वयस्क चूहों से अलगाव, संस्कृति, और sinoatrial नोड myocytes के कार्यात्मक विशेषताओं के लिए तरीके

1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

तरीके पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या इमेजिंग अध्ययन के लिए वयस्क चूहों से sinoatrial नोड myocytes (SAMs) के अलगाव के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। अलग कक्षों सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है या इस तरह के आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवाददाताओं के रूप में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice. J. Vis. Exp. (116), e54555, doi:10.3791/54555 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sinoatrial नोड myocytes (SAMs) दिल की प्राकृतिक पेसमेकर के रूप में कार्य, हर दिल सहज कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) पैदा करने से हराया की शुरुआत। ये पेसमेकर प्राधिकृत व्यक्ति कई झिल्ली धाराओं और intracellular कैल्शियम साइकिल चालन के समन्वित गतिविधि प्रतिबिंबित करते हैं। हालांकि सटीक तंत्र है कि SAMs में सहज पेसमेकर गतिविधि ड्राइव मायावी रहते हैं। तीव्रता से पृथक SAMs प्रयोगों हृदय pacemaking के आणविक आधार काटना करने के लिए एक आवश्यक तैयारी कर रहे हैं। हालांकि, अस्पष्ट शरीर रचना विज्ञान, जटिल microdissection, और नकचढ़ा enzymatic पाचन की स्थिति तीव्रता से पृथक SAMs के व्यापक उपयोग को रोका है। इसके अलावा, तरीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति की पढ़ाई के लिए SAMs की लंबी अवधि संस्कृति को अनुमति देने के लिए हाल ही में जब तक उपलब्ध नहीं थे। यहाँ हम वयस्क चूहों से SAMs के अलगाव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल और वीडियो प्रदर्शन प्रदान करते हैं। एक विधि को भी इन विट्रो में और expressi के लिए वयस्क माउस SAMs बनाए रखने के लिए प्रदर्शन किया हैadenoviral संक्रमण के माध्यम से exogenous प्रोटीन के पर। तीव्रता से अलग-थलग और इन तरीकों के माध्यम से तैयार सुसंस्कृत SAMs electrophysiological और इमेजिंग अध्ययन की एक किस्म के लिए उपयुक्त हैं।

Introduction

दिल की sinoatrial नोड में पेसमेकर myocytes (sinoatrial myocytes, "SAMs") सहज, लयबद्ध कार्रवाई की क्षमता (ए पी एस) कि मायोकार्डियम के माध्यम से प्रचार हर दिल की धड़कन आरंभ करने के लिए उत्पन्न करते हैं। कई प्रजातियों से तीव्रता से पृथक SAMs का उपयोग कर प्रयोगों तंत्र है कि पेसमेकर गतिविधि के उत्पादन में योगदान की व्याख्या के लिए आवश्यक किया गया है। SAMs अति विशिष्ट cardiomyocytes कि आकृति विज्ञान, समारोह, और प्रोटीन अभिव्यक्ति के मामले में आलिंद और निलय मायोकार्डियम में अपने समकक्षों से काफी अलग हैं। SAMs में सहज प्राधिकृत व्यक्ति की पहचान पाद लंबा है कि सीमा के झिल्ली क्षमता ड्राइव अगले एपी 1,2 को गति प्रदान करने के दौरान एक सहज विध्रुवण है। यह "पेसमेकर संभावित" "अजीब वर्तमान" (मैं च) सहित कई अलग अलग धाराओं झिल्ली, टी और एल प्रकार कैल्शियम धाराओं, और सोडियम-कैल्शियम एक्सचेंजर curr के समन्वित गतिविधि पर निर्भर करता हैईएनटी (मैं NCX), जो sarcoplasmic जालिका 3,4 से सीए 2 रिलीज से प्रेरित है।

जबकि तीव्रता से पृथक माउस SAMs pacemaking के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य प्रयोगात्मक तैयारी कर रहे हैं, चूहों से SAMs के अलगाव के एक चुनौतीपूर्ण विधि को अपनाने के लिए हो सकता है क्योंकि अस्पष्ट शरीर रचना विज्ञान और माउस सैन के छोटे आकार के एक सूक्ष्म microdissection और संयुक्त एंजाइमी और यांत्रिक की आवश्यकता है कोशिकाओं की हदबंदी सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है।

हम यहाँ एक प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक पैच दबाना रिकॉर्डिंग 5-8 के लिए वयस्क चूहों से SAMs को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है की एक विस्तृत वीडियो प्रदर्शन प्रदान करते हैं। हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ किसी भी अन्य स्रोत से ऐसी कोई दृश्य प्रदर्शन उपलब्ध है। इसके अलावा, एक नई विधि में जो प्रदर्शन किया है पृथक SAMs वयस्क चूहों से जिससे प्रोटीन की शुरूआत की अनुमति, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग, कई दिनों के लिए इन विट्रो में रखा जा सकता हैसंवाददाता अणुओं या आरएनएआई adenoviral संक्रमण 9 के माध्यम से।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैम्पस विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे। नीचे मानक प्रोटोकॉल पुरुष C57BL / 6J उम्र के 2-3 महीने के चूहों का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है।

1. समाधान स्टॉक्स और आपूर्ति तैयार प्रयोगों के अग्रिम में

नोट: आवश्यक उपकरण और आपूर्ति के लिए सामग्री तालिका देखें।

  1. पूरा Tyrode के, कम सीए 2/2 मिलीग्राम + Tyrode की, संशोधित क्राफ्ट-Brühe (KB) समाधान है, और गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान: के रूप में 1 टेबल में संकेत 1 एल निम्न समाधानों में से प्रत्येक के लिए तैयार करें। ultrapure उपयोग सभी समाधान के लिए फ़िल्टर विआयनीकृत पानी। अप करने के लिए छह महीने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर aliquots में प्रत्येक समाधान और दुकान फूट डालो। तुरंत प्रयोगों से पहले अलग-अलग aliquots गला लें, और एक सप्ताह तक 4 के लिए स्टोर6, सी।
  2. Ultrapure फ़िल्टर विआयनीकृत पानी (1 टेबल) में सोडियम क्लोराइड और 2 CaCl भंग द्वारा 10 मिमी NaCl और 1.8 मिमी 2 CaCl अनुकूलन समाधान के 50 मिलीलीटर की तैयारी। अप करने के लिए छह महीने के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर।
  3. microfuge ट्यूबों में pipetting द्वारा 4.75 एंजाइम गतिविधि इकाई (यू) elastase की aliquots तैयार करें। अप करने के लिए तीन महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  4. Microfuge ट्यूबों में pipetting द्वारा 375 माइक्रोग्राम aliquots कोलैजिनेज़-प्रोटीज एंजाइम मिश्रण की (ultrapure एच 2 ओ में) तैयार करें। अप करने के लिए तीन महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. (चित्रा 1Aiv और चित्रा 1C ~ 1.5 मिमी अंतिम खोलने व्यास) और पृथक्करण के लिए एक (~ 2 मिमी व्यास, चित्रा 1Aiii और चित्रा 1 सी) दो आग पॉलिश पाश्चर pipettes, ऊतक हस्तांतरण के लिए एक तैयार करें।
    1. एक गिलास कटर के साथ स्कोर को पाश्चर pipettes और स्कोर के साथ तस्वीर एक खोलने वांछित आकार की तुलना में थोड़ा बड़ा उत्पादन करने के लिए। आगएक लेम्प बर्नर एक मोटी दीवार पॉलिश और वांछित व्यास की एक खोलने का उत्पादन करने पर एक कम लौ पर ~ 30-60 सेकंड के लिए प्रत्येक पिपेट की कटौती अंत -जर्मन। सुनिश्चित आग पॉलिश उद्घाटन किसी भी दरारें या किसी न किसी किनारों से मुक्त है।
  6. जोड़कर दो विच्छेदन व्यंजन तैयार ~ 25 मिलीलीटर सिलिकॉन elastomer प्रत्येक 100 मिमी पेट्री डिश के लिए निर्माता के निर्देशों (चित्रा 1Ai और चित्रा 1 बी) के अनुसार मिलाया। 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इलाज करने की अनुमति दें।
  7. संस्कृति के लिए केवल: तैयार 25-50 मिलीलीटर प्रत्येक चढ़ाना मध्यम और प्रति 2 टेबल के रूप में संस्कृति मध्यम दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।।

2. तैयार समाधान सेल अलगाव के दिन पर इस्तेमाल किया जा

नोट: निम्न मात्रा में एक माउस से sinoatrial myocytes के अलगाव के लिए कर रहे हैं।

  1. जोड़े 2.5 कम सीए की मिलीलीटर 2 + / 2 मिलीग्राम + Tyrode के (6.9 पीएच) तीन छोटे, गोल तली संस्कृति ट्यूब से प्रत्येक के लिएएस। 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें ट्यूबों।
  2. 2.5 मिलीलीटर कम सीए 2/2 मिलीग्राम + Tyrode के लिए एक बड़े दौर तली संस्कृति ट्यूब की जोड़ें। इस ट्यूब के लिए, 1 विभाज्य (4.75 यू) elastase और एक विभाज्य (375 माइक्रोग्राम) कोलैजिनेज़-प्रोटीज एंजाइम मिश्रण जोड़ें। मिश्रण करने के भंवर। 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह ट्यूब।
  3. तीन अतिरिक्त छोटे, गोल तली संस्कृति ट्यूब और एक अतिरिक्त बड़े, गोल तली संस्कृति ट्यूब के माध्यम KB का 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें ट्यूबों।
  4. एक बड़े तली संस्कृति ट्यूब के लिए बीएसए समाधान के ~ 7 मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर इस ट्यूब रखें।
  5. पूरा Tyrode समाधान के 20-40 मिलीलीटर एक 50 मिलीलीटर बीकर (चित्रा 1Aii) में रखें। 10 खासियत / मिलीलीटर हेपरिन, भंवर मिश्रण में जोड़ने, और 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बीकर जगह है।

3. अतिरिक्त समाधान और सामग्री तैयार करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं (तीव्रता से अलग कक्षों के लिए इन चरणों को छोड़ दें)

  1. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में, एक 24 अच्छी तरह से थाली की अलग-अलग कुओं में माउस प्रति दो 12 मिमी दौर कांच coverslips जगह है।
    नोट: क्योंकि कुओं एक सुविधाजनक आकार है, जो बाद में वायरल संक्रमण के लिए मात्रा को सीमित करने का कार्य करता हैं 24 अच्छी तरह से थाली प्रयोग किया जाता है।
  2. पिपेट एक 100 एनजी / एमएल माउस laminin के प्रत्येक coverslip पर समाधान बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पतला के लगभग 200 μl।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में अलगाव (कम से कम 1 घंटा) की अवधि के लिए laminin के साथ coverslips सेते हैं।
  4. पूर्व गर्म चढ़ाना मझौले और संस्कृति के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए (1.7 कदम और 3 टेबल से)।

4. sinoatrial नोड अलगाव

  1. एक रासायनिक धूआं हुड में, एक दो कक्ष बॉक्स में से एक कक्ष में एक माउस जगह है और ~ 200 μl तरल अन्य कक्ष में एक कपास झाड़ू के माध्यम से पेश isoflurane साथ anesthetize। एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण (आमतौर पर ~ भीतर 30-60 सेकंड) की पुष्टि करें। euthanizeग्रीवा अव्यवस्था से माउस।
    नोट: एक खाली 1 मिलीलीटर विंदुक टिप बॉक्स दो कक्ष बॉक्स बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; isoflurane यह सीधे संपर्क करने से रोकने के लिए माउस के लिए अलग डिब्बे बनाने के लिए बॉक्स में रैक उल्टा बारी।
  2. कैंची और आड़ा काट रिब पिंजरे के साथ सीने से फर निकालें बाहरी ऊतक संदंश (चित्रा 1Aviii) और विच्छेदन कैंची (चित्रा 1Avix) का उपयोग कर छाती गुहा का पर्दाफाश करने के लिए। छाती गुहा स्नान ~ 2 मिलीलीटर के साथ पूर्ण करें Tyrode के गरम हेपरिन एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग के साथ।
    ध्यान दें: जारी स्नान छाती गुहा जब आवश्यक तैयारी बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं है।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से फेफड़ों को हटाने और आंतरिक कैंची (चित्रा 1Avi) और विच्छेदन संदंश (चित्रा 1Avii) का उपयोग थाइमस।
  4. जबकि धीरे आंतरिक विच्छेदन संदंश के साथ दिल के शीर्ष पकड़े, ध्यान से अवर रग Cava और एक कटछाती गुहा से दिल को दूर करने के लिए आंतरिक कैंची से Orta। सिलिकॉन विच्छेदन व्यंजनों में से एक के लिए दिल स्थानांतरण और स्नान ~ 4 मिलीलीटर के साथ पूर्ण करें Tyrode के हस्तांतरण पिपेट का उपयोग heparinized गरम।
  5. ओरिएंट दिल है कि इस तरह पीछे जहाजों दिखाई और सामना करना पड़ रहा है, प्रयोगकर्ता की बाईं तरफ के प्रयोगकर्ता के अधिकार पर जानवर के सही आलिंद और बाएं आलिंद के साथ हैं। एक बार जब उन्मुख, सिलिकॉन विच्छेदन डिश में शीर्ष के माध्यम से लगाए द्वारा हृदय स्थिर है।
  6. निलय और अटरिया (निलय ऊपर स्पष्ट अंगूठी) के बीच नाली का पता लगा।
  7. आंतरिक विच्छेदन कैंची का प्रयोग, अटरिया से निलय के करीब रखने, नाली में एक चीरा बनाते हैं। नाली और अतिरिक्त गरम heparinized पूरा Tyrode के रूप में अटरिया और वाल्व की एक स्पष्ट दृष्टिकोण की अनुमति की जरूरत के साथ चीरा फ्लश। नाली के साथ कटौती करने के लिए निलय से अटरिया अलग करने के लिए आगे बढ़ें।
  8. दूसरी सिलिकॉन विच्छेदन डिश के लिए आलिंद ऊतक स्थानांतरण और स्नान ~ 3 मिलीलीटर के साथ पूर्ण करें Tyrode के heparinized गरम।
  9. ओरिएंट ऊतक तो यह है कि जानवर के सही आलिंद प्रयोगकर्ता के छोड़ दिया पर अब है, और बाएं आलिंद सही पर है।
    ध्यान दें: सही आलिंद, अधिक पारदर्शी है, जबकि बाएं आलिंद एक गहरे लाल स्वर से अधिक है।
  10. अवर और बेहतर रग cavae और सही और बाएँ आलिंद उपांग के माध्यम से ऊतक पिन, धीरे तैयारी खींच। किसी भी शेष वसा या अन्य ऊतकों को हटाने की तैयारी (, आलिंद दीवार में कटौती नहीं करने के लिए सावधान रहना होगा के रूप में sinoatrial नोड काफी नाजुक है और आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं) की एक स्पष्ट दृष्टिकोण की अनुमति है।
  11. venae cavae के माध्यम से काटने से अटरिया के पूर्वकाल दीवार खोलें। आवश्यक के रूप में पिन फिर से स्थिति अलिंदीय पट कल्पना करने के लिए।
  12. अंतरा अलिंदीय पटल के साथ कट बाएं आलिंद हटा दें। तैयारी पुन पिन, धीरे खींच।
  13. टी हटायेवह सही आलिंद उपांग और cristae terminalis है, जो एक गहरे नारंगी लकीर आलिंद उपांग की सीमा के रूप में प्रकट होता है के साथ काटने से sinoatrial नोड मुक्त।
  14. नोडल ऊतक पुन पिन और यह laterally कटौती (शिखा terminalis को सीधा) तीन स्ट्रिप्स समान रूप से आकार का उत्पादन।

5. sinoatrial नोड पाचन

  1. संकीर्ण आग पॉलिश पिपेट (चित्रा 1Aiv) का प्रयोग, तीन छोटे, गोल तली ट्यूब कम सीए के 2.5 मिलीग्राम से युक्त के पहले में sinoatrial नोड ऊतक के तीन स्ट्रिप्स हस्तांतरण 2 + / 2 मिलीग्राम + Tyrode के 35 ± 1 डिग्री में सेल्सियस पानी के स्नान। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. दूसरे छोटे, गोल नीचे 2.5 मिलीलीटर कम सीए युक्त ट्यूब स्थानांतरण ऊतक स्ट्रिप्स 2 + / 2 मिलीग्राम + Tyrode के 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में, एक ही संकीर्ण पिपेट का उपयोग। कोमल ट्यूब घूमता द्वारा या धीरे संकीर्ण विंदुक के साथ pipetting द्वारा ऊतक स्ट्रिप्स धो लें। Inver मत करोट्यूब टी।
  3. तीसरे छोटे, गोल नीचे 2.5 मिलीलीटर कम सीए युक्त ट्यूब स्थानांतरण ऊतक स्ट्रिप्स 2 + / 2 मिलीग्राम + Tyrode की, और कपड़े धोने के कदम से कदम 5.2 में वर्णित दोहराएँ।
  4. बड़े दौर तली ट्यूब कम सीए के 2.5 मिलीग्राम से युक्त में स्थानांतरित स्ट्रिप्स 2 + / 2 मिलीग्राम + Tyrode के साथ एंजाइमों 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में (elastase प्लस कोलैजिनेज़-प्रोटीज मिश्रण)। सुनिश्चित करें कि सभी तीन ऊतक स्ट्रिप्स मौजूद हैं। 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए सेते हैं। धीरे ट्यूब घूमता द्वारा हर 5 मिनट मिक्स। ट्यूब पलटना नहीं है।

6. sinoatrial नोड myocyte हदबंदी

  1. एंजाइम पाचन के बाद, संकीर्ण आग पॉलिश पिपेट का उपयोग धीरे 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर पहले छोटे, गोल तली ट्यूब 2.5 मिलीलीटर KB समाधान युक्त करने के लिए ऊतक स्ट्रिप्स हस्तांतरण करने के लिए। धीरे ट्यूब घूमता द्वारा ऊतक धो लें।
    नोट: ऊतक स्ट्रिप्स कुछ हद तक पारदर्शी दिखाई देगा और वें पर एक साथ पेड़ों का झुरमुट सकता हैबिंदु है। enzymatic पाचन के बाद बहुत धीरे संभाल कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए।
  2. 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर दूसरे छोटे दौर तली युक्त ट्यूब 2.5 मिलीलीटर KB करने के लिए ऊतक स्थानांतरण। भंवर धीरे धोने के लिए।
  3. 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर तीसरे छोटे दौर तली युक्त ट्यूब 2.5 मिलीलीटर KB करने के लिए ऊतक स्थानांतरण। भंवर धीरे धोने के लिए।
  4. 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर बड़े, गोल तली युक्त ट्यूब 2.5 मिलीलीटर KB करने के लिए ऊतक स्थानांतरण।
  5. , बड़ा आग पॉलिश पिपेट (चित्रा 1Aiii और चित्रा 1 सी) का उपयोग करते हुए लगभग 5-10 मिनट के लिए 0.5-1 हर्ट्ज निरंतर विचूर्णन द्वारा बड़े दौर तली ट्यूब में कोशिकाओं को अलग कर देना, देखभाल करने में डूबे हुए हदबंदी ट्यूब रखने के लिए 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान और समाधान में बुलबुले शुरू करने से बचें।
    नोट: Trituration समय हदबंदी पिपेट का व्यास और pipetting के बल के साथ बदलता रहता है। इतना समय है कि ऊतक के टुकड़े टी में शेष समायोजित किया जाना चाहिएवह हदबंदी के अंत में, पतली पारदर्शी और wispy दिखाई देते हैं। ऊतक किसी भी रंग को बरकरार रखे हुए हैं, हदबंदी अधूरा होने की संभावना है। फ्रीक्वेंसी (0.5-1 हर्ट्ज) हाथ से निर्धारित होता है।
  6. दौर तली ट्यूब नहाने के पानी से अलग SAMs युक्त निकालें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करना।

7. sinoatrial नोड कैल्शियम पुनः अनुकूलन (कमरे के तापमान पर प्रदर्शन)

नोट: SAMs संस्कृति प्रयोगों के लिए किस्मत के लिए, निम्न अनुभाग में प्रक्रियाओं एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। SAMs तीव्र प्रयोगों के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं, वहाँ एक बाँझ वातावरण में इन चरणों को पूरा करने की कोई जरूरत नहीं है।

  1. NaCl / 2 CaCl अनुकूलन समाधान (तालिका 2) के 75 μl जोड़ें। भंवर धीरे मिश्रण और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. NaCl / 2 CaCl अनुकूलन समाधान के 160 μl जोड़ें। भंवर धीरे मिश्रण और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. बीएसए सोल के 390 μl जोड़ेसंविधान (तालिका 2)। भंवर धीरे मिश्रण और 4 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. बीएसए समाधान के 1.25 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर धीरे मिश्रण और 4 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. बीएसए समाधान के 4.37 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर धीरे मिश्रण और 4 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: कैल्शियम की अंतिम एकाग्रता 1.8 मिमी होगा।
  6. कैल्शियम फिर से अनुकूलन के बाद, 3 मिनट के लिए ~ 2,000 XG पर ~ के लिए 10 मिनट या centrifugation द्वारा गंभीरता से व्यवस्थित करने की अनुमति देकर SAMs इकट्ठा।
    1. तीव्रता से अलग कक्षों के लिए, धीरे हटाने और सतह पर तैरनेवाला एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग कर के बारे में 5 मिलीलीटर त्यागें, ~ 2 मिलीलीटर की मात्रा में कोशिकाओं को छोड़कर। पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए साइन अप ~ से 8 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इन कोशिकाओं स्टोर।
    2. संवर्धित कोशिकाओं के लिए, एक बाँझ कांच पाश्चर विंदुक का उपयोग संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला की बहुत दूर। 1 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) चढ़ाना मध्यम (तालिका 2)।

8. चढ़ाना और sinoatrial म्यो की संस्कृतिcytes (तीव्रता से अलग कक्षों के लिए जाएं)

  1. पाश्चर विंदुक के साथ 3.3 कदम से coverslips से laminin समाधान निकालें। इसके तत्काल बाद प्रत्येक laminin लेपित coverslip (3 कदम से) पर 500 μl (~ 50-100 कोशिकाओं) बीज।
    नोट: सिकुड़ा अवरोध 2,3-butanedione monoxime (BDM) संकुचन, जो कोशिकाओं 9 की उदासीनता का कारण बनता है को रोकने के लिए चढ़ाना और संस्कृति मीडिया में शामिल है।
  2. इनक्यूबेटर के लिए 24 अच्छी तरह से थाली नव वरीयता प्राप्त SAMs युक्त लौटें और 95% हवा / 5% सीओ 2 के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। कोशिकाओं चढ़ाना मीडिया में 4-6 घंटे के लिए (तालिका 2) के लिए coverslips का पालन करने की अनुमति दें।
  3. धीरे एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग चढ़ाना के माध्यम से निकालें। पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मध्यम संस्कृति के प्रति अच्छी तरह से 500 μl (तालिका 2) के साथ बदलें।

9. एडल्ट sinoatrial myocyte संस्कृतियों की adenoviral पारगमन (तीव्रता से अलग कक्षों के लिए जाएं)

  1. सीई की संख्या का अनुमानcoverslip प्रति lls तुरंत एक खुर्दबीन के नीचे देखने का एक क्षेत्र में कोशिकाओं की गिनती, बढ़ाई के लिए समायोजन करके एडीनोवायरस लागू करने से पहले। सभी कोशिकाओं में ही नहीं, SAMs गणना।
  2. मीडियम 199 में एडीनोवायरस पतला और इतने 1-10 μl के उस आवेदन सेल प्रति 100 वायरल इकाइयों के संक्रमण के अंतिम बहुलता (MOI) प्राप्त करने के लिए आवश्यक है वायरल अनुमापांक के लिए कमजोर पड़ने समायोजित करें। एक dropwise फैशन में adenoviral समाधान सीधे चढ़ाया SAMs पर जोड़ें।
  3. वायरस युक्त मध्यम रातोंरात (~ 12-14 घंटा) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। फिर ताजा संस्कृति के माध्यम से आदान-प्रदान कर। कोशिकाओं जब तक वांछित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त की है, इनक्यूबेटर में बनाए रखने के लिए संस्कृति के माध्यम से हर 48 घंटा बदल रहा है।

10 तीव्रता से पृथक या संवर्धित SAMs के कार्यात्मक मूल्यांकन

नोट: निम्न प्रोटोकॉल पृथक SAMs के कार्यात्मक आकलन दोनों सहज ए पी एस और मैं रिकॉर्ड करने के लिए amphotericin छिद्रित पैच तकनीक का उपयोग का एक उदाहरण है 9 देखें)।

  1. तालिका 3 में वर्णित के रूप में रिकॉर्डिंग समाधान तैयार करें।
  2. DMSO में 20 मिलीग्राम / एमएल amphotericin-बी के एक शेयर समाधान रिकॉर्डिंग के दिन पर ताजा तैयार करें। कमरे के तापमान पर रखने के शेयर और प्रकाश से बचाने के लिए। 200 यूजी के अंतिम एकाग्रता के लिए intracellular समाधान में पतला amphotericin बी शेयर / सिर्फ उपयोग करने से पहले मिलीलीटर। बर्फ पर अंतिम पिपेट समाधान बनाए रखने और प्रकाश से बचाने के लिए।
    नोट: प्रयोगों के लिए amphotericin युक्त पिपेट समाधान कम से कम 1 मिनट के लिए intracellular समाधान और vortexing में शेयर समाधान के एक विभाज्य गिराए द्वारा ताजा प्रति घंटा तैयार रहना चाहिए।
  3. के एक विभाज्य स्थानांतरण तीव्रता से सैम सेल निलंबन या गिलास coverslip 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर Tyrode समाधान युक्त एक रिकॉर्डिंग कक्ष असर सुसंस्कृत SAMs का एक टुकड़ा अलग। electrophysiological recordin करने से पहले कम से कम 2 मिनट के लिए Tyrode समाधान के साथ कोशिकाओं छिड़कनाजीएस संस्कृति के माध्यम से शेष किसी भी अवशिष्ट BDM हटा दें।
    ध्यान दें: सहज संकुचन तुरंत Tyrode समाधान करने के लिए स्थानांतरण पर स्पष्ट होना चाहिए। रिकॉर्डिंग के लिए SAMs सहज सिकुड़ा गतिविधि विशेषता आकृति विज्ञान (जैसे।, चित्रा 2), स्त्रिअतिओन्स की कमी है, HCN4 प्रोटीन की अभिव्यक्ति, वर्तमान मैं एफ की उपस्थिति, झिल्ली समाई <50 पीएफ, और सहज ए पी एस सहित सुविधाओं के संयोजन के द्वारा पहचाना जा सकता है waveforms कि एक डायस्टोलिक विध्रुवण चरण और एक धीमी गति से upstroke शामिल है के साथ।
  4. 1.5-3.0 MΩ के प्रतिरोध के साथ borosilicate ग्लास pipettes का उपयोग, intracellular समाधान के साथ टिप भरने के 10-30 सेकंड के लिए सूई से amphotericin कमी। तब amphotericin युक्त समाधान के साथ पिपेट वापस भरण। एक GΩ सेल संलग्न मुहर संभव के रूप में जल्दी से प्राप्त किया जाना चाहिए। अगर सील गठन मुश्किल है, नोक-भरने के समय में वृद्धि।
    ध्यान दें: उपयोग प्रतिरोध लगातार होना चाहिएसेल संलग्न मुहर के गठन के बाद से नजर रखी, और रिकॉर्डिंग केवल <10 MΩ की एक स्थिर उपयोग प्रतिरोध प्राप्त करने के बाद शुरू किया जाना चाहिए।
  5. सहज ए पी एस रिकॉर्ड करने के लिए, कोई मौजूदा इंजेक्शन के साथ तेजी से वर्तमान दबाना मोड में एम्पलीफायर स्विच।
    नोट: जब ए पी एस रिकॉर्डिंग, फायरिंग दर को स्थिर करने के रूप में पहले से 10 की सूचना दी 1 एनएम isoproterenol बाह्य Tyrode समाधान में शामिल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पहले वयस्क चूहों कि विभिन्न पैच दबाना अध्ययनों में 5-8 की एक किस्म के लिए उपयुक्त हैं से अनायास सक्रिय SAMs को अलग-थलग करने के लिए नियोजित किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल पृथक SAMs कि अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है के लिए अनुमति देते हैं। संवर्धित कोशिकाओं में जीन स्थानांतरण adenoviral संक्रमण 9 के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। इस अनुभाग में प्रस्तुत परिणाम हमारे पिछले काम से निकाले जाते हैं और यहाँ तीव्रता से अलग और सुसंस्कृत SAMs की विशेषताओं के उदाहरण के रूप में दिखाया जाता है।

चित्रा 2 में दिखाया गया है, अनायास सक्रिय SAMs 6 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। संवर्धित कोशिकाओं एक समग्र आकृति विज्ञान है कि बहुत तीव्रता से पृथक SAMs के समान है, औसत लंबाई, चौड़ाई में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन, पार अनुभाग क्षेत्र, या सुसंस्कृत की झिल्ली समाई के साथ बनाए रखने के लिएकोशिकाओं तीव्रता से अलग कक्षों (- चित्रा 2 बी) की तुलना में। हालांकि वहां की संस्कृति में समय के साथ व्यवहार्य SAMs की संख्या की उदासीनता था। इसलिए, यह सिफारिश की है कि संस्कृतियों कई जानवरों से जमा कोशिकाओं से तैयार किया है, तो प्रयोगात्मक डिजाइन व्यापक डेटासेट की आवश्यकता है।

वयस्क चूहों से sinoatrial myocytes की संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के विकास में एक प्रमुख लक्ष्य के लिए एक प्रणाली है कि वयस्क SAMs के देशी सेलुलर संदर्भ में exogenous प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति होगी बना रहा था। फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर GFP और mCherry व्यक्त वायरस से संक्रमित सह प्रोटीन अभिव्यक्ति के इस प्रकार का एक उदाहरण कोशिकाओं के मामले के लिए 3 चित्र में दिखाया गया है। हमने पाया है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से adenoviral संक्रमण के 24 घंटा के भीतर स्पष्ट हो गया था, और 48 घंटा (चित्रा 3) के भीतर परीक्षण प्रोटीन के लिए अधिक से अधिक था। 100 के एक वायरल MOI लगभग 100% inf में हुईसेलुलर विषाक्तता का कोई सबूत के साथ ection दक्षता। इसके विपरीत, लिपिड आधारित अभिकर्मकों का उपयोग अभिकर्मक वयस्क SAMs में किसी भी detectable जीन स्थानांतरण में उत्पादन करने के लिए, 72 घंटा 9 के बाद भी असफल रहा।

पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के माध्यम से कार्यात्मक विशेषताओं दोनों तीव्रता से अलग और सुसंस्कृत SAMs। चित्रा -4 ए के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है amphotericin छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग विन्यास का उपयोग तीव्रता से पृथक या सुसंस्कृत SAMs से दर्ज सहज कार्रवाई की क्षमता के विशिष्ट वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग से पता चलता है। संभावित कार्रवाई waveforms तीव्रता से अलग और सुसंस्कृत SAMs में इसी तरह के थे और वहाँ औसत एपी फायरिंग दर (चित्रा 4 बी) में कोई अंतर नहीं था।

मैं SAMs और HCN4 चैनलों कि मैं उत्पादन की एक बानगी sinoatrial नोड के Immunocytochemical मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। इसलिए जनसंपर्कपैच दबाना रिकॉर्डिंग में मैं की esence विचार है कि कोशिकाओं तथ्य यह है SAMs में हैं समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अनायास सक्रिय तीव्र और सुसंस्कृत SAMs के सभी वर्णित इस के साथ साथ यह भी -120 एम वी के लिए एक 1 सेकंड वोल्टेज कदम के जवाब में मैं च> 100 पीए का प्रदर्शन किया। यहाँ दिखाया प्रतिनिधि परिणामों के लिए, कोशिकाओं 1 मिमी BaCl 2 युक्त + K धाराओं (3 टेबल) और मैं की सक्रियता का वोल्टेज निर्भरता को ब्लॉक करने के -60 से -160 को 3 सेकंड hyperpolarizing वोल्टेज कदम से यत्न किया गया था Tyrode समाधान के साथ perfused थे -50 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से एम वी, जैसा कि हम पहले से 5-8 का वर्णन किया है। वर्तमान घनत्व -50 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से 3 सेकंड hyperpolarizing परीक्षण -150 एम वी दालों के जवाब में मूल्यांकन किया गया था। वहाँ या तो या मैं की सक्रियता के एफ की वोल्टेज निर्भरता मैं तीव्रता से अलग और सुसंस्कृत SAMs (चित्रा 4 के बीच वर्तमान घनत्व में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थेसी - डी)। सहज ए पी एस के सह-ये रिकॉर्डिंग और मैं व्यक्तिगत SAMs से कुल में लगभग 9 मिनट (एक 2 मिनट प्रारंभिक धोने सहित, वर्तमान दबाना मोड में सहज ए पी एस के 30-60 सेकंड, एक 2 मिनट समाधान परिवर्तन की आवश्यकता होती है, और लगभग 5 मिनट मैं एफ) की सक्रियता का वोल्टेज-निर्भरता का वर्णन करने के लिए पर्याप्त वोल्टेज दबाना डेटा इकट्ठा। इसलिए चित्रा 4C में दिखाया गया डेटा भी सेल तैयारी की मजबूती को दर्शाते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: अलगाव और माउस SAMs की हदबंदी के लिए विच्छेदन उपकरणों (ए) मैं दो 10 सेमी पेट्री 25 मिलीलीटर ठीक हो सिलिकॉन elastomer युक्त ~ व्यंजन।।। प्रत्येक पकवान 35 और में पूरा Tyrode के आयोजन के लिए ऊतक immobilizing के लिए 6-10 छोटे विच्छेदन पिन के साथ preloaded है। द्वितीय। 100 मिलीलीटर बीकर# 176;।।। सेल्सियस पानी के स्नान III वाइड (~ 2 मिमी व्यास), आग पॉलिश हदबंदी पिपेट चतुर्थ संकीर्ण (~ 1.5 मिमी व्यास) आग पॉलिश हस्तांतरण पिपेट वी पूरा Tyrode के साथ साथ स्नान की तैयारी के लिए प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट।।। हेपरिन। vi। आत्म खोलने आंतरिक काटने प्रक्रियाओं के लिए माइक्रो कैंची। VII। ठीक संदंश (टिप आकार 0.06 x 0.02 मिमी) आंतरिक ऊतक हेरफेर के लिए। आठवीं। ऊतक संदंश, में 5.5, 1 एक्स 2 बाहरी ऊतक हेरफेर के लिए दांत। IX। घुमावदार परितारिका कैंची काटने बाहरी प्रक्रियाओं के लिए 4.3। (बी) के ऊपर बंद तस्वीर विच्छेदन डिश में रखा छोटे विच्छेदन पिन पर प्रकाश डाला। (सी) बंद हुआ तस्वीर पर प्रकाश डाला आग पॉलिश संकीर्ण हस्तांतरण पिपेट (बाएं) और यांत्रिक विचूर्णन (दाएं)। के लिए आग पॉलिश चौड़े मुँह पिपेट कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा versio देखने के लिएयह आंकड़ा के एन।

चित्र 2
चित्रा 2: तीव्रता से अलग-थलग और सुसंस्कृत SAMs आकृति विज्ञान पृथक कर रहे हैं एक:। प्रतिनिधि SAMs के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों या तो तुरंत अलगाव (तीव्र) के बाद या 24 घंटा, 48 घंटा, 72 घंटा, 96 घंटा, या इन विट्रो में 6 दिनों के बाद बी - डी : औसत (± SEM) अधिकतम लंबाई, तीव्रता से 48 घंटा बनाम पृथक सुसंस्कृत SAMs ई के लिए चौड़ाई और पार के अनुभागीय क्षेत्र। पौंड (SEM ±) तीव्रता से पृथक या सुसंस्कृत SAMs से वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग से झिल्ली समाई। तीव्र p> 0.05 बनाम: सभी तुलना महत्वपूर्ण नहीं हैं। संदर्भ 9 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3:। सुसंस्कृत SAMs उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिनिधि सुसंस्कृत SAMs की epifluorescent छवियों में exogenous प्रोटीन है कि EGFP (हरा) और mCherry (लाल) व्यक्त adenoviruses के लिए 100 के एक MOI में संक्रमित किया गया है की adenoviral अभिव्यक्ति है, या तो 24 या 48 घंटे के बाद डबल संक्रमण। स्केल बार = 20 माइक्रोन। संदर्भ 9 से reproduced।

चित्रा 4
चित्रा 4: 1 एनएम isoproterenol युक्त Tyrode समाधान में तीव्रता से पृथक (काला) से प्रतिनिधि वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग या संवर्धित (ग्रे) Sams:। सुसंस्कृत SAMs के electrophysiological लक्षण वर्णन। स्केल सलाखों: 40 एम वी, 100 मिसे बी:। औसत (± SEM) तात्कालिकतीव्रता से अलग-थलग में आवृत्ति फायरिंग (काला, एन = 6) या 48 घंटा सुसंस्कृत (ग्रे, n = 14) SAMs सी:। सामान्यीकृत औसत (SEM ±) मैं के लिए प्रवाहकत्त्व वोल्टेज रिश्तों तीव्रता से अलग-थलग में (काला, n = 8) या संवर्धित (ग्रे, n = 14) SAMs Insets:।। तीव्र (काला) या संवर्धित (ग्रे) Sams 10 एम वी वेतन वृद्धि में -60 से -160 एम वी 3 सेकंड hyperpolarizing परीक्षण दालों द्वारा हासिल प्रतिनिधि से वर्तमान परिवारों डी: औसत ( ± SEM) तीव्रता से पृथक (काले रंग में -150 एम वी पर मैं वर्तमान घनत्व, एन = 7) और सुसंस्कृत (ग्रे, n = 8) SAMs। संदर्भ 9 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरा टीyrode की कम सीए 2/2 मिलीग्राम + Tyrode की KB मझौले बीएसए समाधान NaCl / 2 CaCl अनुकूलन समाधान
NaCl 140 140 140 10
KCl 5.4 5.4 25 5.4
के.एच. 2 4 पीओ 1.2 1.2 10 1.2
HEPES 5 5 5 5
शर्करा 5.55 18.5 20 5.55
2 MgCl 1 1
2 CaCl 1.8 0.066 1.8 1.8
बैल की तरह 50 20
बीएसए 1 मिलीग्राम / एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल
कश्मीर ग्लूटामेट 100
कश्मीर aspartate 10
MgSO 4 2
creatine 5
EGTA 0.5
पीएच को समायोजित NaOH के साथ 7.4 NaOH के साथ 6.9 KOH के साथ 7.2 NaOH के साथ 7.4

तालिका 1:। हदबंदी समाधान sinoatrial नोड myocytes की हदबंदी में इस्तेमाल समाधान की रचनाएँ। सांद्रता जहां उल्लिखित को छोड़कर मिमी में दिया जाता है।

चढ़ाना मझौले संस्कृति के माध्यम
Media199 आधार आधार
2,3-butanedione monoxime (BDM) 10 मिमी 10 मिमी
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5% -
गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर
इंसुलिन 10 माइक्रोग्राम / एमएल
transferrin 5.5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
सेलेनियम 5 एनजी / एमएल
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल 100 यू / एमएल
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर

तालिका 2: चढ़ाना और संस्कृति समाधान चढ़ाना और sinoatrial नोड myocytes की संस्कृति के लिए इस्तेमाल समाधान की रचनाएँ।।

tyrode की पीपी Intracellular
NaCl 140 5
KCl 5.4 135
के.एच. 2 4 पीओ 1.2
HEPES 5 10
शर्करा 5.55
2 MgCl 1 1
2 CaCl 1.8 0.1
EGTA 10
मिलीग्राम एटीपी 4
Amphotericin-बी 200 माइक्रोग्राम / एमएल जरूरत के रूप में
isoproterenol 1 एनएम जरूरत के रूप में
पीएच को समायोजित NaOH के साथ 7.4 KOH के साथ 7.2

तालिका 3: इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग समाधान कोशिकी की रचनाओं (Tyrode) और intracellular (पीपी) sinoatrial नोड myocytes से amphotericin छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल समाधान।।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पत्र अलगाव और वयस्क चूहों से पूरी तरह से अलग-अलग sinoatrial नोड myocytes की संस्कृति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। अलगाव प्रोटोकॉल मज़बूती से अनायास सक्रिय माउस या तो तत्काल electrophysiological विश्लेषण या बाद में संस्कृति के लिए उपयुक्त SAMs पैदा करता है। इसी तरह के प्रोटोकॉल (उदाहरण के लिए, संदर्भ देखें 11,12,10,13-17) कई अन्य समूहों द्वारा सूचित किया गया है। हालांकि, इन विट्रो में वयस्क माउस SAMs बनाए रखने के लिए हमारे प्रोटोकॉल विशेषता आकृति विज्ञान, सहज गतिविधि, और कोशिकाओं की electrophysiological गुण बरकरार रखता है और प्रोटीन 9 के adenoviral प्रसव के लिए अनुमति देता है।

संशोधन और प्रोटोकॉल के निवारण के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम ध्यान दिया जाना चाहिए। पहला महत्वपूर्ण कारक पचाने एंजाइमों (1.4 कदम), जो नाटकीय रूप से नंबर और Sams की गुणवत्ता को बदल सकते हैं की गतिविधि में एक महत्वपूर्ण बहुत कुछ करने वाली बहुत परिवर्तनशीलता एक दिया prepar में अलग हैसमझना। इस परिवर्तनशीलता elastase, जो आम तौर पर बहुत-विशिष्ट अनुकूलन, जिसमें एकाग्रता और जोखिम बार कई तैयारियों के कोर्स (अक्सर समानांतर में किया) पर bracketing किया जाना चाहिए सेल नंबर और स्वास्थ्य को अधिकतम करने की आवश्यकता है के लिए विशेष रूप से सच है। विभिन्न प्रजातियों से SAMs के अलगाव के लिए कुछ प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटोकॉल में कोलैजिनेज़-प्रोटीज एंजाइम मिश्रण के बजाय अलग-अलग collagenase और प्रोटीज एंजाइमों का उपयोग करें। हालांकि, इन एंजाइमों से प्रत्येक के लिए बहुत कुछ करने वाली बहुत परिवर्तनशीलता, काफी उच्च (elastase के समान है) के सह-अनुकूलन के बार-बार चक्कर लगाने की जरूरत महसूस। एंजाइम मिश्रण बहुत सारे भर में और अधिक स्थिरता प्रदान करता है और कम अनुकूलन कदम की आवश्यकता है।

एक दूसरा महत्वपूर्ण है, और unobvious, सैम अलगाव के निवारण के लिए कारक आग पॉलिश कांच हदबंदी पिपेट (चित्रा 1 सी) की अखंडता है। पिपेट के रिम किसी भी तेज किनारों, दरारें या संचित सी होता है तोellular मलबे, यांत्रिक विचूर्णन कदम है, कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है कैल्शियम विषाक्तता में जिसके परिणामस्वरूप। आग पॉलिश हदबंदी पिपेट प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए नियमित रूप से उपयोग के 2 महीने कम से कम हर, या किसी भी समय है कि सेल उपज या गुणवत्ता कई तैयारी के पाठ्यक्रम पर स्पष्ट रूप से गिरावट आती है।

समय और यांत्रिक हदबंदी के बल अलगाव प्रोटोकॉल के निवारण के लिए एक तिहाई महत्वपूर्ण कदम है। विचूर्णन धीमी गति से (लगभग 0.5-1 हर्ट्ज), लेकिन 5-10 मिनट के लिए सशक्त अशांति की आवश्यकता है। तेजी दरों और कम समय के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह बुलबुले शुरू करने या समाधान में झाग पैदा करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। जब sinoatrial नोड नमूने पूरी तरह से अलग कर दिया गया है, शेष ऊतक स्ट्रिप्स wispy और सफेद रंग में दिखाई देनी चाहिए; सूक्ष्म गुलाबी रंग-ish अधूरा विचूर्णन इंगित करता है। जब 200-400X बढ़ाई जांच की, बेहतर तैयार नमूनों से कोशिकाओं, चिकनी कोशिका झिल्ली है सेल memb जबकिओवर-पच या अधिक triturated नमूनों से Ranes एक cratered और धारीदार भूमिका है। स्वस्थ कोशिकाओं में, संकुचन कोशिकाओं के सिरों के रूप में मुख्य रूप सूक्ष्म हिल मनाया जाता है। संकुचन की लहरें क्षतिग्रस्त कोशिकाओं है, जो डांट लगाई-अप से पहले थोड़े समय के लिए सख्ती अनुबंध करने के लिए मनाया जा सकता है की एक संकेत कर रहे हैं। एक फटा हदबंदी पिपेट ऐसी कोशिका क्षति का सबसे आम कारण है। नमूने है कि अंडर पचा या के तहत triturated किया गया है, कोशिकाओं गुच्छों के रूप में मौजूद हैं या एकल कक्षों के बजाय समुच्चय, और करार SAMs की बड़ी संख्या शेष ऊतक मात्रा में मनाया जा सकता है।

प्रत्येक उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत रूप से हदबंदी का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगी। हालांकि enzymatic पाचन और यांत्रिक हदबंदी बार दोनों समायोजित किया जाना चाहिए, यह शुरू में स्थिर रखने के लिए enzymatic पाचन समय जबकि हदबंदी समय को संशोधित करने की सिफारिश की है। अतिरिक्त ट्यूनिंग ठीक उपयोगकर्ता की एक पहचान करने की क्षमता पर निर्भर करता है मुख्य रूप सेविचूर्णन के पूरा होने पर शेष ऊतक टुकड़े की ppearance - जब टुकड़े wispy और रंग में सफेद कर रहे हैं, तो विचूर्णन रोका जाना चाहिए। अनुकूलन भी sinoatrial नोड में बदलाव है कि उम्र, लिंग, या चूहों के तनाव में मतभेद के साथ समायोजित करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, बड़े पशुओं 7 से कोशिकाओं की हदबंदी दोनों enzymatic पाचन और यांत्रिक हदबंदी के समय में कमी की आवश्यकता है। एक सामान्य दिशानिर्देश, एक 2-3 महीने पुराने पुरुष C57BL / 6 माउस पैदावार मोटे तौर पर 50-200 व्यवहार्य SAMs से एक ठेठ तैयारी है, जो शायद 5-10 सफलतापूर्वक पैच-clamped, एक अच्छा दिन के सत्र में प्रयोगों के आधार पर हो सकता है के रूप में । उपज में काफी (~ 30%) कम जब बड़े चूहों 7 उपयोग किया जाता है।

संस्कृति प्रोटोकॉल की सफलता भी कुछ महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर करता है। महत्वपूर्ण बात, एक प्राथमिक सेल संस्कृति की सफलता के रूप में ऊपर चर्चा की, एक उच्च गुणवत्ता वाले हदबंदी की आवश्यकता है। यह वीं की सिफारिश की हैतीव्रता से पृथक सेल तैयारी में संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रयास करने से पहले अनुकूलित किया। संवर्धित कोशिकाओं के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण कारक electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए कक्षों के चयन में निहित है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सुसंस्कृत रिकॉर्डिंग के लिए चयनित किया SAMs तुरंत BDM युक्त मध्यम संस्कृति के वार्शआउट पर सहज संकुचन प्रदर्शन करना चाहिए। BDM के बाहर धोने पर सहज संकुचन की एक धीमी शुरुआत अस्वस्थ कोशिकाओं का एक संकेत है।

सैम संस्कृति प्रणाली कुछ सीमाएं, माउस सैन की सबसे विशेष रूप से बहुत छोटे आकार है। तरीकों का प्रदर्शन यहां electrophysiological और इमेजिंग अध्ययन के लिए पर्याप्त सेल नंबर के लिए अनुमति देते हैं, वहीं ऊतक की सीमित मात्रा सुसंस्कृत SAMs की जैव रासायनिक विश्लेषण अलग करता है। तकनीक की एक और सीमा SAMs प्रतिवर्ती मायोसिन ATPase अवरोध, BDM की उपस्थिति में सुसंस्कृत होना चाहिए। यह एक संभावित चिंता का विषय है क्योंकि BDM सहित अन्य सेलुलर प्रभाव है,गैर विशिष्ट फॉस्फेट गतिविधि, हृदय प्रतिलेखन के निषेध 19 कारक है, और सोडियम चैनल, कैल्शियम चैनलों और ryanodine रिसेप्टर्स 20 का निषेध। हालांकि, डेटा कि BDM SAMs की रूपात्मक और electrophysiological गुण यहाँ यत्न पर कम से कम असर पड़ता दिखा।

भविष्य अनुप्रयोगों में, यह संभावना है कि यहाँ उल्लिखित तरीकों बड़ा स्तनधारियों से Sam संस्कृतियों तैयार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। adenoviral जीन स्थानांतरण के साथ संयोजन में, इस तरह संस्कृतियों बड़े पशु मॉडल में pacemaking की आनुवंशिक जोड़तोड़ अनुमति दे सकता है। ब्याज की प्रोटीन को पेश करने की क्षमता भी भविष्य अनुप्रयोगों में जो आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवाददाता अणुओं SAMs में intracellular संकेत दे रास्ते की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgruard/Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes Fisher Scientific 352059
Large, round bottomed culture tubes Corning 14-959-11B
Elastase Worthington Biochemical LS002279
Liberase TM Roche 5401119001 Tissue dissociation solution
Heparin SAGENT Pharmaceuticals  NDC 25021-400-10
Mouse Laminin Corning CB-354232
12 mm round glass coverslips Fisher  12-545-80
24-well culture plate Fisher 08-772-1
Ad-mCherry Vector Biolabs 1767
Ad-eGFP Vector Biolabs 1060
Plastic, disposable transfer pipette Fisher Scientific
Micro scissors Fisher Scientific 17-467-496
Dumont #4 Forceps Roboz Instruments RS-4904
Tissue Forceps Roboz Instruments RS-8164
Dissecting Iris Scissors WPI, Inc. 501264
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
NaCl Sigma 71376
KCl Sigma 60128
KH2PO4 Sigma 60353
HEPES Sigma 54457
glucose Sigma G0350500
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C1016
taurine Sigma T0625
BSA Sigma A2153
K-glutamate Sigma G1501
K-aspartate Sigma A6558
MgSO4 Sigma M7506
creatine Sigma C0780
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
Amphotericin-B Fisher Scientific 1397-89-3
Isoproterenol Calbiochem 420355
Media199 Sigma M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM) Sigma B0753
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A5611
Insulin   Sigma I3146
Transferrin Sigma I3146
Selenium Sigma I3146
Penicillin GE Healthcare SV30010
Streptomycin Hyclone SV30010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16, (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88, (3), 919-982 (2008).
  4. Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47, (2), 157-170 (2009).
  5. Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136, (3), 247-258 (2010).
  6. Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5, (2), 115-119 (2011).
  7. Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110, (44), 18011-18016 (2013).
  8. St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7, (4), 318-321 (2013).
  9. St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2015).
  10. Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286, (5), H1757-H1766 (2004).
  11. Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52, (1), 51-64 (2001).
  12. Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550, (Pt 1), 169-180 (2003).
  13. Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286, (5), H1970-H1977 (2004).
  14. Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101, (12), 1274-1282 (2007).
  15. Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7, (10), e47652 (2012).
  16. Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8, (11), e81633 (2013).
  17. Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  18. Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428, (1), 405-424 (1990).
  19. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, (1), 61-72 (2001).
  20. Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66, (3), 708-717 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics