على المدى الطويل عالية الدقة حيوي داخلي المجهري في الرئة مع فراغ استقرت النافذة التصوير

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ورم خبيث في المواقع الثانوية مثل الرئة والكبد والعظام هو ذلك الحدث الأليم مع معدل وفيات ما يقرب من 90٪ 1. من هذه المواقع، والرئة هو الأكثر صعوبة في تقييم باستخدام التصوير الضوئي حيوي داخلي بسبب موقف المغلقة في داخل الجسم، والطبيعة الحساسة ودورها الحيوي في الحفاظ على وظائف الأعضاء السليم. في حين طرائق السريرية (التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي (CT)) قادرة على توفير صور موسع من هذا النسيج، أنها تفتقر إلى القرار اللازم لتصور الأحداث المبكرة بذر، مع بكسل واحد تتكون من ما يقرب من ألف الخلايا. النماذج الحالية من الرئة المنتشر البذر الفرضية القائلة بأن الأحداث بعد وصوله إلى الخلايا السرطانية هي حتمية من أجل البقاء والنمو اللاحق. وهذا يعني أن الوقت الحقيقي أدوات التصوير حيوي داخلي لقرار خلية واحدة 2 مطلوبة من أجل تحديد الظواهر من سل البذرليرة سورية واختبار هذه النماذج. في حين عالية الدقة التصوير الضوئي في الرئة وقد تم تنفيذ باستخدام مختلف الاستعدادات خارج الحي، هذه التجارب عادة ما تكون المقايسات واحدة وقت نقطة وعرضة للالتحف واستنتاجات خاطئة محتملة، بسبب البيئة المتغيرة بشكل كبير (درجة الحرارة، وفرة، السيتوكينات، الخ ) الناتجة عن إزالة من تجويف الصدر والدورة الدموية 3. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي الوقت الفاصل بين التصوير الضوئي حيوي داخلي في الرئة سليمة ومن الممكن استخدام فراغ استقرت نافذة التصوير 2،4،5 ومع ذلك، فقد اقتصرت الأوقات التصوير التقليدية إلى ما يقرب من 6 ساعات. نحن هنا وصف بروتوكول للأداء على المدى الطويل التصوير حيوي داخلي الوقت الفاصل بين الرئة باستخدام مثل نافذة على مدى 12 ساعة. تسلسل صورة مرور الزمن تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تمكن التصور والكميات من التفاعلات خلية خلية، وديناميات غشاء ونضح الأوعية الدموية في الرئة. علينا مواصلة دescribe تقنية معالجة الصور التي تعطي رؤية واضحة غير مسبوق من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة.

Introduction

وقد ثبت عالية الدقة التصوير الضوئي حيوي داخلي أن تكون حاسمة لفهم العديد من العمليات البيولوجية، مما يسمح للوحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية إلى أن تقاس وكميا. في أبحاث السرطان، وقد أدى التصوير حيوي داخلي من الخلايا السرطانية واللحمية لاكتشاف العديد من التفاعلات microenvironmental 6-11 التي تكون موجودة فقط في الحيوان سليمة.

الاكتشافات حول microenvironments المرتبطة دخول الوعاء ونشر الخلايا السرطانية في سرطان الثدي باستخدام تحليل خلية واحدة التصوير الضوئي في الجسم الحي أدت حتى إلى علامات جديدة لتشخيص والاستجابة للعلاج في مرضى سرطان الثدي 12-16. تقنيات أفضل التصوير المتاحة للعرض في أعماق الأجهزة الحيوية الداخلية سليمة هي طرائق السريرية (التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، CT) والتي توفر إطلالة رائعة على الجهاز بأكمله ويمكن أن تكشف عن الأمراض حتى قبل أن تنتج الأعراض السريرية. أنهم غير قادرين، حowever، للكشف عن المراحل الأولى من ورم خبيث والآليات الخلوية يقود تطور الورم نظرا لعدم وجود قرار خلية واحدة. بحلول الوقت الانبثاث الرئة واضحة في هذه الطرائق، فهي راسخة والمتكاثرة. ونظرا للتقدير أن 90٪ من خلايا نشر الورم التي تصل إلى الرئة إما لا البقاء على قيد الحياة 17 أو في البداية تظل نائمة 18، ومراقبة وصولها في وقت سابق بكثير مما كان متوقعا 19 سابقا، تصوير أولى خطوات الوصول والبقاء على قيد الحياة يصبح من الأهمية ل فهم عملية البذر النقيلي وتكرار نمو الورم في مواقع بعيدة.

وقد ثبت أداء هذه الملاحظات في الرئة صعب للغاية ولكن؛ وقد استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التصوير خارج الحي أو يزدرع الاستعدادات 20-23، والتي تعطي فقط وجهة نظر في الرئة في نقطة زمنية واحدة. في حين أن هذه الاستعدادات لا توفر معلومات مفيدةrmation، فإنها لا تعطي فهم كامل للتفاعلات، علاقة العلة والمعلول، والديناميات التي تحدث بين مختلف مكونات المكروية. عدم وجود نظام سليم الدورة الدموية (وعدم التوازن ما يصاحب ذلك من التوازن)، وفصل عن بقية نظام المناعة في الجسم يجعل من رغبة في التحقق من صحة الاستنتاجات التي تولد هذه الاستعدادات في أنسجة سليمة في الجسم الحي.

وقد أجريت العديد من المجموعات التصوير حيوي داخلي في الرئة سليمة 2،4،5،24-33 مع Wearn والألمانية كونه أول من جراحيا فضح طبقة الجنبي 24 وتيري أول من الاستفادة من نافذة التصوير زرع 25.

ارتفاع القرار التصوير في الرئة أعاق إلى حد كبير من قبل حركة مستمرة الرئة ولقد تم تطوير العديد من التقنيات للتغلب على هذا القيد. فاغنر و[فيلي] 27 درس الحركة الطبيعية في الرئة الكلابويهدف البروتوكول من العمليات الجراحية لتحديد نافذة على زرعها على المنطقة ثابتة نسبيا في حين تستخدم فاغنر فراغ في كتابه نافذة إعداد الجراحية لشل حركة الأنسجة 28. منذ ذلك الوقت، وقد تم استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات لصورة الرئة بما في ذلك: لقط القصبات الهوائية، توقف التنفس أثناء متسلسل والتصوير بوابات، واقتناء oversampled، لصق الفص الرئة والفراغ (34). كل من هذه مزاياه وعيوبه بحيث لم يبرز أي أسلوب واحد متفوقة على 34 بلدا آخر. على سبيل المثال، لقط القصبات الهوائية وتوقف التنفس أثناء متتابعة يغير تبادل العادي من الغازات في الرئة وقد يسبب انخماص. التصوير مسور واكتساب oversampled لا يعانون من هذه العيوب ولكنها تتطلب سرعة عالية أو معدات التصوير المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. وأخيرا كل من لصق الرئة وتقنية فراغ تجنب كلا من العيوب المذكورة أعلاه، ولكن قد تظهر الإصابة القوة التي يسببها القص إذا الرعاية ليست تاكداخلية. في السنوات الأخيرة، وقد تم تصغير نافذة فراغ وتكييفها للاستخدام في الفئران باستخدام متحد البؤر وmultiphoton المجهر 4،5،33 وممتازة عالية الدقة التصوير وقد تم تحقيق 2. ويلخص الجدول 1 هذا التاريخ الغني ويسلط الضوء على تلك الأوراق التي تصف الرواية التطورات في استخدام حيوي داخلي نوافذ التصوير الرئة.

يصف هذا البروتوكول استخدام موسع الوقت الفاصل بين multiphoton حيوي داخلي المجهري لورم خبيث الصورة في العيش والرئة سليمة مع أعلى دقة التحت خلوية ممكن. يتم الحصول على الصور لمدة تصل إلى 12 ساعة باستخدام مجهر multiphoton مجهزة عالية الفتحة العددية عدسة موضوعية ومتعددة أنبوب مضخم (PMT) كاشفات. وتستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا لتسمية fluorescently الضامة الأم جنبا إلى جنب مع الفلورسنت عالية ديكستران الوزن الجزيئي والبروتينات transfected الخلايا السرطانية الفلورسنت (لتسمية خلايا الأوعية الدموية والأورام التواليذ). في حين أن هذا الاختيار من خلايا fluorescently المسمى يمكن تصور التفاعلات خلية بلعم الخلايا البطانية الورم وديناميكية، وهذا البروتوكول يعمل على أي سلالة من الماوس الفلورسنت أو غير الفلورسنت. بعد الاستحواذ، والقضاء على حركة الانجراف المتبقية (إن وجدت) باستخدام فيجي المساعد 35،36 والعرف وحدات الماكرو الوقت المتوسط قناة الأوعية الدموية للقضاء على اللمعان الناجم عن غير المسماة الخلايا الدموية.

في حين يركز هذا البروتوكول على الانبثاث التصوير، وتقنيات قابلة للتطبيق على العديد من العمليات البيولوجية الأخرى يمكن ملاحظتها مع التصوير ذات الدقة العالية وحيدة الخلية في الرئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك موافقة مسبقة من كلية ألبرت أينشتاين للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. توليد Fluorescently المسمى الفأر نموذج وورم الخلايا

  1. إعداد 100 مل من 0.1٪ (ث / ت) زلال المصل البقري / الفوسفات مخزنة المالحة (BSA / PBS) عازلة عن طريق خلط 0.1 غرام من BSA مع 100 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد الخلايا السرطانية التي fluorescently المسمى ترنسفكأيشن مستقرة.
    ملاحظة: هنا نستخدم خلايا E0771-LG، وهو مشتق المنتشر بشدة E0771 الماوس خلايا غدية الثديية 37 التي تم عزلها من الأورام النقيلي المتقدمة في الرئة من C57BL / 6 الماوس حقنه عن طريق الوريد مع خلايا E0771 الوالدين 38.
    1. 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، لوحة 1 × 10 5 خلايا EO771-LG على طبق نسيج الثقافة 60 ملم في 2 مل من المضاداتعرة الحرة 10٪ FBS (الجنين المصل البقري) DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة) واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. في وقت ترنسفكأيشن، احتضان 2 ميكروغرام من ناقلات البروتين الفلوري مع 10 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن لمدة 30 دقيقة قبل إضافة 190 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل.
    3. غسل الخلايا EO771-LG مع Dulbecco والفوسفات المالحة (D-PBS) مرة واحدة وإضافة مزيج ترنسفكأيشن بلطف.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة.
    5. غسل الخلايا والثقافة transfected في 2 مل من DMEM كاملة (10٪ FBS، البيروفات 1MM، 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) لمدة 2 أيام.
    6. غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. جمع تعليق خلية وتخلط مع حجم 1 على الأقل من اكتمال DMEM وتدور باستمرار في 280 ز س.
    8. Resuspend الخلايا في 1 مل من اكتمال DMEM وتوسيع ثقافة الخلية إلى10 سم صحن زراعة الأنسجة.
    9. بدء اختيار الخلايا transfected بإضافة 700 ميكروغرام / مل من G418 المضادات الحيوية الانتقائية إلى 8 مل من DMEM وثقافة كاملة لمدة أسبوع، وتغيير المتوسط ​​كل ثلاثة أيام.
  3. إثراء السكان الفلورسنت من خلايا transfected التي كانت تحت التحديد في G418 بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 39،40.
    1. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 1.5 مل من 0.25٪ التربسين.
    2. احتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية وتخلط مع حجم واحد على الأقل من اكتمال DMEM.
    3. جمع تعليق خلية وتدور باستمرار في 280 x ج واعادة تعليق الخلايا في 1 مل من معقم 0.1٪ (ث ت /) العازلة BSA / برنامج تلفزيوني.
    4. تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة 40 ميكرون وضبط مستوى الصوت إلى 1 مل مع 0.1٪ BSA عازلة / برنامج تلفزيوني للفرز.
    5. FACS-فرز 10٪ ألمع السكان على أساس الطيف مضان باستخدام فارز FACS 41.
    6. ثقافة الخلايا مرتبة لمدة أسبوع آخر شاختيار التانجو (700 ميكروغرام / مل G418 في DMEM كاملة).
    7. إعادة تحديد الخلايا fluorescently المسمى التدفق الخلوي عن طريق تكرار الخطوات 1.3.1 إلى 1.3.6 مرة أخرى.
    8. بعد الجولة الثانية من الاختيار، ويعرض للتريبسين وتصفية وإعادة تعليق الخلايا في 0.1٪ BSA / PBS كما هو موضح (خطوات 1.3.1-1.3.4). ضبط التركيز إلى 2 × 10 6 خلية / مل لخلية واحدة الفرز في 96 لوحات جيدة باستخدام فارز FACS.
    9. إعداد 3-5 96 لوحات جيدة مع 100 ميكرولتر من DMEM الكامل لجمع. لتحسين البقاء على قيد الحياة بعد الفرز، وإضافة 100 ميكرولتر من مستنبت تصفيتها من الأطباق التي كانت تزرع الخلايا EO771-LG 42.
    10. بعد فرز الخلايا في لوحات 96-جيدا، والعودة الخلايا ثقافة لمدة 2 أيام (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2).
    11. تحديد الآبار مع الحيوانات المستنسخة واحدة قابلة للحياة عن طريق الفحص تحت المجهر المقلوب في 5X التكبير.
    12. يعرض للتريبسين وتوسيع استنساخ قابلة للحياة وتجميد الخلايا للنسخ الاحتياطي.
      1. غسل الآبار مع غرامبسبب استنساخ مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ ث / التربسين الخامس واحتضان 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 50 ميكرولتر من اكتمال DMEM ونقل إلى العقيمة أسفل لوحة 96-جيدا V-أسفل أو مستديرة لتدور باستمرار في 280 x ج لمدة 5 دقائق.
      2. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 700 ميكروغرام / مل G418 الكامل DMEM ولوحة كل استنساخ في لوحات 12-جيدا. إضافة 400 ميكرولتر من DMEM كاملة مع G418 والثقافة حتى متموجة.
      3. غسل الآبار مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين واحتضان 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 100 ميكرولتر من DMEM كاملة وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 280 ز س. و resuspend الخلايا في 100 من المجاهدين DMEM كاملة مع G418 ولوحة الخلايا في 6 لوحات جيدا حتى متموجة.
      4. مرة واحدة متموجة، ويعرض للتريبسين الخلايا، تدور أسفل وresuspend في 10٪ DMSO في FBS لتجميد أسهم الخلية.
      5. الحفاظ 1/10 من الايقاف الخلية في الثقافة عن طريق طلاء لهم في أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم لتقييم قدراتهم النقيلي.
  4. اختبار إمكانية النقيلي من الحيوانات المستنسخة مختارة.
    1. يعرض للتريبسين وإعادة تعليق الخلايا في المياه المالحة إلى تركيز 2.5 × 10 6 خلية / مل وحقن 200 ميكرولتر في C57BL / 6 الفئران عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل.
    2. بعد 2 أسابيع، وجمع أنسجة الرئة كما هو موضح سابقا 23 وقياس عبء الورم عن طريق العد السطح أو طريقة stereological 43. اختيار الحيوانات المستنسخة مع إمكانية النقيلي عالية للتصوير حيوي داخلي.
  5. رفع MacBlue (مروج محدد النخاعي القيادة سماوي ببروتين (CFP) التعبير (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) الفئران مراسل 44.
    ملاحظة: عادة، وتستخدم الفئران بين 8 و 12 أسبوعا، ولكن الفئران في وقت مبكر من 7 و قد تم اختبارها في وقت متأخر من 20 أسبوعا إلى العمل كذلك.

2. Multiphoton مجموعة مجهر صعودا وإعداد التصوير

ملاحظة: في حين أن هذا البروتوكول لا يمكن أن يؤديها في أي موقد وصفت ultiphoton المجهر، وهو النظام المستخدم للحصول على البيانات الواردة في هذا البروتوكول سابقا بالتفصيل 45.

  1. بدوره على جميع مكونات المجهر والليزر بما في ذلك أشعة الليزر ثنائي الفوتون وكشف عن قبل ساعة واحدة على الأقل من وقت التصوير المرجوة.
  2. قبل الجراحة، وقياس قوة الضوء إلى المجهر عن طريق وضع رئيس السلطة متر البصرية في مسار الشعاع قبل المجهر وضبط المقابض ليزر نهاية تجويف مرآة حتى أقصى شدة الضوء في 880 نانومتر للقراءة على السلطة متر البصرية.

محدد نظام 3. فراغ يصل

  1. الغراء ساترة في إطار التصوير (التكميلي الشكل 1) مع cyanoacrylate. سماح لا يقل عن 4 ساعة للالغراء لتجف تماما.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم ذلك خطوة إلى الأمام من الزمن.
  2. قطع 100 ميكرولتر ماصة في السطر الأول من فتحة صغيرة وربط الطرف تقطيعه إلى الخامس رقيقةخرطوم acuum.
  3. ربط نظام فراغ وفقا لشكل 1 والتكميلي الشكل 2.
  4. مع الفراغ على ونهاية مفتوحة سدت، وضبط منظم للفراغ <3 بوصة زئبقية.
    ملاحظة: التعديل النهائي للمستوى فراغ سيتم تنفيذ طريق الملاحظة من الأوعية الدموية في الجسم الحي.
  5. تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم البترولية على الجانب السفلي من لوحة التصوير لمنع موضوعي المتوسطة عدسة الغمر من اشرار بعيدا عن لوحة التصوير.
  6. وضع لوحة التصوير على المسرح المجهر.
    ملاحظة: لوحة التصوير مخصصة (الشكل التكميلي 3) هي ورقة من 1/8 "الألومنيوم سميكة تشكيله على حد سواء لتناسب في الفضاء مرحلة إدراج ومع من خلال ثقب في مركز لعقد نافذة التصوير.
  7. إدراج نافذة فراغ في لوحة التصوير مع ساترة إلى أسفل.
  8. تعقيم جميع الأسطح والأدوات بما في ذلك لوحة مرحلة التصوير، والتصوير الفوزمؤشر داو جونز مع 70٪ من الإيثانول.
  9. قم بتوصيل الطرف قطع من طرف ماصة إلى إطار فراغ والشريط خرطوم وصولا الى لوحة التصوير.
  10. جلب وثيقة موضوعية إلى إطار التصوير ووضع قطرة ماء كبيرة بين الهدف وساترة.
  11. تأكد من عدم وجود تسرب من ساترة من خلال منع افتتاح المركزي من النافذة فراغ والتحقق من أن قطرة الماء بين الهدف وساترة لا يحصل يستنشق.
    ملاحظة: هناك القديمة الكمبيوتر أسلوب الماوس وضع الكرة على نافذة مفيدة لمنع افتتاح مركزي.

4. جراحة

  1. اعداد منطقة الجراحية المعقمة.
    1. وضع جميع الأدوات في متناول اليد. تعقيم جميع الأسطح والأدوات بما في ذلك منطقة العمليات الجراحية، والأدوات الجراحية مع 70٪ من الإيثانول.
  2. ربط طول 3 بوصة من 2-0 خياطة لالقسطرة، ¼ بوصة فوق جلبة مع عقدة مزدوجة.
  3. إعداد ذيل فل الوريد القسطرةخوار بروتوكول نشرتها هارني وآخرون. 46.
  4. باستخدام مصباح الحرارة بالأشعة تحت الحمراء (IR)، تدفئة الحيوان في قفصه ل~ 5 دقائق لزيادة تدفق الدم في الوريد الذيل وللمساعدة في إدخال القسطرة. فمن المستحسن للحفاظ على الحيوانات استعد لدرجات حرارة الفسيولوجية طوال العملية الجراحية باستخدام مصباح الحرارة أو وسادة الاحترار.
  5. تخدير الحيوانات مع 5٪ الأيزوفلورين والتحقق من عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميه.
  6. تطبيق مرهم للعين للعيون للحيوان.
  7. تطبيق محلول مزيل الشعر لمدة 10-30 ثانية لإزالة الشعر من الجانب الأيسر من الحيوان؛ من خط الوسط من الصدر إلى ربع الظهر ومن الإبطين إلى أقل من القفص الصدري.
  8. تنظيف أي محلول الزائد وتعقيم البشرة المكشوفة مع 70٪ من الكحول.
  9. إرفاق محقنة معقمة مليئة برنامج تلفزيوني إلى الوريد القسطرة الذيل وإدراج والشريط في مكان بعد بروتوكول نشرتها هارني وآخرون. 46. تأكد من أن الشريط هو الالتزام بإحكام الإبرة نفسها وليس حرا في الفجوة بين الذيل والشريط.
  10. أنبوبا الماوس التالية إما بروتوكول نشرتها داس وآخرون 47 أو دوبج وآخرون. 48
  11. بدوره على جهاز التنفس الصناعي وضعه على توريد 135 نفسا في الدقيقة و 200 ميكرولتر من خليط الأيزوفلورين الأكسجين.
  12. ربط القسطرة القصبة الهوائية إلى التنفس الصناعي.
  13. تحريك الماوس إلى منطقة العمليات الجراحية. خذ الحذر الشديد على عدم طرد القسطرة.
  14. ربطة عنق خياطة 2-0 في جميع أنحاء خطم من الفأرة تحت أسنان الأمامية.
  15. الشريط القسطرة إلى الخطم.
  16. الشريط forelimb الأيسر لالقسطرة للحفاظ عليه للخروج من المجال الجراحي.
  17. خفض التخدير الأيزوفلورين إلى المستوى السابق من 2.5٪ وتحقق من عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميه.
  18. باستخدام مقص حاد، وإزالة 1 سم 2 من الجلد فوق جدار الصدر الأيسر.
  19. رفع رانه الثديية وحة الدهون وكوى أي الأوعية الدموية تتعرض مع القلم الكي.
  20. بتر لوحة الدهون عن طريق قطع مع مقص حاد.
  21. إزالة طبقة العضلات وصولا الى القفص الصدري عن طريق قطع مع مقص حاد. الحرص على عدم قطع الوريد الإبطي التوالي في قاعدة forelimb.
  22. استخدام ملقط لانتزاع ورفع ضلع ال 6. باستخدام مقص حاد عقدت في زاوية الضحلة (~ 5 °) قطع الضلع بالقرب من حافة فتحة في الجلد. خذ الحذر الشديد على عدم لمس أنسجة الرئة عرضة للخطر.
  23. توسيع فتحة في جدار الصدر لفضح الفص الرئة بالكامل عن طريق إزالة أربعة أضلاع متتالية.
    ملاحظة: حافظ على افتتاح 5 مم على الأقل بعيدا عن القص لتجنب القلب.
  24. بعناية رفع الماوس عن طريق استيعاب الذيل والقصبة الهوائية القسطرة وتحريك الماوس لمرحلة المجهر التصوير.
  25. مع من فراغ، وملء الغرفة من النافذة فراغ مع برنامج تلفزيوني.
  26. عكس الماوس وموقف يتعرضالرئة خلال نافذة فراغ التصوير.
  27. تتحول ببطء في الفراغ إلى ما يقرب من 3-5 بوصة من الزئبق باستخدام صمام الكرة.
  28. وضع تسخير الزجرية مصنوعة من المناديل الورقية في نصف مطوية مرتين على صدره من الفأرة وشريط لوحة المرحلة كما هو مبين في الشكل التكميلي 2.
  29. مقطع استشعار الفخذ للمقياس التأكسج النبض إلى أعلى الفخذ الحيوان والبدء في البرنامج.
  30. مكان الغرفة البيئية على المسرح وتشغيل نظام التدفئة للحفاظ على الماوس عند درجة حرارة الفسيولوجية.
  31. خفض مستوى الأيزوفلورين إلى 1-1.5٪ للحفاظ على التخدير والحفاظ على تدفق الدم.

5. حيوي داخلي التصوير

  1. جلب 25 × 0.95 الفتحة العددية (NA) هدف عدسة بالقرب من ساترة وإضافة قطرة ماء كبيرة بينهما.
  2. عن طريق وضع epifluorescence، عرض قناة FITC وتقديم أنسجة الرئة إلى التركيز.
  3. إذا لم تفعل قبل الجراحة، طالخلايا السرطانية nject عن طريق القسطرة الوريد الذيل.
    1. قطع المحقنة برنامج تلفزيوني من القسطرة الوريد الذيل.
    2. تحميل محقنة معقمة مع 100 ميكرولتر من تعليق خلية الورم (2 × 10 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني كحد أقصى).
      ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك خطوة مقدما لدراسة صول الخلايا السرطانية للرئة عند نقاط زمنية مختلفة.
    3. ربط المحاقن مع الخلايا السرطانية على القسطرة الوريد الذيل.
    4. ببطء حقن الخلايا السرطانية في الوريد الذيل.
    5. قطع المحقنة مع الخلايا السرطانية من القسطرة الوريد الذيل.
    6. إعادة حقنة برنامج تلفزيوني للقسطرة الوريد الذيل.
      ملاحظة: التعرف على مواقع كل من الخلايا السرطانية قبل حقن ديكستران كما يصبح من الصعب التمييز بين الخلايا السرطانية من إشارة ديكستران عبر بصري بعد الحقن.
  4. تحديد موقع الخلايا السرطانية إلى صورة
    1. لتصوير الخلايا السرطانية الفردية، العثور على جميع الخلايا السرطانية وتسجيل مواقعها مع الالبريد لوحة متعددة من البرنامج.
      1. العثور على جميع مجالات بغية صورة من خلال مراقبة الخلايا السرطانية في بصري المجهر.
      2. في البرنامج، والتحول إلى لوحة متعددة عن طريق النقر على زر متعدد نقطة وتخزين موقع الخلية عن طريق النقر على زر إضافة الوظيفة.
    2. للتصوير الفسيفساء، تحديد أصل الفسيفساء وتعيين الإحداثيات التصوير
      1. تحديد موقف في أعلى الزاوية اليسرى من الهيكل ليتم القبض.
      2. صفر إحداثيات X و Y و Z من المرحلة بالضغط على زر "الصفر" على وحدة تحكم المرحلة.
      3. تصل حمولة القائمة المناسبة الإحداثيات الفسيفساء من خلال النقر على زر "تحميل" واختيار القائمة.
        ملاحظة: سيكون هناك قائمة مثال للفسيفساء 2 × 2 مع تداخل 20٪ من حقل 500 ميكرون نظر هي: Pos.1 = (0،0)، نقاط البيع. 2 = (400،0)، نقاط البيع. 3 = (0400)، نقاط البيع. 4 = (400400).
  5. إزالة حقنة ثإيث برنامج تلفزيوني في الوريد القسطرة الذيل واستبدال مع حقنة تحتوي على ديكستران.
  6. حقن ببطء يصل إلى 100 ميكرولتر من 20 ملغ / مل 155 كيلو دالتون رودامين-ديكستران الذائبة في برنامج تلفزيوني في الماوس عن طريق القسطرة الوريد الذيل تليها ضخ 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة لمسح الخط. لا يعرض أي فقاعات في الخط. عند الضرورة، حقن ديكستران ساعة واحدة على الأقل بعد حقن الخلايا السرطانية بحيث لا يتجاوز إجمالي حجم تدار على الماوس 4 مل / كغ / ساعة.
  7. إعداد المعلمات التصوير.
    1. التبديل المجهر لوضع multiphoton.
    2. تعيين التكبير إلى عامل من 2X من خلال النقر على زر إشارات التوقيت وتحديث مجال تكبير عامل.
    3. ضبط قوة الليزر ل~ 10٪ (~ 10-15 ميغاواط في العينة) من خلال النقر على زر كشف والليزر ومن ثم تعديل شريط التمرير تسونامي الطاقة إلى 10.
  8. صورة كل موقع للتحقق من وجود الخلايا السرطانية ووضع تصور تدفق وسلامة vasculature.
    ملاحظة: يجب أن يظهر سفن perfused تماما مع الكريات الحمراء تتدفق، وينبغي أن يتضمن ديكستران الفلورسنت داخل الأوعية دون تسرب إلى مساحات خارج الأوعية. ومن المتوقع 20 الخلايا السرطانية لتكون ضمن فتحة واضحة من النافذة فراغ - 10 تقريبا.
  9. ضبط عمق الانطلاق من كل مكان يتم تصويرها.
    1. لكل موقع، وضبط ض موقف بتدوير مقبض التركيز على وحدة تحكم مرحلة لصورة شريحة العليا من الخلايا السرطانية.
    2. وضع الخلايا في وسط مجال الرؤية.
    3. انقر على زر متعددة، انقر على الموقف من مجال الرؤية لتسليط الضوء عليه وانقر على إضافة يليه زر حذف لتحل محل موقف الخلية المخزنة في قائمة متعددة.
    4. مراقبة بصريا السطوع النسبي للخلية الورم في كل موقف.
  10. حفظ مواقع جديدة في كل من الخلايا عن طريق النقر على زر حفظ في لوحة على عدة نقاطد تحديد اسم الملف.
  11. للتصوير الخلايا السرطانية الفردية، واختيار ثلاث خلايا من سطوع أي ما يعادل تقريبا وحذف جميع المواقع الأخرى من قائمة متعددة عن طريق النقر على موقعها في القائمة ومن ثم النقر على زر حذف.
  12. انقر على زر كشف والليزر وضبط المتزلجون لتحقيق مكاسب PMT من قنوات خضراء وحمراء 45 بحيث إشارات أدناه التشبع.
  13. ضبط شريط التمرير للقناة الزرقاء 45 بحيث الضامة تظهر السماوي.
    ملاحظة: سوف تظهر أي إشارة التوافقية الثانية فقط في القناة الزرقاء، ويمكن فصلها عن الضامة السماوي باتباع الإجراء قناة الطرح الموصوفة سابقا 45.
  14. تحديد بداية ض المكدس عمق 0 ميكرون وعمق نهاية إلى 24 ميكرون عن طريق تحريك المرحلة ض إلى الموقع والنقر على بداية ونهاية أزرار على التوالي.
    ملاحظة: سيتم تصور الخلايا الموجودة داخل هذا العمق مع أفضل إشارة لالضوضاء والقرار.
  15. تعيين حجم ض خطوة إلى 3 ميكرون.
  16. تعيين المعلمات التصوير المعلمات التالية الموصوفة سابقا 45،49.
    1. للتصوير الخلايا السرطانية الفردية، انقر فوق الزر إشارات التوقيت وثم أدخل 4 الخامس في حقل عامل التكبير (أي ما يعادل عامل التكبير 1.5X)، أدخل 3 في حقل المتوسطات الإطار وانقر على زر الوقت الفاصل بين وأدخل 10 في حقل الوقت الفاصل.
      ملاحظة: هذه الإعدادات الحصول على 1 إطار كل 3 ثوان.
    2. للتصوير الفسيفساء، انقر فوق الزر إشارات التوقيت وإدخال عامل التكبير من 1.5 V (أي ما يعادل عامل التكبير من 4X)، أدخل 3 في عدد من المتوسطات الإطار وانقر على زر الوقت الفاصل بين وأدخل 10 في قت- الفاصل الزمني الحقل تأخير.
      ملاحظة: هذه الإعدادات الحصول على 1 إطار كل 3 ثوان.
  17. تمكين متعددة، ض المكدس وسائط التصوير ر الفاصل بين بالضغط على الأزرار الخاصة بهم.
  18. اضغط على زر التسجيل للحصول على الصور.
    ليسE: أنسجة الرئة حساسة جدا وعرضة للتلف الصور. يجب القيام به إذا بعد توقف الوقت تدفق التصوير مرور الدم في مجال المصورة، هو الأكثر احتمالا ليزر التصوير عالية جدا ولاحق من غيرها من المجالات في خفض استهلاك الطاقة.
  19. كل 30-45 دقيقة، وضخ ببطء 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو المالحة للحفاظ على الماء للحيوان.

6. القتل الرحيم

  1. زيادة الأيزوفلورين إلى 5٪.
  2. حفاظ على الحيوانات أقل من 5٪ الأيزوفلورين حتى 30 ثانية بعد أن يتوقف عن التنفس وإزالة الحيوان من المرحلة.
  3. أداء خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم الكامل.

تحليل 7. صورة

  1. لتجارب التصوير خلية واحدة:
    1. تحميل الصور في فيجي وتنسيقها كما Hyperstack.
    2. لكل ض شريحة في Hyperstack، ولعب مرة فيلم مرور والبحث في الحركة س ص المتبقية. إذا وجدت الحركة س ص المتبقية، وتطبيق البرنامج المساعد دعا StackReg 36 إلى المكدس لالقضاء على الحركة.
  2. لتجارب التصوير الفسيفساء:
  3. تحميل الصور في فيجي وغرزة بعضهم البعض عن طريق فتح الفسيفساء خياطة الماكرو (التكميلي ملف التعليمات البرمجية الفسيفساء خياطة) وإدخال المعلومات حول الصور مثل الدليل، واسم قاعدة الملفات، وعدد من الحقول X و Y في الفسيفساء وعدد من شرائح ونقاط الوقت.
    ملاحظة: نظرا لكيف يفسر جافا الدلائل، يجب أن يكون أسماء المجلدات اثنين الخطوط المائلة العكسية مثل الفواصل فرعي. ونظرا لضيق في المدمج في البرنامج المساعد البشرى خياطة، ويجب ألا تحتوي على أسماء الملفات قاعدة أي شرطات.
  4. للحصول على رؤية واضحة للحدود الأوعية الدموية، ومتوسط ​​بين كل نقطة من النقاط الزمنية للقناة الدم في صورة واحدة، ثم تكرار هذه الصورة كخلفية لكل إطار من الفيلم من القنوات الأخرى.
    ملاحظة: يتم ذلك ببساطة عن طريق تشغيل نفذ المتوسط ​​الدم الماكرو (ملف التعليمات البرمجية التكميلي نفذ المتوسط ​​الدم).
  5. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتدليل على نوع النتائج التي يمكن تحقيقها مع هذا الأسلوب، نحن حقن الخلايا السرطانية E0771-LG المسمى مع البرسيم البروتين الفلوري في الوريد ذيل MacBlue الفئران 44 في متفاوتة نقاط الوقت قبل الجراحة. بعد الجراحة، تم حقن 155 دينار كويتي رودامين المسمى ديكستران الرابع للاحتفال أجري الأوعية الدموية والوقت الفاصل بين التصوير.

عند التصوير الفئران 24 ساعة حقن آخر، خلايا مفردة مرئية داخل الأوعية الدموية، والتفاعل مع الضامة، وحيدات. ويرد مثال على ذلك في الشكل 2A (التكميلي الفيلم 1). هنا هو تصوير قسم بصري واحد من الخلايا السرطانية الانفرادي (الأخضر) قدمت 12 ميكرون في عمق الأوعية الدموية في الرئة أكثر من 5 ساعة و 20 دقيقة كما أنه يتفاعل بشكل عابر مع البلاعم المقيمين (السماوي). وصفت الأوعية الدموية عن ارتفاع الوزن الجزيئي ديكستران. استقرارالتصوير هو من النوع الذي متسلسل التصوير ض المكدس الحقل يمكن الحصول عليها وإعادة الإعمار 3 الأبعاد يمكن إجراء (الشكل 2B، التكميلي فيلم 2).

استخدام إعدادات المجهر هو موضح في البروتوكول للتصوير فسيفساء يسمح التصوير هياكل أكبر من حقل واحد للعرض. على سبيل المثال، الشكل (3) يوضح الاستحواذ على آفة المتنقل واحدة و 12 آخر أيام حقن. ويظهر هذا 5 × 5 فسيفساء من 890 ميكرون مجال الرؤية خلال 205 دقيقة في 15 (الشكل 3A، غادر الفريق؛ التكميلي فيلم 3) و 25 ميكرون (الشكل 3A، اللوحة اليمنى) تحت سطح الرئة. وعلى الرغم من حقل كبير للعرض، ارتفاع القرار من الأطر الأساسية التي تتألف منها فسيفساء يمكن القبض على الأحداث التحت خلوية مثل الانقسام من خلية واحدة كما يتضح من الفصل الكروموسومات (الشكل 3B، التكميليفيلم 4).

حقن الوريدي للوزن جزيئي عال fluorescently المسمى النتائج ديكستران في وضع العلامات لمعة الأوعية الدموية، ولكن تحمل اسما تعميم كريات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء تسد ديكستران. في الشعيرات الدموية الصغيرة في الرئة، وانسداد هو الناتجة كاملة في وامض للإشارة ديكستران وفقدان تعريف حدود الأوعية الدموية (الشكل 4، الأيسر. التكميلي الفيلم 5). استقرار مكانية عالية المنصوص عليها في هذا البروتوكول يسمح المتوسط ​​الوقت للقناة الدم، دون وضوح، وبالتالي استعادة انسداد مؤقت. ويمكن بعد ذلك قنوات إشارة أخرى يتم مضافين على الأوعية الدموية لتوفير رؤية واضحة للحدود السفينة (الشكل 4، اليمنى. التكميلي الفيلم 6).

شكل 1
الشكل 1: يستخدم تخطيط نظام فراغ فراغ البيت وتعيين إلى مستوى محدد مع منظم فراغ. قارورة القبض يمنع تلوث نظام منظم والفراغ الذي سوائل الجسم. أنبوب مرن رقيقة ينقل فراغ لقطع ماصة لتناسب بمنفذ الفراغ من النافذة التصوير. نافذة التصوير يصلح في أخدود راحة في لوحة التصوير الحفاظ على الاستقرار الموضعية لها فيما يتعلق المجهر العدسة الشيئية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: واحد التصوير خلية في الرئة (A) لا يزال من وقت الفيلم مضي الخلايا السرطانية واحدة في السرير الشعرية في الرئة 24 ساعة بعد الوريد الذيل.حقنة. (سفن الأحمر = الدم، الخلايا أخضر = ورم، سماوي = الضامة) (ب) التصوير مستقرة تسمح ثلاثة إعادة الإعمار بعد بيانات التصوير مع مرور الوقت. وكانت الأوعية الدموية وقت متوسط ​​لوضوح. (سفن الأحمر = الدم، أخضر = الخلايا السرطانية، أزرق = الضامة). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: استقرار الرئة يسمح عالية الدقة، في الميدان كبير من مشاهدة التصوير في الرئة قبل متسلسل اقتناء وخياطة معا من متعددة منخفضة التكبير الحقول (A) 5 × 5 فسيفساء مبديا 890 ميكرون مجال الرؤية من. آفة المنتشر في الرئة بعد 12 يوما حقن الوريد الذيل من الخلايا السرطانية التي اتخذت في 15 ميكرومتر تحت سطح الرئة(لوحة اليسار). وتظهر اللوحة اليمنى نفس الآفة المنتشر في 25 ميكرون تحت سطح الرئة. (ب) مجالات عالية الدقة الفردية تكشف عمليات التحت خلوية مثل محاذاة الكروموسومات (الأسهم الصفراء) وفصل (الأسهم الحمراء) أثناء انقسام الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: حقن داخل الأوعية من Fluorescently إعتبر عالية الوزن الجزيئي ديكستران ماركس في التجويف من الأوعية الدموية إلا عندما ليس لها علامة الكريات الحمر وغيرها من الخلايا تعميم تسد الإسفار الإشارة (A) النتائج انسداد في وضع العلامات غير مكتملة والتي تتحرك في الوقت المناسب مما أدى إلى وامض التعتيم تأثير. حدود السفينة. (ب) ارتفاعالاستقرار المكاني للنافذة فراغ يسمح للقناة الدم ليكون الوقت قد حان متوسط، وملء في انسداد مؤقت ووضع تعريف واضح للحدود السفينة. ثم يتم مضافين القنوات الأخرى دون المتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عام الأول الكاتب / نشاط الكاتب حيوان العملية الجراحية نوع من التصوير الملاحظات
1926 Wearn والألمانية القطط قطع جدار الصدر وصولا الى طبقة الجنبي. جعلت افتتاح الثاني من خلال الحجاب الحاجز وصولا الى غشاء الجنب للإضاءة. المجهر مشرق الميدان. أول "نافذة" من خلال جدار الجنبي.
1939 تيري القطط يتم فصل الأضلاع، 1 في. نافذة مزروع، إزالة الهواء من الصدر مع فراغ. مجهر والجلد باستخدام المجهر الإضاءة الاستقطاب. زرع أول نافذة البصرية. مستعملة فراغ لرسم الأنسجة إلى النافذة.
1963 دي ألفا و راينر الأرانب والكلاب ومقطوعة واحدة أو اثنين من أضلاعه و 1 في. نافذة إدخال وتخاط على جدار الصدر. تم إغلاق الجلد فوق النافذة والحيوان يسمح للشفاء. قبل التصوير، وكان تشريح الجلد لفضح النافذة. مستعملة سرعة عالية السينما اصطرابي من خلال الهدف ماج منخفضة (11X). نافذة بقاء الأول.
1965 فاغنر و[فيلي] الكلاب forelimb الحق إزالة، وقطع ضلع واحد ونافذة إدخال وخياطة. المجهر انعكاس مع الهدف 22X. أول إطار حركة حرة نسبيا دون فراغ.
فاغنر الكلاب ومقطوعة واحدة الضلع، و 3 في. نافذة مزروع. الخيوط مسامير شفة على نافذة لتشكيل ختم لجدار الصدر. المجهر Brightfield مع ارتفاع التكبير الهدف 100X الغمر النفط. النافذة الأولى لاستخدام الفراغ لتحقيق الاستقرار في حركة الأنسجة.
1992 GROH وجويتز الأرانب أحد الأضلاع مقطوعة، 1.2 في. نافذة مزروع. الخيوط مسامير شفة على نافذة لتشكيل ختم لجدار الصدر. فراغ تطبيقها. Epifluorescent المجهر مع الهدف 25X. أول استخدام للنافذة فراغ مع epifluorescence.
1994 فنغر ويمان الفئران ومقطوعة 2 الأضلاع، 1 في. نافذة مزروع وتخاط على جدار الصدر والجلد. Epifluorescent المجهر مع الهدف 40X. نافذة بقاء الأول في الفئران.
2000 Funakoshi وميتسوي الفئران جدار الصدر كامل إزالتها. فراغ حلقة شفط تعلق على الرئة اليمنى. المجهر متحد البؤر مع الهدف 20X. أول استخدام للنافذة فراغ في الفئران.
2005 لام وجليني الفئران جدار الصدر كامل إزالتها، 1 في. نافذة تعلق على الرئة. التأمل والفحص المجهري epifluorescent مع الهدف 20X. أول استخدام للنافذة فراغ في الفئران.
2008 Tabuchi وKeubler الفئران ومقطوعة 3 الأضلاع، تطبيق فيلم من البلاستيك لافتتاح لاغلاق ثقب في جدار الصدر. إزالة الجوي عن طريق القسطرة داخل التجويف الجنبي. Epifluorescent المجهر مع الهدف 20X. أول من استخدم فيلم من البلاستيك لاغلاق فتحة في جدار الصدر.

الجدول 1: مسح تاريخي للجمعةاإلمنائية لحيوي داخلي الرئة التصوير ويندوز. وقد وضعت العديد من رواية الرئة حيوي داخلي نوافذ التصوير على مدى السنوات بالأحدث يجري مصغرة لاستخدامها في الفئران، وتوظيف الفراغ لتحقيق الاستقرار الأنسجة وتحقيق دقة عالية بما يكفي لتكون قادرة على الكشف عن التفاصيل التحت خلوية.

التكميلي الشكل 1: تصميم رسم من نافذة التصوير فراغ الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الرقم.

التكميلي الشكل 2: صور من إعداد فراغ الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: تصميم Drawi نانوغرام من المرحلة لوحة إدراج الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1
التكميلي الفيلم 1: فيلم من اللقطات في الشكل 2A (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

الشكل التكميلي 2
التكميلي نقل 2: الفيلم من إعادة الإعمار 3D هو مبين في الشكل 2B تظهر زوايا النظر المختلفة وتطور على مر الزمن (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

> الشكل التكميلي 3
التكميلي فيلم 3: الفيلم من 5X5 الفسيفساء هو مبين في الشكل 3A في 15 ميكرون تحت سطح الرئة (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

الشكل التكميلي 4
الفيلم التكميلي 4: الفيلم من خلية واحدة هو مبين في الشكل 3B تمر الانقسام في الرئة (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

الشكل التكميلي 5
الفيلم التكميلي 5: الفيلم من الشكل 4، غادر فريق تبين انسداد ووجلد. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

الشكل التكميلي 6
الفيلم التكميلي 6: الفيلم من الشكل (4)، لوحة الصحيحة التي تبين استعادة تعريف الأوعية الدموية بعد المتوسط الدم (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

التكميلي ملف التعليمات البرمجية: فسيفساء خياطة الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي ملف التعليمات البرمجية: نفذ المتوسط الدم الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دقة عالية في التصوير الضوئي الجسم الحي بالإضافة إلى العلامات وظيفية fluorescently المسمى مثل البروتينات والأجسام المضادة قد زاد بشكل كبير من فهمنا للتتالي النقيلي. وقد مكن ذلك التصور المباشر وتقدير من وحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية في الخلايا السرطانية والخلايا المضيفة والمكروية بهم. وقد أدى هذا التصوير داخل الورم الرئيسي، على سبيل المثال، إلى اكتشاف microenvironments المنفصلة التي تدعم إما الغزو النمو أو 6،7 نشرها. في حالة الغزو، قد كشفت في الجسم الحي التصوير دور تفضيلية من شارك في migrational تدفق الضامة والخلايا السرطانية في دخول الوعاء 7،50.

في المواقع الثانوية مثل الرئة، فهم ديناميات سلوك الخلايا السرطانية في المراحل المبكرة من ورم خبيث، بما في ذلك مرحلة البذر قبل نقيلة مجهرية عند وصول مجموعة واحدة وصغيرة من الخلايا السرطانية والتفاعل مع بطانة الأوعية الدموية، وسيتحقق فقط باستخدام عالية الدقة التصوير الضوئي. طرائق التصوير السريرية القياسية لا تملك قرار يحتاج إلى تصور إما التركيب الدقيق للالسرير الشعرية أو التشكل والتفاعل بين الخلايا في قرار خلية واحدة. تقنيات التصوير الواردة في هذا البروتوكول إنجاز هذه المهمة الصعبة.

نوافذ التصوير حيوي داخلي مثل تلك المذكورة في الجدول 1 العرض تفوقا كبيرا على فيفو السابقين الاستعدادات الرئة من خلال الحفاظ على الفيزيولوجيا الرئة السليم بما نضح، اتصال لجهاز المناعة، وتقدم أكثر من مجرد عرض ثابت من ديناميات الخلوية. استقرت الفراغ النوافذ في عرض خاص على مستوى الاستقرار الأنسجة التي تسمح للاقتناء الصور المسجلة للغاية، مما ثلاث عمليات إعادة البناء الأبعاد (الشكل 2B) والقدرة على حقل كبير للتصوير عرض الفسيفساء (الشكل3A لدى عودتهم). معا توفر هذه مجموعة من الآراء في الرئة، من نوع نسيجية عرض التكبير المنخفض الذي يعطي التشكل الأنسجة، إلى وجهة نظر الخلوي دون أن يستطيع حتى تكشف عن فصل الكروموسومات وتميز الخلايا السرطانية النائمة وتقسيم (الشكل 3B). القنوات اكتساب متعددة تسمح عدة أنواع الخلايا وتفاعلاتها أن تصور في وقت واحد (الشكل 2A).

في حين أن البروتوكول لا يستغرق بعض المهارات الفنية والممارسة والانتباه إلى بعض الخطوات الحاسمة ونقاط من شأنها تحسين معدل نجاح العملية والتصوير مرات لمدة تصل إلى 12 ساعة يمكن أن يتوقع. فمن الأهمية بمكان للتأكد من أنسجة الرئة وتتركز بشكل جيد خلال نافذة (الخطوة 4.25). هذا يضمن أن يتم تطبيق فراغ بالتساوي وبشكل كامل في جميع أنحاء أنسجة الرئة (الخطوة 4.27). وفشل لتوسيط الأنسجة يؤدي إلى حركة الأنسجة. يتم استخدام تسخير الزجرية (الشكل التكميلي 2) رس تقليل الحركة الناجم عن انقباض العضلات الوربية خلال الأنفاس الطبيعية يأخذ الحيوان. وينبغي أن يكون دافئ على الماوس، ولكن ليس ضغط الصدر. الكثير من ضغط ضغطا على كل من فصوص الرئة وكذلك القلب ويؤدي إلى انخفاض الجدوى من الفأرة. إن لم يكن لوحظ ديكستران تتدفق في الأوعية الدموية في الرئة بعد الحقن (الخطوة 5.8)، وأنسجة الرئة إما تضررت من سوء التعامل أثناء الجراحة أو مستوى فراغ مرتفع جدا. خفض الفراغ الذي 0،5-1 بوصة زئبق يمكن أن تكون محاولة لمعرفة ما إذا كان يتم استعادة التدفق. إذا لم يتم استعادة التدفق، أو إذا كان هناك تدفق، ولكن لوحظ ديكستران extravascularly، قد تعرض للتلف أنسجة الرئة في تلك المنطقة، وسوف يكون من الضروري لصورة حقل نظر مختلفة. الحفاظ على تدفق الدم السليم في المنطقة التصوير مهمة لضمان أن يتم قياس علم وظائف الأعضاء السليم. منذ يتم تزويد الأكسجين إلى أنسجة من داخل الحويصلات الهوائية وليس من خلال خدمات القيمة المضافةculature، نقص الأكسجة الدماغية من غير المرجح. ومع ذلك، يمكن أن الأوعية الدموية unperfused يحتمل أن يؤدي إلى تغير الأوكسجين / CO 2 المستويات وسيمنع أيضا تعميم الكريات البيض من الوصول إلى الأنسجة من الاهتمام. التصور من الكريات الحمراء تتدفق يمكن أن تستخدم كمؤشر على وظيفة الرئة السليمة. أنسجة الرئة حساسة جدا وأيضا عرضة للتلف الصور. يجب القيام به إذا بعد توقف الوقت تدفق التصوير مرور الدم في مجال المصورة، هو الأكثر احتمالا ليزر التصوير عالية جدا ولاحق من غيرها من المجالات في خفض استهلاك الطاقة. لقد وجدنا ~ 10-15 ميغاواط في عينة لإنتاج صور مشرقة بما فيه الكفاية دون photodamage عند استخدام إما GFP أو البرسيم (التي لديها أربعة أضعاف متوسط ​​السطوع) خلايا transfected. مستويات السطوع الحد الأدنى للالبروتينات الفلورية تعتمد اعتمادا كبيرا على المعلمات المجهر ومستويات التعبير في الخلايا، ويجب أن يتم اختبارها تجريبيا.

في هذا البروتوكول، وصفت الخلايا السرطانية مع cytoplas مشرقالبروتين الفلوري هيئة التصنيع العسكري التي توفر رؤية واضحة للجسم الخلية والمساحات داخل الخلايا التي تستبعد البروتين (أي النواة). وصفت الضامة عن طريق استخدام المعدلة وراثيا نموذج الفأر مسانج للخلايا السرطانية. وصفها كل من أنواع الخلايا يمكن تصور التفاعل المباشر في الوقت الحقيقي. فترة طويلة من التصوير تسمح الكمي من وتيرة ومدة ومدى التي الخلايا السرطانية تتفاعل مع الضامة في سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية.

عندما يقوم بشكل صحيح، وهذا الإجراء يتيح الحركة الحرة، متعددة القنوات، وارتفاع القرار، التصوير وحيدة الخلية في الرئة سليمة لفترات تصل إلى 12 ساعة. استخدام عالية العددية فتحة العدسة الشيئية مثل 25X 0.95NA وقدرات multiphoton لزوم الإلكترونية يسمح للأعلى دقة التصوير الضوئي في الرئة ينظر إلى التاريخ.

حقن Intravascularly الفلورسنت، وارتفاع الوزن الجزيئي ديكستران بيrforms الدور المزدوج للوصفها مساحة الأوعية الدموية والتحقق من سلامتها. يستخدم 155 كيلو دالتون ديكستران لمنع نشرها من خلال المساحات interendothelial. أي علامة على وجود نقص في تدفق الأوعية الدموية أو تسرب الأوعية الدموية في الفضاء خارج الأوعية يشير الأضرار التي لحقت الأنسجة بسبب سوء التعامل أو فراغ المفرط.

وأخيرا، وتقنيات معالجة الصور فريدة من نوعها يمكن أن تستخدم التي تستفيد من استقرار مكانية عالية من هذا البروتوكول. منذ كريات الدم الحمراء غير المسماة والكريات البيض أخرى تستبعد ديكستران الفلورسنت عندما تمر من خلال الشعيرات الدموية، وهذا إشارة يمكن بمعدل متوسط ​​أعلى من الوقت لإزالة اللمعان التي يقومون بإنشائها. هذا يقدم وجهة نظر محددة جيدا من الأوعية الدموية غير ممكن على خلاف ذلك.

وتشمل القيود المفروضة على هذه التقنية كلا من طبيعة الغازية لعملية جراحية، والتي يحتمل أن يعقد استخدامه لدراسة الأمراض التي تضعف الحيوان (مثل مرحلة متأخرة السرطان النقيلي،الحادة وفقر الدم المنجلي)، والحقيقة أن الجراحة هي المحطة مما يحد من ذلك استخدامها لفترة واحدة، وإن كانت طويلة (تصل إلى 12 ساعة)، دورة التصوير. وعلاوة على ذلك، نظرا للمدة الطويلة للدورة التصوير وانخفاض الاحتياطي الجليكوجين في الكبد من الفئران 51، يمكن إعطاء مكملات الجلوكوز لتجنب مصادر محتملة للتحيز في التجارب.

من المحتمل أن يتم تعديل هذا البروتوكول مع حقن الأجسام المضادة fluorescently المسمى إما في مكان أو بالإضافة إلى ديكستران من أجل تسمية الهياكل الأخرى أو أنواع الخلايا في الوقت الحقيقي. سيؤدي ذلك الى توسيع قدرات لتحليل وتشريح المكروية الورم من خلال وضع تصور مباشرة الورم التفاعلات خلية خلية المضيف وديناميكية في الوقت الحقيقي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6, (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4, (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179, (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12, (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5, (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15, (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112, (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106, (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14, (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7, (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13, (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58, (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6, (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475, (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24, (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90, (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2, (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26, (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192, (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98, (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25, (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212, (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16, (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12, (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158, (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6, (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2, (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, (1), C1-C18 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics