创作和移植的糖尿病伤口愈合模型中脂肪源性干细胞 (ASC) 表

Medicine

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Summary

脂肪干细胞 (陶瓷) 容易孤立和收获从正常大鼠脂肪。ASC 床单可以使用单元格表工程创建,可以移植到 Zucker 糖尿病脂肪肝大鼠表现出全层皮肤缺损伴骨外露,然后用双层的人工皮肤覆盖。

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Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

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Abstract

人工皮肤取得了相当大的治疗效果,在临床实践中。然而,可能会延长人工皮肤治疗糖尿病患者与阻碍的血流或大的伤口的伤口。作为一种新技术治疗糖尿病溃疡,出现了基于细胞疗法及细胞板工程已改善细胞移植的疗效。大量的报告建议脂肪源性干细胞 (陶瓷),一种间充质基质细胞 (MSC),表现出由于他们在脂肪组织和其可访问性集合时相比骨髓间充质干细胞从其他组织中的相对丰度的治疗潜力。因此,陶瓷似乎是一个良好的来源的干细胞用于治疗目的。在这项研究,ASC 床单从正常 Lewis 大鼠附睾脂肪已成功创建使用温度反应性培养皿和正常培养基含有抗坏血酸。ASC 床单被移植进 Zucker 糖尿病脂肪酸 (ZDF) 大鼠,大鼠模型的 2 型糖尿病、 肥胖等,表现出减少创面愈合。伤口被创建后颅骨表面、 ASC 床单被移植到伤口,和双层人工皮肤被用来支付床单。收到 ASC 床单的 ZDF 大鼠有更好地愈合比没有移植的 ASC 床单 ZDF 老鼠。这种方法是有限的因为 ASC 床单是敏感的干燥条件,需要一个潮湿的伤口环境的维护。因此,人工皮肤用于封面 ASC,防止干燥。同种异体移植的 ASC 床单结合人工皮肤也可能适用于其他难治性溃疡或烧伤,例如那些观察外周动脉疾病与胶原病和可能给予营养不良或使用类固醇的患者。因此,这种治疗可能改善糖尿病创面愈合的治疗选项的第一步。

Introduction

糖尿病患者的人口世界范围内增加,达到 4 亿 2015年1;估计有 15-25%的糖尿病患者处于危险从下肢糖尿病溃疡2的进展。糖尿病下肢溃疡是棘手的可能需要长期治疗与康复训练后完全恢复。长治疗期间经常导致显著降低患者的生活质量。因此,治疗糖尿病创面必须开发新的治疗方法,减少或防止恶化。评价糖尿病创面愈合,我们优化糖尿病溃疡创面愈合大鼠模型,模仿实际临床情况,并评估是否移植脂肪源性干细胞 (ASC) 床单使用单元格表工程加速伤口愈合。

骨髓间质细胞 (MSCs) 表现出极大的潜力,加速创面愈合其自我更新的能力,他们的免疫调节作用,它们能够分化成多种细胞谱系3。陶瓷是一种类型的 MSC 来源于脂肪组织,和他们表现出骨髓间充质干细胞来自其他组织,包括其潜在的血管生成和旁分泌活动45的几个优势。脂肪组织是较为丰富的人体,并其辅助功能允许收集使用微创手术。因此,陶瓷已用于实验伤口愈合应用67

以前的报道表明,单个单元格 MSC 悬浮液直接注入伤口周围地区可以加快伤口愈合89。然而,尽管报告的加速伤口愈合的糖尿病溃疡模型的单细胞悬液注射后,在伤口部位移植细胞的存活时间尚不清楚。

在此研究中,我们应用使用温度反应性培养皿的细胞板工程。这些菜有温度响应聚合物N-异丙基丙烯共价键到10他们表面上。接枝的聚合物层允许温度控制的细胞粘附或脱离表面的培养皿。这道菜的表面变得疏水在 37 ° C,让细胞粘附和增殖,而细胞自发地从表面分离的时候就亲水在温度低于 32 ° c。体外培养的细胞可以收获作为完整细胞到细胞连接与细胞外基质 (ECMs) 的连续单元格表只是通过降低的温度;因此,蛋白水解酶,破坏 ECM,如胰蛋白酶,并非需要的11。因此,细胞板工程可以保护细胞间连接和改善细胞移植的疗效。

此外,细胞板移植增加细胞存活率时相比,细胞注射12。在此协议中,作为延迟的伤口愈合 2 型糖尿病与肥胖模型选取 Zucker 糖尿病脂肪肝 (ZDF) 鼠。在大约 4 个星期中 ZDF 大鼠自发形成肥胖。他们然后患 2 型糖尿病与肥胖之间 8 和 12 周龄,此时他们表现出高血糖与胰岛素抵抗、 血脂异常和甘油13相关联。延迟的伤口愈合,血流量减少外围及血管中,糖尿病肾病也观察到141516。此外,ZDF 大鼠可能适当模型研究顽固性皮肤溃疡,例如糖尿病溃疡的愈合。

人类和啮齿类动物在创面愈合的机制上的差异是与皮肤的解剖学差异相关联。正常大鼠愈合的伤口基于伤口收缩而创面愈合的人类基于重新上皮和肉芽组织的形成。通常情况下,伤口小夹板固定在啮齿动物模型中使用有助于尽量减少伤口收缩并允许逐步形成的肉芽组织17,虽然非糖尿病大鼠伤口已经几乎完全闭合的收缩。然而,糖尿病创面收缩 ZDF 在大鼠是受损,并且伤口愈合主要发生通过重新上皮和肉芽组织的形成;因此,这一进程是更类似于人类的伤口愈合14

糖尿病伴骨外露创面后清创术临床上经常遇到。先前的研究审查了直径为 12 毫米全层皮肤伤口的裸鼠裸鼠1819背上和背上的正常小鼠20直径为 10 毫米全层皮肤伤口。发展为严重的糖尿病创面的临床模型,较大的 (15 x 10 mm2) 全层皮肤缺损暴露骨并没有骨膜被创造了,作为先前描述21,大鼠 2 型糖尿病和肥胖。

通过同种异体移植的 ASC 床单创造了大鼠 ASC (区域审计事务中心) 床单从正常 Lewis 大鼠的陶瓷。在临床实践中,自体移植是行不通的因为溃疡的糖尿病患者常表现出严重的糖尿病并发症,如不加控制高血糖和高身体质量指数,这些并发症原因伤口愈合障碍,增加了从这些患者获得脂肪组织的难度。此外,从动物与糖尿病展览体干改变属性和受损功能22。因此,议定书 》 在这里提出了一种描述区域审计事务中心床单从正常大鼠同种异体移植和人工皮肤对糖尿病大鼠的应用。

在本协议中使用的双层人工皮肤防止伤口的自发性收缩、 促进合成的一种新的结缔组织矩阵,和类似于真正的真皮23。在此协议中,人工皮肤是放置区域审计事务中心工作表上,用尼龙线,防止伤口收缩或扩大造成的松散大鼠皮肤固定。此外,人造皮肤提供一种三维框架为 ASC 床单、 保持潮湿的环境下的移植的 ASC 床单和伤口,和保护伤口免受感染和外部力量。最后,非胶粘剂敷料被放置在伤口保护它免受外部冲击、 保持潮湿的伤口环境,和吸收渗出物。

一个区域审计事务中心表是薄薄的、 灵活的和可变形和可以坚持移动收件人的网站,例如24跳动的心。单元格表工程已被用于各种组织重建和可以生成疗效2526.表现出临床治疗潜力的 ASC 床单可能加速许多类型的伤口的愈合。此外,ASC 床单,结合人工皮肤,使用同种异体移植可能适用于治疗难治性溃疡或烧伤,例如那些观察外周动脉疾病或胶原病,或者他们可能注射到患者营养不良或使用类固醇。这种方法提高移栽体干的效率。伤口愈合 ZDF 大鼠模型产生严重的伤口情况,类似于人类的伤口愈合过程,模仿在小型实验动物临床条件。

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Representative Results

本议定书试图建立一种新的基于单元格的难治性糖尿病伤口疗法。简要 (如图 1所示),同种异体区域审计事务中心床单从正常大鼠使用单元格表工程被创造了,然后移植对糖尿病大鼠使用双层人工皮肤全层皮肤缺损。光镜图像的区域审计事务中心表 (图 2A) 的一个好例子和一个坏的榜样的区域审计事务中心表 (图 2B) 如图 2所示。当陶瓷镀上一道新的文化菜时,这道菜应该是慢慢地来回冲击和左、 右在一个孵化器,以达到均匀区域审计事务中心播种及厚度均匀区域审计事务中心资产负债表 (图 2A)。如果区域审计事务中心不能均匀地连接,而且表面的培养皿培养,不能作为一个连续的 ASC 表 (图 2B) 收集工作表。图 3显示了收获后作为室温连续单元格表因为体干被均匀附着盘表面的 ASC 床单。通常情况下,区域审计事务中心床单可以处理用钳子。如果有必要,热转印花膜可用于将一个单元格表从培养皿转移到伤口网站,例如,如果单元格表是脆性和脆弱。
图 4描绘了 ZDF 大鼠用作糖尿病创面愈合模型和同种异体区域审计事务中心表结合人工皮肤移植。区域审计事务中心表是软和灵活、 可调节大小,和能够用镊子 (图 4A F) 扩展到每一个角落,伤口部位。区域审计事务中心张纸盖缺损和缝合 10 针大约使用 5-0 尼龙线缝合 (图 4) 也覆盖人工皮肤 (15 × 10 毫米2)。为了保护伤口,保持潮湿的伤口环境和分泌物被吸收,非胶粘剂酱 (20 x 15 毫米2) 被放置在人工皮肤,应用 5-0 尼龙缝线 (图 4I)。在应用程序的几天内,非胶粘剂敷料也经常被切除 ZDF 老鼠。因此,必须移植术后监测大鼠。通常情况下,非胶粘剂敷料是每 2 天更换在全身麻醉下。请点击这里查看此图的大版本。

图 5中的宏观照片是代表区域审计事务中心表移植的结果。在我们以前的研究中,在区域审计事务中心表移植组 (图 5B) 平均创面面积是明显小于对照组 (图 5A)。对于控件,只有人工皮肤用来盖住伤口,没有移植的区域审计事务中心表。这些照片是伤口创建后的14 天 (n = 在每个组 6)31

Figure 1
图 1: 实验性移植过程示意图。实验性移植过程示意图进行同种异体大鼠脂肪源性干细胞 (区域审计事务中心) 表和人工皮肤创面愈合模型大鼠 2 型糖尿病和肥胖症。(A) 大鼠脂肪组织从正常 Lewis 大鼠手术切除。区域审计事务中心分离和播种到 60 厘米2培养皿、 5%CO2保温箱中,37 ℃ 培养 7-8 天。(B) 区域审计事务中心每隔 2-3 天,传代培养和传 3 区域审计事务中心被播种到 35 毫米直径温度反应性培养皿。细胞在完全培养基 16.4 微克/毫升 L-抗坏血酸磷酸镁盐 n-水合物 (AA) 在 37 ° C,5%CO2孵化器为 7-8 天。区域审计事务中心收获了作为一个连续区域审计事务中心表通过降低温度至 20 ° c。(C) 区域审计事务中心床单移植到 15 x 10 mm2全层皮肤缺损伴骨外露在大鼠表现出糖尿病和肥胖 (Zucker 糖尿病脂肪肝 (ZDF) 大鼠) 用作伤口愈合模型的头上。(D) 区域审计事务中心表盖,放在颅骨上直接对这一缺陷) 与 15 x 10 mm 双层人工皮肤,并缝合到2张地方 10 尼龙缝线 (5-0)。糖尿病 2015年; 64: 2723年-2734;具有权限。糖尿病 (c) 版权所有美国糖尿病协会 (2015 年)。请点击这里查看此图的大版本。

Figure 2
图 2:光显微镜图像的体干。光镜图像的 ASC 扩散到边缘的培养皿,无间隙之间的陶瓷。(A) 区域审计事务中心板厚度均匀四面八方 7 天后开始的培养 (A)。(B) 区域审计事务中心板材无统一播种。一个连续区域审计事务中心表不能达到培养 (B) 开始后第 7 天。规模酒吧 =请点击这里查看此图的大版本。 100 µ m。

Figure 3
图 3:延时图像的区域审计事务中心表雕像在室温。延时图像的区域审计事务中心表在室温的状态。区域审计事务中心在 35 毫米直径温度反应性培养皿上的自发地逐渐脱离盘表面在室温 (约 20 ° C),收获了作为一个连续的表。(A) 约 5 分钟后将温度反应性培养皿移到室温。(B) 大约 10 分钟后将 35 毫米直径的温度反应性培养皿移到室温。(C) 大约 20-30 分钟后移动到室温温度反应性培养皿。这是一个质量好的区域审计事务中心表 (C)。(D E) 区域审计事务中心表状态大约 20-30 分钟后移动到室温温度反应性培养皿。此区域审计事务中心表是的平均质量 (D)。(F G) 区域审计事务中心床单通常都用镊子来处理。如果单元格的工作表脆性和脆弱,膜可以用作脚手架培养皿的细胞板转移到伤口部位。请点击这里查看此图的大版本。

Figure 4
图 4: 伤口创作时间序列图像和区域审计事务中心表移植人工皮肤与非胶粘剂敷料
时间序列图像的伤口创造和区域审计事务中心表移植人工皮肤与非胶粘剂敷料。(A) ZDF 团长大鼠用电动剃须刀剃了头发。在剃毛体毛后, 检查标记 (15 x 10 mm2) 使用油性的疏水笔绘制。(B) A 全层皮肤缺损 (15 x 10 mm2) 是由去除表皮皮肤组织的骨膜麻醉 ZDF 鼠头上创建的。皮肤和皮肤组织切除与手术刀和骨膜去除了以骨膜 raspatory。使用纱布蘸无菌生理盐水,施加压力来止血后切除。(C) 区域审计事务中心表移植。区域审计事务中心表放在上方的使用镊子大鼠颅骨缺损。(D G)调整区域审计事务中心表扩展以匹配伤口的大小。区域审计事务中心表是灵活的、 可调节,并可以扩展到每个角落使用镊子,伤口部位。为更广泛的伤口,两个或三个灵活的区域审计事务中心床单可堆叠。(H) 缝合覆盖区域审计事务中心表的人工皮肤。缺陷和移植区域审计事务中心表满了人工皮肤 (15 x 10 mm2),10 针使用 5-0 尼龙缝线缝合。() 的非-胶粘敷料 (20 x 15 毫米2) 到伤口部位缝合覆盖着人造皮肤。为了保护伤口,非胶粘剂酱 (20 x 15 毫米2) 被置于人工皮肤的 5-0 尼龙缝线。糖尿病 2015年; 64: 2723年-2734;具有权限。糖尿病 (c) 版权所有美国糖尿病协会 (2015 年)。请点击这里查看此图的大版本。

Figure 5
图 5: 宏观图像的全层皮肤缺损。宏观照片的全层皮肤缺损没有移植区域审计事务中心表 (A) 与 (B) 区域审计事务中心表移植 14 天后伤口的创作。请点击这里查看此图的大版本。

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Discussion

成功地培养区域审计事务中心表最关键的步骤如下: 1) 温度必须在温度反应性培养皿培养过程维持在大约 37 ° C。在区域审计事务中心表的创建,过程中每道工序进行 37 ° C 的热板,和每个试剂被加热到 37 ° C,以防止细胞自发地分离从菜31。2) 收件人 ZDF 大鼠必须进行监测,以防止被删除的非胶粘剂的酱汁,是区域审计事务中心床单移植成功的关键。如果删除了更衣室,必须应用新的非胶粘剂敷料,防止移植的 ASC 床单从伤口部位分离。

使用此过程,区域审计事务中心床单一般得到了播种通道 5-7 天内温度反应性培养皿 3 细胞。可根据初始细胞密度和完整的培养基含有 AA 应用时间调整生成区域审计事务中心工作表所需的文化时间。如果区域审计事务中心板分离从盘子里在细胞培养过程中,应重塑区域审计事务中心表,并应该在细胞脱离准备额外的菜。

本议定书的限制如下: 1) 在整个过程中保持一个近似温度 37 ° C,使用温度反应性培养皿时,必须进行严格的温度管理。2) 后获得区域审计事务中心表,必须使用特殊医疗设备保持潮湿的条件,因为区域审计事务中心表是敏感的干燥条件。3) 术后管理,包括日常条件的收件人,观察是大鼠的必需的。

大伴骨外露的伤口通常临床观察。例如,交通事故创伤、 烧伤、 感染的伤口,损坏或坏死创面清创术后的可以发展成大骨外露的伤口。在这里,临床模型伤重不治,利用大、 全层皮肤缺损与 2 型糖尿病与肥胖大鼠骨外露。这种模式有可能用作评价糖尿病大鼠创面愈合的标准模型。

人工皮肤病灶清除后,是商业上可用的医疗设备,全层皮肤缺损和重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 已被广泛用于伤口愈合,促进血管生成和造粒。这两种治疗方法已用于达到相当大的治疗效果,甚至类糖尿病伤口的慢性伤口。据报体干分泌 angiogeneic 生长因子28,如血管内皮生长因子 (VEGF)、 肝细胞生长因子 (HGF) 和 bFGF,有助于新生血管2930 ,并加速伤口的愈合。我们以往的研究证实体干持续分泌这些生长因子31。因此,ASC 床单,结合人工皮肤,有可能被用于作为一种新的治疗选择加速血管化及创面愈合31,和这些表可能适用于在未来的许多类型的顽固性皮肤溃疡或在人类临床设置烧伤治疗。

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Disclosures

以下作者披露与此发布相关的财务关系: 辉冈野是创始人和董事的细胞种子有限公司许可证技术和专利从东京女子医科大学,并照雄冈野和雅之大和利益相关者在细胞种子公司东京女子医科大学接收从细胞种子公司研究基金其他作者宣称,他们并没有到此出版物有关的财务关系。

Acknowledgments

作者感谢塑料部和整形外科手术,东京大学医学院博士由纪子古贺提供实用的建议。我们还感谢先生秀和村田的糖尿病中心的东京妇女医疗大学医学院为优异的技术支持。这项研究被支持由创新中心创造先进的跨学科研究领域项目的发展中国家创新系统"单元格表组织工程中心 (CSTEC)"项目从部的教育、 文化、 体育、 科学和技术 (文部科学省) 的日本。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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