L'isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University
Published 12/14/2016
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Immunology and Infection

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Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

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Abstract

La caractéristique de l'immunité humorale est de générer ASCs fonctionnels qui synthétisent et sécrètent Ab spécifique à un antigène (Ag), par exemple un agent pathogène, et sont utilisés pour la défense de l'hôte. Pour la détermination quantitative de l'état fonctionnel de la réponse immunitaire humorale d'un individu, à la fois sérique et d'ABS ASCs de circulation sont généralement mesurés comme des lectures fonctionnelles. Chez l'être humain, le sang périphérique est l'échantillon le plus commode et facilement accessible, qui peut être utilisé pour la détermination de la réponse immunitaire humorale induite par les cellules hôtes B. sous-ensembles distincts de lymphocytes B, y compris les ASC, peuvent être isolés directement à partir du sang périphérique par sélection avec des microbilles conjuguées à Ab spécifique à la lignée ou par tri cellulaire par cytométrie de flux. De plus, les cellules B naïves et mémoire purifiés peuvent être activées et différenciées en ASCs en culture. Les activités fonctionnelles des ASC pour contribuer à la sécrétion Ab peuvent être quantifiés par ELISpot, qui est un essai enzyme qui convergetest de immunoabsorbance lié en (ELISA) et les technologies de transfert de Western pour permettre l'énumération des ASCs individuelles au niveau d'une seule cellule. En pratique, le test ELISpot a été de plus en plus utilisé pour évaluer l'efficacité du vaccin à cause de la facilité de manipulation d'un grand nombre d'échantillons de sang. Les procédés d'isolement des cellules B humaines à partir de sang périphérique, de la différenciation des cellules B en ASCs in vitro, ainsi que l'emploi d' un test ELISPOT pour la quantification du nombre total IgM et IgG ASCs seront décrites ici.

Introduction

les cellules B jouent un rôle central dans le développement de l'immunité humorale. Ils se développent d'abord dans la moelle osseuse et entrent dans la circulation sanguine sous forme de cellules B naïves, qui peuvent migrer dans les tissus lymphoïdes, tels que la rate, les ganglions lymphatiques et amygdales, pour un développement ultérieur. Après Ag rencontre, certaines cellules B naïves migrent dans les follicules lymphoïdes, où les cellules du centre germinatif B peuvent se différencier en cellules de mémoire B et plasmoblastes (PBS) / cellules plasmatiques (PC). Alors que la plupart du PBS / PC de sortie dans le flux de sang, quelques éventuellement résident dans la moelle osseuse à subir une différenciation terminale dans les PC à long terme 1. Les cellules B en circulation sont hétérogènes, et à l' état d' équilibre, PB / PC sont rares dans le sang périphérique 2. En raison de la disponibilité de marqueurs de surface spécifiques à la lignée, la cytométrie de flux est devenue une méthode populaire pour l'identification et la caractérisation des sous-ensembles de cellules B dans le sang périphérique. Une application prolongée de cytometr de fluxy est l'addition d'une fonction de tri de cellules, ce qui permet la séparation et l'isolement des sous-ensembles individuels de cellules B avec une pureté élevée. Sur la base de l'expression de récepteurs de surface spécifiques à différents stades de développement, des cellules B humaines en circulation sont généralement classés en trois sous - populations principales: les cellules B naïves (CD19 + CD27 - CD38 -), de cellules B à mémoire (CD19 + CD27 + CD38 -), et PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figure 1). Les cellules B naïves, par nature, ne sont pas rencontrées Ags. Cependant, ils peuvent être différenciées en cellules IgM + CD27 + B mémoire. Bien que les cellules B naïves sont homogènes en exprimant le récepteur de l' antigène des lymphocytes B (BCR) -Associated molécules (par exemple, CD19, CD20 et CD22) , ils sont hétérogènes dans leur répertoire d' immunoglobulines 5. La majorité des cellules CD27 + B mémoires peuvent être différenciées en CD27+ / CD38 + salut PB / PC 6. En outre, les cellules B mémoires et PB / PC sont polyclonaux et présentent une hétérogénéité de développement et fonctionnelle 4-7. PB / PC en circulation sont normalement de courte durée et n'expriment CD138, mais celles faites à installer dans la moelle osseuse sera terminale différencier et de devenir à long terme. Terminally PC différenciées expriment CD138 et régulent les molécules de CD27 sur leurs surfaces 8. Étant donné que PB et PC sont capables de sécréter Abs, dans de nombreuses occasions, ils sont collectivement désignées comme ASCs. En revanche, ni les cellules B naïves ni les cellules B mémoires peuvent produire des quantités appréciables de Abs 9-10. Néanmoins, lorsqu'il est isolé, les deux cellules B naïves et mémoires peuvent être différenciées en ASCs en 3 - 10 jours lorsqu'il est placé dans les conditions de culture appropriées 6, 11-15. En fait, ASCs dérivés d'actions in vitro de différenciation expressions de surface similaires de CD27 et CD38 avec ceux fr directement isoléle sang périphérique om 6. En outre, les ASCs différenciées in vitro expriment un faible niveau de CD20 de surface, comme celle de circulation PB / PC 6. Bien que les ASCs de culture dérivés sont de courte durée, ils peuvent sécrètent Abs, ce qui indique qu'ils sont fonctionnellement compétents et capables de contribuer à l'immunité humorale.

Les deux ELISA et ELISpot sont de loin les méthodes les plus couramment appliquées avec qui pour obtenir des informations fonctionnelles sur la réponse immunitaire humorale. ELISA est un test basé sur une plaque de 96 puits, et il est souvent utilisé pour mesurer les titres de sérum Abs Ag-spécifique et d' autres analytes (par exemple, des cytokines). Il est commode et évolutive. ELISA est conçu pour utiliser un dosage enzymatique en phase solide pour détecter la présence d'Ac ou d' autres substances, telles que le sérum, dans un échantillon liquide 16. Les lectures de tests ELISA sériques ont été largement utilisés pour représenter la réponse immunitaire du corps. Un outil nécessaire pour l'acquisition de readouts de dosages ELISA est un lecteur de microplaques spectrophotométrique. Le lecteur peut déterminer la densité optique (DO) des produits finaux résultant généralement de la réaction de la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à Abs de détection et de leurs substrats spécifiques 17. En ce qui concerne le rapport de la réponse immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA indiquent le collectif, mais pas individuelle, le rendement de l'ASC dans le corps. En outre, ELISA ne tient pas compte de la participation par les cellules B de mémoire, qui ne sécrètent pas Abs.

Comme ELISA, ELISpot est une méthode largement utilisée pour détecter et surveiller la réponse immunitaire dans des échantillons de sang périphérique 17-18. ELISpot est une technique liée à un ELISA en sandwich. Dans ce document, les cellules sont placées dans le difluorure de polyvinylidène (PVDF) puits de membranes-backed de microplaques de 96 puits pour une culture à court terme. Le test ELISPOT est analogue à effectuer un transfert de Western sur une microplaque et developing, les taches sur la membrane de (PVDF) dans chaque puits. Un système de lecteur ELISpot automatisé ou un stéréomicroscope pour le comptage manuel est nécessaire. Le principal avantage d'un test ELISPOT pour la détection d'une réponse immunitaire est sa sensibilité exceptionnelle à la quantification des ASC et des cellules sécrétant des cytokines. Il rend compte de leurs activités fonctionnelles dans l'immunité humorale et cellulaire, respectivement. Dans la mesure de la fonction immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA et le nombre de ASCs énumérés par ELISpot sont souvent corrélées, mais les lectures de données de ces deux essais ont des différences dans les implications fonctionnelles 19-20. Le principal avantage de ELISpot est sa sensibilité de la méthode. Le niveau de titres Ab sériques tel que rapporté par ELISA est présenté comme semi-quantitative des lectures de DO, indiquant le niveau Ab relative, ou plus quantitative, comme les lectures de concentration lorsqu'une quantité connue des isotypes appropriés de Abs est inclus pour référence. En revanche, les résultats d'un test ELISPOT sont presented comme le nombre absolu de ASCs dans un pool de cellules d'intérêt (par exemple, des cellules non fractionnées périphériques mononucléaires du sang (PBMC) et des cellules B purifiées à partir de PBMC). ELISpot peut détecter une seule ASC, mais nécessite des quantités ELISA Ab à partir ASCs pour atteindre des concentrations d'essai dépendant optimisées avant la mesure. Par conséquent, ELISpot est évidemment supérieure à ELISA de la sensibilité de la quantification. En outre, ELISpot est également adapté pour quantifier les ASCs différenciées in vitro à partir de cellules B à mémoire activés. les cellules mémoire B ne sécrètent pas Abs, mais peuvent se différencier en ASCs lors de l'activation; ils ont donc aucune contribution à Abs sériques détectés par ELISA. Ainsi, ELISpot est la méthode de choix pour la mesure de la réponse immunitaire des cellules circulantes B mémoires après son activation en culture. Elle permet la surveillance de l'entretien d'une immunité humorale à long terme.

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Protocol

le sang périphérique humain doit être obtenu à partir de donneurs sains en vertu du consentement éclairé, et l'utilisation d'échantillons de sang doivent être conformes aux lignes directrices approuvées établies par différents conseils d'examen institutionnels. Dans cette étude, le protocole à utiliser le sang humain dans une démonstration des résultats de cytométrie de flux (Figure 1) et des tests ELISpot (figure 3) a été approuvé par la Commission de révision interne de National Taiwan University Hospital (numéro de protocole 201307019RINB).

1. Isolement et purification des cellules de sang périphérique humain B

  1. Dessiner ~ 10 ml de sang de la veine médiane cubitale (dans le creux antérieur cubital du coude) dans un tube de 15 ml contenant du K2EDTA (1,5 à 2,0 mg / mL de sang) et inverser immédiatement le tube plusieurs fois pour empêcher un caillot formation.
  2. Ajouter 35 ml d'autoclave (121 ° C, 15 min) de globules rouges (RBC) de tampon de lyse (150 mM de NH4CI, 10 mM de KHCO 3 et 1 mM d' EDTA, pH 7,4) dans le tube contenant l'échantillon de sang frais (≥ 3: 1 volume / volume) et incuber à température ambiante (TA) pendant une durée de 5 min.
    NOTE: L'apparition de transmission de la lumière à travers le tube indique l'achèvement de RBC lyse.
  3. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Assurez-vous que la pastille est de couleur blanche.
  4. Remettre en suspension le culot avec 10 ml de sérum physiologique autoclavée tamponnée au phosphate (PBS, NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4 et 1,47 mM de KH 2 PO 4; pH 7,4) et centrifugation comme dans l' étape 1.3.
  5. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (supplément: 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, 0,25 pg / ml d'amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine), puis plaquer la cellules dans une boîte de culture de 10 cm (10 ml de sang par plat). Placer le récipient dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes.
  6. Remuer doucement la boîte de culture à quelques reprises et placer lemilieu de culture (cellules en suspension) dans des tubes coniques en matière plastique de 15 ml. Jeter les cellules adhérentes (principalement des macrophages) sur les boîtes de culture.
  7. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant.
  8. Remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu RPMI 1640. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé.
    REMARQUE: La viabilité des leucocytes isolés est normalement supérieure à 90% par exclusion au bleu trypan.
  9. Centrifugeuse à l' étape 1.7 , et de remettre en suspension les cellules dans ~ 200 pi de tampon PBS froid (0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d' EDTA) à la concentration de 5 - 10 x 10 6 cellules / ml.
  10. Ajouter 5 ul de cocktail biotinylée anti-humaine Ab spécifique aux cellules sanguines (pour la sélection négative des cellules B) pour 10 6 cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes 21.
    NOTE: Le cocktail Ab anti-humain doit comprendre au moins Abs spécifique à CD2 (ou CD3), CD14 et CD16.
  11. Ajouter un volume en excès de 10 foisde PBS stérile aux cellules, centrifuger à 600 g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
  12. Ajouter des quantités égales de microbilles de streptavidine conjugué (5 pi par 10 6 cellules) à la pastille et mélanger soigneusement.
  13. Incuber sur de la glace pendant 30 min dans un tube conique de 15 ml en matière plastique.
  14. Ajouter 2 mL de tampon PBS dans le tube.
  15. Placer le tube dans un support magnétique et incuber à température ambiante pendant 8 min. Les microbilles brunes progressivement fixer à la paroi du tube à côté de l'aimant 22.
  16. Avec le tube restant dans le support magnétique, transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube stérile de 15 ml 22.
  17. Répétez les étapes de 1,14 à 1,16, et de combiner les deux surnageants qui contiennent les cellules intactes B. Jeter les microbilles.
  18. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant.
  19. Reprendre le culot dans du milieu RPMI 1640 pour des expériences en aval.
    NOTE: En règle générale, 1 - 5 x 10 5 cellules B witha pureté supérieure à 95% par rapport à 10 ml de sang périphérique 23 peut être isolé.

2. Purification et séparation de la mémoire et de Naïf B Les cellules provenant des cellules isolées B

  1. Utiliser des cellules purifiées à partir de l'étape 1 et de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique.
  2. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de tampon PBS froid après centrifugation à 600 x g et à température ambiante pendant 5 min.
  3. Ajouter 1 - 2 pg de mAb biotinylé de CD27 par 10 6 cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes.
  4. Ajouter 10 ml de tampon PBS au tube et centrifuger à 600 g pendant 5 min.
  5. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ul de tampon PBS.
  6. Ajouter des quantités égales de microbilles magnétiques de streptavidine (1 - 2 ng / 10 6 cellules) à des cellules dans un tube conique de 15 ml en matière plastique.
  7. Bien mélanger délicatement et incuber sur de la glace pendant 30 min.
  8. Ajouter 2 - 3 ml de tampon PBS au tube.
  9. Placer letube dans un support magnétique et incuber à température ambiante pendant 8 min pour permettre aux microbilles brunes pour fixer sur le côté le plus proche de l'aimant.
  10. Avec le tube dans le support magnétique, transférer soigneusement la fraction de surnageant dans un nouveau tube stérile. Cette fraction contient le CD27 enrichi - cellules B naïves.
  11. Ajouter 5 mL dans le tube contenant les microbilles et resuspendre doucement les microbilles (ie, la fraction enrichie de cellules CD27 + B mémoire) 24-25.
  12. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Resuspendre les pellets avec RPMI 1640 pour les expériences en aval.
    NOTE: En règle générale, ~ 30 - 60% des cellules B peut être purifié en tant que cellules de mémoire CD27 + à partir des PBMC d'un donneur sain 7, 25-26.

3. tri cellulaire pour la collecte de cellules Naïf B, cellules mémoire B et PB / PC

  1. En utilisant les cellules purifiées à partir de l'étape 1, de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hemocytometer ou un compteur de cellules automatique.
  2. Remettre en suspension les cellules dans du tampon PBS froid à la concentration de 10 7 par ml dans un tube en polystyrène de 5 ml.
  3. Ajouter 1 - 2 pg d'IgG humaine par 10 6 cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes pour le bloc Fc.
  4. Ajouter 1 pg de chacun des anticorps anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) et anti-CD38-PE (clone: HIT2) pour 10 6 cellules; bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 min 4, 27.
  5. Dans les 5 dernières minutes à l'étape 3.4, ajouter 5 pi du commerce 7-aminoactinomycine D (7-AAD).
  6. Ajouter 2 mL de PBS dans le tube, vortex et centrifuger à 600 xg pendant 5 min.
  7. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de tri (PBS stérile avec 2% de BSA et 2 mM d' EDTA) à une concentration de 1 - 5 x 10 7 cellules par mL dans un tube de 15 ml.
  8. Filtrer les cellules à travers un tamis de maille de nylon (40 um de taille des pores) pour éliminer les amas de cellules.
  9. Séparer les cellules avec une sorte cytométriqueer équipé de trois lasers: violet (405 nm), bleu (488 nm) et rouge (640 nm).
    NOTE: Seul le laser bleu est suffisant pour 3 couleurs cytométrie en flux 27-28.
  10. Trier les cellules en trois tubes de 15 ml (contenant 5 ml de milieu RPMI) pour la collecte simultanée des cellules B naïves (CD19 + CD27 -), les cellules mémoire B (CD19 + CD27 +) et PB / PC (CD19 + CD27 + / CD38 + salut) 3-4, 28.
    NOTE: les cellules B naïves et mémoire de classement peuvent être cultivées comme décrit à l'étape 4.

4. In Vitro Différenciation des cellules isolées CD19 Human + B, CD19 + CD27 + cellules mémoire B et CD19 + CD27 - Naïf B Cellules

  1. En utilisant les cellules purifiées dans les étapes 1.19, 2.10, 2.11 et 3.10, déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique.
  2. Resuspendre les cellules avec du milieu RPMI 1640à une concentration de 1 - 10 x 10 5 par ml et aliquote les dans les puits d'une plaque de 12 puits.
  3. Ajouter CpG (ODN 2006) à 5 ug / 10 6 cellules / mL 18, 29.
  4. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 pendant 5 jours.
  5. Récolter les cellules de chaque puits, placez-les séparément dans des tubes de 15 ml, ajouter 5 ml de PBS à chaque tube et centrifuger les à 600 xg et RT pendant 5 min.
  6. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 - 10 x 10 5 par ml avec du milieu RPMI 1640.

5. ELISpot Assay

  1. Ajouter 30 ul de 35% d'éthanol dans de l'eau distillée à chaque puits des plaques ELISpot à 30 s.
    NOTE: Lorsque pipetage, évitez de toucher la membrane dans les puits en tout temps.
  2. Inversez les plaques ELISpot pour éliminer l'éthanol.
  3. Mettez 150 pi de ddH autoclavé 2 O dans chaque puits et incuberelles à température ambiante pendant 5 min pour rincer de l'éthanol résiduel; suivre avec un lavage de PBS stérile à température ambiante pendant 3 min.
    REMARQUE: Les étapes 05.01 à 05.03 peut être en option, en fonction de la fabrication des plaques.
  4. Mettre 50 pl de 5 pg / ml polyclonale F (ab ') 2 fragment d'anticorps anti-Ig humaine (IgG + IgM + IgA) (dans du PBS) dans chaque puits des plaques ELISpot et de les incuber à 4 ° C pendant la nuit ( de préférence) ou 37 ° C pendant 2 h 11.
    NOTE: Sceller les bords des plaques avec du Parafilm jusqu'à utilisation.
  5. Inversez les plaques pour éliminer Abs non liée, ajouter 200 ul de PBS à chaque puits et incuber deux fois à température ambiante pendant 3 min à chaque fois.
  6. Ajouter 200 ul de PBS avec 5% de BSA (ou le milieu RPMI 1640) à chaque puits pour bloquer, et incuber à température ambiante pendant 2 h.
  7. Inversez les plaques pour enlever le tampon de blocage. Laver chaque puits deux fois avec 200 ul de PBS, comme dans l'étape 5.5.
  8. Ajouter 100 ul de milieu RPMI 1640 à chaque puits et incuber à 37 ° C.
  9. Lorsque vous êtes prêt à ensemencer les cellules, inverser les plaques pour éliminer le milieu RPMI 1640.
  10. Semences de 100 pi (5 x 10 4), 50 ul (2,5 x 10 4), et 25 ul (1,25 x 10 4) des cellules ( à partir des étapes 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 et 4.6) dans les puits d'une plaque ELISpot. Avec RPMI 1640, porter le volume à 150 pl / puits.
    NOTE: Un minimum d'un ou deux 2 fois des dilutions en série pour l'étalement des cellules est recommandé.
  11. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO2 pendant 8-14 h 18. Évitez de déplacer les plaques pendant l'incubation.
  12. Inverser les plaques pour éliminer les cellules et le milieu RPMI 1640.
  13. Ajouter 200 pl / puits de PBS-T (PBS avec 0,05% de Tween 20) et incuber à température ambiante 5 fois, chaque fois pendant 3 min. Inversez la plaque pour enlever le tampon de lavage entre chacune des 5 lavages.
  14. Ajouter la phosphatase alcaline IgG de chèvre anti-humaine (AP), Abs Fcy spécifique (pour la détection des IgG, 1: 5000 dans du PBS-T) Ou de chèvre anti-humain IgM-AP, Fcμ Ab spécifique à un fragment (pour la détection des IgM, 1: 5000 dans du PBS-T) dans les puits désignés et incuber à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité.
  15. Laver chaque puits deux fois avec 200 ul de PBS, comme dans l'étape 5.5.
  16. Ajouter 50 ul / puits de tétrazolium (BCIP / NBT) solution de substrat de phosphate nitro bromochloroindolyl. taches de couleur pourpre apparaissent normalement en 5-15 min.
  17. Ajouter 100 pl / puits de ddH 2 O pour empêcher le développement excessif de taches.
  18. Rincer les plaques avec l'eau du robinet après le développement complet de toutes les taches.
  19. Retirez le dalot des plaques et leur permettre de sécher à l'air dans l'obscurité.
  20. Compter les taches en utilisant un lecteur de plaque automatique avec une unité acquisition d' image / d'analyse (par exemple, un scanner automatique ou manuellement via un microscope à dissection).
    NOTE: Les plaques peuvent être stockées à température ambiante dans l'obscurité et analysées plus tard.

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Representative Results

PBMC ont été appauvries en globules rouges et des cellules adhérentes (étapes 01.02 à 01.07). Une aliquote (2 x 10 6) des cellules ont été soumises à une analyse par cytométrie de flux pour illustrer les populations de cellules B naïves, les cellules B à mémoire, et le PBS / PC dans le sang périphérique (figure 1). Dans les CMSP de ce donneur, environ 10% des lymphocytes sont des cellules B CD19 +. Dans le compartiment des cellules B, le pourcentage de CD19 + CD27 - cellules B naïves était d' environ 50%. D'autre part, environ 50% des cellules B CD19 + étaient des cellules CD27 + mémoire B 7, 25-26. Il faut noter que les cellules CD27 + B à mémoire peuvent être en outre séparées par l'inclusion de 4 IgD. Le phénotype de circulation PB peut être mieux défini avec peu ou pas d' expression de surface de CD20 (CD19 + CD27 + / CD38 + CD20 salut lo / -) 2, 30-31. Pour exclure les cellules mortes, la 7-AADpeuvent être inclus dans la coloration des cellules (étape 3.5), et un terrain pour FSC contre 7-AAD permet pour déclencher la population de cellules vivantes (7-AAD -).

Les principales étapes du test ELISpot sont représentés sur la figure 2. À la fois des cellules B humaines purifiées et les cellules B mémoires CD19 + CD27 + sont cultivées en présence de CpG avec du milieu RPMI 1640 pendant 5 jours. Les cellules ont été récoltées pour le test ELISpot pour quantifier les ASCs nouvellement écloses. Si elle est présente, la pré-existante BPs isolée du sang périphérique va mourir dans 48 h 11. Le test ELISPOT a été réalisé, et les images ponctuelles acquises par un scanner automatique de plaque sont démontrées sur la figure 3. Les résultats de ELISpot typiquement montreront 50 - 200 IgM-ASCs de 10 4 B cellules traitées avec CpG pendant 5 jours, alors que le nombre d'IgG-ASCs est de 10 - 50 10 4 cellules 11.


Figure 1. Illustration de la stratégie Gating pour séparer les cellules Naïf B, les cellules mémoire B et PB dans la CMSP. (A) Les cellules (2 x 10 6) ont été colorées avec 2 pg de chacun de CD19-APC, CD27-eFluor450 et CD38-PE mAb (étape 3.4). Le compartiment des lymphocytes a été fermée (G1) sur le tracé de points pour la diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC). (B) doublets cellulaires, qui sont formées par deux cellules collées ensemble, ont été exclus (ceux G2 extérieur) sur la parcelle pour FSC-W (largeur) par rapport FSC-H (hauteur). (C) des cellules CD19 + B ont été bloqués comme G3 sur le terrain pour SSC-A (région) et CD19-APC. (D) Des cellules CD19 +, le tracé de points de paramètres CD27 et CD38 a montré des cellules naïves B (CD19 + CD27 -, Q1 et Q4), les cellules mémoire B (CD19 + CD27 +;Q2 et Q3) et PB (CD19 + CD27 + / CD38 + salut; G4, 0,6% de Q2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Illustrations des étapes clés de la ELISpot Assay. (A) mettre 50 pl / puits (5 pg / ml) de F (ab ') 2 fragment d'anticorps anti-Ig humaine (IgG + IgM + IgA) dans une plaque ELISpot pendant 2 h à 37 ° C ou pendant une nuit à 4 ° C (de préférence) (étape 5.4). Ensemencer les cellules dans les puits de la plaque ELISpot. Permettre aux ASCs de joindre à la membrane de PVDF et sécrètent Abs pour 8 - 14 h (étape 5.11). (B) Laver les cellules avec du PBS (avec 0,05% de Tween 20). (C) Ajouter la AP- ou HRP-conjdétection ugated Abs spécifique soit IgG ou IgM. (D) Laver l'Abs de détection qui sont non liés. (E) Développer les taches avec une solution de substrat d'AP ou HRP pour correspondre à la Abs de détection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. ELISpot Les résultats d'une plaque représentant. (A) cellules purifiées CD19 + B ont été placés dans trois puits adjacents (50.000 cellules dans le puits n ° 1, 25.000 cellules dans le puits n ° 2, et 12.500 cellules dans le puits n ° 3, respectivement) de la plaque ELISpot. Les cellules ont ensuite été cultivées dans du milieu RPMI 1640 pendant une nuit (~ 14 h). Le test ELISpot a été effectuée après avoir terminé la culture (étapes 5.12 à 5.18). Pour Analyze les résultats, la plaque ELISpot a été scannée pour acquérir des images par l'intermédiaire d'un analyseur automatique équipé du scanner et du logiciel. Cellules de mémoire (B) Purified CD19 + CD27 + (10 6 / ml) ont été cultivées en présence de 5 pg / ml de CpG pendant 5 jours. Les cellules ont été traitées comme dans (A) pour l'essai ELISPOT. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'isolement et la purification des cellules B du sang périphérique humain

Normalement, les globules rouges peuvent être efficacement éliminées par rompues et le tampon de lyse (étape 1.2). Il est important de ne pas laisser incuber les PBMC avec le tampon de lyse des globules rouges supérieure à 5 min, comme la viabilité des cellules peut être affectée par le chlorure d'ammonium. En variante, les globules rouges et les plaquettes peuvent être éliminés simultanément par le protocole suivant.

Mélanger du sang frais avec de l'acide citrate dextrose (ACD), un tampon (acide citrique 39 mM, citrate de sodium 75 mM, et mM de dextrose 135; pH 7,4) dans un rapport en volume de 9: 1, le sang à la mémoire tampon. Centrifuger à 250 g pendant 10 min à température ambiante. Faites attention à la formation de couches, indiquant la séparation. Aspirer et jeter la couche supérieure, qui contient les plaquettes et plasma riche en plaquettes (couleur jaune). Retirer la couche intermédiaire mince à l'interface, qui contient CMSP (i .e., La couche leucocytaire). Éviter la contamination des globules rouges dans la couche inférieure (dark couleur rouge). Ajouter un tampon de lyse à la CMSP pour éliminer les globules rouges résiduels, puis suivez les étapes 1.2 à 1.19.

Deux approches peuvent être utilisées pour isoler les cellules B à partir de PBMC: sélection positive et négative 21. La méthode de sélection négative (étapes 01.01 à 01.19) est utilisé pour obtenir des cellules B vierges, fonctionnels, sans Abs ou microbilles lié, pour des expériences en aval. Il est essentiel de prendre en compte lors de l'activation et / ou la différenciation des cellules B purifiées se produit dans la culture. Le problème est que les cellules purifiées par sélection positive peuvent être influencés par inadvertance par les microbilles mAb conjugués (0,2 à 5 pm de diamètre). mAb peuvent se lier à des récepteurs spécifiques sur les cellules B et pourrait donc réticuler récepteurs pour l'activation. De plus, les microbilles peuvent être endocytose par des cellules B par l'intermédiaire des récepteurs liés. Bien que biodégradables, les microbilles peuvent rester à l'intérieur des cellules pendant plus d'une semaine. Que ce soit la rétention des microbilles influenceront expéles résultats mentaux doit être déterminée empiriquement. Dans la purification des cellules B humaines par l' intermédiaire d'une sélection positive, anti-CD19 (clones: 4G7 ou HIB19) microbilles sont couramment utilisés parce que CD19 est largement exprimé tout au long des stades de développement des cellules B. La pureté des cellules B après la séparation peut être déterminée par cytométrie en flux avec un anticorps anti-CD19 mAb (clones: SJ25C1 ou LT19), qui reconnaissent des épitopes distincts de microbilles anti-CD19.

Purification et séparation de la mémoire et de Naïf cellules B à partir de cellules isolées B

CD27 est un marqueur de surface largement acceptée pour la mémoire humaine et B naïve cellule distinction 24. La molécule de CD27 appartient à la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFR). Parce que CD27 est exprimé sur la plupart des cellules B mémoires humaines, il est couramment utilisé pour les distinguer de CD27 - cellules B naïves. Cependant, parce que CD27 est également exprimé sur les lymphocytes T et les cellules NK, l'utilisation de l'anti-CD27 microbeads (clone: ​​O323) dans la sélection positive des cellules B mémoire nécessite une purification préalable des cellules B (étapes 01.01 à 01.19). Pour une vérification de la pureté après la séparation, les mAb spécifiques de CD27 humaine (clones: L128 ou LG.3A10) sont recommandées (étape 2.12). Parce que les cellules CD27 + B mémoire sont hétérogènes, des marqueurs de surface supplémentaires, tels que les IgD et FCRL4, peuvent être envisagées pour une séparation supplémentaire dans la cellule de tri 4, 7.

Tri cellulaire pour obtenir des cellules Naïf B, les cellules mémoire B et PB / PC

Parce que les cellules B expriment FcyRIIB, un bloc Fc (étape 3.3) est recommandée avant la coloration des cellules avec des mAb pour cytométrie en flux. Les fragments Fc de l'IgG humaine seule peut bloquer tout aussi bien que l'ensemble de l' IgG humaine à 1 pg / 10 6 cellules. CD32 mAb anti-humains (clones: 3D3 ou AT10) est une autre option pour le bloc Fc. Il faut noter que si FcyRIIB est un marqueur de surface à teindre dans les cellules B purifiées, l'anti-CD32 mAb sh fluorophore conjugué àould être ajouté à renoncer au bloc Fc, suivie d'une coloration avec d'autres mAb sans lavage PBS.

Pour trois couleurs cytométrie en flux, CD38-FITC (fluorescéine), CD27-PE (phycoérythrine), et CD19-APC (Allophycocyanin) sont une combinaison typique de fluorophores Néanmoins, si la trieuse de cytométrie de flux est équipé de trois lasers, tels que ceux de 405 nm à 488 nm et 640 nm, les chercheurs ont ensuite le luxe de choisir les fluorophores excités par différents lasers pour le tri cellulaire. Comme cela est illustré sur la figure 1, les cellules ont été colorées avec CD19-APC (clone: HIB19), CD27-eFluor450 (équivalent au bleu Pacifique, le clone: O323) et CD38-PE (clone: HB7) pour séparer les cellules B naïves, une mémoire les cellules B, et PBS. Il faut noter que certains chercheurs préfèrent l'inclusion de CD45 (clone: HI30) comme marqueur de lignée leucocytaire et les cellules B porte comme CD45 + CD19 + population. Parce que la détection de BPs en circulation à l'état d'équilibre est une veille rarent chez les individus sains, faibles ou même aucune expression de CD20 de surface sur PBS (CD19 + CD27 + / CD38 + CD20 salut lo / -) vient étayer leur existence de bonne foi 2, 30-31. Ceci est utile lorsque les résultats de quantification de PBS par phénotypes de surface et ASCs par des dosages ELISpot sont comparés. Au cours de la période antérieure à la cellule-tri, 7-AAD est préféré à l'iodure de propidium pour l'exclusion des cellules mortes, en raison de son spectre d'émission plus étroit et des retombées plus faible dans multicolore cytométrie en flux.

Stimulation in vitro et de la différenciation des cellules B humaines isolées

Le type B CpG (ODN 2006) seul peut induire une différenciation limitée des deux IgM et IgG-ASCs à partir de cellules B mémoires. De plus, les cellules B naïves ne sont que faiblement sensibles à CpG et donnent lieu à des IgM ASCs 6, 11 principalement. La concentration de CpG dans la culture est comprise dans l'intervalle de 2,5 à 5 pg / ml par 10 6 cellules Bou CMSP 11, 18. Autre que le CpG, les cellules PBMC et B purifiés peuvent être cultivées en présence de combinaisons de CpG avec les mitogenes, les cytokines et les agonistes BCR, pour différencier les cellules B humaines en culture dans ASCs (étape 4.3). Par exemple, couramment utilisés recettes pour 10 6 cellules par millilitre comprennent (a) CpG (5 ug / ml), de l' IL-2 (10 ng / mL) humaine recombinante et de l' IL-10 (10 ng / mL) humaine recombinante 15, 34; (b) CpG (5 ug / ml) et F (ab ') 2 d'Ig anti-humaine (IgG + IgM + IgA) (20 pg / ml) 11; (c) CpG (5 ug / ml), de la protéine A de S. aureus Cowan (SAC) (1: 10.000 dilution) et le mitogene pokeweed (PWM) (1: 100 000 dilution) 18; (d) humain recombinant de l' IL-21 (100 ng / ml) et de sCD40L recombinant (1 pg / mL) 12, 15, 33; et (e) recombinant humain IL-2 (10 ng / ml) et R848 (1 pg / ml), un agoniste du TLR7 33-34. Bien que les cellules B peuvent être différenciées en ASCs en trois jours 11, les cellules sont généralement pré-stimulated pendant 5 à 6 jours avant d'être ajouté à la plaque ELISpot pour la quantification de ASCs 11, 18. Au cours de la période de culture, il n'y a généralement pas de reconstitution des agents de différenciation de départ.

L'addition d'IL-2 et l' IL-10 à des cultures contenant du CpG peut augmenter de manière significative le nombre de différencier IgM et IgG-ASCs 15, 35. La présence d'IL-2 dans la culture peut fournir une stimulation mitogene pour faciliter l'expansion des cellules B différenciées par CpG. IL-10 dans l'intervalle de 10 à 25 ng / ml peut augmenter considérablement la production de ASCs (~ 3 à 10 fois) en présence de 35 CpG. Agonistes BCR, y compris les anti-BCR et SAC, et PWM peuvent également stimuler la prolifération des cellules B humaines primaires 18. Incubation des cellules B mémoires avec CpG et polyclonaux anti-BCR résulte principalement une augmentation de la IgM-ASCs mais pas dans les IgG-ASCs 28. Pour la prévention de l'inhibition de la signalisation par BCR par FcyRIIB, un F (ab &# 39;) 2 fragment d'anti-Ig (10 - 20 pg / ml par 10 6 cellules) est recommandée lors de la réticulation BCR 11. Au lieu d'anticorps polyclonaux anti-Ig, les mAb anti-BCR spécifiques soit des cellules IgM + IgG + ou B devraient être considérés comme des sous - ensembles pour cibler des cellules B spécifiques d' un isotype pour la différenciation en ASCs. Une combinaison de CpG, le SAC (1: 10 000 dilution) et MLI (1: 100 000 dilution) peut activer efficacement des cellules de mémoire B à se différencier en IgM et IgG-ASCs 18, 24. En outre, CpG peut modérément induire le changement de classe d'Ig in vitro 28-29. En revanche, l' IL-21 (100 ng / ml) et de sCD40L (1 pg / ml) induire efficacement la différenciation des cellules B mémoires exclusivement à commutation IgG ASCs 12, 30. Le sCD40L peut activer des cellules B en mimant l' aide des lymphocytes T par le CD40 sur les cellules B, influençant leur différenciation en PJ in vivo. Il convient de noter, anti-CD40 (clones: 89 ou G28.5) peut se substituer à sCD40L dans la culture 15. however, ni sCD40L, ni anti-CD40 seul est capable d'induire la différenciation des cellules B mémoires. Ainsi, l'activation de CD40 des cellules B cultivées est souvent combiné avec un agent de différenciation, comme l'IL-4, CpG, le R848, ou l'IL-21, dont l'un quelconque peut favoriser la commutation de classe d'Ig. IL-4 joue un rôle essentiel dans la différenciation des cellules Th2 CD4 +, ce qui permet l'induction de la plupart des cellules B IgM + pour basculer sur des cellules IgG1 + B dans la culture. De même, en présence d'IL-21, les cellules B de mémoire et les cellules B naïves se différencient uniquement dans ASCs de classe à commutation 12, 32. Comme CpG, R848 peut induire une commutation de classe marginale de cellules B 34. Enfin, il convient de mentionner que , bien que le lipopolysaccharide (LPS) peut effectivement induire la différenciation des cellules B de souris dans ASCs, les cellules B humaines expriment des niveaux faibles de TLR4 et CD14 29. Étant donné que l'addition d'un agent de différenciation en culture favorise la production de cellules B commutées, cette addition doit être évitéelorsque PB / PC pré-existants ou des cellules B mémoires non commutées sont à mesurer.

ELISpot Assay

Le test ELISPOT combine des tests ELISA à base de type plaque avec des technologies de transfert de Western à base de membrane, ce qui permet la détection d'Abs sécrété par une cellule B 18. Le ELISpot a également été adapté pour quantifier les cellules T Ag spécifiques qui sécrètent des cytokines 17, 36. Dans un test ELISpot, soit des cellules purifiées ou des PBMC non fractionnées (exempt de globules rouges) peuvent être utilisés. Cependant, ~ 10 fois plus CMSP sont nécessaires que les cellules purifiées pour obtenir des résultats cohérents dans des dosages ELISpot. Un bon point de départ est de 1 - 2 x 10 5 cellules par puits pour détecter les ASCs circulant dans les CMSP. La détection de l'Ag-spécifique ASLs anti-Ig est généralement remplacé par Ag (5-10 pg / ml dans du PBS) pour capturer Ag spécifique ACS (étape 5.4). L'utilisation de la détection Abs spécifiques isotype permet la distinction entre les IgM-ASCs Ag-spécifiques et IgG isotype-ASCs (étape 5.14). Il est à noter, que l'anti-Ig ou Ag sont utilisés pour capturer les ASC, les Ab de détection utilisés pour le test ELISA peut ne pas être toujours apte à ELISPOT. De même, tous les substrats de couleur pour ELISA fonctionnent pas correctement en ELISpot. AP- et Abs HRP conjugués sont les plus couramment utilisés pour la détection de place dans ELISpot. La solution de substrat BCIP / NBT est un choix populaire pour la détection à base d'AP, alors que 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et de 3-amino-9-ethylcarbazole solutions (AEC) sont des substrats communs pour HRP dans ELISPOT. Si l'AP ou HRP est directement conjugué à de l'ABS de détection, une seule étape est nécessaire pour la détection, tel que décrit dans le protocole (étape 5.14). En revanche, le système ABS de détection sont biotinylés et nécessitent une incubation qui a suivi avec AP- ou de la streptavidine conjuguée à HRP avant de réagir avec les substrats dans un procédé en deux étapes. Les deux méthodes en une seule étape et à deux étapes de travailler efficacement pour détecter les taches en ELISpot.

Le test ELISpot peut quantifier non seulement circulattion, mais aussi différenciée ASCs en culture (étape 1,19 contre 4,6). Si elle est présente, ASCs, qui vivent normalement pas plus de deux jours de culture en circulation, peut être directement cultivées dans la plaque ELISpot, avec ou sans purification à partir de PBMC 11. En revanche, la différenciation des cellules B à mémoire nécessite 5 jours. Par conséquent, la culture directe dans des plaques ELISpot après l'isolement cellulaire (étape 1.19) est déconseillée; les débris de cellules mortes résultant de la période de culture prolongée peut augmenter l'arrière-plan dans la détection de place. Au lieu de cela, les cellules B purifiées et les PBMC totales peuvent d'abord être mises en culture dans un 6 puits ou à 12 puits plaque en présence de mitogènes et des agents de différentiation (étape 4.3). Au cours du processus de culture, l'addition répétée d'agents de stimulation est nécessaire (étape 4.3). Alors que les plaques sont dans l'incubateur, la porte de l'incubateur doit être doucement ouvert et fermé pour empêcher ASCs ensemencées de se déplacer, car ils peuvent diffuser Abs sécrétées le long des pistes mobiles, générant des tachesavec des queues (les taches dites «comète») (étape 5.11). La période d'incubation dans des plaques ELISpot est déterminée par le temps nécessaire pour les cellules à sécréter des quantités détectables de Abs sans permettre aux cellules de se diviser, ce qui créerait des difficultés au comptant comptage. Ainsi, les cellules cultivées sont généralement dans la gamme de 8 h à une nuit (étape 5.11).

Le test ELISpot est la méthode la plus largement utilisée pour quantifier les réponses des cellules B mémoires. Il est devenu, une lecture populaire indépendante de la réponse immunitaire humorale et la mémoire immunologique. Dans la pratique, la culture mitogénique précédente est nécessaire pour activer les cellules B mémoires pour la différenciation en ASCs (étape 4.3). Cependant, la fréquence à laquelle les cellules B à mémoire se dilatent et se différencient en ASCs varie dans les différents milieux de culture, tel que décrit ci-dessus. Bien que l'absence de consensus, la plupart des chercheurs adoptent la condition d'induction qui peut maximiser la production de ASCs. En termes de l'agent utilisé pour la première place detection, un soluble biotinylé Ag peut remplacer la détection insatisfaisante Ab sans compromettre la sensibilité 37. Ceci est d'une importance particulière lorsque la disponibilité de l'Ag est limitée en raison d'une quantité beaucoup plus faible de l'Ag est nécessaire pour la détection que pour le revêtement des plaques. Enfin, ELISpot ne permet pas l'analyse phénotypique de l'hétérogénéité cellulaire, et nécessite de ce fait un fractionnement préalable de sous-populations de cellules. Récemment, un dosage ELISpot multicolore, dans lequel la détection d' ABS sont marqués avec des fluorophores différents, a été développé pour détecter plusieurs types de cellules sécrétant des cytokines dans un seul puits 38-39. Cette nouvelle technologie sera d'un intérêt particulier pour la détection de cellules à basse fréquence dans les CMSP et pour une analyse à grande échelle des réponses de lymphocytes B induits par le vaccin.

Parce que le test ELISpot est rapide et efficace dans la quantification ASCs et des cellules sécrétant des cytokines, il a été étendu pour mesurer la fonctionnalité de non seulement circuLating lymphocytes, mais aussi les cellules immunitaires des tissus tels que les leucocytes intrahépatiques 40. En raison de sa sensibilité pour atteindre le niveau de détection de même un seul ASC, le test ELISpot a été de plus en plus utilisé pour mesurer les réponses immunitaires humaines à des efficacités de vaccins contre les agents pathogènes existants et émergents. Bien que les performances à haut débit et la robustesse du test ELISpot sont superbes pour les évaluations à grande échelle des réponses immunitaires utilisant PBMC, les résultats des tests peuvent être influencés par divers facteurs, tels que le délai de traitement des échantillons, si les cellules sont fraîches ou congelées , des composants sériques dans le milieu de culture, et le nombre de cellules ajoutées à la plaque ELISpot 41. Ainsi, les procédures de normalisation devraient être inclus dans le protocole ELISpot pour minimiser les variations intra- et inter-dosage à grande échelle et des études de suivi longitudinal (par exemple, les essais de vaccins). La méthode de normalisation de la plaque de lecture est également critique pour la linéarité, la précision, et les inconvénientsistency dans l'essai résulte 41-42. Une façon d'effectuer la lecture plaque normalisation est d'étendre la procédure de dilution en série de cellules ensemencées sur des plaques ELISpot (étape 5.10). En créant une plaque de référence, plus des dilutions en série doivent démontrer une relation linéaire entre le nombre de cellules plaquées par puits et les comptages ponctuels par puits. balayages répétés de la plaque ELISpot peuvent être utilisées pour valider le modèle de la tache de comptage, à la fois automatiquement et manuellement. La variabilité intra-bien Minimal dans les comptages ponctuels est prévu après ces procédures de normalisation 43. Enfin, l'application de ELISpot peut être étendue à de nombreux égards, tels que le suivi des réponses au traitement de patients souffrant d' infections et prendre des immunothérapies cancéreuses, ainsi que pour l'évaluation des immunotoxiques (par exemple, l' immunosuppression et l' auto - immunité induite par un médicament).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

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