Création et la Transplantation d’une feuille adipeux dérivées de cellules souches (ASC) dans un modèle de cicatrisation diabétique

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Summary

Cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs) sont facilement isolées et récoltées dans la graisse des rats normaux. Feuilles de NCP peuvent être créés à l’aide de la cellule-fiche technique et peuvent être transplantés dans Zucker rats gras diabétiques présentant pleine épaisseur défauts avec OS exposé de l’épiderme et ensuite recouvert d’une double couche de peau artificielle.

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Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

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Abstract

La peau artificielle a obtenu des résultats thérapeutiques considérables dans la pratique clinique. Toutefois, les traitements de peau artificielle pour plaies chez les diabétiques avec débit sanguin entravé ou grandes plaies pourraient être prolongées. Thérapies cellulaires sont apparus comme une nouvelle technique pour le traitement des ulcères diabétiques, et ingénierie cellulaire-feuille a amélioré l’efficacité de la transplantation de cellules. Plusieurs rapports ont suggéré que les cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs), un type de cellules stromales mésenchymateuses (CSM), présentent un potentiel thérapeutique en raison de leur abondance relative dans les tissus adipeux et leur accessibilité pour la collection par rapport à MSCs provenant d’autres tissus. ASCs semblent donc être une bonne source de cellules souches pour un usage thérapeutique. Dans cette étude, les feuilles de l’ASC de la graisse adipeuse dans l’épididyme de rats normaux de Lewis ont été avec succès créés à l’aide de température Pétri et normal milieu de culture contenant de l’acide ascorbique. Les feuilles de l’ASC ont été transplantés à des rats diabétiques gras (ZDF), Zucker, un modèle de rat de diabète de type 2 et d’obésité, qui présentent une diminution la cicatrisation. Une blessure apparue sur la surface crânienne postérieure, feuilles de l’ASC ont été transplantées dans la plaie et une peau artificielle bicouche a servi à couvrir les feuilles. Rats ZDF qui a reçu les feuilles de l’ASC avaient mieux la guérison des plaies que les rats ZDF sans la transplantation des feuilles de l’ASC. Cette approche a été limitée car les feuilles de l’ASC sont sensibles aux conditions sèches, nécessitant le maintien d’un environnement humide. Par conséquent, la peau artificielle a servi à couvrir la feuille de l’ASC pour éviter le dessèchement. La greffe allogénique de feuilles de l’ASC en combinaison avec la peau artificielle pourrait également s’applique aux autres ulcères insolubles ou des brûlures, tels que ceux observés avec les maladies artérielles périphériques et maladie du collagène et peut être administrée aux patients qui souffrent de malnutrition ou utilisent des stéroïdes. Ainsi, ce traitement pourrait être la première étape visant à améliorer les options thérapeutiques pour diabétique wound healing.

Introduction

La population de patients diabétiques est en augmentation partout dans le monde et a atteint 400 millions en 2015,1; environ 15 à 25 % des patients atteints de diabète sont menacées par la progression d’un ulcère diabétique de bas-extrémité2. Les ulcères diabétiques de bas-extrémité sont insolubles et peuvent nécessiter une période thérapeutique prolongée avec formation de réadaptation après une récupération complète. Une période longue thérapie souvent se traduit par une réduction significative de la qualité de vie des patients. Ainsi, les nouvelles thérapies qui diminuent ou empêchent aggravation doivent être développés pour le traitement des plaies diabétiques. Pour évaluer la guérison des plaies diabétiques, nous avons optimisé un ulcère diabétique cicatrisation modèle chez les rats, qui imite les conditions cliniques pratiques, et évalué si repiquage feuilles adipeux dérivées de cellules souches (ASC) à l’aide de cellules feuilles génie accéléré la guérison des plaies.

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) présentent un excellent potentiel pour accélérer la cicatrisation des plaies en raison de leur capacité d’autorenouvellement, leurs effets immunomodulateurs et leur capacité à se différencier en divers de lignées cellulaires3. CRA est un type de MSC provenant de tissus adipeux, et ils présentent plusieurs avantages sur MSCs dérivés d’autres tissus, y compris leur potentiel angiogénique et paracrine activité4,5. Le tissu adipeux est relativement abondant dans le corps humain, et son accessibilité permet à la collection à l’aide de procédures minimalement invasives. Par conséquent, CRA ont été utilisées expérimentalement pour la cicatrisation des applications,6,,7.

Les rapports précédents ont montré que l’injection directe de suspensions MSC unicellulaires dans les zones autour des blessures peut accélérer la cicatrisation des8,9. Cependant, malgré les rapports de l’accélération de la cicatrisation dans les modèles d’ulcère diabétique après l’injection des suspensions de cellules individuelles, le temps de survie des cellules transplantées à la plaie n’est pas clair.

Dans cette étude, nous avons appliqué des cellules feuilles ingénierie utilisant Pétri de température. Ces plats ont la température polymère de N- isopropylacrylamide covalente sur leur surface10. La couche de polymère greffé permet à adhérence cellule isotherme à ou détachement de la surface de la boîte de Pétri. La surface du plat devient hydrophobe à 37 ° C, permettant aux cellules d’adhérer et se multiplient, tandis que les cellules spontanément se détachent de la surface quand il devient hydrophile à une température inférieure à 32 ° C. Les cellules cultivées peuvent être récoltées comme une feuille de cellules contiguës avec des jonctions cellule-cellule intactes et matrices extracellulaires (ECMs) simplement en réduisant la température ; ainsi, des enzymes protéolytiques qui endommagent l’ECM, tels que la trypsine, ne sont pas requis11. Par conséquent, ingénierie cellulaire-feuille peut préserver les connexions de cellule-cellule et améliorer l’efficacité de la transplantation de cellules.

En outre, transplantation de cellules feuilles augmente les taux de survie des cellules par rapport aux cellules injection12. Dans ce protocole, Zucker les rats diabétiques gras (ZDF) ont été sélectionnés comme un modèle de type 2 diabète et l’obésité avec retard de cicatrisation. Rats ZDF développent spontanément l’obésité à environ 4 semaines. Puis, ils développent le diabète de type 2 avec l’obésité entre 8 et 12 semaines d’âge, à quel point ils présentent l’hyperglycémie associé à l’insulino résistance, la dyslipidémie et hypertriglycéridémie13. Retardé la cicatrisation, diminution du débit sanguin dans les vaisseaux sanguins périphériques et la néphropathie diabétique sont également observées14,15,16. En outre, les rats ZDF pourraient être un modèle approprié pour l’étude de la guérison des ulcères cutanés insolubles, tels que les ulcères diabétiques.

Les différences entre les humains et les rongeurs dans les mécanismes de cicatrisation sont associés à des différences anatomiques de la peau. La cicatrisation chez les rats normaux est basée sur la contraction de la plaie, alors que la cicatrisation des plaies chez l’être humain repose sur la formation réépithélialisation et tissu de granulation. En général, plaie éclisser utilisés dans les modèles de rongeurs contribue à minimiser la contraction de la plaie et permet la formation progressive du tissu de granulation17, bien que les blessures chez les rats non diabétiques sont presque complètement fermés par contraction. Cependant, les diabétiques plaie contraction chez ZDF rats est altérée, et la cicatrisation surtout s’effectue via la réépithélialisation et formation de tissu de granulation ; ainsi, ce processus est plus semblable à l’humaine14de cicatrisation.

Plaies diabétiques avec un OS exposé après débridement sont souvent rencontrés sur le plan clinique. Des études antérieures ont examiné plaies peau pleine épaisseur 12 mm de diamètre sur le dos des athymiques souris Nudes18,19 et blessures de peau pleine épaisseur 10 mm de diamètre sur le dos des souris normales20. Pour développer un modèle clinique de graves plaies diabétiques, plus gros défauts de peau pleine épaisseur (15 x 10 mm2) avec exposés des os et sans le périoste ont été créés, comme décrit précédemment21chez des rats souffrant de diabète de type 2 et de l’obésité.

Feuilles de NCP (SRAC) rat de l’ASCs des rats normaux de Lewis ont été créés par le biais de la greffe allogénique de feuilles de l’ASC. Dans la pratique clinique, autogreffe est irréalisable, parce que les patients diabétiques avec ulcères présentent souvent des complications du diabète sévères, tels que la glycémie élevée incontrôlée et indices de masse corporelle élevé et ces troubles de cicatrisation cause des complications qui augmentent la difficulté d’obtenir des tissus adipeux chez ces patients. En outre, CRA d’animaux avec pièce de diabète modifié les propriétés et troubles de fonction22. Par conséquent, le protocole présenté ici décrit la transplantation allogénique de SRAC feuilles des rats normaux et l’application de la peau artificielle aux rats diabétiques.

La peau artificielle utilisée dans le présent protocole en bicouche empêche la contraction spontanée des blessures, favorise la synthèse d’une nouvelle matrice de tissu conjonctif et ressemble à la vrai derme23. Dans ce protocole, la peau artificielle est placée sur une feuille de la SRAC et fixe avec des fils de nylon pour empêcher la contraction de la plaie ou l’élargissement résultant de peau lâche rat. En outre, la peau artificielle fournit un cadre tridimensionnel pour les feuilles de l’ASC, maintient un milieu humide pour les transplantés feuilles ASC et plaies et protège les plaies de l’infection et de forces extérieures. Enfin, un pansement non adhésif est placé sur la plaie pour le protéger des chocs externes, maintenir un environnement humide et absorber l’exsudat.

Une feuille de la SRAC est mince, souple et déformable et déplacement de sites destinataires, comme un battement cardiaque24peut être respectée. Ingénierie cellulaire-feuille a été utilisée pour la reconstruction de divers tissus et peut générer des effets curatifs25,26. Feuilles de NCP qui présentent un potentiel thérapeutique clinique peuvent accélérer la guérison de nombreux types de plaies. Par ailleurs, la transplantation allogénique de feuilles de l’ASC, combinée à l’utilisation de la peau artificielle, pourrait être applicable au traitement des ulcères insolubles ou des brûlures, tels que ceux observés dans la maladie artérielle périphérique ou maladie du collagène, ou ils peuvent être administrés aux patients qui souffrent de malnutrition ou utilisent des stéroïdes. Cette approche augmente l’efficacité de la transplantation ASCs. Le modèle de rat ZDF cicatrisation produit un état de grave blessure qui ressemble la processus de cicatrisation humaine et imite les conditions cliniques chez un animal expérimental de petite taille.

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Representative Results

Ce protocole a tenté d’établir une nouvelle thérapie cellulaire pour plaies diabétiques insolubles. Brièvement (comme illustré à la Figure 1), SRAC allogéniques feuilles furent créés à partir des rats normaux, à l’aide de cellules feuilles ingénierie et ont été transplantées ensuite à l’aide d’une double couche de peau artificielle sur un défaut de pleine épaisseur de peau sur un rat diabétique. Images de microscopie photonique d’un bon exemple d’une feuille de la SRAC (Figure 2 a) et un mauvais exemple d’une feuille de la SRAC (Figure 2 b) sont indiquées à la Figure 2. Lorsque ASCs sont plaqués sur une nouvelle boîte de Pétri, le plat doit être lentement basculé en arrière et de gauche et de droite dans un incubateur pour atteindre ensemencement SRAC uniforme et une feuille d’épaisseur uniformément SRAC (Figure 2 a). Si l’audit ne peut pas être uniformément fixée et cultivés sur la surface de la boîte de Petri, la feuille ne peuvent être recueillie sous forme de tableau ASC contigu (Figure 2 b). La figure 3 montre les feuilles de l’ASC qui ont été récoltés en une couche de cellules contiguës à la température ambiante parce que l’ASC étaient attachés uniformément à la surface du plat. Habituellement, SRAC feuilles peuvent être traitées avec une paire de pinces. Si nécessaire, qu'une membrane de transfert peut être utilisée pour transférer une feuille de la cellule de la boîte de Pétri à la plaie, par exemple, si la feuille de la cellule est friable et fragile.
Figure 4 illustre les rats ZDF utilisés comme un modèle de cicatrisation diabétique et la transplantation de feuilles SRAC allogéniques combinée avec la peau artificielle. Une feuille de la SRAC est doux et souple, réglable dans la taille et pouvant être déployée aux quatre coins de la plaie avec une paire de pinces (Figure 4 a-F). Le SRAC recouverts de feuille défaut était également recouverte d’une peau artificielle (15 x 10 mm2) et suturé avec environ 10 points de suture à l’aide d’une suture de nylon de 5-0 (Figure 4). Afin de protéger la plaie, a été maintenu un environnement humide et les exsudats sont absorbés, un pansement non adhésif (20 x 15 mm2) a été placé sur la peau artificielle et sutures en nylon de 5-0 ont été appliqués (Figure 4I). Le pansement non adhésif est souvent enlevé par les rats ZDF en quelques jours d’application. Par conséquent, les rats doivent être contrôlés après la transplantation. Habituellement, le pansement non adhésif est remplacé tous les 2 jours sous anesthésie générale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les photographies macroscopiques dans la Figure 5 sont les résultats représentatifs de la transplantation d’une feuille de la SRAC. Dans notre étude précédente, la région de la plaie moyen dans le groupe de transplantation SRAC feuille (Figure 5 b) a été significativement plus faible que dans le groupe témoin (Figure 5 a). Pour les contrôles, seulement la peau artificielle a été utilisée pour couvrir la plaie, sans la transplantation d’une feuille de la SRAC. Ces images ont été prises la 14e jour après la création de la plaie (n = 6 dans chaque groupe)31.

Figure 1
Figure 1 : schéma de la procédure de Transplantation expérimentale. Schéma de la procédure de transplantation expérimentale réalisée avec une feuille d’allogéniques rat adipeux dérivées de cellules souches (SRAC) et la peau artificielle dans un modèle de cicatrisation de rat de diabète de type 2 et d’obésité. Rat (A) le tissu adipeux a été excisé chirurgicalement des rats normaux de Lewis. Audit ont été isolés et ensemencée sur une boîte de Petri de 60 cm2 et cultivées à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pour 7 à 8 jours. (B) audit ont été repiqués tous les 2-3 jours, et audit passage 3 ont été ensemencées sur une boîte de Petri température de diamètre 35 mm. Les cellules ont été cultivées dans un milieu complet contenant 16,4 µg/mL L-ascorbique acide phosphate magnésium sel n-hydrate (AA) à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pour 7 à 8 jours. L’audit ont été récoltés comme une feuille de la SRAC contigus en réduisant la température à 20 ° C. (C) SRAC feuilles transplantés sur un défaut de peau pleine épaisseur 15 x 10 mm2 avec un OS exposé sur les têtes de rats présentant le diabète et l’obésité (diabète gras (ZDF) des rats Zucker), utilisé comme un modèle de cicatrisation. (D) une feuille de la SRAC a été placé sur le crâne, directement sur le vice et couverts) avec un 15 x 10 mm2 feuille de peau artificielle bicouche, qui a été suturée en place avec du nylon 10 sutures (5-0). Diabète 2015 ; 64 : 2723-2734 ; avec la permission. Diabète (c) copyright (2015) par l’American Diabetes Association. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Lumière Microscope Images des cra. Images au microscope photonique de prolifération de NCP au bord des récipients de culture, sans lacunes entre l’ASCs. (A) un SRAC feuille d’une épaisseur uniforme dans toutes les directions 7 jours après le début de la culture (A). (B) une feuille de la SRAC sans ensemencement uniforme. Une feuille de la SRAC contiguë ne peut être obtenue sur le 7e jour après le début de la culture (B). Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images décomposée du SRAC feuille Statues à température ambiante. Time-lapse images du statut d’une feuille de la SRAC à température ambiante. Audit sur une boîte de Petri température de diamètre 35 mm spontanément et progressivement détaché de la surface de plat à température ambiante (environ 20 ° C) et ont été récoltés comme une feuille contigue. (A) environ 5 min après le déplacement de la boîte de Petri température à la température ambiante. (B) environ 10 min après le déplacement de la boîte de Petri température de diamètre de 35 mm à la température ambiante. (C) environ 20-30 min après le déplacement de la boîte de Petri température à la température ambiante. Il s’agit d’une feuille de bonne qualité SRAC (C). État de feuille de SRAC (D-E) environ 20-30 min après le déplacement de la boîte de Petri température à la température ambiante. La présente fiche de SRAC est de qualité moyenne (D). Feuilles SRAC (F-G) sont généralement traitées avec une paire de pinces. Si la feuille de la cellule est friable et fragile, une membrane peut servir comme un échafaudage pour transférer la feuille de la cellule de la boîte de Pétri à la plaie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images chronologiques de la plaie création et SRAC Transplantation de feuille avec la peau artificielle et un pansement Non adhésif
Images en série temps de création et la SRAC transplantation de feuille plaie avec peau artificielle et un pansement non adhésif. (A), les chefs de ZDF rats ont rasé avec un rasoir électrique. Après le rasage des poils, coches (15 x 10 mm2) ont été dessinées à l’aide d’une plume grasse hydrophobe. (B) une pleine épaisseur cutanée (15 x 10 mm2) a été créée sur la tête d’un rat anesthésié de la ZDF en enlevant les tissus cutanés de l’épiderme pour le périoste. La peau et les tissus cutanés ont été excisées avec un scalpel, et le périoste a été supprimé avec un périoste raspatory. À l’aide de gaze imbibé de sérum physiologique stérile, la pression a été appliquée pour arrêter le saignement après l’excision. (C) SRAC transplantation de feuille. Une feuille de la SRAC a été placée sur le défaut immédiatement au-dessus du crâne du rat à l’aide d’une paire de pinces. (D-G) Réglage extension feuille de SRAC faire correspondre la taille de la plaie. La feuille de la SRAC est flexible et ajustable et peut être étendue aux quatre coins de la plaie à l’aide d’une paire de pinces. Pour les plaies plus larges, deux ou trois feuilles SRAC flexibles peuvent être empilés. (H) suture la peau artificielle couvrant la feuille de la SRAC. Le vice et la feuille de la SRAC transplantées étaient recouverts de peau artificielle (15 x 10 mm2), qui a été suturée avec 10 points de suture à l’aide de sutures en nylon de 5-0. (j’ai) suture de la non-adhésifs dressage (20 x 15 mm2) sur le site de la plaie recouverte d’une peau artificielle. Afin de protéger la plaie, pansement non adhésif (20 x 15 mm2) a été placé sur la peau artificielle avec sutures en nylon de 5-0. Diabète 2015 ; 64 : 2723-2734 ; avec la permission. Diabète (c) copyright (2015) par l’American Diabetes Association. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : défauts de l’épiderme des Images macroscopiques de pleine épaisseur. Les défauts de photographies macroscopiques de pleine épaisseur de peau sans la transplantation d’une feuille de la SRAC (A) et avec la transplantation d’une feuille de la SRAC (B) 14 jours après la création de la plaie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les étapes plus critiques pour cultiver avec succès une feuille SRAC sont comme suit : 1) la température doit être maintenue à environ 37 ° C au cours de la mise en culture sur les plats de la température de la culture. Lors de la création d’une feuille de la SRAC, chaque procédure a été effectuée sur un thermo-plaque de 37 ° C, et chaque réactif a été chauffé à 37 ° C pour empêcher les cellules de détacher spontanément le plat31. 2) les rats ZDF bénéficiaires doivent être surveillés pour empêcher l’enlèvement du pansement non adhésif, ce qui est essentiel pour la transplantation réussie du SRAC feuilles. Si le pansement est enlevé, un nouveau pansement non adhésif doit être appliqué pour empêcher les feuilles de NCP transplantés de détacher de la plaie.

En utilisant cette procédure, SRAC feuilles étaient généralement obtenus dans les 5-7 jours d’ensemencement de passage 3 cellules sur température Pétri. Le temps de la culture nécessaire pour générer une feuille SRAC peut être ajusté selon la densité de la cellule initiale et l’heure à laquelle le milieu de culture complet contenant AA est appliqué. Si une feuille SRAC se détache de la vaisselle au cours de la mise en culture de cellules, la feuille de la SRAC doit être refaite et plats supplémentaires devraient être prêts en cas de détachement de la cellule.

Les limites du présent protocole sont les suivants : 1) gestion de température strictes doit être appliquée afin de maintenir une température environ de 37 ° C durant tout le processus lorsque vous utilisez la température Pétri. 2) après l’obtention d’une feuille de la SRAC, dispositifs médicaux spéciaux doivent servir à maintenir des conditions humides, car la feuille SRAC est sensible aux conditions sèches. 3) gestion post-opératoire, y compris l’observation quotidienne de l’état du destinataire rat, est nécessaire.

Grandes plaies avec OS exposé sont souvent observées cliniquement. Par exemple, un traumatisme accident circulation, brûlures, plaies infectées et endommagés ou nécrotiques plaies après débridement peuvent évoluer en grandes plaies avec OS exposé. Ici, un modèle clinique de blessures graves a été développé en utilisant une large, pleine épaisseur cutanée avec un OS exposé chez des rats souffrant de diabète de type 2 et obésité. Ce modèle a le potentiel pour être utilisé comme un modèle standard pour évaluer la cicatrisation chez les rats diabétiques.

La peau artificielle est un dispositif médical disponible dans le commerce pour les défauts de l’épiderme de pleine épaisseur après débridement et facteur de croissance recombinantes basique des fibroblastes (bFGF) a été largement utilisé pour la cicatrisation des plaies, à promouvoir l’angiogenèse et la granulation. Ces deux traitements ont été utilisés pour obtenir des résultats thérapeutiques considérables, même pour les plaies chroniques, comme les plaies diabétiques. Il a été signalé que ASCs sécrètent des facteurs de croissance angiogeneic28, comme facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et bFGF, qui pourrait contribuer à une néovascularisation29,30 et accélérer la cicatrisation des plaies. Notre étude précédente a confirmé que l’ASCs sécrètent continuellement ces facteurs de croissance31. Par conséquent, feuilles de NCP, combinés avec la peau artificielle, ont le potentiel d’être utilisé comme une nouvelle option thérapeutique pour accélérer la vascularisation et la cicatrisation31, et ces feuilles pourraient s’appliquer au traitement de nombreux types d’ulcères réfractaires ou des brûlures en milieu clinique humaine dans le futur.

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Disclosures

Les auteurs suivants divulguer des relations financières pertinentes à cette publication : Teruo Okano est fondateur et directeur du Conseil d’administration de cellule Seed Inc., dont les licences de technologie et brevets de l’Université médicale des femmes de Tokyo, et Teruo Okano et Masayuki Yamato sont parties prenantes dans l’Université de médecine de cellule Seed Inc. Tokyo féminines reçoit des fonds de recherche de cellule Seed Inc. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de relations financières pertinentes à cette publication.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Dr Yukiko Koga du Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Juntendo University School of Medicine, de donner des conseils pratiques. Nous remercions également M. Hidekazu Murata du centre de Tokyo les femmes diabétiques de Medical University School of Medicine excellent soutien technique. Cette étude a été financée par la création de centres d’Innovation pour l’avancée de programme de zones de recherche interdisciplinaire du projet pour les systèmes d’Innovation en développement « cellule feuille Tissue Engineering Center (CCCES) » du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT) du Japon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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