إنشاء وزرع للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) ورقة في نموذج التئام السكري

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هي عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (الخزفية) وتحصد من الدهون الفئران العادية بسهولة. أوراق الرابطة يمكن إنشاؤها باستخدام هندسة الخلايا--ورقة ويمكن زرعها في زوكر الجرذان الدهنية السكري العارضة كامل-سمك الجلد العيوب مع العظام مكشوفة ومغطاة ثم بيلايير جلد الاصطناعي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الجلد الاصطناعي حققت نتائج علاجية كبيرة في الممارسة السريرية. ومع ذلك، قد يطول علاجات البشرة الاصطناعية للجروح في مرضى السكري مع تدفق الدم إعاقة أو الجروح الكبيرة. ظهرت العلاجات المستندة إلى الخلية كتقنية جديدة لعلاج قرح السكري، وهندسة خلية ورقة تحسنت فعالية زرع الخلايا. وقد اقترح عدد من التقارير أن الدهنية المستمدة من الخلايا الجذعية (الخزفية)، نوع من خلايا mesenchymal stromal (MSC)، يحمل إمكانات العلاج بسبب هذه الوفرة النسبية في الأنسجة الدهنية، وإمكانية الوصول لمجموعة بالمقارنة مع MSCs من الأنسجة الأخرى. ولذلك، يبدو الخزفية مصدرا جيدا لخلايا الجذع للاستخدام العلاجي. في هذه الدراسة، إنشاء أوراق الرابطة من الدهون الدهنية البربخيه العادي لويس الفئران بنجاح باستخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة والمتوسطة الثقافة العادية التي تحتوي على حمض الأسكوربيك. أوراق الرابطة تم زرعها في الجرذان الدهنية السكري (زد دي إف) زوكر، نموذج الفئران من مرض السكري من النوع 2 والبدانة، أن المعرض تقلص التئام الجروح. تم إنشاؤه بجرح على سطح الجمجمة الخلفية وأوراق ASC تم زرعها في الجرح وجلد اصطناعي بلير كان يستخدم لتغطية الأوراق. زد دي إف الفئران التي تلقت أوراق الرابطة كان أفضل التئام الجروح من الفئران زد دي إف دون زرع أوراق ASC. وكان هذا النهج محدودة نظراً لأن الرابطة أوراق حساسة للظروف الجافة، التي تتطلب الحفاظ على بيئة الجرح رطبة. ولذلك، استخدم لتغطية الورقة ASC لمنع تجفيف الجلد الاصطناعي. زرع allogenic أوراق ASC في تركيبة مع الجلد الاصطناعي يمكن أن ينطبق أيضا على غيرها قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت مع أمراض الشرايين الطرفية وأمراض الكولاجين، وقد تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. وهكذا، هذا العلاج قد يكون الخطوة الأولى نحو تحسين الخيارات العلاجية لمرضى السكري الجرح الشفاء.

Introduction

سكان مرضى السكري يتزايد في جميع أنحاء العالم، ووصلت إلى 400 مليون بحلول عام 20151؛ ما يقدر 15-25 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض السكري هم في خطر من تطور قرحة السكري السفلي أقصى2. قرحة السكري السفلي أقصى مستعصية على الحل، وقد تتطلب فترة علاجية طويلة مع إعادة التأهيل التدريب بعد الشفاء الكامل. فترة علاج طويلة وكثيراً ما ينتج عن انخفاض كبير في نوعية حياة المريض. وبالتالي، يجب تطوير علاجات جديدة أن تقليل أو منع تفاقم لعلاج الجروح السكري. نحن الأمثل لتقييم التئام الجرح السكري، قرحة السكري التئام نموذجا في الفئران، الذي يحاكي الظروف السريرية العملية، وتقييم ما إذا كان زرع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) الأوراق باستخدام هندسة الخلايا-ورقة تسارع التئام الجروح.

يحمل الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بإمكانيات ممتازة لتسريع التئام الجروح بسبب قدرتها على التجديد الذاتي، وآثارها إيمونومودولاتوري، وقدرتهم على التفريق في خلية مختلفة الأنساب3. الخزفية نوع من لجنة السلامة البحرية المستمدة من الأنسجة الدهنية، وأنهم يحمل العديد من المزايا المستمدة من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك تلك الأوعية المحتملة و paracrine النشاط4،5MSCs. الأنسجة الدهنية وفيرة نسبيا في الجسم البشري، وإمكانية الوصول إليها ويتيح تجميع باستخدام إجراءات كسبها. ولذلك، استخدمت الخزفية تجريبيا لالتئام تطبيقات6،7.

وقد أظهرت التقارير السابقة أن الحقن المباشر لخلية واحدة ماجستير المعلقات في المناطق المحيطة بالجروح ويمكن التعجيل بالجرح الشفاء8،9. ومع ذلك، وعلى الرغم من التقارير للإسراع بالتئام الجروح في نماذج قرحة السكري بعد حقن تعليق خلية واحدة، الوقت البقاء على قيد الحياة من زرع الخلايا في موقع الجرح ليس واضحا.

في هذه الدراسة، قمنا بتطبيق الهندسة خلية ورقة استخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. هذه الأطباق قد تستجيب لدرجة الحرارة البوليمر N-إيسوبروبيلاكريلاميدي تساهمي ملزمة على السطح عن10. طبقة البوليمر المطعمة يسمح لالتصاق الخلايا درجة الحرارة التي تسيطر على أو مفرزة من السطح الطبق الثقافة. يصبح سطح الطبق مسعور في 37 درجة مئوية، والسماح للخلايا بالانضمام وتتكاثر، حين فصل الخلايا تلقائياً من السطح عندما يصبح ماء في درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية. يمكن حصادها الخلايا المستزرعة كورقة خلايا متجاورة مع تقاطعات خلية إلى خلية سليمة ومصفوفات خارج الخلية (ECMs) ببساطة عن طريق تخفيض درجة الحرارة؛ وهكذا، لا proteolytic الإنزيمات التي تلحق الضرر إدارة المحتوى في المؤسسة، مثل التربسين، مطلوب11. ولذلك، يمكن الحفاظ على اتصالات خلية إلى الهندسة خلية ورقة وتحسين فعالية زرع الخلايا.

وباﻹضافة إلى ذلك، زرع خلية ورقة يزيد معدلات بقاء الخلية عند مقارنتها ب حقن الخلية12. واختيرت زوكر السكري الدهنية في الفئران (زد دي إف) في هذا البروتوكول، كنموذج نوع 2 مرض السكري والسمنة مع تأخر التئام الجروح. الفئران زد دي إف تلقائياً وضع السمنة في 4 أسابيع تقريبا. ثم يطورون مرض السكري من النوع 2 مع السمنة بين 8 و 12 أسبوعا من العمر، وعند هذه النقطة يحمل فرط سكر الدم المرتبطة بالانسولين المقاومة ودسليبيدميا hypertriglyceridemia13. كما لوحظت الجرح تأخر الشفاء، تدفق الدم انخفاض في الأوعية الدموية المحيطية، وحدوث السكري14،،من1516. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الفئران زد دي إف نموذجا مناسباً لدراسة الشفاء من القرحة الجلدية المستعصية، مثل قرح مرضى السكري.

الاختلافات بين البشر والقوارض في التئام الآليات المرتبطة بالاختلافات التشريحية في الجلد. الجرح الشفاء في الفئران العادية يستند إلى انكماش الجرح، حين التئام الجروح في البشر يستند تشكيل epithelialization إعادة وتحبيب الأنسجة. بشكل عام، الجرح التجبير المستخدمة في نماذج القوارض يساعد على التقليل من انكماش الجرح ويسمح بتشكيل التدريجي للأنسجة تحبيب17، على الرغم من أن يتم إغلاق الجروح في الفئران نونديابيتيك تقريبا تماما بتقلص. ولكن الجرح السكري الانكماش في زد دي إف الفئران البصر، ويحدث الجرح الشفاء في المقام الأول من خلال إعادة ابيثيلياليزيشن وتشكيل النسيج تحبيب؛ وهكذا، أن هذه العملية أشبه بالجرح البشرية شفاء14.

السكري الجروح مع العظام المكشوفة بعد debridement غالباً ما تواجهها سريرياً. تبحث الدراسات السابقة الجراح الجلد كامل-سمك قطرها 12 مم على ظهورهم athymic الفئران عارية،من18إلى19 والجراح الجلد كامل-سمك قطرها 10 ملم على ظهورهم من الفئران العادية20. إلى وضع نموذج السريري لجروح السكري الحاد، أكبر العيوب كامل-سمك الجلد (15 × 10 مم2) مع كشف العظام ودون السمحاق تم إنشاؤها، كما هو موضح سابقا21، في الفئران مع داء السكري من النوع 2 والبدانة.

الفئران أوراق ASC (مراجعة الحسابات) من الخزفية العادية لويس الفئران تم إنشاؤها من خلال زرع allogenic صحائف ASC. في الممارسة السريرية، زرع ذاتي غير مجد لأنه غالباً ما يحمل مرضى السكري مع القرحة مضاعفات السكري الحادة، مثل مستويات الجلوكوز في الدم غير المنضبط ومؤشرات كتلة الجسم عالية، وهذه مضاعفات قضية التئام الاضطرابات التي تزيد من صعوبة الحصول على الأنسجة الدهنية من هؤلاء المرضى. وعلاوة على ذلك، الخزفية من الحيوانات مع معرض داء السكري تغيير خصائص وإعاقة وظيفة22. ولذلك، يصف البروتوكول المعروضة هنا زرع allogenic أوراق مراجعة الحسابات من الفئران العادية وتطبيق الجلد الاصطناعي للفئران السكري.

الجلد الاصطناعي بيلايير المستخدمة في هذا البروتوكول يمنع انكماش عفوية من الجروح ويعزز التوليف النسيج الضام مصفوفة جديدة ويشبه الأدمة صحيح23. في هذا البروتوكول، ووضعها على ورقة مراجعة الحسابات الجلد الاصطناعي والثابتة مع خيوط النايلون لمنع تقلص الجرح أو توسيع الناتجة عن الفئران فضفاضة الجلد. وبالإضافة إلى ذلك، الجلد الاصطناعي يوفر إطارا ثلاثي الأبعاد للأوراق ASC ويحافظ على بيئة رطبة لزرع أوراق ASC والجروح، والجروح ويحمي من العدوى والقوى الخارجية. وأخيراً، يوضع خلع ملابس غير لاصقة فوق الجرح حمايته من التأثيرات الخارجية، والحفاظ على بيئة رطبة جرح، وامتصاص الإفرازات.

ورقة مراجعة الحسابات رقيقة ومرنة، وتشوه ويمكن التقيد بنقل المواقع المستفيدة، مثل ضرب قلب24. هندسة خلية ورقة قد استخدمت لإعادة بناء الأنسجة المختلفة، ويمكن أن تولد الآثار العلاجية25،26. أوراق الرابطة التي يحمل إمكانات العلاجية السريرية قد تسريع الشفاء من العديد من أنواع الجروح. وعلاوة على ذلك، زرع متمكنة من أوراق ASC، جنبا إلى جنب مع استخدام الجلد الاصطناعي، يمكن تطبيقها لمعالجة قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت في أمراض الشرايين المحيطية أو أمراض الكولاجين، أو أنها يمكن أن تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. هذا النهج يزيد من الكفاءة من زرع الخزفية. نموذج الفئران زد دي إف التئام ينتج شرط جرح شديدة التي تمثل عملية التئام الجرح البشرية ويحاكي الظروف السريرية في الحيوانات تجريبية الصغيرة الحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حاول هذا البروتوكول وضع علاج يستند إلى الخلية جديدة لجروح السكري مستعصية على الحل. بإيجاز (كما هو موضح في الشكل 1)، تم إنشاؤها من الفئران العادية باستخدام هندسة الخلايا-ورقة أوراق مراجعة الحسابات متمكنة وتم زرع ثم استخدام بلير للجلد الاصطناعي على عيب كامل-سمك جلد في الفئران السكري. صور المجهر الخفيفة مثال جيد لورقة مراجعة الحسابات (الشكل 2A) ومثالا سيئاً لورقة مراجعة الحسابات (الشكل 2) مبينة في الشكل 2. عندما يتم مطلي الخزفية على طبق ثقافة جديدة، ينبغي أن يكون الطبق ببطء هزت ذهابا وإيابا، واليسار واليمين في حاضنة لتحقيق مراجعة الحسابات الموحدة البذر وورقة موحدة سميكة مراجعة الحسابات (الشكل 2A). إذا كان لا يمكن أن تعلق الحسابات موحد ومثقف على سطح الطبق الثقافة، لا يمكن تجميع الورقة كورقة ASC متجاورة (الشكل 2). ويبين الشكل 3 أوراق الرابطة التي تم حصادها كورقة خلايا متجاورة في درجة حرارة الغرفة لكانت يعلق الخزفية شكل موحد على سطح الطبق. عادة، يمكن أن تعالج أوراق مراجعة الحسابات مع زوج من الملقط. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام غشاء نقل لنقل ورقة خلية من الطبق الثقافة إلى موقع الجرح، الورقة خلية مثل حالة هشة وضعيفة.
ويصور الشكل 4 زد دي إف الفئران المستخدمة كنموذج السكري التئام الجروح وزرع الأعضاء أوراق مراجعة الحسابات متمكنة جنبا إلى جنب مع الجلد الاصطناعي. ورقة مراجعة الحسابات لينة ومرنة وقابلة للتعديل في الحجم، وقادرة على تمديد إلى كل ركن في موقع الجرح مع زوج من الملقط (الشكل 4A-F). عيب المغطاة بورقة مراجعة الحسابات أيضا مغطاة بالجلد الاصطناعي (15 × 10 مم2) وخياطة مع حوالي 10 غرز باستخدام خياطة نايلون 5-0 (الشكل 4). لحماية الجرح، وأبقى على بيئة رطبة جرح وقد تم استيعاب نتحات، وانصب خلع ملابس غير لاصقة (20 × 15 مم2) عبر الجلد الاصطناعي وطبقت خيوط النايلون 5-0 (الرقم 4I). غالباً ما تتم إزالة الملابس غير لاصقة بالفئران زد دي إف في غضون عدة أيام من التطبيق. ولذلك، يجب رصد الفئران بعد زرع الأعضاء. عادة، يتم استبدال الملابس غير لاصقة كل يومين تحت التخدير العام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الصور العيانية في الشكل 5 هي نتائج تمثيلية لزرع الأعضاء ورقة مراجعة الحسابات. في دراستنا السابقة، كانت منطقة الجرح متوسط في المجموعة زرع ورقة مراجعة الحسابات (الشكل 5B) أصغر بكثير من السيطرة على المجموعة (الشكل 5A). لعناصر التحكم، استخدم فقط الجلد الاصطناعي لتغطية الجرح، دون زرع ورقة مراجعة الحسابات. واتخذت هذه الصور اليومال 14 بعد إنشاء الجرح (n = 6 في كل مجموعة)31.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي إجراء زراعة تجريبية. التخطيطي إجراء زراعة تجريبية يؤديها مع ورقة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (مراجعة الحسابات) الفئران متمكنة والجلد الاصطناعي في نموذج التئام الفئران من مرض السكري من النوع 2 والبدانة. الأنسجة الدهنية وقد اقتطعت جراحيا من العادي لويس الفئران الفئران (A). الحسابات كانت معزولة والمصنفة على طبق 60 سم2 ثقافة ومثقف في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لأيام 7-8. (ب) الحسابات كانت سوبكولتوريد كل 2-3 أيام، وكانت تبذر مرور 3 الحسابات على طبق ثقافة مراعية لدرجة حرارة قطرها 35 ملم. كانت الخلايا المستزرعة في المتوسط كاملة تحتوي على 16.4 ميكروغرام/مل الأسكوربيك L حمض فوسفات المغنسيوم الملح ن هيدرات (أإ) عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لأيام 7-8. كانت تحصد في الحسابات كورقة مراجعة الحسابات متجاورة بتخفيض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية. (ج) مراجعة الحسابات أوراق زرعها على عيب كامل-سمك جلد2 15 × 10 ملم مع العظام مكشوفة على رؤوس الفئران العارضة السكري والبدانة المفرطة (زوكر السكري الدهني (زد دي إف) الفئران) المستخدمة كنموذج التئام الجروح. (د) ورقة مراجعة الحسابات كانت تضع في الجمجمة مباشرة على العيب وغطت) مع 15 × 10 مم2 ورقة من الجلد الاصطناعي بلير، الذي كان خياطة في مكان مع النايلون 10 خيوط (5-0). مرض السكري عام 2015؛ 64: 2723-2734؛ مع الإذن. مرض السكري (ج) حقوق الطبع والنشر (2015) من "الرابطة الأمريكية لمرض السكري". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الضوء على صور المجهر الخزفية. صور المجهر الخفيفة انتشار الرابطة إلى الحافة الأطباق الثقافة، دون فجوات بين الخزفية. (أ) مراجعة الحسابات ورقة مع سماكة موحدة في جميع الاتجاهات 7 أيام بعد البدء تثقيف (A). (ب) ورقة مراجعة الحسابات دون بذر موحدة. لا يمكن الحصول على ورقة مراجعة الحسابات متجاورة في اليوم السابع بعد بدء تثقيف (ب). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: "الوقت الفاصل بين الصور" لمراجعة الحسابات "تماثيل ورقة" في درجة حرارة الغرفة- الوقت الفاصل بين الصور لوضع ورقة مراجعة الحسابات في درجة حرارة الغرفة. الحسابات على طبق ثقافة مراعية لدرجة حرارة قطرها 35 ملم عفويا وتدريجيا منفصلة من سطح الطبق في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) وكانت تحصد كورقة متجاورة. (أ) حوالي 5 دقائق بعد تحريك الطبق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة. (ب) حوالي 10 دقيقة بعد نقل الطبق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة قطرها 35 ملم إلى درجة حرارة الغرفة. (ج) ما يقرب من 20-30 دقيقة بعد نقل الطبق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة. وهذا ورقة مراجعة الحسابات ذات النوعية الجيدة (ج). وضع ورقة مراجعة الحسابات (د-ه) حوالي 20-30 دقيقة بعد نقل الطبق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة. هذه ورقة مراجعة الحسابات متوسط الجودة (د). وعادة ما يتم التعامل مع أوراق مراجعة الحسابات (وز) مع زوج من الملقط. إذا كانت الورقة خلية هشة وضعيفة، يمكن استخدام غشاء سقالة لنقل الورقة خلية من طبق الثقافة إلى موقع الجرح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: السلسلة الزمنية "لخلق الصور الجرح" و "زرع الورقة" مع الجلد الاصطناعي وخلع ملابس لاصقة عدم مراجعة الحسابات
الوقت سلسلة صور من الجرح زرع ورقة إنشاء ومراجعة الحسابات مع الجلد الاصطناعي وخلع ملابس غير لاصقة. كانت حلق الفئران (أ) رؤساء زد دي إف مع حلاقة الكهربائية. بعد حلق شعر الجسم، تحقق من علامات (15 × 10 مم2) تم رسمها باستخدام قلم مسعور زيتية. (ب) بالكامل--سمك الجلد عيب (15 × 10 مم2) أنشئت على رأس الفئران زد دي إف أنيسثيتيزيد عن طريق إزالة الأنسجة الجلدية من البشرة السمحاق. الجلد والأنسجة الجلدية وقد اقتطعت مع مشرط، وتمت إزالة السمحاق مع بيريوستيل راسباتوري. استخدام شاش مبلل مع المالحة العقيمة، تم تطبيق الضغط لوقف نزيف بعد الختان. (ج) مراجعة الحسابات ورقة الزرع. تم وضع ورقة مراجعة الحسابات على العيب مباشرة فوق الجمجمة للفئران باستخدام زوج من الملقط. (د-ز) ضبط ملحق ورقة مراجعة الحسابات لتتناسب مع حجم الجرح. ورقة مراجعة الحسابات هو مرن وقابل للتعديل، ويمكن أن تمتد إلى كل ركن من أركان موقع الجرح باستخدام زوج من الملقط. للجروح أوسع، يمكن أن يكون اثنين أو ثلاثة أوراق مراجعة الحسابات مرنة مكدسة. (ح) خياطة الجلد الاصطناعي الذي يغطي الورقة مراجعة الحسابات. العيب والورقة زرع مراجعة الحسابات كانت مغطاة بالجلد الاصطناعي (15 × 10 مم2)، التي كانت خياطة مع 10 غرز باستخدام خيوط النايلون 5-0. (أنا) سوتورينج غير لاصقة خلع الملابس (20 × 15 مم2) إلى موقع الجرح مغطى بالجلد الاصطناعي. لحماية الجرح، وضع غير لاصقة خلع الملابس (20 × 15 مم2) عبر الجلد الاصطناعي مع خيوط النايلون 5-0. مرض السكري عام 2015؛ 64: 2723-2734؛ مع الإذن. مرض السكري (ج) حقوق الطبع والنشر (2015) من "الرابطة الأمريكية لمرض السكري". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: صور عيانية لكامل-سمك الجلد العيوب. صور عيانية لكامل-سمك الجلد العيوب دون زرع ورقة مراجعة الحسابات (A) وزرع الأعضاء ورقة مراجعة الحسابات (ب) 14 يوما من تاريخ إنشاء الجرح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أن الخطوات الأكثر أهمية لنجاح استزراع ورقة مراجعة الحسابات كما يلي: 1) يجب الحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 37 درجة مئوية خلال استزراع على أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. أثناء إنشاء ورقة مراجعة الحسابات، تم تنفيذ كل إجراء من الإجراءات على صفيحة حرارية 37 درجة مئوية، وقد ارتفعت درجة حرارة كل كاشف إلى 37 درجة مئوية لمنع الخلايا من فصل عفويا من الطبق31. 2) ويجب رصد على الفئران زد دي إف المتلقية منع إزالة الملابس غير لاصقة، هو أمر حاسم لنجاح زرع أوراق مراجعة الحسابات. إذا تمت إزالة الملابس، يجب تطبيق خلع ملابس غير لاصقة جديدة لمنع زرع ASC الأوراق من فصل من موقع الجرح.

باستخدام هذا الإجراء، أوراق مراجعة الحسابات عموما تحققت في غضون 5-7 أيام من البذر مرور 3 الخلايا في أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. يمكن ضبط الوقت الثقافة المطلوبة لإنشاء ورقة مراجعة الحسابات وفقا لكثافة الخلية الأولى والوقت الذي يتم تطبيق المتوسطة ثقافة كاملة تحتوي على أإ. إذا كان يفصل ورقة مراجعة الحسابات من الطبق خلال استزراع خلية، ورقة مراجعة الحسابات ينبغي أن يكون مجدد، وينبغي إعداد أطباق إضافية في حالة انفصال الخلية.

القيود المفروضة على هذا البروتوكول على ما يلي: 1) يجب تطبيق إدارة صارمة درجة الحرارة للحفاظ على درجة حرارة تقريبية 37 درجة مئوية خلال العملية بأكملها عند استخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. 2) بعد الحصول على ورقة مراجعة الحسابات، يجب استخدام الأجهزة الطبية الخاصة للحفاظ على الظروف الرطبة، لأن ورقة مراجعة الحسابات حساسة للظروف الجافة. 3) إدارة بعد العمليات الجراحية، بما في ذلك المراقبة اليومية لحالة الفئران المستفيدة، مطلوب.

كثيرا ما يلاحظ الجروح أكبر مع العظام المكشوفة سريرياً. على سبيل المثال، يمكن أن تتطور الصدمة حادث المرور والحروق والجروح المصابة والجروح التالفة أو نخرية بعد ديبريديمينت إلى الجروح الكبيرة مع العظام المكشوفة. هنا، كان وضع نموذج سريرية من الجروح الشديدة استخدام عيب كبير، كامل-سمك جلد مع العظام المكشوفة في الفئران مع داء السكري من النوع 2 والبدانة. هذا النموذج لديه القدرة على استخدامها كنموذج قياسي لتقييم التئام الجروح في الفئران السكري.

الجلد الاصطناعي جهاز طبية متاحة تجارياً للعيوب كامل-سمك الجلد بعد ديبريديمينت، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية المؤتلف (بفجف) وقد استخدمت على نطاق واسع لالتئام لتشجيع الأوعية وتحبيب. وقد استخدمت هذه العلاجات اثنين لتحقيق نتائج علاجية كبيرة، حتى بالنسبة للجروح المزمنة، مثل السكري الجروح. وأفيد أن تفرز الخزفية أنجيوجينيك عوامل النمو28، مثل عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وعامل النمو تتمثل (هجف)، وبفجف، التي يمكن أن تسهم في نيوفاسكولاريزيشن29،30 والتعجيل بالتئام الجروح. وأكدت الدراسة السابقة أن الخزفية تفرز باستمرار هذه العوامل النمو31. ولذلك، أوراق ASC، جنبا إلى جنب مع الجلد الاصطناعي، لديها القدرة على استخدامها كخيار علاجي جديد للتعجيل بالأوعية الدموية والجرح شفاء31، وهذه الأوراق يمكن تطبيقها لمعالجة العديد من أنواع قرح مستعصية على الحل أو حروق في إعدادات السريرية البشرية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب التالية تكشف عن العلاقات المالية ذات الصلة لهذا المنشور: اوكانو تيرو هو مؤسس ومدير مجلس إدارة شركة البذور الخلية, وتراخيص التكنولوجيا وبراءات الاختراع من جامعة "طوكيو النسائية" الطبية، واوكانو تيرو وياماتو ماسايوكي هم أصحاب المصلحة في الجامعة الطبية خلية البذور وشركة طوكيو "المرأة" يتلقى أموالا للبحث من شركة البذور الخلية تعلن مؤلفين آخرين أن لم يكن لديهم العلاقات المالية ذات الصلة لهذا المنشور.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور يوكيكو كوجا الإدارة من البلاستيك وجراحة، "كلية الطب جامعة جونتيندو"، لتقديم المشورة العملية. ونشكر أيضا السيد هيدكازو موراتا من "مركز السكري من النساء طوكيو الطبية كلية الطب بجامعة" للدعم الفني الممتاز. وأيد "إنشاء مراكز الابتكار" هذه الدراسة "المتقدم البرنامج مجالات البحوث المتعددة التخصصات" المشروع لنظم الابتكار النامية "خلية ورقة الأنسجة الهندسة مركز (كستيك)" من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) في اليابان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366, (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214, (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3, (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20, (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2, (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27, (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7, (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52, (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19, (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18, (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12, (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9, (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9, (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14, (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137, (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21, (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14, (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12, (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267, (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24, (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48, (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18, (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. db141133 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics