真空安定化撮像窓と肺における長期高分解能生体顕微鏡

Cancer Research

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Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

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Abstract

例えば、肺、肝臓や骨などのセカンダリサイトへの転移は約90%1の死亡率との衝撃的な出来事です。これらのサイトのうち、肺が原因ボディ、繊細な自然と適切な生理機能を維持する上で重要な役割内のその囲まれた位置に生体光学イメージングを使用して評価することが最も困難です。臨床モダリティ(陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴イメージング(MRI)及びコンピュータ断層撮影(CT))は、この組織の非侵襲的な画像を提供することができるが、それらは、単一のピクセルと、最も早く播種イベントを可視化するために必要な解像度を欠いていますほぼ千の細胞からなります。転移性肺の現行モデルは、単に腫瘍細胞の到着後のイベントは生存とその後の成長のために確定的公準を播種します。これは、単一セルの解像度を2とリアルタイム生体イメージングツールが播種セル画の表現型を定義するために必要とされることを意味しますlsコマンドは、これらのモデルをテストし。肺の高分解能光学的イメージングは、 生体外の様々な製剤を用いて行われてきたが、これらの実験は、典型的には、単一の時間ポイントアッセイであり、アーチファクトと劇的に変化した環境(温度、豊富、サイトカインなどによる誤結論に影響されやすいです)胸腔および循環系3からの除去に起因します。最近の研究は、無傷の肺のタイムラプス生体光イメージングを示した真空を使用して可能であるが、撮像窓2,4,5を安定化し、典型的なイメージング時間は約6時間に限られていました。ここでは、12時間の期間にわたって、このようなウィンドウを利用し、肺の長期生体内タイムラプスイメージングを行うためのプロトコルを記述します。タイムラプス画像シーケンスは、この方法を用いて得られた細胞間相互作用、膜動態および肺における血管灌流の可視化および定量化を可能にします。我々はさらにD肺微小血管系の従来にないクリアな視界を提供する画像処理技術を傍接させます。

Introduction

高分解能生体内光学イメージングは​​、単一細胞および細胞下のパラメータを測定し、定量化することを可能にする、多くの生物学的プロセスを理解するために重要であることが証明されています。癌研究では、腫瘍細胞および間質細胞の生体内イメージングは、無傷の動物にのみ存在している多くの微小環境の相互作用6-11の発見につながりました。

インビボでの単細胞解像度光学イメージングを用いた乳癌における血管内および腫瘍細胞の播種に関連付けられた微小環境についての発見は、さらに予後および乳癌患者12-16における治療に対する反応のための新規マーカーをもたらしました。無傷の内部の重要な臓器内の深いご覧いただけ最高のイメージング技術は、臓器全体の素晴らしい景色を眺めることができますし、彼らは臨床症状を引き起こす前であっても病理を明らかにすることができ、臨床的モダリティ(MRI、PET、CT)です。彼らは、Hができませんowever、転移の初期段階起因単細胞解像度の欠如に腫瘍の進行を駆動する細胞メカニズムを明らかにします。時間によって肺転移は、これらのモダリティに表示され、それらは十分に確立し、増殖しています。肺に到着播種性腫瘍細胞の90%が17を生き残るか、最初は18休止状態のまま、彼らははるかに早く、以前に19を予想より到着観察は、到着と生存の最も初期の段階を画像化するために重要となりませんいずれかのことを推定を考えます離れた部位に転移性播種し、腫瘍増殖の再発のプロセスを理解します。

肺にこれらの観測を実行することが極めて困難であることが判明しました。イメージング研究の大半は、単一の時点で肺にビューを提供エクスビボまたは外植調剤20-23を 、利用してきました。これらの製剤は、有用な情報を提供されますがrmation、彼らは微小環境のさまざまなコンポーネント間で発生する相互作用、因果関係、およびダイナミクスの完全な理解を与えることはありません。適切な循環系(およびホメオスタシスの同時アンバランス)と身体の免疫系の残りの部分から切断の欠如は、それが望ましい、これらの製剤は、 生体内での無傷組織に発生結論を検証することができます。

多くのグループがWearnとドイツが胸膜層24を露出させる外科的に最初とテリー移植可能な観察窓25を利用すること第一であると無傷の肺2,4,5,24-33の生体内イメージングを行いました。

肺の高分解能イメージングが大幅に肺の一定の動きにより阻害され、いくつかの技術が、この制限を克服するために開発されてきました。ワーグナーやフィレー27は、イヌの肺の自然な動きを研究しましたそして、ワーグナーが組織28を固定するために彼のウィンドウ外科手術の準備に真空を利用しながら、相対的に静止領域の上に彼らの移植ウィンドウを見つけるために彼らの外科的プロトコルを設計しました。気管支クランプ、シーケンシャル無呼吸と同期撮影、オーバーサンプリング取得、肺葉と真空34の接着:その時以来、種々の技術は、画像に含めて肺を利用されてきました。これらの各々は、長所と短所があり、誰の技術は、他の34にとして優れ出現していません。例えば、気管支クランプとシーケンシャル無呼吸は、肺内のガスの正常な交換を変更し、無気肺を引き起こす可能性があります。同期撮影とオーバーサンプリングされた買収は、これらの欠点を有するが、高速や特殊な画像機器に広くアクセスすることはできません必要はありません。最後に、肺の両方の接着と真空技術は、上述した欠点の両方を回避するが、注意が徳でない場合は、せん断力誘発される損傷を示すことができますアン。近年では、真空窓が小型化されたマウスでの使用に適合共焦点及び多光子顕微鏡4,5,33を使用して、優れた高解像度イメージングは2達成された。 表1は、この歴史を要約し、小説を記述するそれら書類を強調生体肺の撮像ウインドウの使用の進歩。

このプロトコルは、可能な限り最高の細胞下解像度でのライブ、無傷の肺の画像の転移に長時間タイムラプス多光子生体顕微鏡の使用を記載しています。画像は、高開口数の対物レンズと、複数の光電子増倍管(PMT)検出器を装備した多光子顕微鏡を用いて、最大12時間に取得されています。トランスジェニックマウスモデルは、血管系および腫瘍細胞を標識する蛍光高分子量デキストラン及び蛍光タンパク質トランスフェクトされた腫瘍細胞(と共に蛍光標識ネイティブマクロファージに利用さrespectivelY)。蛍光標識された細胞のこの選択は、腫瘍細胞 - 内皮細胞 - マクロファージの相互作用とダイナミクスの可視化を可能にしているが、このプロトコルは、蛍光または非蛍光マウスの任意の株のために動作します。買収後、残留ドリフト運動(もしあれば)フィジープラグイン35,36およびカスタムマクロの時間平均に標識されていない循環血液細胞によって引き起こさ点滅排除するための脈管を用いて除去されます。

このプロトコルは、撮像転移に焦点を当てているが、技術は、肺における高解像度の単一細胞イメージングで観察多くの他の生物学的プロセスにも適用可能です。

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Protocol

このプロトコルで説明されているすべての手順は、医療制度動物実験委員会のアルバート・アインシュタイン大学の事前承認を含む、脊椎動物の使用のためのガイドラインと規則に従って行われてきました。

1.生成蛍光標識マウスモデルおよび腫瘍細胞

  1. PBS 100 mlのBSAを0.1gを混合し、0.1%(w / v)のウシ血清アルブミン/リン酸緩衝生理食塩水(BSA / PBS)緩衝液100mlを調製します。
  2. 安定なトランスフェクションすることにより、蛍光標識された腫瘍細胞を準備します。
    注:ここでは、E0771-LG細胞、静脈内に親E0771細胞38を注射したC57BL / 6マウスの肺に開発された転移性腫瘍から単離されたE0771マウス乳腺癌細胞の転移性の高いデリバティブ37を使用します
    1. トランスフェクションの24時間前に、プレート1×10 antibioの2ミリリットルに60ミリメートル組織培養皿上で5 EO771-LG細胞チックフリー、10%FBS(ウシ胎児血清)を含むDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、37℃、5%CO 2でインキュベートします。
    2. トランスフェクションの時点では、低血清培地の190μLを加える前に30分間トランスフェクション試薬10μlの持つ蛍光タンパク質ベクター2μgのをインキュベートします。
    3. かつてダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で洗浄EO771-LG細胞と穏やかにトランスフェクションミックスを追加します。
    4. 6時間、37℃、5%CO 2でインキュベートします。
    5. 2日間完全DMEM(10%FBS、1mMのピルビン酸、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン)の2ミリリットルでトランスフェクションされた細胞と文化を洗ってください。
    6. 滅菌PBSの2ミリリットルで細胞を洗浄し、0.25%トリプシン-EDTAの500μlを添加し、37℃で2分間インキュベートします。
    7. 細胞懸濁液を収集し、完全DMEMの少なくとも1容量と混合し、280×gでスピンダウン。
    8. 完全DMEM 1mlに細胞を再懸濁し、中に細胞培養を拡大10cmの組織培養皿。
    9. 3日ごとに培地を交換し、週に完全DMEMと文化の8ミリリットルにG418選択用抗生物質の700μgの/ mlで添加することにより、トランスフェクトされた細胞の選択を開始します。
  3. 蛍光活性化細胞選別(FACS)39,40によって、G418で選択が行われているトランスフェクションされた細胞からの蛍光集団を濃縮。
    1. 5mlのPBSで細胞を洗浄し、0.25%トリプシンの1.5ミリリットルを追加します。
    2. 37℃で2分間インキュベートし、完全DMEMの少なくとも一つのボリュームと混合。
    3. 細胞懸濁液を収集し、280×gでスピンダウンし、滅菌0.1%の1ミリリットル(w / v)のBSA / PBS緩衝液中で細胞を再懸濁。
    4. 40ミクロンメッシュを通して細胞懸濁液を濾過し、ソートするために、0.1%BSA / PBS緩衝液で1ミリリットルにボリュームを調整します。
    5. FACSソーター41を用いて蛍光スペクトルに基づいて10%明るい人口をFACSソートしてください。
    6. 別の週のuのための文化選別細胞ファインダーの選択(完全DMEM中の700μgの/ mlのG418)。
    7. 手順を繰り返して、フローサイトメトリーにより蛍光標識された細胞を再選択すると、もう一度1.3.6 1.3.1。
    8. (手順を1.3.1-1.3.4)記載されているように選択、トリプシン処理、フィルタおよび第二ラウンドの後、0.1%BSA / PBS中で細胞を再懸濁します。 FACSソーターを使用して、96ウェルプレート中に並べ替え単一セルのために2×10 6細胞/ mlの濃度に調整。
    9. コレクションの完全DMEM100μlで3月5日96ウェルプレートを準備します。ソート後の生存を改善するために、EO771-LG細胞を42成長させた皿から濾過した培養培地100μlを添加します。
    10. 96ウェルプレートに細胞を選別した後、2日間培養した細胞を戻す(37℃、5%CO 2)。
    11. 5倍の倍率で倒立顕微鏡下で検査することにより実行可能な単一のクローンを含むウェルを特定します。
    12. トリプシン処理し、実行可能なクローンを拡大し、バックアップのために、細胞を凍結します。
      1. グラムでウェルを洗浄滅菌PBS100μlでクローンによる。 Vトリプシン/ wの0.25%の50μlを添加し、37℃で2分間インキュベートします。完全DMEMの50μlを添加し、5分間280×gでスピンダウンする無菌V底または丸底96ウェルプレートに移します。
      2. 再懸濁し、700μgの/ mlのG418の完全DMEM100μl中の細胞と12ウェルプレートの各クローンをプレート。コンフルエントになるまでG418および文化に完全DMEM400μlのを追加します。
      3. 500μlのPBSでウェルを洗浄し、0.25%トリプシンの100μlを添加し、37℃で2分間インキュベートします。完全DMEM100μlのを追加し、280×gで5分間スピンダウン。コンフルエントになるまで6ウェルプレート中のG418およびプレート細胞と完全DMEM100μlの中で細胞を再懸濁します。
      4. コンフルエント後、細胞株を凍結するFBS中の10%DMSO中で、細胞をトリプシン処理スピンダウンし、再懸濁。
      5. それらの転移の可能性の評価のための100mm組織培養皿でそれらをプレーティングすることによって、培養中の細胞懸濁液の1/10を保ちます。
  4. 選択されたクローンの転移の可能性をテストします。
    1. トリプシン処理およびミリリットル2.5×10 6細胞/の濃度になるように生理食塩水で細胞を再懸濁し、尾静脈を介して静脈内にC57BL / 6マウスに200μLを注入します。
    2. 以前に23を説明したように2週間後、肺組織を収集し、表面数または立体法43により腫瘍負荷を定量化します。生体内イメージングのための高転移能を有するクローンを選択します。
  5. MacBlueレポーターマウス44(シアン蛍光タンパク質(CFP)式(CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)を駆動する骨髄特異的プロモーター)を上げます。
    注:通常、8〜12週の間にマウスが使用されるが、早ければ7とし、遅くとも20週間は同様に動作するようにテストされたマウス。

2.セットアップ多光子顕微鏡とイメージングの準備

注:このプロトコルは、どのメートル上で行うことができますがultiphoton顕微鏡、このプロトコルに示されたデータを取得するために使用されるシステムについて詳細45に以前に記載されています。

  1. 二光子レーザーと、少なくとも1時間進ん所望の撮影時間の検出器を含む、すべての顕微鏡とレーザーのコンポーネントをオンにします。
  2. 880 nmでの最大光強度を読みれるまで単に手術前、ちょうど顕微鏡の前のビーム経路内に光パワーメータのヘッドを配置することにより、顕微鏡に入力される光のパワーを測定し、レーザ端キャビティミラーノブを調整します光パワーメータ。

3.真空システムをセットアップします

  1. シアノアクリレートで撮像窓(補足図1)にカバーガラスを接着。完全に乾燥糊にするために、少なくとも4時間を許可します。
    注:このステップは、事前に行われてもよいです。
  2. 小さな開口部からの最初の行で、100μlのピペットチップをカットし、薄いVにノーカットの端を接続acuumホース。
  3. 図1および補足図2に係る真空システムを接続します。
  4. 上の真空およびブロックされた開放端と、<3 inHg用真空レギュレータを調整します。
    注:真空レベルの最終調整は、 インビボで脈管構造を観察することにより行われます。
  5. イメージングプレート離れ吸い上げされるの対物レンズ液浸媒体を防止するために、イメージングプレートの下面に石油グリースの薄膜を適用します。
  6. 顕微鏡ステージ上にイメージングプレートを置きます。
    注:カスタムイメージングプレート( 補足図3)1/8のシートである「厚のアルミニウムは、両方のステージの挿入空間にし、撮像窓を保持するための中央の貫通穴に合うように機械加工しました。
  7. ダウンカバースリップとイメージングプレートに真空窓を挿入します。
  8. すべての表面や楽器イメージングステージプレートを含む、およびイメージング勝利を滅菌します70%エタノールでウ。
  9. 真空窓にピペットチップの切断端を接続し、イメージングプレートまでホースをテープで固定します。
  10. 撮像窓に客観近くを持参し、目的とカバーガラスの間に水の大きな低下を置きます。
  11. 真空窓の中央開口部を遮断し、目的とカバーガラスの間に水滴が吸引されないことを確認することにより、カバースリップからの漏れがないことを確認してください。
    注:ウィンドウ上に配置された古いスタイルのコンピュータのマウスボールが中央の開口部をブロックするために有用です。

4.手術

  1. 無菌の手術領域を準備します。
    1. 簡単に手の届くところにすべての楽器を置きます。手術領域、および70%エタノールで手術用ツールを含むすべての表面や楽器を滅菌します。
  2. ダブルノットとブッシングの上に、カテーテルに¼インチを2-0縫合糸の3インチの長さを接続します。
  3. 尾静脈カテーテルFOLを準備ハーニー 46によって発表されたプロトコルを牛の鳴き声。
  4. 赤外線(IR)加熱ランプを使用して、尾静脈の血流を増加させ、カテーテルの挿入を補助するために約5分間そのケージに動物を暖めます。加熱ランプまたは加温パッドのいずれかを使用して、外科的処置を通じて生理的温度に温めた動物を維持することが推奨されています。
  5. 5%イソフルランで動物を麻酔し、つま先のピンチに応答がないことを確認してください。
  6. 動物の眼に眼軟膏を適用します。
  7. 動物の左側から毛を除去するために10から30秒間脱毛ローションを適用します。背中の1/4に胸の正中線からわずか胸郭の下に腋窩から。
  8. 余分なローションを清掃し、70%アルコールで露出した皮膚を殺菌。
  9. 尾静脈カテーテルにPBSで満たされた無菌の注射器を取り付け、ハーニーによる公開されたプロトコルに従って、所定の位置に挿入し、テープ 46。テープがしっかりと針自体に付着し、尾とテープの間のギャップで無料ではありませんされていることを確認します。
  10. ダスによって発表されたプロトコル。47またはイリノイによる以下のいずれかのマウスを挿管。48
  11. 人工呼吸器の電源をオンにし、毎分135回の呼吸およびイソフルランと酸素の混合物の200μLを供給するように設定します。
  12. 人工呼吸器に気管カテーテルを接続します。
  13. 手術領域にマウスを移動します。カテーテルを除去しないように細心の注意を払ってください。
  14. 前歯の下でマウスの鼻の周りに2-0縫合糸を結びます。
  15. 鼻にカテーテルをテープで固定します。
  16. 手術野の外にそれを維持するためにカテーテルに左前肢をテープで固定します。
  17. 2.5%の保守レベルにイソフルラン麻酔を下げて、つま先のピンチに応答がないことを確認します。
  18. 鋭いハサミを使用して、左胸壁の上に皮膚の1cm 2削除します
  19. リフトトン彼は脂肪パッドを乳腺と焼灼ペンで露出血管を焼灼します。
  20. 鋭いハサミで切断することにより、脂肪パッドを切除。
  21. 鋭いハサミで切断することにより、胸郭に筋層を下に削除します。前肢の付け根に腋窩静脈の走行をカットしないように注意してください。
  22. 6 番目の肋骨をつかみ、持ち上げるために鉗子を使用してください。浅い角度(〜5℃)で開催された鋭いハサミを使用すると、皮膚の開口部の縁の近くにリブをカット。露出した肺組織に触れないよう十分に注意してください。
  23. 4つの連続したリブを除去することによって、全体の肺葉を露出するように胸の壁の開口部を広げます。
    注:心を避けるために少なくとも5ミリメートル離れ胸骨から開放してください。
  24. 慎重に尾と気管カテーテルを把握することにより、マウスを持ち上げ、顕微鏡イメージングステージにマウスを移動します。
  25. 真空をオフにすると、PBSで真空窓のチャンバーを埋めます。
  26. マウスを裏返し、露出して配置します真空画像ウィンドウの上肺。
  27. ゆっくりとボールバルブを使用して、水銀の約3〜5インチの真空をオンにします。
  28. 補足図2に示すように、ステージプレートにマウスやテープの胸の上に二回半分に折り畳まれたティッシュペーパーで作られた拘束ハーネスを配置します。
  29. 動物の大腿にパルスオキシメータの太ももセンサーをクリップし、ソフトウェアを起動します。
  30. ステージ上の環境室を置き、生理的温度でマウスを維持するために熱をオンにします。
  31. 麻酔を維持し、血液の流れを維持するために、1から1.5パーセントにイソフルランのレベルを低下させます。

5.生体内イメージング

  1. カバーガラスの近くに25×0.95の開口数(NA)の対物レンズを持参し、それらの間に水の大きな低下を追加します。
  2. 落射蛍光モードを使用して、FITCチャンネルを表示し、焦点に肺組織をもたらします。
  3. 手術前に行われていない場合は、私尾静脈カテーテルを通してnject腫瘍細胞。
    1. 尾静脈カテーテルからのPBSの注射器を外します。
    2. 腫瘍細胞懸濁液(PBS最大で2×10 7細胞/ ml)100μlの滅菌注射器をロードします。
      注:このステップは、異なる時点での肺への癌細胞の到着を研究するために、事前に行うことができます。
    3. 尾静脈カテーテルに腫瘍細胞を注射器を接続します。
    4. ゆっくり尾静脈に腫瘍細胞を注入します。
    5. 尾静脈カテーテルからの腫瘍細胞を注射器を外してください。
    6. 尾静脈カテーテルにPBS注射器を再接続します。
      注:それは注射後の眼を介してデキストラン信号からの腫瘍細胞を区別することが困難になるとしてデキストランを注入する前に、腫瘍細胞のすべての場所を特定します。
  4. 画像への腫瘍細胞の位置を確認します
    1. 個々の腫瘍細胞を画像化するため、すべての腫瘍細胞を見つけ、目とその位置を記録しますソフトウェアの電子のマルチパネル。
      1. 顕微鏡接眼レンズに腫瘍細胞を観察することにより、画像にビューのすべてのフィールドを検索します。
      2. ソフトウェアでは、マルチポイントのボタンをクリックすることで、マルチパネルに切り替えて、追加位置]ボタンをクリックすることで、セルの位置を格納します。
    2. モザイクイメージングのために、モザイクの起源を見つけ、撮影座標を設定します
      1. 捕獲される構造体の左上隅の位置を見つけます。
      2. ステージコントローラ上「ゼロ」ボタンを押して、ステージのゼロのx、y、zの座標。
      3. 「読み込み」ボタンをクリックしてリストを選択することにより、モザイク座標の適切なリストをロードします。
        注:ビューの500μmのフィールドの20%のオーバーラップを有する2×2モザイクための例のリストは次のようになりますPos.1 =(0,0)、順位。 2 =(400,0)、順位。 3 =(0400)、順位。 4 =(400400)。
  5. シリンジワットを削除しますPBS i番目の尾静脈カテーテル内およびデキストランを含むシリンジと交換してください。
  6. ゆっくりとラインをフラッシュする無菌PBSを50μlを注入し、その後、尾静脈カテーテルを介してマウスにPBSに溶解した20 mg / mlで155 kDaのローダミン - デキストランの100μlにまで注入します。ラインに気泡を導入しないでください。必要なときにマウスに投与し、総体積を4ミリリットル/ kg /時間を超えないように、少なくとも1時間、癌細胞の注射後のデキストランを注入します。
  7. 撮像パラメータを設定します。
    1. 多モードに顕微鏡を切り替えます。
    2. タイミング信号のボタンをクリックするとズーム率のフィールドを更新することによって、2倍の倍率にズームを設定します。
    3. 検出器およびレーザーボタンをクリックし、次に10に津波パワースライダーを調整することにより、〜10%のレーザーパワー(〜10月15日mWのサンプルで)を調整します。
  8. 画像の各位置は、腫瘍細胞の存在を確認し、vascuの流れと完全性を視覚化しますlature。
    注:船舶は完全に流れる赤血球で灌流し、蛍光デキストランは血管外の空間に漏れることなく、血管内に含まれるべきで表示されます。約10 - 20腫瘍細胞を真空窓の開口部内にあると予想されます。
  9. 撮像される各場所の開始の深さを調整します。
    1. それぞれの場所については、画像への腫瘍細胞のトップスライスをステージコントローラ上のフォーカスノブを回転させることにより、zの位置を調整します。
    2. 視野の中心にセルを配置します。
    3. 、マルチボタンをクリックして強調表示し、マルチポイントリスト内のセルの記憶されている位置を交換するには、[削除]ボタンに続いて[追加]をクリックし、視野の位置をクリックします。
    4. 視覚的に各位置での腫瘍細胞の相対的な明るさを観察します。
  10. マルチパネルANに保存]ボタンをクリックすることで、各セルの新しい場所を保存ファイル名を指定しdは。
  11. 個々の腫瘍細胞のイメージングのために、ほぼ同等の明るさの三つのセルを選択し、リスト内のそれらの位置をクリックし、[削除]ボタンをクリックすることで、マルチポイントリストから他のすべてのロケーションを削除します。
  12. 検出器およびレーザーボタンをクリックして、信号が飽和状態の下にあるように、緑と赤のチャンネル45のPMTゲインのスライダを調整します。
  13. マクロファージは、シアン表示されるように、青チャネル45のためのスライダーを調整します。
    注:任意の第二高調波信号のみが青のチャンネルに表示され、以前に45を説明したチャネル減算手順に従ってシアンマクロファージから分離することができます。
  14. 場所にZステージを移動させ、それぞれ開始と終了ボタンをクリックすることで、24μmで0ミクロンと終了深さzスタックの開始深度を設定します。
    注:この深さ内の細胞はに最良の信号を用いて可視化されますノイズや解像度。
  15. 3μmとzのステップサイズを設定します。
  16. 以前に45,49を説明するパラメータを次の撮像パラメータを設定します。
    1. 個々の腫瘍細胞のイメージングのために、タイミング信号のボタンをクリックして、(1.5Xのズーム倍率に相当)ズーム倍率フィールド、フレーム平均フィールドに3を入力し、タイムラプスボタンをクリックして、10を入力に4 Vを入力してくださいタイムラプスフィールドに。
      注:これらの設定は、1フレームごとに3秒を取得します。
    2. モザイク画像化のために、タイミング信号のボタンをクリックして、(4Xのズーム倍率に相当)1.5 Vのズーム倍率を入力し、フレーム平均の数に3を入力して、タイムラプスボタンをクリックして、時間に10を入力します。時間遅延フィールドが失効。
      注:これらの設定は、1フレームごとに3秒を取得します。
  17. そのボタンをクリックしてマルチポイント、zスタックおよびtタイムラプス撮影モードを有効にします。
  18. 画像を取得するために録音ボタンを押してください。
    NOTE:肺組織は非常に繊細で光損傷を受けやすいです。他のフィールドの時間経過イメージング血流が画像化されたフィールドで停止した後、レーザーが最も可能性が高い場合は高すぎるとその後の撮影が低い電力で行う必要があります。
  19. すべての30-45分は、ゆっくりと動物の水和を維持するために、PBSまたは生理食塩水を50μlを注入します。

6.安楽死

  1. 5パーセントにイソフルランを増やします。
  2. それは呼吸と段階から動物を除去するために停止した後、30秒まで5%イソフルランの下で動物を保管してください。
  3. 完全な安楽死を確実にするために頸椎脱臼を実行します。

7.画像解析

  1. 単一細胞イメージング実験のために:
    1. フィジーに画像をロードし、Hyperstackとしてそれらをフォーマットします。
    2. Hyperstackにおける各zスライスの場合は、時間の経過ムービーを再生し、残留XY移動を探します。残留XY移動が検出された場合にスタックにStackReg 36と呼ばれるプラグインを適用します動きを排除します。
  2. モザイクイメージング実験のために:
  3. フィジーに画像をロードし、そのようなディレクトリ、ファイルのベース名、モザイクでxとyフィールドの数と数としてイメージに関するモザイクステッチマクロ(補足コードファイルモザイクステッチ)と入力した情報を開いて、それらを一緒にステッチスライスおよび時間点。
    注:Javaはディレクトリを解釈する方法のため、フォルダ名は、サブフォルダの区切りとして、2つのバックスラッシュを持っている必要があります。内蔵のプラグインペアワイズステッチで制限により、基本ファイル名は任意のダッシュを含めることはできません。
  4. 血管系の境界の明確なビューを取得するには、単一の画像に一緒に血液流路のための時間のすべてのポイントを平均化し、他のチャンネルの動画の各フレームの背景としてこのイメージを複製します。
    注:これは単に血液アベレージを実行するマクロを実行することによって行われます(補足コードファイルは、血液平均化を実行します)。
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Representative Results

この方法を用いて達成することができる結果の種類を示すために、我々は、手術前の時点を変えることでMacBlueマウス44の尾静脈に蛍光タンパク質で標識されたクローバーE0771-LG腫瘍細胞を注射しました。手術後、155 kDのローダミン標識デキストランは、脈管構造とタイムラプス撮影を行ったマークするために静脈内注射しました。

マウス24時間後に注射を画像化すると、単一細胞は、マクロファージおよび単球との相互作用、血管系の内部に表示されます。この例は、図2(a)( 補足動画1)に示されています。それは一過常駐マクロファージ(シアン)と相互作用するように、ここで孤立腫瘍細胞の単一の光学部(緑色)肺深部の血管系内に留まる12μmで5時間と20分かけて結像されます。血管系は、高分子量デキストランによって標識されます。の安定性イメージングフィールドのシーケンシャルzスタック画像を取得することができ、3次元再構成は、( 図2B、 補足動画2)とすることができるようなものです。

モザイク画像化のためのプロトコルに記載の顕微鏡の設定を使用すると、1つの視野よりも大きな構造のイメージングを可能にします。例えば、 図3は、単一転移性病変の買収を実証し、12日には、注射後。肺の表面の下に、25ミクロン( 図3A、右パネル)。この5×5のモザイクは( 補足ムービー3 図3A、左パネル)15で205分の景色の890μmのフィールドを示しています。染色体分離( 図3B、補足によって証明されるように広い視野にもかかわらず、モザイクを構成する基礎となるフレームの高解像度は、単一細胞の有糸分裂などの細胞内イベントの取得を可能にしますムービー4)。

高分子量の血管内注入は、蛍光が標識されていない循環赤血球と白血球がデキストランを閉塞、血管内腔のラベリングにデキストラン結果をラベルされました。肺の小毛細血管では、閉塞が完全デキストラン信号の点滅をもたらし、血管系の境界の定義の損失(; 補足ムービー5図4は 、)です。このプロトコルによって提供される高空間的安定性は、このように一時的な閉塞を復元し、ぶれずに、血液流路の時間平均を可能にします。他の信号チャネルは、その後、容器の境界(; 補足ムービー6 図4、右)のクリアな視界を提供するために、血管系にオーバーレイすることができます。

図1
1: 真空システムのレイアウトハウス真空を利用し、真空レギュレータで定義されたレベルに設定されています。キャプチャフラスコは、体液によってレギュレータと真空システムの汚染を防止します。薄いフレキシブルチューブは、撮像窓の真空ポートに収まるようにピペットチップカットに真空を伝えます。撮像窓は、顕微鏡の対物レンズに関して、その位置安定性を維持し、イメージングプレートで凹溝に嵌合する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: 肺における単一細胞イメージング (A)それでも肺の毛細血管床における単一の腫瘍細胞のタイムラプスムービーから24時間尾静脈後注入。 (赤=血管、緑=腫瘍細胞、シアン=マクロファージ)(B)安定した撮影が時間をかけて撮影データの3次元再構成を可能にします。血管は、明確にするために時間平均されています。 (赤=血管は、グリーン=腫瘍細胞、青=マクロファージ)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: 肺の安定性は、複数の低倍率のフィールドの連続取得やステッチによる肺における高解像度、表示画像の大視野を可能にします (A)のビューの890μmのフィールドを示す5×5のモザイク 12日後、肺表面の下に15ミクロンで取られた腫瘍細胞の尾静脈注射後の肺の転移性病変(左パネル)。右側のパネルには、肺の表面下25μmの時と同じ転移性病変を示しています。 (B)は、個々の高解像度フィールドには、このような染色体のアライメント(黄色の矢印)および細胞分裂の間に分離(赤矢印)のような細胞内のプロセスを明らかにしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4: 未標識赤血球および他の循環細胞は、蛍光シグナルを閉塞する場合を除き、蛍光標識高分子量デキストランマークス血管系の内腔の血管内注入 (A)オクルージョン結果点滅効果不明瞭で得られた時間内に移動し、不完全なラベリングインチ容器の境界。 (B)高真空窓の空間的な安定性は、血液流路は時間が一時的な閉塞に充填し、明らかに血管の境界を画定する、平均化することを可能にします。他のチャネルは、その後、平均化することなく、オーバーレイされる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

まず著者/最後の著者動物手術イメージングのタイプノート
1926 Wearn&ドイツキャッツ胸壁は胸膜層に削減しました。第二の開口部は、ダウン照明用胸膜にダイアフラムを介して行わ。 明視野顕微鏡。 胸膜壁を通って最初の「窓」。
1939 テリーキャッツリブが分離され、注入された。ウィンドウ内の1は、空気が真空に胸部から削除しました。 偏光照明を使用して、両眼や皮膚顕微鏡。 まず、光学窓を移植しました。ウィンドウに組織を描画するために使用される真空。
1963 デ・アルバ&ライナーウサギ&ドッグス一つまたは二つのリブを切除し、1。ウィンドウが挿入され、胸壁に縫合されています。皮膚は、ウィンドウと癒すために許可された動物の上に閉鎖されました。撮影の前に、皮膚は、ウィンドウを公開するために解剖しました。 低MAG(11X)対物レンズを通して使用高速ストロボ映画撮影。 最初の生存ウィンドウ。
1965 ワーグナー&フィレードッグ右前肢は、一つのリブカットを削除し、ウィンドウが挿入され、縫合します。 22Xの目的と反射顕微鏡。 真空なしの最初の比較的動きを無料窓。
ワーグナードッグ一リブに、3切除される窓を注入します。ウィンドウのねじフランジネジが胸壁にシールを形成します。 高倍率100Xの油浸対物レンズとの明視野顕微鏡。 最初のウィンドウは、組織の動きを安定させるために真空を使用します。
1992 Groh&ゲッツウサギ切除つのリブ、。ウィンドウ内の1.2を移植。ウィンドウのねじフランジネジが胸壁にシールを形成します。真空が適用されます。 25Xの対物レンズと落射蛍光顕微鏡。 落射蛍光と真空窓の最初の使用。
1994 Fingar&ウィーマンラット 2リブは。で、1を切除ウィンドウが移植され、胸壁や皮膚に縫合されています。 対物レンズ40倍と落射蛍光顕微鏡。 ラットにおける最初の生存ウィンドウ。
2000 Funakoshi&三井マウス全体胸壁を除去しました。右肺に取り付けられた真空吸引リング。 20Xの目的とした共焦点顕微鏡。 マウスでの真空窓の最初の使用。
2005 ラム&Glenny ラット肺に取り付けられている。ウィンドウ内の削除全体胸壁、1。 20Xの対物レンズと反射と落射蛍光顕微鏡。 ラットにおける真空窓の最初の使用。
2008 田淵&Keubler マウス 3リブが切除され、プラスチックフィルムは、胸の壁の穴をシールするために開口部に適用されます。空気が胸腔カテーテルを介して除去します。 20Xの対物レンズと落射蛍光顕微鏡。 第一は、胸壁の開口部を封止するためにプラスチックフィルムを使用します。

表1:Develのの歴史的調査生体内肺イメージングのWindowsの発。多くの小説生体肺の撮像ウインドウは、最新のが組織安定化のための真空を採用し、細胞内の詳細を明らかにすることができるように十分な高解像度を達成する、マウスでの使用のために小型化されていると長年にわたって開発されてきました。

補足図1:真空画像ウィンドウの設計製図 この図をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2:真空セットアップの写真は 、この図をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図3:デザインDrawiステージプレートインサートのngがこの数字をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図1
補足ムービー1:図2A中の静止画のムービー (右クリックしてダウンロード)。

補足図2
補足移動2:異なる視角と時間をかけて進行を示す、図2(b)に示す3次元再構成のムービー (右クリックしてダウンロード)。


補足ムービー3:肺表面下15μmの時に、図3(a)に示す5×5モザイクのムービー (右クリックしてダウンロード)。

補足図4
補足ムービー4:肺の有糸分裂を受けて、図3Bに示された単一のセルのムービー (右クリックしてダウンロード)。

補足図5
補足ムービー5:図4の映画、閉塞を示す左側のパネルと、fラッシング。(右クリックしてダウンロード)。

補足図6
補足ムービー6:図4の映画、血液平均化後の血管定義の回復を示す右側のパネル (右クリックしてダウンロード)。

補足コードファイル:モザイクステッチ このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足コードファイル:。血液平均化を実行し 、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

例えば、タンパク質や抗体などの蛍光標識された機能タグと組み合わせて、インビボ光学イメージングにおける高分解能が劇的に転移カスケードの我々の理解を増加しています。これは、直接可視化し、単一細胞と腫瘍細胞における小細胞パラメーター、宿主細胞およびそれらの微小環境の定量化を可能にしました。原発腫瘍内のこのイメージングは、例えば、成長の浸潤や播種6,7のいずれかを支持している離散的な微小環境の発見に、つながっています。浸潤の場合、 インビボイメージングは、血管内7,50におけるマクロファージおよび腫瘍細胞の共遊走ストリーミングの優先的な役割を明らかにしました。

肺などのセカンダリサイトでは、腫瘍細胞のシングルと小グループが到着したときに、プリ微小転移の播種段階を含む、転移の初期段階、で腫瘍細胞の挙動のダイナミクスを理解し、血管内皮細胞と相互作用する、唯一の高分解能光学イメージングを用いて達成されます。標準的な臨床イメージングモダリティは、毛細血管床の微細構造または単一細胞の解像度での細胞の形態との相互作用のいずれかを視覚化するために必要な解像度を持っていません。このプロトコルで提示イメージング技術は、この困難なタスクを達成します。

そのような灌流を含む適切な肺生理学、免疫システムへの接続を維持し、細胞動態の静的なビュー以上のものを提供することにより、ex vivoでの肺製剤より表1申し出に重要な利点を列挙したような生体内撮像ウインドウ。真空は、3次元再構成( 図2B)とビューモザイク画像の大規模なフィールドのための機能( 図を可能にする、特定のオファーで窓高度登録画像の取得を可能にする組織の安定性のレベルを安定化UREの3A)。一緒にこれらのはあっても、染色体の分離を明らかにし、休眠と除腫瘍細胞( 図3B)を識別することができるサブセルラービューに、組織形態を与える組織型低倍率ビューから、肺のビューの範囲を提供します。複数の取得チャンネルは、いくつかの細胞型との相互作用を同時に可視化し図2A)ことを可能にします。

プロトコルは、いくつかの技術的なスキルがかかりますが、いくつかの重要なステップとポイントへの実践と注意は、プロシージャの成功率を改善し、最大12時間の撮影時間が期待できます。肺組織がよく窓(ステップ4.25)上の中心になっていることを確認しますすることが重要です。これは、真空が肺組織(ステップ4.27)に均等にかつ完全に適用されることを保証します。組織を中心に失敗すると、組織の運動になります。拘束ハーネス( 補足図2)が Tに使用されO動物がかかり、自然呼吸時に肋間筋の収縮によって誘発される運動を減らします。これは、マウスの上にジャストサイズが、胸を圧迫されてはいけません。あまりにも多くの圧縮は、マウスの減少の生存率で肺の葉だけでなく、心と結果のすべてに圧力をかけます。デキストランは、注射後の肺血管系(ステップ5.8)に流れ観察されない場合、肺組織のいずれかであり、手術中の不適切な取り扱いの損傷または真空レベルが高すぎます。 0.5から1インチ水銀によって真空を低下は、流れが復元されるかどうかを確認するために試みることができます。流れが回復されていない、または流れが存在する場合が、デキストランを血管外に観察された場合、肺組織は、その領域で破損しており、それは、異なる視野画像に必要であろう。撮像領域内の適切な血流の維持は、適切な生理学的に測定されていることを保証することが重要です。酸素は、VASを通じて肺胞の内部から組織に供給されないのでculature、虚血性低酸素症はほとんどありません。それでも、unperfused血管系は、潜在的に変更された酸素/ CO 2のレベルにつながることができ、また、目的の組織に到達する循環白血球を防ぐことができます。赤血球の流れの可視化は、適切な肺機能の指標として用いることができます。肺組織は非常に繊細で光損傷にも敏感です。他のフィールドの時間経過イメージング血流が画像化されたフィールドで停止した後、レーザーが最も可能性が高い場合は高すぎるとその後の撮影が低い電力で行う必要があります。我々は、GFPまたはクローバー(4回の平均輝度を有する)トランスフェクトされた細胞のいずれかを使用した場合、光損傷することなく、十分に明るい画像を生成するために、サンプルに〜10-15のMwを発見しました。蛍光タンパク質の最小輝度レベルは、顕微鏡パラメータおよび細胞における発現レベルに大きく依存しており、経験的にテストする必要があります。

このプロトコルでは、腫瘍細胞は明るいcytoplasで標識されます細胞体とタンパク質( すなわち核 )を除外し、細胞内のスペースのクリアな視界を提供していますマイク蛍光タンパク質。マクロファージは、腫瘍細胞へのトランスジェニックマウスモデル同系を利用することによって標識されます。両方の細胞型を標識することは、リアルタイムでそれらの直接的な相互作用の可視化を可能にします。イメージングの延長期間は、癌細胞は、生理学的に関連するコンテキストで、マクロファージと相互作用する頻度、持続時間および程度の定量化を可能にします。

正しく実行すると、この手順では、最大12時間の期間のために無傷の肺の動き無料、多チャンネル、高分解能、単一細胞イメージングを可能にします。このような電子ズームのための25X 0.95NAおよび多の機能として、高開口数の対物レンズを使用することは、これまでに見られ、肺で最高の解像度光学イメージングを可能にします。

血管内には、蛍光、高分子量デキストランPEを注入しました血管スペースを標識し、その完全性を検証する二重の役割をrforms。 155 kDaのデキストランinterendothelial空間を通って拡散するのを防止するために使用されます。血管外空間への血流のまたは血管漏出の欠如の兆候は、不適切な取り扱いや過度の真空に起因する組織への損傷を示しています。

最後に、ユニークな画像処理技術は、このプロトコルの高い空間的安定性を利用するものを用いることができます。彼らは毛細血管を通過する際、非標識赤血球および他の白血球は蛍光デキストランを除外しているので、この信号は、彼らが作成することを点滅を除去するために、時間をかけて平均化することができます。これは、そうでなければ可能ではない血管系の明確に定義されたビューを提供しています。

この技術の制限事項は、潜在的に動物を弱める疾患の研究のためのその使用を複雑に手術の侵襲性、( 例えば後期転移性癌の両方を含みます急性鎌状赤血球貧血)と、長いとはいえ(12時間まで、それは単一に使用制限手術が端末であるという事実)、イメージングセッション。また、撮像セッションの長い持続時間およびマウス51の低い肝グリコーゲン予備与え、グルコース補充実験バイアスの潜在的な原因を回避するために与えられてもよいです。

このプロトコルは、潜在的にリアルタイムで他の構造や細胞型を標識するために、の代わりに、またはデキストランの他のいずれかの注射可能な蛍光標識抗体を用いて変更することができます。これは、リアルタイムで直接腫瘍細胞 - 宿主細胞の相互作用とダイナミクスを可視化することにより、腫瘍の微小環境を分析し、解剖のための機能を拡張します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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