Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
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Genetics

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Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

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Abstract

La mouche méditerranéenne des fruits (mouche méditerranéenne) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) est une espèce nuisible avec pertinence agricole extrêmement élevé. Cela est dû à son comportement de reproduction: les femelles endommagent la surface externe des fruits et légumes quand ils pondent des œufs et les larves se nourrissent hachurée sur leur pulpe. Sauvage C. populations capitata sont traditionnellement contrôlés par pulvérisation d' insecticides et / ou des approches écologiques, le plus de succès étant la technique de l' insecte stérile (TIS). Le SIT repose sur l'élevage en masse, la stérilisation à base de rayonnement et la dissémination des hommes qui conservent leur capacité à accoupler, mais ne sont pas en mesure de générer une descendance fertile. L'avènement et le développement rapide subséquente des outils biotechnologiques, ainsi que la disponibilité de la séquence du génome de la mouche méditerranéenne, a considérablement renforcé notre compréhension de la biologie de cette espèce. Cela favorisait la prolifération de nouvelles stratégies pour la manipulation du génome, qui can être appliquée au contrôle de la population.

Dans ce contexte, l'embryon microinjection joue un double rôle dans l'expansion de la boîte à outils pour le contrôle de la mouche méditerranéenne. La capacité à interférer avec la fonction des gènes qui régulent les processus biologiques clés, en effet, élargit notre compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacente invasivité mouche méditerranéenne. En outre, la capacité de réaliser la transformation de la lignée germinale facilite la production de multiples souches transgéniques qui peuvent être testées pour les futures applications sur le terrain dans de nouveaux paramètres de SIT. En effet, la manipulation génétique peut être utilisé pour conférer des traits désirables qui peuvent, par exemple, être utilisés pour surveiller la performance des mâles stériles dans le domaine, ou qui peut entraîner au début de la létalité de stades de vie. Nous décrivons ici une méthode pour micro-injection des acides nucléiques dans des embryons de mouches méditerranéennes pour atteindre ces deux objectifs principaux.

Introduction

La mouche méditerranéenne des fruits (mouche méditerranéenne) Ceratitis capitata est une espèce cosmopolite que intensivement dommages fruits et plantes cultivées. Il appartient à la famille des Tephritidae, qui comprend plusieurs espèces de parasites, tels que ceux appartenant aux genres Bactrocera et Anastrepha. La mouche méditerranéenne est l'espèce la plus étudiée de cette famille, et il est devenu un modèle non seulement pour l'étude des invasions d' insectes 1, mais aussi pour l' optimisation des stratégies de lutte antiparasitaire 2.

La mouche méditerranéenne est une espèce multivoltines qui peuvent attaquer plus de 300 espèces de sauvages et les plantes cultivées 3,4. Le dommage est causé par les adultes et les stades larvaires: femelles fécondées percent la surface du fruit pour la ponte, ce qui permet des micro-organismes d'affecter leur qualité commerciale, alors que les larves se nourrissent de la pulpe de fruits. Après trois stades larvaires, les larves émergent de l'hôte et se nymphosent dans le sol. Ceratitiscapitata affiche une répartition presque dans le monde entier, y compris l' Afrique, le Moyen-Orient, en Australie occidentale, centrale et Amérique du Sud, en Europe et régions des États-Unis 5.

Les stratégies les plus communes pour limiter les infestations de mouches méditerranéennes impliquent l'utilisation d'insecticides (par exemple, Malathion, spinosad) et respectueux de l' environnement Technique de l' insecte stérile (TIS) 6. Cette dernière approche implique la libération dans la nature des centaines de milliers de mâles rendus stériles par exposition à une irradiation ionisante. L'accouplement de ces mâles stérilisés aux femelles sauvages se traduit par aucune descendance, ce qui provoque une réduction de la taille de la population, pour aboutir finalement à l'éradication. Bien que le SIT a prouvé son efficacité dans de multiples campagnes dans le monde entier, ses principaux inconvénients comprennent les coûts élevés de l'élevage et de stérilisation des millions d'insectes à être libéré. Marquage des individus relâchés est nécessaire de distinguer stérile des insectes sauvages capturés sur le terrain pendantles activités de surveillance et il est actuellement réalisé en utilisant des poudres fluorescentes. Ces procédures sont coûteuses et ont des effets secondaires indésirables 7.

Afin d'optimiser et / ou de développer des approches plus efficaces pour le contrôle de ce ravageur, la biologie et la génétique mouche méditerranéenne ont été largement exploré par de nombreux chercheurs dans le monde entier. La disponibilité de la séquence du génome de la mouche méditerranéenne 8,9, facilitera de nouvelles enquêtes sur les fonctions des gènes. l'interférence ARN est un outil puissant pour de telles études et il peut être atteint par la microinjection d'ARNdb (en ARN double brin) ou siRNA (petits ARN interférents). Cette technique a été utilisée, par exemple, pour démontrer que la cascade moléculaire de détermination du sexe chez C. capitata est partiellement conservée par rapport à celle de la drosophile 10.

Le développement des protocoles à micro - injection d' embryons permis C. mouche méditerranéenne capitata d'être le premier nonespèces de mouches -Drosophilid à être génétiquement modifiées. Comme ses œufs sont semblables à ceux de la drosophile, tant en termes de morphologie et de la résistance à la dessiccation 11, le protocole pour délivrer l' ADN plasmidique dans des embryons pré-blastoderme premier développés pour D. melanogaster 12,13 a été initialement conçu pour être utilisé en C. capitata. Ces premières expériences ont permis la transformation de la mouche méditerranéenne lignée germinale sur la base des éléments transposables Minos 11. Par la suite, a été modifié le système d' origine 14 à l' aide d' autres approches à base de transposons. Tel est le cas de piggyBac de lépidoptères 15 Trichoplusia ni. Le protocole a depuis été optimisé, ce qui a permis la transformation d'autres espèces téphritides 16-21 ainsi que de nombreux autres diptères 22-31. Tous ces systèmes reposent sur l'utilisation d'un système typique de vecteur binaire / auxiliaire de transformation: plasmide artificiel, transp défectueuseles fils contenant les gènes souhaités sont assemblés dans l' ADN plasmidique et intégré dans le génome de l'insecte en fournissant l'enzyme transposase 32. Un certain nombre de lignes de mouches méditerranéennes transgéniques ont été générées, avec de multiples fonctionnalités, y compris des souches portant un gène létal dominant conditionnel qui induit la létalité, les souches produisant exclusivement masculine descendance et ne nécessitant donc pas de stratégies de sexage supplémentaires, et les souches avec le sperme fluorescent, qui peut améliorer la précision de la phase de surveillance SIT 33-37. Bien que la libération dans la nature des organismes transgéniques a eu lieu dans des essais pilotes contre les moustiques seulement 38,39, au moins une entreprise évalue un certain nombre de souches transgéniques pour leur mouche méditerranéenne utilisation dans le domaine 40.

Embryo microinjection peut également favoriser le développement de nouveaux outils génome-édition, telles que la transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens), regroupées répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) / CRISPR protéine associée 9 nucléase (cas9) et endonucléases homing gènes (HEGs), ce qui permettra de nouvelles études sur l'évolution et le développement, ainsi que l'expansion de la boîte à outils biotechnologiques disponibles. Approches Genome-édition déjà permis à la génération de systèmes de gènes entraînement chez les moustiques 41, et leur transfert à la mouche méditerranéenne est imminente. Nous décrivons ici un protocole universel pour microinjection acides nucléiques dans des embryons qui peuvent être la mouche méditerranéenne utile pour toutes les applications mentionnées ci-dessus.

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Protocol

1. Experimental Set-up

  1. exigences insectarium
    1. Maintenir tous C. vie capitata étapes à 25 ° C, 65% d' humidité et de 12/12 heures de lumière / photopériode sombre.
    2. Placer environ 1500-2000 pupes mouche méditerranéenne dans un 6 L cage. Utilisez une cage avec un laiton filet sur un côté avec des trous suffisamment petits pour stimuler la ponte 42. Insérez une bande éponge à travers une petite ouverture dans la base de la cage pour fournir des mouches avec de l'eau au moyen d'une action capillaire. Utilisez un mélange de levure et de sucre (1:10) en tant que source de nourriture pour les adultes (figure 1A). Augmenter la quantité de levure (jusqu'à 1: 3, de la levure: sucre) si les femmes ne parviennent pas à pondre des œufs.
    3. Placez une plaque remplie d'eau en dessous de la cage pour recueillir les œufs déposés à travers les mailles. Comme les femelles vierges peuvent pondre, attendre jusqu'à ce que les mouches sont au moins 6-7 jours vieux avant la collecte des œufs pour les expériences de microinjection. Cela permettra d'assurer que les femelles sont accoupléset que les œufs ont été fécondés.
    4. Ramassez les oeufs en filtrant l'eau avec une passoire nette amende. Transférer les oeufs de la crépine dans une boîte en plastique contenant de la nourriture larvaire standard (1,5 LH 2 O, 100 ml de HCl 1%, 5 g de large spectre agent antimicrobien dissous dans 50 ml d' éthanol, 400 g de sucre, 175 g de levure de bière déminéralisé, 1 kg de son de blé tendre) à l'aide d'une pipette Pasteur.
    5. Placez chaque boîte dans un récipient transparent fermé d'un couvercle net pour permettre la circulation de l' air et contenant une couche de bran de favoriser la nymphose (figure 1B).
    6. Après environ 10 jours, vérifiez 3 ème stade larvaire qui se dégagent de la nourriture des larves et de sauter vers le bas dans la couche de son pour la nymphose.
    7. 24 heures plus tard, de recueillir les pupes dans une petite tasse avec une brosse douce et de les transférer à une nouvelle cage adulte. Les adultes émergent normalement 10 jours après la nymphose. La mouche émergente utilise le ptilinum, une poche gonflable situé sur sa tête au- dessus ee base des antennes, pour forcer l'extrémité de la pupe. Après la levée, l'ptilinum effondre en permanence à l' intérieur de la tête.
  2. Préparation de 1 L nourriture pour les larves microinjecté
    1. Dissoudre 2,5 g d' agar dans 300 ml H 2 O.
    2. Chaud 500 ml H 2 O sur une plaque d' agitation chaude et dissoudre 4 g de benzoate de sodium, HCl 4,5 ml 37%, 42 g d' extrait de levure et 115 g de carotte déshydratée en poudre.
    3. Ajouter au mélange une solution de 2,86 g de large spectre antimicrobien dissous dans 10 ml d'éthanol absolu.
    4. Distribuer le milieu dans 15 cm autour des boîtes de Pétri et laisser refroidir. Si nécessaire, conserver à 4 ° C.
  3. Préparation de diapositives
    1. Placez une bande de 2 cm de ruban adhésif double face sur une lame de microscope (75 x 26 mm 2) et marquer les bords avec un marqueur Chine, pour prévenir la propagation de l' huile et de la dessiccation consécutive des embryons injectés.
  4. Isoler l' ADN plasmidique en utilisant des kits disponibles dans le commerce 34. Précipiter le plasmide en utilisant de l'éthanol et remise en suspension dans un tampon d'injection (0,1 mM de tampon phosphate de pH 7,4, KCl 5 mM) à la concentration souhaitée.
  5. Purifier in vitro en utilisant l' ARN double brin synthétisé à long phénol-chloroforme, précipité avec de l' isopropanol et remettre en suspension dans un tampon d'injection 43.

2. Embryon Préparation

  1. Placez un bac rempli d'eau sous une cage contenant 6-7 jour adultes âgés.
  2. Permettre aux femmes d'pondent pendant 30 min, puis recueillir les embryons en filtrant l'eau à l'aide d'une passoire fine. Toujours garder la crépine dans l'eau pour éviter la dessiccation des embryons.
  3. Dechorionate les embryons en immergeant le tamis pendant 5 secondes dans une solution à 50% d'eau de javel commerciale.
  4. Laver soigneusement les embryons par immergeant à plusieurs reprises la crépine dans l'eau ultrapure propre (au moins4-5 fois). Enfin, placer la crépine dans l'eau ultrapure propre. Utilisez les embryons dans un délai maximum de 2 heures.
    NOTE: Le calendrier de microinjection est liée à la nécessité d'injecter dans des embryons pré-blastoderme, lors d'une phase de divisions nucléaires avant cellularisation. Cela permet à l'ADN injecté à prendre en place dans les noyaux, en particulier dans les noyaux des cellules germinales primordiales qui sont créés gamètes. Chez la drosophile, cellularisation les cellules polaires commence à environ 90 min après la fécondation (à 25 ° C), avec la formation de blastoderme se produisant environ 30 minutes plus tard 44, alors que dans la cellularisation mouche méditerranéenne a lieu entre 9 et 12 h 45,46.
  5. Orientation Embryo en rangées
    1. L'utilisation d'un pinceau fin, recueillir environ 50 embryons et les placer sur un disque de papier filtre noir imbibé d'eau.
    2. En vertu d'un stéréomicroscope à dissection, organiser les embryons dans une rangée sur la surface supérieure du ruban adhésif double face surla lame de microscope à l' aide d' un pinceau fin (000) (figure 1C).
      REMARQUE: Alignez les embryons dans la même orientation, que l'injection est réalisée dans le pôle postérieur, où la lignée germinale proviendra; le pôle postérieur est opposée à la région de micropyle.
    3. Couvrir les embryons avec une couche d'huile de chlorotrifluoroéthylène faire en sorte que l'huile ne rejaillissent pas sur porcelaine frontières de marqueur (voir 1.3).
      NOTE: Avant de recouvrir les embryons avec de l'huile, une étape supplémentaire peut être réalisée: les embryons peuvent être desséchées pendant quelques minutes afin de réduire leur teneur en liquide et faciliter ainsi l'entrée de la solution d'ADN injectée. Cela peut aider à éviter l'éclatement embryon lors de l'injection ou une fuite excessive de la solution injectée, en raison de la pression de liquide élevée.

3. Embryo microinjection

  1. Remplir une aiguille (1-2 ul) avec de l'ADN de plasmide ou d'une solution ARNdb (1-2 ug / ul) en utilisant une micropipette.
  2. Effectuer une micro - injection sous un stéréomicroscope, à l' aide d' un micromanipulateur pour commander les mouvements de l'aiguille (figure 1D). Utiliser la platine du microscope pour déplacer la diapositive.
    1. Placer la lame sur la scène de la portée.
    2. Insérer la pointe de l'aiguille dans le pôle postérieur de l'embryon (figure 1E).
    3. Injecter la solution en activant le système de micro-injection avec la pédale. Le liquide injecté provoque une augmentation de la pression interne, ce qui entraîne un léger mouvement de l'embryon.
    4. Relâcher la pédale et immédiatement, mais doucement, retirez l'aiguille de l'embryon.
    5. Observer un peu de fuites cytoplasmique au niveau du site d'injection.
      NOTE: Pour une discrimination entre les effets létaux potentiels d'ADN / ARNdb / siRNA et de la mortalité due à la pro microinjectionprocédure elle-même, des expériences de contrôle doivent être effectuées. Celles-ci comprennent l'injection du tampon uniquement, ou, dans le cas de la génétique inverse des expériences, d'une protéine fluorescente verte (GFP) -derived ARN double brin (ARNdb-GFP) ou ARNsi.
  3. Après injection incuber les embryons à 25 ° C.

4. Procédures de post-injection

  1. Deux jours après l' injection, vérifiez les diapositives de larves écloses (figure 1F) sous un stéréomicroscope. Les larves peuvent se déplacer dans l'huile, mais doivent être transférés à la nourriture des larves dès que possible. Pour cette raison, vérifiez les diapositives plusieurs fois par jour.
  2. L'utilisation d'un pinceau fin (000), transférer doucement les larves écloses à la nourriture des larves sur la base de la carotte. Transfert jusqu'à un maximum de 200 larves par chaque boîte de Pétri.
  3. Incuber les larves à 65% d'humidité (25 ° C). Assurez-vous que le couvercle ne colle pas à l'antenne, d'altérer l'échange d'air.
  4. Gardez les boîtes de Pétri avec le couverclela plupart du temps fermé afin qu'il y ait encore l'écoulement d'air vers les larves. Pour éviter un séchage excessif, vérifiez les plats tous les jours et, si nécessaire, ajouter de l'eau pour compenser l'évaporation.
  5. Placez les boîtes de Pétri dans un récipient transparent fermé par un filet-couvercle et contenant une couche de bran de favoriser la nymphose. En ce qui concerne l' élevage insectarium de routine, 3 e stade larvaire sauter hors de la nourriture des larves et se nymphosent dans le son.
  6. Collecter les pupes et les placer dans une petite cage pour l'élevage des adultes et le dépistage (ce qui est la génération 0, G0). Arrière de la descendance sur la nourriture des larves standard.
  7. Dans le cas des expériences de transformation de lignée germinale, vérifier les individus possibles transformées dans la prochaine génération (G1), en tant qu'individus injectées sont généralement chimères. Les événements de transposition, en effet, ont pu se produire dans l'un des noyaux du syncytium embryonnaire, qui formeront soit le germe en ligne ou le soma.
    1. Peu après la levée, anesthésier individus G1 en utilisant le CO 2 et vérifier transfévénements ormation en vertu d'un stéréomicroscope à épifluorescence. Pour dépister la présence de la fluorescence rouge, utiliser un filtre DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), tout à l'écran pour la fluorescence verte utiliser le filtre EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Placez les personnes transformées dans une petite cage avec de type sauvage adultes du sexe opposé et proviennent d'une nouvelle, d'abord hétérozygote, la souche.

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Representative Results

Nous rapportons ici deux applications de l'embryon microinjection dirigé à la caractérisation fonctionnelle d'un gène d'intérêt (cas 1), et à la génération de souches transgéniques (cas 2), respectivement.

Livraison d'ARNdb dans des embryons à démêler la fonction des gènes.

Le gène innexin-5 code pour un écart-jonction qui, chez les insectes, est exprimé spécifiquement dans les gonades femelles 43,47,48 mâle et. Sur la base de l'information disponible pour les espèces étroitement liées, a été prévu que le silençage génique ARNdb induite par aboutir à l'ablation de la lignée germinale mâle et la mouche méditerranéenne des femmes. Un nombre total de 2.400 embryons ont été injectés avec un / mélange ARNdb pi 2 pg, dont 548 larves éclosent et 216 adultes ont survécu (données non publiées). Dans environ 75% des adultes, les testicules et les ovaires semblaient être soit sous-déveped ou totalement absente (Figure 2). Quantification de la 5-innexin l' abondance des transcrits dans les abdomens des individus des deux sexes a confirmé l'expression significativement plus faible du gène, par rapport aux témoins.

Génération de souches transgéniques avec des spermatozoïdes fluorescente.

Medfly souches transgéniques avec des spermatozoïdes marqués par fluorescence ont été générées par Scolari et ses collaborateurs 34 par injection d' embryons avec de l' ADN de plasmide. Le mélange contenait deux plasmides mélangés en pourcentages relatifs fixes: l' un, le «plasmide Helper", codé la transposase piggyBac; d'autre part, le «plasmide donneur», contenait le transposon artificiel et transporté deux marqueurs fluorescents, on a exprimé dans le soma des mâles et des femelles, l'autre en particulier dans les testicules. Le promoteur du gène de la bêta - 2-tubuline, responsable de la tl'expression estes spécifique, a été fusionné à l'ATG avec les séquences codantes des protéines fluorescentes turboGFP (construction # 1260) ou DsRedExpress (construction # 1261), respectivement. Un nombre total de 821 embryons ont été injectés, dont 205 larves éclosent et 37 adultes ont survécu. 9 femmes et 8 passages mâles ont été mis en place, dont 6 a donné une descendance fluorescente 34 (Licence de réutiliser ces données obtenues à partir Elsevier - Nombre de licence 3796240759880). La transformation réussie a conduit au développement de souches avec des testicules fluorescentes rouges et vertes, respectivement (figure 3).

Figure 1
Figure 1. de l' équipement et des embryons Insectarium. (A) standard d' élevage cage contenant 1500-2000 adultes. Les femelles pondent leurs œufs à travers le laiton maille sur le devant de la cage. Les oeufs sont collectés dans l'eau. À gauchecôté de la cage, le filtre utilisé pour filtrer les oeufs est visible. (B) Deux boîtes de contenant des larves de nourriture larvaire standard. Les boîtes sont placées dans une boîte en plastique transparent contenant du son plus grand pour faciliter la nymphose; le filet couvrant la zone a été supprimée. (C) Embryons disposées en rangées. Les bords de la bande double face sur la lame ont été marquées avec un marqueur en porcelaine blanche. Oeufs alignés sur la bande seront couverts avec de l'huile de chlorotrifluoroéthylène. Appareil (D) de micro - injection ( à gauche) raccordée à un stéréomicroscope équipé d'un micromanipulateur ( à droite). (E) pôles d'embryons; la flèche rouge indique le pôle postérieur (le site d'injection), alors que la flèche noire indique le pôle antérieur (où le micropyle est situé). Barre d'échelle = 500 um. (F) larve hachurée se déplaçant dans l'huile. Barre d'échelle = 500 um. Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Mâle et femelle avec gonades sous-développés. Femme ( à gauche) et mâle ( à droite) disséqués appareil reproducteur. Ci-dessus: type sauvage individus avec gonades normales. Ci-dessous: interféré individus avec gonades sous-développés. MAG: Homme Accessoire Glands; Sp: spermathèques. Barre d' échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Transgenic mâles avec des testicules fluorescents et des spermatozoïdes. Les mâles adultes transformées avec la construction # 1260 et # 1261, respectivement. Les flèches indiquent le fluotesticules rescentes. # 1260 hommes montrent corps et vert testicules rouges, alors que # 1261 mâles montrent testicules rouges et des corps verts. Barre d' échelle = 2 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Microinjection d'acides nucléiques dans les embryons d'insectes est une technique universelle qui facilite à la fois l'analyse de la fonction génique et des applications biotechnologiques.

La publication récente des séquences génomiques provenant d'un nombre croissant d'espèces d'insectes conduit à un besoin urgent d'outils pour la caractérisation fonctionnelle des gènes de fonction inconnue encore. L' ARN interférence est avérée être une des méthodes les plus utiles pour déduire des fonctions moléculaires 49 et la micro - injection d' embryons facilite ces études.

L' injection d'ADN de plasmide peut être utilisé pour modifier des génomes d' insecte en utilisant l' insertion de gène à médiation par transposase, et, plus récemment, des outils d'édition de génome (par exemple Talen CRISPR / cas9, HEGs). Ces techniques ont déjà permis le développement de souches de multiples espèces d'insectes qui pourraient être utilisés pour les programmes de lutte antiparasitaire, visant à la fois à l'éradication ou au remplacement de la population sauvage with insectes avec des caractéristiques biologiques modifiés. Dans ce protocole, on décrit un procédé optimisé pour la mouche méditerranéenne microinjection d'embryons avec un ADN de plasmide ou d'ARN double brin.

La disponibilité du bien établie et rentable à moyen larvaire semi-sec pour l'élevage de la mouche méditerranéenne, ainsi que l'information moléculaire étendue réalisés au cours des années par les chercheurs qui étudient la détermination du sexe et du processus de cellularisation dans cette espèce, facilitera grandement la mise en place d'un système fiable embryon protocole de micro-injection. En particulier, le protocole d'élevage a été optimisé pour garantir la fertilité maximale et la vitalité des embryons. Il est important de maximiser la probabilité d'obtenir des adultes viables avec le moins grand nombre d'embryons injectés possibles. Différents protocoles sont disponibles pour l'élevage de la mouche méditerranéenne, comme la nourriture des larves sur la base de la carotte que nous décrivons à l'arrière les larves injecté. Cependant, cette méthode est plus coûteuse et sa préparation est plus longue queautres supports utilisés pour l'élevage de routine.

Un obstacle important à l'utilisation de microinjection est le dommage spécifique causé par la manipulation mécanique des embryons. Cela inclut plusieurs variables influençant la survie des embryons, tels que le perçage des membranes embryonnaires avec le pinceau servant à orienter les embryons, les volumes injectés, le site d'injection et le tampon et le type d'aiguille utilisé 50. Certains de ces paramètres ont été optimisés, comme les volumes injectés et le tampon. Dans le cas des aiguilles, ils peuvent également être produits en interne à l'aide d'un extracteur, ce qui nécessite une étape d'optimisation pour déterminer le protocole idéal.

Parmi les principaux inconvénients de la procédure de microinjection est également dechorionation: bien que cette étape est essentielle pour rendre les œufs plus facile de gestionnaire (moins glissante) et pour faciliter l' injection, une exposition prolongée à l' eau de Javel peut fortement affecter la vitalité embryonnaire. for cette raison, le protocole que nous décrivons ici les rapports de l'utilisation d'un temps très court de dechorionation (5 sec), qui a été établi comme un bon compromis entre la suppression du taux de chorion et de survie.

Les protocoles utilisés à l'arrière du stade de la vie ultérieure sont également pertinents. Les larves écloses à partir d'embryons injectés doivent être éliminés de l'huile dès que possible. Le pétrole est en effet essentiel pour éviter la dessiccation des embryons, mais peut être nocif pour les larves. La méthode utilisée pour éliminer les larves, le temps passé dans l'huile, et le type d'aliments utilisés sont toutes les variables importantes qui doivent être pris en considération car ils peuvent compromettre le taux de survie final.

Lors de la sélection des adultes et les larves, les méthodes d'immobilisation peut être aussi critique. Adultes Medfly peuvent être immobilisés en utilisant soit la glace ou CO 2, mais une exposition prolongée peut être néfaste pour la survie des adultes. A titre d'alternative à l'embryon micro-injection, l'administration orale est révéléeêtre une méthode moins invasive et potentiellement à haut débit pour effectuer des essais de l'ARNi. Il peut être particulièrement efficace chez les espèces qui ne se prêtent pas à une micro-injection, ainsi que pour le contrôle de l'ARNi à médiation par un organisme nuisible dans les populations naturelles.

Dans cet article, deux cas ont été signalés à titre d'exemples des applications possibles du protocole décrit: d'abord, la transformation réussie par insertion du génome de la mouche méditerranéenne, qui a conduit à la création de plusieurs souches avec testicules fluorescentes gène transposase-médiée. En utilisant un procédé de micro-injection similaire, il est également possible d'injecter de l'ARN double brin, avec les effets de l'effet de choc étant visible jusqu'au stade adulte.

La mise en place d'un protocole de microinjection fiable pour les embryons de mouches méditerranéennes a ouvert la voie à envisager des souches génétiquement modifiées comme un outil pour lutter contre les mouches dans la nature, comme alternatives ou complémentaires des stratégies aux approches classiques, y compris les insectes stérilesTechnique. Enfin, les progrès récents dans la technologie pour la microinjection automatisé dans des embryons de poisson zèbre pourraient potentiellement contribuer au développement de systèmes de distribution à haut débit présentant de l' intérêt important pour la création de souches transgéniques de la mouche méditerranéenne et d' autres organismes nuisibles concernés 51.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

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References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
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