערה: התזמון של microinjection קשור בצורך להזריק לעוברי טרום blastoderm, במהלך שלב של חטיבות גרעיניות לפני cellularization. זה מאפשר ה- DNA מוזרק להילקח למעלה לתוך גרעינים, במיוחד לתוך גרעין התא נבט הקדמוני אשר מקורן הגמטות. ב תסיסנית, cellularization על תאי המוט מתחיל בערך 90 דקות לאחר ההפריה (25 מעלות צלזיוס), עם היווצרות blastoderm המתרחשת כ -30 דקות מאוחר יותר 44, ואילו cellularization medfly מתרחש בין 9 ל 12 שעות 45,46.
  5. האוריינטציה העובר בשורות
    1. באמצעות מכחול בסדר, לאסוף כ -50 עוברים ומניחים אותם על דיסק של נייר פילטר שחור ספוגה במים.
    2. תחת סטראו לנתח, לארגן את העוברים ברציפות על פני השטח העליונים של הסרט דו צדדי עלשקופיות מיקרוסקופ באמצעות מכחול בסדר (000) (תרשים 1C).
      הערה: ישר את העוברים כולם באותו הכיוון, כמו ההזרקה מתבצעת בקוטב האחורי, שם ניבט אונליין ייוצר; בקוטב האחורי הוא הפוך באזור micropyle.
    3. מכסה את העוברים עם שכבה של שמן chlorotrifluoroethylene ולוודא כי השמן לא יגלוש סין גבולות סמן (ראה 1.3).
      הערה: לפני המכסים את העוברים עם שמן, צעד נוסף יכול להתבצע: העוברים ניתן מיובשים במשך כמה דקות כדי להפחית את תכולת הנוזל ובכך להקל על כניסתם של הפתרון ה- DNA המוזרק. זה עשוי לעזור למנוע התפוצצות עוברת במהלך הזרקה או דליפה מוגזמת של הפתרון המוזרק, כפועל יוצא של הלחץ הנזיל הגבוה.

העובר 3. Microinjection

  1. מלאו מחט (1-2 μl) עם DNA פלסמיד או פתרון dsRNA (1-2 מיקרוגרם / μl) באמצעות micropipette.
  2. בצע microinjection תחת סטראו, באמצעות micromanipulator לשלוט בתנועות של המחט (איור 1D). השתמש הבמה מיקרוסקופ כדי להעביר את השקף.
    1. מניחים את השקף על הבמה של היקף.
    2. הכנס את קצה המחט לתוך בקוטב האחורי של העובר (איור 1E).
    3. להזריק את הפתרון על ידי הפעלת מערכת microinjection עם הדוושה. הנוזל המוזרק גורם לעלייה בלחץ פנימי, וכתוצאה מכך תנועה קלה של העובר.
    4. שחרר את הדוושה ומייד, אבל בעדינות, להוציא את המחט מן העובר.
    5. שים דליפה cytoplasmic קטנה במקום ההזרקה.
      הערה: כדי להפלות בין השפעות קטלניות הפוטנציאל של DNA / dsRNA / siRNA ותמותה בשל פרו microinjectioncedure עצמו, ניסויי שליטה חייבות להתבצע. אלה מהווים את הזריקה של חיץ בלבד, או, במקרה של ניסויים גנטיקה הפוכה, של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -derived RNA פעמיים תקועים (dsRNA-GFP), או siRNA.
  3. הזרקה בעקבות הדגירה עוברת על 25 מעלות צלזיוס.

4. הליכים שלאחר הזרקה

  1. יומיים לאחר ההזרקה, לבדוק את השקופיות עבור הזחלים בקעו (איור 1F) תחת סטראו. הזחלים יכולים לנוע שמן אבל צריך להיות מועבר המזון הזחל בהקדם האפשרי. מסיבה זו, לבדוק את השקופיות כמה פעמים ביום.
  2. באמצעות מכחול בסדר (000), להעביר את הזחלים בקעו בעדינות לאוכל זחל מבוסס הגזר. העבר עד למקסימום של 200 זחלים לכל צלחת פטרי.
  3. דגירת הזחלים בלחות 65% (25 מעלות צלזיוס). ודא כי המכסה אינו מקל על הצלחת, וכתוצאה מכך נפגע חילופי אוויר.
  4. שמור על צלחות פטרי עם מכסהבעיקר סגור כך שעדיין יש זרימת אוויר אל הזחלים. כדי למנוע ייבוש יתר, תבדוק את הכלים יומי, במידת הצורך, מוסיפים מים כדי לפצות על התאדות.
  5. מניח את צלחות פטרי במכל ברור העצום בקרום-נטו המכיל שכבת הסובין להעדיף התגלמות. באשר לגידול insectary שגרתית, 3 rd instar הזחלים לקפוץ החוצה של מזון הזחל pupate ב סובין.
  6. אסוף הגלמים ומניחים אותם בכלוב קטן עבור גידול מבוגר ומיון (זה הדור 0, G0). אחורי הצאצאים על מזון זחל סטנדרטי.
  7. במקרה של ניסויי טרנספורמציה ניבט אונליין, לבדוק ליחידים טרנספורמציה אפשריים בדור הבא (G1), כיחידים מוזרקים בדרך כלל הן מפלצות. אירועי טרנספוזיציה, אכן, אולי התרחשו בכל הגרעינים של syncytium העוברי, אשר יהוו גם את שורת הניבט או סומה.
    1. זמן קצר לאחר הופעתה, להרדים אנשים G1 באמצעות CO 2 ולבדוק transfאירועי ormation תחת סטראו epifluorescence. למסך עבור נוכחות של הקרינה אדום, להשתמש במסנן DsRedwide (שלוחה 546/12;.. Emm 605/75), זמן מסך פלואורסצנטי ירוק להשתמש במסנן EYFP (שלוחה 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. מניחים אנשים שינו בכלוב קטן עם מבוגרים wild-type של המין השני מקורן זן חדש, בתחילה הטרוזיגוטיים,.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מדווחים שני יישומים של microinjection עובר מכוון האפיון הפונקציונלי של גן של עניין (מקרה 1), ועל הדור של זנים מהונדסים (מקרה 2), בהתאמה.

משלוח dsRNA לעוברי לפענח תפקוד הגן.

הגן innexin-5 מקודד צומת-הפער, חרקים, מתבטא במיוחד אצל הזכר והאשכים נקבה 43,47,48. בהתבסס על המידע זמין עבור מינים קרובים, השתקת גני מושרה dsRNA הייתה צפויה לגרום אבלציה של ניבט אונליין הנשי וגברי medfly. מספר כולל של 2,400 עובר הוזרק בתערובת dsRNA 2 מיקרוגרם / μl, שממנו 548 זחלים בקעו 216 מבוגרי שרד (נתונים שלא פורסמו). בערך 75% של מבוגרים, האשכים והשחלות שנראה גם תחת-developed או נעדר לחלוטין (איור 2). כימות של שפע תמליל innexin-5 הבטן של אנשים מן המינים גם אישר את הביטוי נמוך משמעותית של הגן, כמו בהשוואה לקבוצת הביקורת.

דור של זנים מהונדסים בזרע ניאון.

Medfly זנים מהונדסים עם זרע שכותרתו fluorescently נוצרו על ידי Scolari ועמיתיו 34 על ידי הזרקה עוברת עם פלסמיד דנ"א. התערובת הכילה שני פלסמידים מעורבבים באחוזים ביחס קבועים: אחד, "פלסמיד Helper", קדדה את transposase piggyBac; והשני, "פלסמיד התורם", הכיל את transposon המלאכותית ונשא שני סמני ניאון, אחד ביטוי סומה של זכרים ונקבות, והשני במיוחד באשכים. האמרגן של הגן 2-בטא טובולין, אחראי tאסטס ספציפי ביטוי, היו מחוברים ATG עם רצפים קידוד של חלבוני ניאון turboGFP (לבנות # 1260) או DsRedExpress (לבנות # 1261), בהתאמה. מספר כולל של 821 עוברים הוזרקו, שממנו 205 זחלים בקעו ו -37 מבוגרים שרדו. 9 נשים ו 8 מעברי זכר היו הגדרה, 6 מתוכם נתן צאצאים פלורסנט 34 (רישיון לעשות שימוש חוזר נתונים אלה המתקבלים Elsevier - מספר רישיון 3796240759880). השינוי המוצלח הוביל לפיתוח של זנים עם האשכים פלואורסצנטי ירוק ואדום, בהתאמה (איור 3).

איור 1
איור 1. ציוד ועובר insectary. (א) תקן גידול כלוב ובו 1,500-2,000 מבוגרים. הנקבות מטילות ביצים, דרך פליז רשת בחזית הכלוב. ביצים נאספות מים. בצד שמאלדופן הכלוב, המסננת, משמש לסינון הביצים גלויה. (ב) שתי קופסות של זחלים המכילים מזון זחל סטנדרטיים. התיבות ממוקמות בתוך קופסא פלסטיק שקופה גדולה המכילה סובין כדי להקל התגלמות; הרשת מכסה את התיבה הוסרה. (ג) עוברים מסודרים בשורות. הקצוות של הסרט דו-מצופה בשקופית סומנו בטוש חרסינה לבן. ביצים מיושרות בקלטת תכוסינה בשמן chlorotrifluoroethylene. מנגנון Microinjection (ד) (משמאל) מחובר סטראו מצויד micromanipulator (מימין). (E) עמודי עובר; החץ האדום מציין את בקוטב האחורי (הזריקה), ואילו החץ השחור מציין את המוט הקדמי (שבו micropyle ממוקם). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (F) בקע זחל נע בתוך השמן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. טיעוןse לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. זכר ונקבה עם בלוטות מין תחת מפותח. נקבה (משמאל) זכר (מימין) גזורים שטחי רבייה. למעלה: אנשי wild-type עם בלוטות מין נורמלים. להלן: התערב אנשים עם בלוטות מין תחת מפותח. מגס: בלוטות אביזר זכר; Sp: spermathecae. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. טרנסגניים זכרים עם אשכים פלורסנט וזרע. זכרים בוגרים הפכו עם מבנה # 1260 ו # 1261, בהתאמה. החצים מצביעים על fluoאשכי rescent. # 1260 זכרים להראות אשכים לגוף וירוק אדומים, ואילו # 1261 זכרים להראות אשכים אדומים וגופים ירוקים. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microinjection של חומצות גרעין בעוברי חרקים הוא טכניקה אוניברסלית המאפשרת הוא הניתוח של תפקוד גן ויישומים ביוטכנולוגיים.

הפרסום האחרון של רצפי גנום ממספר גדל והולך של מיני חרקים מוביל צורך דחוף כלים לאפיון הפונקציונלי של גנים של פונקציה עדיין לא ידועה. RNA ההתערבות הוכיחה להיות באחת מהשיטות היקרות ביותר להסיק פונקציות מולקולריות 49 ו microinjection עובר הופך לפשוט מחקרים אלה.

הזרקה של ה- DNA פלסמיד יכול לשמש כדי לשנות את הגנום חרקים באמצעות החדרת גנים בתיווך transposase, ולאחרונה, כלים לעריכת הגנום (למשל, Talen, CRISPR / Cas9, HEGs). טכניקות אלו כבר יצרו את התשתית לפיתוח זנים של מיני חרקים מרובים שעשויים לשמש לתוכניות דברה, מכוונות הוא המיגור או החלפת האוכלוסייה בטבע wה- i חרקים עם תכונות ביולוגיות שונות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטת אופטימיזציה עבור microinjection העובר medfly עם DNA פלסמיד או או dsRNA.

הזמינות של ומבוסס וחסכוני חצי יבש בינוני זחל עבור גידול medfly, כמו גם המידע המולקולרי הנרחב השיג במהלך השנים על ידי חוקרים לומדים את קביעת מין תהליך cellularization המין הזה, מאוד להקל על הקמתה של אמין פרוטוקול microinjection העובר. בפרט, פרוטוקול גידול עבר אופטימיזציה כדי להבטיח את פוריות וחיוניות מקסימלית של העוברים. זה חשוב על מנת למקסם את ההסתברות לקבלת מבוגרי קיימא עם המספר הנמוך ביותר של עוברים מוזרקים אפשריים. פרוטוקולים שונים זמינים עבור גידול medfly, כגון מזון הזחל מבוסס גזר שאנחנו מתארים לגדל את הזחלים המוזרקים. עם זאת, שיטה זו היא יקרה יותר והכנתו היא יותר זמן רב יותר מאשרמדיה אחרת המשמשת לגידול שיגרתי.

מחסום חשוב שימוש microinjection הוא הניזק הלא ספציפי הנגרם על ידי המניפולציה המכאנית של העוברים. זה כולל משתנים מרובים המשפיעים ההישרדות של עוברים, כגון פירסינג בפתח ממברנות העובר עם מכחול השתמשו להתמצא את העוברים, היקפי מוזרק, הזריקה חיץ, ואת סוג של מחט בשימוש 50. כמה פרמטרים אלה ממוטבים, כגון כרכים הזריקו למאגר. במקרה של מחטים, הם יכולים גם להיות מיוצר ללא צורך במיקור חוץ באמצעות חולץ, וזה דורש צעד אופטימיזציה לקבוע את הפרוטוקול האידיאלי.

בין החסרונות העיקריים בהליך microinjection גם dechorionation, למרות צעד זה הוא חיוני כדי להפוך את הביצים קלות יותר מטפל (כלומר, פחות חלקלקות) וכדי להקל הזרקה, חשיפה ממושכת אקונומיקה יכולה בכבדות להשפיע חיוניות עובריות. For מסיבה זו, הפרוטוקול המתואר כאן מדווח שימוש זמן dechorionation קצר מאוד (5 שניות), אשר הוקם בתור פשרה טובה בין הסרת השער הסיסי והישרדות.

הפרוטוקולים המשמשים לגדל את השלב בחיים שלאחר מכן הם גם רלוונטיים. זחלים בקעו מעוברת מוזרקים צריכים להסיר מהשמן בהקדם האפשרי. הנפט הוא אכן חיוני כדי למנוע התייבשות של העוברים, אבל יכול להיות מזיק הזחלים. השיטה השתמשו כדי להסיר הזחלים, את משך הזמן לתוך השמן, ואת סוג של מזון בהם נעשה שימוש הם כל המשתנים החשובים שצריכים להיחשב שכן הם יכולים לסכן את שיעור ההישרדות הסופי.

כאשר הקרנה מבוגרת וזחלים, שיטות הקיבוע יכולות להיות גם ביקורתיות. יכולים להיות משותקים מבוגרי Medfly או באמצעות קרח או 2 CO, אך חשיפה ממושכת עלולה להיות מזיקה להישרדות מבוגרת. כחלופת microinjection העובר, משלוח אוראלי הוכיחלהיות פחות פולשנית שיטת תפוקה גבוהה פוטנציאל לבצע מבחני RNAi זה יכול להיות יעיל במיוחד במינים שאינם מקובלים microinjection, כמו גם להדברה בתיווך RNAi באוכלוסיות שדה.

במאמר זה, בשני מקרים דווחו כדוגמאות של יישומים אפשריים של פרוטוקול המתואר: ראשית, טרנספורמציה מוצלחת באמצעות החדרת גנים בתיווך transposase של הגנום medfly, שהוביל להקמת זנים מרובים עם האשכים ניאון. באמצעות הליך microinjection דומה, אפשר גם להזריק dsRNA, עם ההשפעות של המציאה להיות גלויות עד לשלב הבוגר.

הקמת פרוטוקול microinjection אמין כלפי עובר medfly פתחה את הדרך לשקול זנים גנטיים שונים ככלי לשלוט זבובים בטבע, כמו אסטרטגיות חלופיות או משלים לגישות קלסיות, כולל החרקים סטריליטֶכנִיקָה. לבסוף, התקדמות הטכנולוגיה עבור microinjection האוטומטית בעוברי דגי זברה קיימת פוטנציאל לסייע בפיתוח של מערכות שיגור קצב העברת נתונים גבוהות עם הרלוונטיות חשובות ליצירת זנים מהונדסים של medfly ומזיקים רלוונטיים אחרים 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats