Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Adipeus-afgeleide cellen van de stam (ASC's) gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd en geoogst van het vet van de normale ratten. ASC bladen kunnen worden gemaakt met behulp van cellaag engineering en in Zucker vette diabetesratten exposeren full-dikte huid gebreken met blootgestelde bot en vervolgens bedekt met een dubbelgelaagde van kunstmatige huid kunnen worden getransplanteerd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kunstmatige huid heeft bereikt aanzienlijke therapeutische resultaten in de klinische praktijk. Kunstmatige huid behandelingen voor wonden bij diabetische patiënten met belemmerde doorbloeding of grote wonden kunnen echter worden verlengd. Cel-gebaseerde therapieën zijn verschenen als een nieuwe techniek voor de behandeling van diabetische ulcera, en cellaag techniek is de werkzaamheid van cel transplantatie verbeterd. Een aantal verslagen hebben gesuggereerd dat adipeus afkomstige stamcellen (ASC's), een soort mesenchymale stromale cellen (MSC), vertonen therapeutisch potentieel als gevolg van hun relatieve overvloed in vetweefsel en hun toegankelijkheid voor collectie in vergelijking met MSCs van andere weefsels. Daarom, ASC's lijken te zijn een goede bron van stamcellen voor therapeutische doeleinden. In deze studie, werden ASC bladen van de epididymaire obesitas vet van normale Lewis ratten gemaakt met behulp van temperatuur-responsieve cultuur gerechten en normale kweekmedium dat ascorbinezuur. De bladen van ASC in Zucker diabetische vetzuren (ZDF) ratten werden getransplanteerd, een rat model van type 2 diabetes en obesitas, die vertonen verminderde wondheling. Een wond is gemaakt op de achterste craniale oppervlak, ASC bladen waren getransplanteerde in de wond en een dubbelgelaagde kunstmatige huid werd gebruikt ter dekking van de bladen. ZDF ratten die ASC bladen ontvangen had beter wondgenezing dan ZDF ratten zonder de transplantatie van ASC bladen. Deze aanpak was beperkt omdat ASC bladen gevoelig voor droge omstandigheden zijn, die het onderhoud van een vochtige wond-omgeving. Daarom, kunstmatige huid werd gebruikt ter dekking van het ASC blad om te voorkomen dat het drogen. Allogene transplantatie van ASC bladen in combinatie met kunstmatige huid kan ook gelden voor andere hardnekkige zweren of brandwonden, zoals die waargenomen met perifere arteriële ziekte en ziekte van collageen, en kan worden toegediend aan patiënten die ondervoed zijn of zijn het gebruik van steroïden. Deze behandeling zou dus de eerste stap naar verbetering van de therapeutische opties voor diabetische wond genezing.

Introduction

De bevolking van diabetische patiënten wereldwijd groeit en bereikt 400 miljoen in 20151; naar schatting 15-25% van de patiënten met diabetes zijn in gevaar van de progressie van een lagere-extremiteit diabetische Ulcus2. Lager-extremiteit diabetische ulcera zijn hardnekkig en wellicht een therapeutische langdurig met revalidatietraining na volledig herstel. Een periode van lange therapie vaak resulteert in een significante vermindering van geduldige levenskwaliteit. Nieuwe therapieën die verminderen of voorkomen van verergering moeten zo worden ontwikkeld voor de behandeling van diabetische wonden. Om te beoordelen diabetische wondgenezing, we een diabetische Ulcus wondgenezing model bij ratten, die klinische praktijkomstandigheden bootst, geoptimaliseerd en geëvalueerd of verplanten adipeus afkomstige stamcel (ASC) bladen met behulp van cellaag engineering versnelde wondheling.

Mesenchymale stromale cellen (MSCs) vertonen een uitstekende mogelijkheden om wondgenezing vanwege hun zelf-vernieuwing capaciteit, hun immunomodulerende-effecten en hun vermogen om te onderscheiden in verschillende cel lineages3te versnellen. ASC's zijn een soort MSC afgeleid van vetweefsel, en zij vertonen verschillende voordelen ten opzichte van de MSCs afgeleid van andere weefsels, inclusief hun potentiële angiogenic en de paracrine activiteit4,5. Adipeus weefsel is relatief overvloedig in het menselijk lichaam, en de toegankelijkheid zorgt voor collectie met gebruikmaking van minimaal invasieve procedures. Daarom, ASC's experimenteel zijn gebruikt voor wondgenezing toepassingen6,,7.

Eerdere rapporten is gebleken dat de directe injectie van eencellige MSC schorsingen in gebieden rond wonden wond genezing8,9kan versnellen. Echter, ondanks de rapporten van de versnelling van de wondgenezing in diabetische Ulcus modellen na de injectie van eencellige schorsingen, de overlevingstijd van getransplanteerde cellen op de site van de wond is niet duidelijk.

In deze studie pasten we cellaag techniek met behulp van temperatuur-responsieve cultuur gerechten. Deze gerechten zijn de temperatuur-responsieve polymeer N- isopropylacrylamide op hun oppervlakte10covalente. De geënte polymeer laag zorgt voor temperatuurgevoelig cel adhesie te of detachement van het oppervlak van de cultuur-schotel. Het oppervlak van de schotel wordt hydrofobe bij 37 ° C, waardoor cellen te houden en te verspreiden, terwijl cellen spontaan van het oppervlak, losmaken zodra het hydrofiele bij temperaturen lager dan 32 ° C. Gekweekte cellen kunnen worden geoogst als het blad van een aangrenzende cel met intact cel-naar-cel kruispunten en extracellulaire matrices (ECMs) gewoon door het verminderen van de temperatuur; Proteolytische enzymen, die schade toebrengen aan de ECM, zoals trypsine, zijn dus, niet vereist11. Daarom kan cellaag engineering cel-naar-cel verbindingen behouden en verbeteren van de doeltreffendheid van cel transplantatie.

Daarnaast verhoogt de cellaag transplantatie cel overlevingskansen vergeleken met cel injectie12. In dit protocol, Zucker vette (ZDF) diabetesratten uitgekozen als type 2 diabetes en obesitas model met vertraagde wondgenezing. Obesitas ontwikkelen ZDF ratten spontaan op ongeveer 4 weken. Vervolgens ontwikkelen ze diabetes type 2 met obesitas tussen 8 en 12 weken leeftijd, op welk punt zij vertonen hyperglycemie geassocieerd met insuline resistentie, dyslipidemia en hypertriglyceridemie13. Vertraagde wond genezing, verminderde bloedstroom in de perifere bloedvaten en diabetische nefropathie zijn ook waargenomen14,15,16. ZDF ratten zou bovendien een passende model voor het bestuderen van de genezing van hardnekkige cutane ulcera, zoals diabetische ulcera.

De verschillen tussen mensen en knaagdieren in de wond-genezing mechanismen worden geassocieerd met anatomische verschillen in de huid. Wond genezing in normale ratten is gebaseerd op de wond contractie, overwegende dat de wondgenezing bij de mens is gebaseerd op de vorming van nieuwe epithelialization en granulatie weefsel. Meestal wond spalken gebruikt in knaagdier modellen helpt bij het minimaliseren van de samentrekking van de wond en zorgt voor de geleidelijke vorming van granulatie weefsel17, hoewel wonden bij niet diabetische ratten bijna volledig door contractie gesloten zijn. Echter, diabetische wond contractie in ZDF ratten verminderde en wond genezing voornamelijk vindt plaats via re epithelialization en de vorming van de granulatie weefsel; Dus, dit proces is meer vergelijkbaar met menselijke wond genezing van14.

Diabetische wonden met blootgestelde been nadat debridement ondervindt vaak klinisch. Eerdere studies hebben onderzocht diameter 12-mm full-dikte huid wonden op de ruggen van athymic naakt muizen18,19 en diameter 10-mm full-dikte huid wonden op de ruggen van normale muizen20. Ontwikkeling van een klinische model voor ernstige diabetische wonden, grotere (15 x 10 mm2) volledig-dikte huid gebreken met blootgesteld been en zonder het beenvlies zijn gemaakt, zoals eerder beschreven21, bij ratten met type 2 diabetes en obesitas.

Rat ASC (rASC) bladen van de ASC's van normale Lewis ratten werden gecreëerd door middel van allogene transplantatie van ASC bladen. In de klinische praktijk is autologe transplantatie onhaalbaar omdat diabetische patiënten met maagzweren vaak ernstige diabetische complicaties, zoals ongecontroleerde hoge bloedglucosespiegels en hoge lichaam massa indexen, en deze complicaties oorzaak wondgenezing aandoeningen die de moeilijkheid vertonen van het verkrijgen van adipeus weefsel van deze patiënten verhogen. Bovendien, ASC's van dieren met diabetes tentoonstelling eigenschappen gewijzigd en verminderde functie22. Daarom wordt het protocol hier gepresenteerd beschreven allogene transplantatie van rASC sheets van normale ratten en de toepassing van kunstmatige huid op diabetische ratten.

De dubbelgelaagde kunstmatige huid gebruikt in dit protocol wordt voorkomen dat de spontane samentrekking van de wonden, bevordert de synthese van een nieuwe matrix van bindweefsel en lijkt op de echte dermis23. In dit protocol, is de kunstmatige huid geplaatst op een vel rASC en vaste met nylon draden om te voorkomen dat de wond inkrimping of uitbreiding als gevolg van losse rat huid. Bovendien, de kunstmatige huid biedt een driedimensionaal raamwerk voor de ASC-bladen, houdt van een vochtige omgeving voor de getransplanteerde ASC lakens en wonden en de wonden beschermt tegen infecties en externe krachten. Ten slotte wordt een niet-klevende dressing geplaatst over de wond te beschermen tegen externe effecten, een vochtige wond omgeving onderhouden en absorberen afgescheiden.

Een rASC vel is dun, flexibel en vervormbare en ontvangende plaatsen, zoals een kloppend hart24verplaatsen kan worden aangehouden. Cellaag techniek is gebruikt voor de wederopbouw van verschillende weefsels en annuleerteken voortbrengen genezende effecten25,26. ASC bladen die klinische therapeutisch potentieel vertonen kunnen versnellen de genezing van vele soorten wonden. Bovendien misschien allogene transplantatie van ASC bladen, gecombineerd met het gebruik van kunstmatige huid, die van toepassing zijn bij de behandeling van hardnekkige zweren of brandwonden, zoals die waargenomen bij perifere arteriële ziekte of collageen ziekte, of ze kunnen worden toegediend aan patiënten die ondervoed zijn of zijn het gebruik van steroïden. Deze aanpak verhoogt de efficiëntie van het ASC's verplanten. De wond-genezing ZDF rat model produceert een ernstige wond aandoening die lijkt op de menselijke wond genezing proces en klinische omstandigheden in een kleine proefdieren nabootst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol heeft geprobeerd om een nieuwe cel-gebaseerde therapie voor hardnekkige diabetische wonden. Kort (zoals geïllustreerd in Figuur 1), allogene rASC lakens zijn gemaakt van normale ratten met behulp van cellaag engineering en werden vervolgens getransplanteerde een dubbelgelaagde van kunstmatige huid op een full-dikte huid defect met een diabetische ratten. Lichte Microscoop beelden van een goed voorbeeld van een rASC blad (figuur 2A) en een slecht voorbeeld van een rASC blad (figuur 2B) zijn afgebeeld in Figuur 2. Bij het ASC's zijn op een nieuwe cultuur schotel uitplaten, moet de schotel langzaam heen en weer wiegde en links en rechts in een incubator om uniforme rASC zaaien en een gelijkmatig dikke rASC blad (figuur 2A). Als de rASCs kan niet uniform worden aangesloten en op het oppervlak van de cultuur-schotel gekweekt, kan niet het blad worden verzameld als een aaneengesloten blad van ASC (figuur 2B). Figuur 3 toont ASC bladen die zijn geoogst als een aaneengesloten cellaag bij kamertemperatuur, omdat de ASC's gelijkmatig op het oppervlak van de schotel is aangesloten. RASC bladen kunnen meestal worden behandeld met een paar pincet. Indien nodig, dat een membraan van overdracht kan worden gebruikt om een cellaag van de cultuur-schotel naar de wond site, bijvoorbeeld als is de cellaag broos en breekbaar.
Figuur 4 toont de ZDF rats gebruikt als een diabetische wondgenezing model en de transplantatie van allogene rASC bladen gecombineerd met kunstmatige huid. Een blad rASC is zacht en flexibel, in grootte verstelbaar en kan worden uitgebreid naar alle uithoeken van de wond-site met een paar pincet (Figuur 4A-F). Het rASC blad bedekte defect was ook bedekt met kunstmatige huid (15 x 10 mm2) en ingehecht met ongeveer 10 steken met behulp van een 5-0 nylon hechtdraad (Figuur 4 g). Ter bescherming van de wond, een vochtige wond omgeving werd gehandhaafd en exsudaten werden geabsorbeerd, een niet-klevende dressing (20 x 15 mm2) was geplaatst over de kunstmatige huid en 5-0 nylon hechtingen werden toegepast (figuur 4I). De niet-klevende dressing is vaak verwijderd door de ZDF rats binnen enkele dagen van toepassing. Daarom moeten de ratten worden gecontroleerd na de transplantatie. Meestal wordt de niet-klevende dressing vervangen om de 2 dagen onder algemene verdoving. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De macroscopische foto's in Figuur 5 zijn de representatieve resultaten van de transplantatie van een rASC blad. In onze eerdere studie was de gemiddelde wond gebied in de rASC blad transplantatie groep (figuur 5B) aanzienlijk kleiner dan in de controlegroep (figuur 5A). Voor de besturingselementen, werd alleen kunstmatige huid gebruikt ter dekking van de wond, zonder de transplantatie van een rASC blad. Deze beelden werden genomen op de 14th dag na de oprichting van de wond (n = 6 in elke groep)31.

Figure 1
Figuur 1: schematische van de experimentele transplantatie Procedure. Schematische voorstelling van de experimentele transplantatie procedure uitgevoerd met een allogene rat adipeus afkomstige stamcel (rASC) blad en kunstmatige huid in een rat wondgenezing model van type 2 diabetes en obesitas. (A) Rat obesitas weefsel chirurgisch van normale Lewis ratten was weggesneden. rASCs werden geïsoleerd en ontpit op een schotel van 60 cm2 cultuur en gekweekt bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 7-8 dagen. (B) rASCs waren overgeënt elke 2-3 dagen, en passage 3 rASCs werden op een 35 mm diameter temperatuur-responsieve cultuur schotel agarvoedingsbodem. De cellen werden gekweekt in het volledige opslagmedium met 16.4 µg/mL L-ascorbinezuur zure fosfaat magnesium zout n-hydraat (AA) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 7-8 dagen. De rASCs zijn geoogst als een aaneengesloten rASC vel doordat de temperatuur op 20 ° C. (C) rASC bladen getransplanteerde op een 15 x 10 mm2 full-dikte huid defect met blootgestelde bot op het hoofd van ratten tentoonstellen van diabetes en obesitas (Zucker vette (ZDF) diabetesratten) gebruikt als een wond-genezing model. (D) een rASC blad was geplaatst op de schedel direct boven het defect en afgedekt) met een 15 x 10 mm2 vel dubbelgelaagde kunstmatige huid, die was ingehecht in plaats met 10 nylon (5-0) hechtingen. Diabetes 2015; 64: 2723-2734; met toestemming. Diabetes (c) copyright (2015) van de American Diabetes Association. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Licht van de Microscoop beelden van ASC's. Lichte Microscoop beelden van ASC proliferatie aan de rand van cultuur gerechten, zonder hiaten tussen de ASC's. (A) een rASC blad met een uniforme dikte in alle richtingen 7 dagen na het begin van kweken (A). (B) een rASC blad zonder uniform zaaien. Een aaneengesloten rASC blad kan niet worden verkregen op dag 7 na de start van kweken (B). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Tijd-tijdspanne beelden van rASC blad beelden kamertemperatuur. Time-lapse beelden van de status van een blad rASC bij kamertemperatuur. rASCs op een 35 mm diameter temperatuur-responsieve cultuur schotel spontaan geleidelijk losgemaakt van het oppervlak van de schotel bij kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C) en als een aaneengesloten blad zijn geoogst. (A) ongeveer 5 min na het verplaatsen van de temperatuur-responsieve cultuur schotel tot kamertemperatuur. (B) ongeveer 10 min na het verplaatsen van de 35 mm diameter temperatuur-responsieve cultuur schotel tot kamertemperatuur. (C) ongeveer 20-30 min na de verhuizing van de temperatuur-responsieve cultuur schotel naar kamertemperatuur. Dit is een kwalitatief goede rASC blad (C). (D-E) rASC blad status ongeveer 20-30 min na de verhuizing van de temperatuur-responsieve cultuur schotel naar kamertemperatuur. Dit rASC blad is van gemiddelde kwaliteit (D). (F-G) rASC bladen worden meestal behandeld met een paar pincet. Als de cellaag broos en kwetsbaar is, kan een membraan worden gebruikt als een steiger voor het overzetten van de cellaag van de cultuur-schotel naar de site van de wond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Tijd-serie afbeeldingen van de schepping van de wond en rASC blad transplantatie met kunstmatige huid en een niet-klevende Dressing
Serie beelden van wond creatie en rASC blad transplantatie met kunstmatige huid en een niet-klevende dressing. (A) de hoofden van de ZDF ratten werden geschoren met een elektrisch scheerapparaat. Na het scheren van de lichaamsbeharing, werden de vinkjes (15 x 10 mm2) getekend met een vette hydrofobe pen. (B) een volledig-dikte huid defect (15 x 10 mm2) ontstond op het hoofd van een narcose ZDF rat door het verwijderen van cutane weefsel van de opperhuid aan het beenvlies. De huid en het weefsel van de cutane waren weggesneden met een scalpel en het beenvlies werd verwijderd met een periosteal raspatory. Met behulp van gaas bevochtigd met een steriele zoutoplossing, werd druk uitgeoefend om te stoppen met het bloeden na excisie. (C) rASC blad transplantatie. Een blad rASC was geplaatst over het gebrek direct boven de schedel van de rat met behulp van een paar pincet. (D-G) Aanpassing rASC blad extensie overeenkomen met de grootte van de wond. Het blad rASC is flexibel, verstelbaar en kan worden uitgebreid tot elke hoek van de plaats van de wond met behulp van een paar pincet. Voor grotere wonden, kunnen twee of drie flexibele rASC bladen worden gestapeld. (H) wordt de kunstmatige huid die betrekking hebben op het rASC blad. Het gebrek en het getransplanteerde rASC blad waren bedekt met kunstmatige huid (15 x 10 mm2), die was met 10 steken met 5-0 nylon hechtingen ingehecht. (ik) Suturing van de niet-klevende dressing (20 x 15 mm2) naar de site van de wond bedekt met kunstmatige huid. Ter bescherming van de wond, was niet-klevende dressing (20 x 15 mm2) geplaatst over de kunstmatige huid met 5-0 nylon hechtingen. Diabetes 2015; 64: 2723-2734; met toestemming. Diabetes (c) copyright (2015) van de American Diabetes Association. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: gebreken van de huid van de macroscopische beelden van Full-dikte. Macroscopische foto's van volledig-dikte huid gebreken zonder de transplantatie van een rASC blad (A) en met de transplantatie van een rASC blad (B) 14 dagen na de oprichting van de wond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische stappen voor met succes het kweken van een blad rASC zijn als volgt: 1) de temperatuur moet worden gehouden bij ongeveer 37 ° C gedurende het kweken op de temperatuur-responsieve cultuur gerechten. Tijdens de creatie van een rASC blad, elke procedure werd uitgevoerd op een 37 ° C thermo-plaat, en elke reagens werd opgewarmd tot 37 ° C om te voorkomen dat de cellen spontaan loskoppelen van de schotel31. 2) de ontvangende ZDF ratten moeten worden gecontroleerd om te voorkomen dat de verwijdering van de dressing van de niet-klevende, die is van cruciaal belang voor de succesvolle transplantatie van rASC vellen. Als de dressing is verwijderd, moet een nieuwe niet-klevende dressing worden toegepast om te voorkomen dat de getransplanteerde ASC bladen loskoppelen van de wond-site.

Met deze procedure, rASC bladen waren over het algemeen verkregen binnen 5-7 dagen na het zaaien van passage 3 cellen op temperatuur-responsieve cultuur gerechten. De cultuur benodigde tijd voor het genereren van een rASC blad kan worden aangepast volgens de oorspronkelijke celdichtheid en de tijd waarop het volledige kweekmedium dat van AA wordt toegepast. Als een blad rASC zijn losgekoppeld van de schotel tijdens cel kweken, het rASC blad moet worden vernieuwd en extra gerechten moeten bereid zijn in het geval van mobiele-detachement.

De beperkingen van dit protocol zijn als volgt: 1) strikte temperatuur beheer moet worden toegepast om een benaderende temperatuur van 37 ° C gedurende het hele proces bij het gebruik van temperatuur-responsieve cultuur gerechten. 2) na het verkrijgen van een rASC blad, moeten speciale medische hulpmiddelen worden gebruikt om te houden vochtige omstandigheden, omdat het blad rASC gevoelig voor droge omstandigheden is. 3) post-operatieve beheer, met inbegrip van dagelijkse observatie van de toestand van de ontvangende rat, is noodzakelijk.

Grotere wonden met blootgestelde bot zijn vaak klinisch waargenomen. Bijvoorbeeld verkeer ongeval trauma, brandwonden, geïnfecteerde wonden en beschadigde of necrotische wonden na debridement tot grote wonden met blootgestelde bot uitgroeien kan. Hier, werd een klinische model van ernstige wonden ontwikkeld met behulp van een grote, volledig-dikte huid defect met blootgestelde bot bij ratten met type 2 diabetes en obesitas. Dit model heeft het potentieel om te worden gebruikt als een standaard model voor de evaluatie van de wondgenezing bij diabetesratten.

Kunstmatige huid is een commercieel beschikbare medisch hulpmiddel voor full-dikte huid gebreken na debridement en recombinant fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF) is wijd verbeid gebruikt voor wondgenezing angiogenese en korreling te bevorderen. Deze twee behandelingen zijn gebruikt om aanzienlijke therapeutische resultaten, zelfs voor chronische wonden, zoals diabetische wonden te bereiken. Er werd gemeld dat ASC's angiogeneic groeifactoren28, zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), de hepatocyte groeifactor (HGF), en bFGF, die kunnen bijdragen tot neovascularization29,30 en versnellen wondgenezing afscheiden. Onze vorige studie bevestigd dat ASC's voortdurend deze groeifactoren31afscheiden. Daarom, ASC bladen, gecombineerd met kunstmatige huid, hebben het potentieel om te worden gebruikt als een nieuwe therapeutische optie voor versnelde vascularisatie en wond genezing31, en deze bladen die van toepassing zijn op de behandeling van vele soorten hardnekkige zweren of brandwonden in menselijke klinische instellingen in de toekomst misschien wel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De volgende auteurs vermelden financiële relaties relevant zijn voor deze publicatie: Teruo Okano is mede-oprichter en directeur van het bestuur van cel zaad Inc., die licenties technologie en patenten uit Tokyo vrouwen Medizinische Universität, en Teruo Okano en Masayuki Yamato zijn belanghebbenden in cel zaad Inc. Tokyo vrouwen Medizinische Universität ontvangt onderzoeksgelden van cel zaad Inc. De andere auteurs verklaren dat zij geen financiële relaties relevant zijn voor deze publicatie.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Yukiko Koga van het departement van de plastische en reconstructieve chirurgie, Juntendo University School of Medicine, voor het verstrekken van praktische adviezen. Wij danken ook de heer Hidekazu Murata van het centrum van Tokyo DiabetesVrouwen van medische University School of Medicine voor uitstekende technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door de oprichting van innovatie centra voor geavanceerde interdisciplinaire gebieden onderzoeksprogramma van het Project voor ontwikkelingslanden innovatiesystemen "cel blad Tissue Engineering Center (CSTEC)" van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366, (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214, (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3, (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20, (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2, (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27, (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7, (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52, (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19, (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18, (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12, (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9, (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9, (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14, (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137, (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21, (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14, (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12, (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267, (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24, (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48, (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18, (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. db141133 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics