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Immunology and Infection

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Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp. (116), e54612, doi:10.3791/54612 (2016).

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Abstract

Introduction

बहु सेलुलर बैक्टीरियल समुदायों प्राकृतिक और मानवजनित वातावरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और फायदेमंद या अत्यधिक हानिकारक हो सकता है। ये बहु-कोशिकीय कालोनियों biofilms, जिसमें व्यक्ति की कोशिकाओं का एक स्वयं उत्पादित कोशिकी polymeric पदार्थों (ईपीएस) मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं के रूप में जाना जाता है। ईपीएस दृढ़ता से सतह वे उपनिवेश स्थापित करने की कोशिकाओं पालन करें। वे यांत्रिक और रासायनिक ताकतों के खिलाफ एक ढाल के रूप में सेवा और सेलुलर संचार की सुविधा 1 पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ संपर्क बनाने। एक biofilm एक विभेदित समुदाय, जहां कोशिकाओं को विनियमित अत्यधिक उपयोग के रूप में देखा जा सकता है, प्रजातियों 2-5 भर के रूप में समुदाय के भीतर उनकी गतिविधियों का समन्वय करने के लिए, साथ ही प्रक्रियाओं करवाया। एक biofilm राज्य के लिए एक planktonic, मुक्त रहने वाले विकास के मोड से संक्रमण अक्सर विकास की प्रक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है। एक अच्छा उदाहरण है ग्राम पॉजिटिव मृदा जीवाणु बेसिलस subtilis, और इसलिए एक undome हैsticated तनाव विकासात्मक biofilm गठन के लिए अग्रणी चरणों का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मॉडल जीव के रूप में कार्य करता है। इस जीवाणु में, गतिशील कोशिकाओं विशिष्ट बहुकोशिकीय संरचनाओं कि विशेष कार्य 4 बाहर ले जाने में खुद को व्यवस्थित। कोशिकाओं के एक समूह, मैट्रिक्स उत्पादकों exopolysaccharides 6 छिपाना, amyloid प्रोटीन TASA 7,8, और सतह hydrophobicity प्रोटीन BslA 9,10; जो सभी के ईपीएस 11-13 की सभा में भाग लेते हैं।

प्राकृतिक और मानवजनित आलों में biofilms की बहुतायत और ख्यात घातक नुकसान वे पैदा कर सकता है को देखते हुए, एक दबाने उनके निर्माण को रोकने के लिए तरीके खोजने की जरूरत नहीं है। छोटे अणु inhibitors नए नियामक रास्ते, एंजाइम और संरचनात्मक biofilm गठन में शामिल प्रोटीन की खोज में सहायता कर सकते हैं, और इस तरह बहुकोशिकीय समुदाय विधानसभा की जटिल प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि को बढ़ावा देने के। बी के रूप में subtilis जैव के लिए एक अच्छी तरह से अध्ययन मॉडल हैफिल्म निर्माण 14,15, यह विभिन्न biofilm अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन के चार मौलिक तरीकों कि छोटे अणु अवरोधकों को biofilms की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं tackles। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि इन अवरोधकों एक biofilm-विशिष्ट लक्ष्य है, biofilm गठन पर प्रभाव से planktonic विकास पर प्रभाव की जुदाई महत्वपूर्ण है। अधिकांश जीवाणुरोधी एजेंटों उनके planktonic विकास के चरण में कोशिकाओं को लक्षित है, लेकिन अणुओं है कि biofilm जीवन शैली लक्ष्य दुर्लभ हैं। इसके अतिरिक्त, के रूप में अणुओं है कि planktonic विकास को प्रभावित नहीं करते विषाक्त नहीं हैं, वे एंटीबायोटिक प्रतिरोधी म्यूटेंट 16 के पक्ष में चयनात्मक दबाव को कम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, जब biofilms डी-एमिनो एसिड या कुछ अन्य सेल दीवार दखल अणुओं के साथ व्यवहार कर रहे हैं, वे या तो परेशान कर रहे हैं या disassembled, लेकिन इन अवरोधकों केवल हल्का planktonic विकास 12,17 प्रभावित करते हैं। इसके विपरीत, कई एंटीबायोटिक दवाओं के नाटकीय रूप से, planktonic विकास ख़राब एल के साथittle या biofilm गठन 17 पर कोई प्रभाव नहीं।

दूसरा, छोटे अणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सुसंगत और मजबूत प्रयोगात्मक ढांचा स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमने देखा है कि छोटे अणु अवरोधकों के सक्रिय एकाग्रता रेंज पूर्व संस्कृति की स्थिति को और प्रयोगात्मक इन छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल सेटअप करने के लिए संवेदनशील था। विभिन्न रिपोर्टों, विशेष रूप से उन बी अध्ययन चल बैक्टीरियल biofilms 12,17-19 - subtilis, एकाग्रता रेंज में बदलाव, जिस पर डी-एमिनो एसिड pellicles के गठन को बाधित पता चला। , पूर्व संस्कृति की स्थिति (लघुगणक 12,17 बनाम देर से स्थिर विकास के चरण 20), मध्यम विकास प्री-संस्कृति हालत में इस्तेमाल किया (अमीर: यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि निम्न कारक सक्रिय एकाग्रता रेंज में मतभेद के लिए खाते में अपरिभाषित [Luria शोरबा, पौंड] बनाम परिभाषित [मोनोसोडियम ग्लूटामेट-glycerol, MSgg]), टीका अनुपात और टीका से पहले प्री-संस्कृति के माध्यम से विशेष रूप से हटाने की। स्थिर पतली झिल्ली विकास का तापमान छोटे अणु अवरोध डी-leucine, एक प्रतिनिधि डी-एमिनो एसिड इस अध्ययन में इस्तेमाल की गतिविधि रेंज में एक कम महत्वपूर्ण भूमिका दिखाया।

अंत में, एक बार biofilms विशिष्ट biofilm निरोधक, मजबूत और सूचनात्मक तरीकों biofilm फिटनेस पर इन अवरोधकों के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए आवश्यक हैं के साथ व्यवहार कर रहे हैं। एक biofilm कॉलोनी और रोगाणुरोधी एजेंटों के लिए उनके प्रतिरोध के भीतर एकल कक्षों पर (1) प्रभाव: यहाँ, दो तरीकों स्वतंत्र रूप से छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव को चिह्नित करने के बारे में विस्तार से बताया गया है। Biofilms में कोशिकाओं को आमतौर पर अधिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी जब मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया 21-23 की तुलना में कर रहे हैं। हालांकि इस घटना multifactorial है, ईपीएस की क्षमता एंटीबायोटिक पैठ को कम करने के लिए अक्सर एक अपील स्पष्टीकरण 24 के रूप में माना जाता था

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Protocol

1. पतली झिल्ली और biofilm कॉलोनी गठन पर छोटे अणु inhibitors के प्रभाव का आकलन

  1. कैल्शियम क्लोराइड और लोहे (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate बिना परिभाषित biofilm उत्प्रेरण MSgg मध्यम 25 की एक 2x समाधान तैयार है। फिल्टर नसबंदी के बाद, कैल्शियम क्लोराइड जोड़ें। मध्यम सीधे उपयोग करने के लिए तैयार है या यह अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. प्रयोग के दिन पर 1x MSgg कमजोर पड़ने को तैयार है।
    1. 2x MSgg मध्यम पतला बाँझ आसुत जल (pellicles) या बाँझ 3% गर्म (80 डिग्री सेल्सियस) अगर (biofilms) के साथ 1x और 50 सुक्ष्ममापी (pellicles) या 250 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए लोहे (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate जोड़ने के लिए ( biofilms)। एंटीबायोटिक दवाओं या छोटे अणु अवरोधकों वांछित एकाग्रता के लिए जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। उदाहरण के लिए, 30 मिलीलीटर में 0.5 मिमी डी-leucine के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, pellicles या biofilms की स्थापना के लिए एक 76.3 मिमी (10 मिलीग्राम / एमएल) डी-leucine स्टॉक समाधान के 196.6 μl जोड़ें।
      नहींते। अंतिम 1x MSgg रचना तालिका 1 में वर्णित मूल नुस्खा 25 की तुलना में, मध्यम निहित 50 माइक्रोग्राम / एमएल threonine और ठोस MSgg माध्यम पर biofilm कालोनियों विकसित करने के लिए लोहे की एकाग्रता झुर्रियों कॉलोनी आकृति विज्ञान अनुकूलन करने के लिए 2.5x वृद्धि की गई थी ।
  3. अगर की solidification के बाद, 30-45 मिनट टीका करने के लिए पूर्व के लिए एक जैविक हुड में ठोस MSgg प्लेटें सूखी।
  4. विशिष्ट अवरोधकों कि पतली झिल्ली गठन (चित्रा 1) के तंत्र के साथ हस्तक्षेप का चयन करने के लिए, कि इस्तेमाल किया सांद्रता planktonic और स्थिर विकास को प्रभावित शासन से बाहर।
    1. स्थिर विकास के चरण तक हर घंटे 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा एक सरल विकास की अवस्था में planktonic विकास (तरल संस्कृति में समय के साथ ऑप्टिकल घनत्व में वृद्धि) निर्धारित करते हैं।
    2. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि मापा संस्कृति में गंदगी को लाइव कोशिकाओं की गिनती का प्रतिनिधित्व करता है, कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या का निर्धारण (CFU)कई बार अंक के बाद एक मिलाते हुए संस्कृति से planktonic विकास के चरण में कोशिकाओं की।
    3. 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति में अच्छी तरह से, वर्गों 1.7-1.9 में वर्णित के रूप में एक ही परिस्थितियों में टीका से 23 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर पतली झिल्ली विकास, एक 3 दिन ऊष्मायन के अंत में फसल की कोशिकाओं पर छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए और CFU का निर्धारण। इस पर नियंत्रण के लिए, एक पतली झिल्ली की कमी तनाव है कि operons बाह्य मैट्रिक्स घटकों के लिए एन्कोडिंग अभाव का उपयोग (यानी, बी subtilis Δ epsH, Δ TASA)।
      नोट: इस तनाव स्थिर शर्तों के तहत बढ़ रही करने में सक्षम है, लेकिन एक पतली झिल्ली के गठन जंगली प्रकार के विपरीत, यह तरल हवा इंटरफेस है, जहां विकास की वृद्धि हुई ऑक्सीजन का स्तर 26 के कारण पक्ष में है करने के लिए नाव की क्षमता की कमी है। इस प्रकार, इस कोशिकी मैट्रिक्स और पतली झिल्ली की कमी तनाव स्थिर शर्तों के तहत विकास का आकलन करने के लिए एक सिफारिश संदर्भ तनाव है।
      नोट: विशिष्ट पूर्व सैनिकों के लिएगैर विहित डी-एमिनो एसिड डी-leucine की पर्याप्त नीचे, सांद्रता उस के साथ पतली झिल्ली गठन 12,17 से इंकार किया था दखल पर planktonic और स्थिर विकास पर एक प्रभाव का वर्णन किया। तरीकों planktonic और स्थिर विकास को निर्धारित करने के लिए विस्तार 17 में वर्णित हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. एक मजबूत प्रयोगात्मक स्थापना की पहचान के लिए वैचारिक सिंहावलोकन biofilm गठन के विशिष्ट निषेध का आकलन करें। छोटे अणु अवरोधकों कि planktonic विकास पर स्पष्ट प्रभाव के बिना biofilm गठन के साथ विशिष्ट हस्तक्षेप से संकेत मिलता है के लिए चयन मानदंड। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।

  1. बाहर बी स्ट्रीक एक -80 डिग्री सेल्सियस से शेयर subtilis (पौंड cultuफिर से 10 9 कोशिकाओं / एमएल 20% ग्लिसरॉल में जमे हुए) एक बाँझ टिप या applicator छड़ी के साथ एक लेग 1.5% अगर प्लेट पर एकल कालोनियों को अलग-थलग करने के लिए।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए आगे बढ़ें।
  3. महत्वपूर्ण कदम: इस तरह के डी-leucine के रूप में गैर विहित डी-एमिनो एसिड से एक मजबूत पतली झिल्ली निषेध के लिए, एक भी कॉलोनी लेग 1.5% अगर थाली से 3 मिलीग्राम लेग शोरबा में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए एक में उठाया हो जाना इनक्यूबेटर मिलाते (झटकों की गति 200 आरपीएम)। 6000 XG पर 4 मिनट के लिए 1.5 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति centrifuging, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 1.5 मिलीलीटर MSgg माध्यम में गोली फिर से निलंबित द्वारा टीका करने से पहले biofilm उत्प्रेरण MSgg माध्यम के साथ लेग शोरबा बदलें। संस्कृति के बाकी खारिज किया जा सकता है।
    महत्वपूर्ण: प्रणाली की मजबूती सुनिश्चित करने के लिए, धोया स्टार्टर संस्कृति के 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल घनत्व 0.6 और 1 के बीच होना चाहिए।
  4. स्टार्टर संस्कृति के विकास के दौरान, एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति multidish प्लेट containin तैयार3 जी के बिना या छोटे अणु अवरोध (जैसे, 0.3, 0.5, 1 मिमी डी-leucine 17) की एकाग्रता रेंज के साथ MSgg माध्यम की मिलीलीटर। बढ़त प्रभाव शासन से बाहर करने के लिए, multidish थाली भर में विभिन्न सांद्रता के स्थान वितरित। वैकल्पिक रूप से, 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति multidish MSgg माध्यम की 1.5 मिलीग्राम से युक्त प्लेटों का उपयोग करें।
  5. (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) धोया स्टार्टर संस्कृति के 3 μl के साथ 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति multidish थाली के कुओं टीका लगाना।
    नोट: एक कम कमजोर पड़ने अनुपात, यानी, 1: 500 का इस्तेमाल किया जा सकता है। इस pellicles के विकास के समय कम हो जाती है।
  6. तीन दिनों के लिए स्थिर शर्तों के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर pellicles आगे बढ़ें। इस समय के दौरान pellicles कदम नहीं है, के रूप में यह पतली झिल्ली की अंतिम सतह आकृति विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं।
  7. बिजली की एक दूरबीन और समरूप जोखिम के साथ चित्रों मोल। वैकल्पिक रूप से, एक उच्च संकल्प कैमरा के साथ pellicles की एक तस्वीर ले लो। inconsis की वजह से कलाकृतियों से बचने के लिएतम्बू प्रकाश कोण और छाया, कैमरा एक तिपाई पर तय साथ ऊपर से नीचे तस्वीरें ले और दोनों पक्षों से 45 डिग्री पर एक नरम और बड़े प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
    नोट: बी अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका subtilis बहुकोशिकता ठोस, biofilm उत्प्रेरण MSgg माध्यम पर biofilm कॉलोनी परख है। pellicles की तरह, इस परख spatiotemporal प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है। एक बार जब छोटे अणु अवरोधकों के सक्रिय सीमा निर्धारित किया जाता है, biofilm कॉलोनी गठन पर उनके प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है।
  8. 8.5 सेमी व्यास का पेट्री डिश प्रति 4 बूँदें - biofilm कालोनियों विकसित करने के लिए, संतुलित रूप से (1.7 कदम) एक टेम्पलेट की मदद से सूखे MSgg 1.5% अगर प्लेट पर मैला पूर्व संस्कृति के 1.5 μl हाजिर। बूंदों उन्हें जाने से पहले प्लेट को सोखना करते हैं।
    ध्यान दें: टेम्पलेट क्षेत्र के भीतर biofilm कालोनियों जहां कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं की एक समान वितरण प्राप्त करने में मदद करता है। टेम्पलेट तैयार करने के लिए, मूल तराजू पर विकास का कुल क्षेत्रफल आकर्षित यह बराबर संप्रदाय को विभाजितओआरएस और केंद्र के निशान। 8.5 सेमी व्यास का एक दौर पेट्री डिश के लिए, यह 14 सेमी 2 करने के लिए एक biofilm कॉलोनी प्रदान करती है।
  9. तीन दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। इस समय के दौरान, biofilm कालोनियों को विकसित करने और एक तीन आयामी, झुर्रियों वाली संरचना के रूप में।
  10. कदम 1.11 के रूप में तस्वीरें ले लो।

2. इथेनॉल प्रतिरोध परख

  1. कदम 1.1-1.7 और 1.12-1.14 में वर्णित के रूप में biofilms आगे बढ़ें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 68 घंटे के बाद, एक रेजर ब्लेड और टेम्पलेट की मदद से दो बराबर भागों में biofilm कालोनियों में कटौती।

चित्र 2
चित्रा 2. उदाहरण स्टरलाइज़ एजेंटों के लिए biofilm कॉलोनी कोशिकाओं के प्रतिरोध का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन। (ए) एक पेट्री डिश भर में biofilm कालोनियों के समान वितरण के लिए और काटने के लिए इस्तेमाल किया टेम्पलेट। (बी)इलाज जंगली प्रकार biofilm के ऊपर से नीचे छवियों 30 डिग्री सेल्सियस पर ठोस, परिभाषित biofilm उत्प्रेरण MSgg माध्यम पर 68 घंटे के लिए वृद्धि हुई है। इज़ाफ़ा कैसे एक biofilm कॉलोनी दो बराबर हिस्सों में काटा जा सकता है पता चलता है। (सी) दो बराबर हिस्सों biofilm समान रूप से व्यवहार कर रहे हैं (नियंत्रण, पीबीएस) या तो पीबीएस या एजेंट स्टरलाइज़ के साथ और के रूप में वर्णित संसाधित। स्केल पट्टी:। 1 सेमी कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

  1. ध्यान से एक छोटा सा रंग के साथ अगर थाली से biofilm कॉलोनी के प्रत्येक आधा उठा और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 500 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए यह कदम। यदि आवश्यक हो, थाली से शेष कोशिकाओं परिमार्जन और साथ ही microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण।
    नोट: biofilm कॉलोनी की दूसरी छमाही, विभिन्न व्यवहार किया जाता है कि क्या यह नियंत्रण है पर निर्भर करता है या steri के लिए प्रतिरोध का परीक्षण करने के लिएLIZING एजेंटों।
  2. नियंत्रण के लिए, 2.3 कदम के रूप में 500 μl पीबीएस में biofilm कॉलोनी की दूसरी छमाही सेते हैं। स्टरलाइज़ एजेंटों के लिए प्रतिरोध का आकलन करने के लिए, 500 μl 50% (v / v) इथेनॉल के लिए biofilm कॉलोनी की दूसरी छमाही के हस्तांतरण।
    नोट: इस तरह के रूप में सोडियम हाइपोक्लोराइट वैकल्पिक स्टरलाइज़ एजेंटों का इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रयुक्त सभी स्टरलाइज़ एजेंटों के लिए, एक प्रारंभिक प्रयोग में सक्रिय एकाग्रता और ऊष्मायन समय का निर्धारण।
  3. कमरे के तापमान पर पीठ टॉप पर 10 मिनट के लिए biofilm कालोनियों सेते हैं।
  4. 18,000 XG पर 5 मिनट के लिए biofilm कालोनियों अपकेंद्रित्र और ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पीबीएस के 300 μl जोड़ें।
  5. एक sonicator के microtip के साथ कोशिकाओं को हल्का (आयाम 10%, नाड़ी 5 सेकंड) Sonicate।
    नोट: sonication ऊर्जा अलग biofilm समुच्चय के लिए पर्याप्त होना चाहिए। हालांकि, बहुत कठोर sonication कोशिकाओं lyse सकता है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी कि sonication ऊर्जा द्वारा अग्रिम में पुष्टिइस्तेमाल कोशिकाओं lyse नहीं है और सभी समुच्चय भंग कर रहे हैं कि।
  6. 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए पीबीएस के 700 μl जोड़ें। पीबीएस में एक धारावाहिक कमजोर पड़ने (10 -7 के लिए) प्रदर्शन और एक लेग 1.5% अगर बाँझ ग्लास मनकों का उपयोग प्लेट पर 3 dilutions के 100 μl फैल गया।
    नोट: इष्टतम dilutions चढ़ाया जा करने के लिए, एक प्रारंभिक प्रयोग में निर्धारित किया जाना चाहिए के रूप में इस स्टरलाइज़ एजेंट के जवाब में ब्याज और कोशिकाओं के जीवित रहने की दर के biofilm कॉलोनी में कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करता है।
  7. 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें सेते CFU गिनती और CFU / एमएल का निर्धारण। अंतिम CFU / प्रत्येक आधा biofilm कालोनियों के मिलीलीटर से, बचे के प्रतिशत की गणना।
    नोट: जब प्रदर्शन किया और विश्लेषण के रूप में वर्णित है, नियंत्रण biofilm कॉलोनी के दो हिस्सों और बनाम इलाज biofilm कॉलोनी व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती में 10% से नीचे मतभेद उपज चाहिए की इथेनॉल का इलाज आधे अनुपचारित, समरूपता या कॉलोनी के प्रतिरोध की पुष्टि करने , respectively। वैकल्पिक रूप से, परिणाम की कुल CFU में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। नियंत्रण और इलाज biofilm कॉलोनी की कोशिकाओं की गिनती परिमाण के उसी क्रम में रहना चाहिए। इसके विपरीत, एक छोटा सा अणु का इलाज biofilm कॉलोनी के इथेनॉल का इलाज आधे की कोशिकाओं की गिनती स्टरलाइज़ एजेंट के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए दावा करने के परिमाण के दो आदेशों की एक न्यूनतम द्वारा ड्रॉप करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं।

3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए Biofilm कालोनी नमूना तैयार

  1. कदम 1.1-1.7 और 1.12-1.14 में वर्णित के रूप में biofilm कालोनियों के लिए आगे बढ़ें।
  2. 2% (वी / वी) glutaraldehyde, 3% (वी / वी) 100 मिमी सोडियम cacodylate में paraformaldehyde समाधान, 5 मिमी कैल्शियम क्लोराइड बफर, पीएच 7.3 की एक ताजा बैच तैयार करें। 8.5 सेमी व्यास के हर पेट्री डिश के लिए लगानेवाला के 5 मिलीलीटर तैयार करें।
    चेतावनी: glutaraldehyde और paraformaldehyde खतरनाक हैं। उन्हें एक रासायनिक हुड के अंदर सुरक्षा उपकरणों के साथ संभाल। Haz के समाधान और दूषित सामग्री त्यागेंardous बर्बादी।
  3. ध्यान से biofilms के शीर्ष पर सीधे वितरण के बिना, biofilm कालोनियों के लिए लगानेवाला जोड़ें।
    नोट: biofilm कॉलोनी के हाइड्रोफोबिक चरित्र कारण, कालोनियों धीरे धीरे अगर से अलग और फ्लोट करने के लिए शुरू करते हैं।
  4. ध्यान से Parafilm की एक पट्टी के साथ प्लेटों सील। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर सेते हैं और बाद में रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेटों हस्तांतरण।
  5. अगले दिन, ध्यान से एक पाश्चर कांच एक वैक्यूम पंप से जुड़ा पिपेट के साथ तरल हटा दें।
  6. ध्यान से biofilm धोने और 5 मिनट के लिए सेते 10 मिलीलीटर 100 मिमी सोडियम cacodylate, 5 मिमी कैल्शियम क्लोराइड बफर जोड़ें। धीरे biofilm हानिकारक से बचने और कोमल pipetting द्वारा नए सिरे से धोने के समाधान जोड़ने के लिए थाली के कोने से पाश्चर कांच विंदुक के साथ तरल हटा दें। यह कदम एक बार दोहराएँ।
  7. Biofilm कालोनियों के निर्जलीकरण के लिए, निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ना: DDH 2 हे में 2x 5 मिनट; 3 में 2x 20 मिनट0% इथेनॉल; 2x 20 से 50% मिन इथेनॉल; 2x 20 से 70% मिन इथेनॉल; 2x 20 96% मिन इथेनॉल; 2x 100% इथेनॉल में 30 मिनट।
    1. प्रत्येक चरण में 8.5 सेमी व्यास के हर पेट्री डिश के लिए तरल के 15 मिलीलीटर जोड़ें और ध्यान से प्रत्येक ऊष्मायन के बाद तरल हटा दें।
  8. इथेनॉल से नमूने सुखाने के लिए दो अलग-अलग विधियों का उपयोग करें।
    1. इथेनॉल से हवा सुखाने के लिए:
      1. एक सेल्यूलोज फिल्टर तिमाहियों में कागज (9 सेमी के व्यास) में कटौती। संक्षेप में 100% इथेनॉल में एक चौथाई डूब, और फिर ध्यान से इसे पर एक अस्थायी biofilm कॉलोनी हस्तांतरण। एक फिल्टर पेपर के साथ लाइन में खड़ा एक पेट्री डिश में गीला फिल्टर पेपर रखो। पेट्री डिश कवर और biofilm कालोनियों एक रासायनिक हुड में सूखे रात भर करते हैं।
    2. महत्वपूर्ण बिंदु (सीपी) संक्रमण तरल पदार्थ के रूप (सीओ 2) कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग -drying के लिए:
      1. 100% इथेनॉल के साथ महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की मशीन चैम्बर के 75% भरें। अपने स्वयं के सी में प्रत्येक नमूना एक धारक में नमूने स्थानांतरण,hamber। यदि आवश्यक हो, छोटे टुकड़ों में कैंची से biofilm काटा। सब से निपटने के दौरान नमूने इथेनॉल में डूबे हुए छोड़ दें। फिर, चैम्बर में धारक हस्तांतरण और कसकर चैम्बर बंद।
      2. 7 डिग्री सेल्सियस के लिए चैम्बर कूल और सरगर्मी शुरू करते हैं। तरल सीओ 2 के साथ पूरी तरह से चैम्बर भरें। एक 7 मिनट ऊष्मायन समय के दौरान, सीओ 2 के साथ इथेनॉल मिश्रण करते हैं। फिर, समाधान के 25% का निर्वहन।
        नोट: नमूना के स्तर से नीचे चैम्बर खाली नहीं है।
      3. दोहराएँ कदम 3.8.2.2 चार बार।
      4. दोहराएँ कदम 3.8.2.2 केवल 5 मिनट की एक ऊष्मायन समय के साथ पांच बार। अंत में, इथेनॉल पूरी तरह से सीओ 2 के द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।
      5. अंतिम दौर, चैम्बर का केवल 5% खाली दौरान। सरगर्मी और ठंडा बंद कर दें। 42 डिग्री सेल्सियस के लिए चैम्बर हीटिंग शुरू। 31.1 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 73.9 बार के दबाव में, तरल सीओ 2 अपनी महत्वपूर्ण बिंदु, राज्य पहुंचता है जहां गैसीय पीएचएएसई विलायक 27 के तरल चरण के रूप में ही घनत्व है। एक बार जब तापमान 42 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, 10 मिनट के लिए सेते हैं। 42 डिग्री सेल्सियस से कम, सीओ 2 कक्ष में सुपरक्रिटिकल गैस के रूप में मौजूद है।
        नोट: लगातार चैम्बर के दबाव की जाँच करें। दबाव 42 डिग्री सेल्सियस से कम 120 बार से अधिक नहीं होनी चाहिए।
      6. धीरे-धीरे निरंतर हीटिंग के साथ गैस जारी करने के लिए शुरू करो। इस सीओ 2 -gas चरण में नमूने रहता है और तरल सतह तनाव के माध्यम से नमूना आकृति विज्ञान की विकृति से बचाता है। पैमाइश वाल्व प्रवाहमापी को नियंत्रित करने के ठीक ट्यूनिंग द्वारा 5 एल / घंटा प्रवाहमापी सेट करें। जब तक सभी कक्ष में दबाव जारी की है रुको। अब कक्ष खोलने के लिए और ध्यान से धारक से नमूने निकालें।
  9. कोट कार्बन टेप के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ठूंठ। चिमटी की मदद से, ध्यान से ठूंठ पर biofilm कालोनियों हस्तांतरण। कार से एक पतली पुल जोड़कर ठूंठ करने के लिए प्रत्येक कॉलोनी कनेक्टबॉन टेप, जो इलेक्ट्रॉन बीम के तहत आरोप उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण है। इस स्तर पर, देखभाल के साथ biofilm कालोनियों को संभालने के रूप में वे बहुत कमजोर हैं। कम से कम 24 घंटे के लिए या जब तक परीक्षा Desiccator में नमूनों की दुकान।
  10. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ परीक्षा के दिन, धूम-कोट 2 मिनट के लिए biofilm कालोनियों एक स्वर्ण-पैलेडियम धूम-coater में एक 60 डिग्री के कोण में। इस कदम दो बार दोहराएँ और बीच में 120 डिग्री से बारी बारी से नमूने। अंत में, धूम-कोट नमूने एक बार ऊपर से 3 मिनट के लिए। 20 एनएम सोने पैलेडियम की पतली परत चालकता में सुधार और SEM में इमेजिंग के लिए नमूने के विपरीत बढ़ाता है।
  11. Desiccator में नमूने की दुकान एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 29,30 के साथ इमेजिंग तक नमूना 28 के पुनर्जलीकरण से बचने के लिए।

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Representative Results

पतली झिल्ली परख बी के उच्च विनियमित और गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक विधि है subtilis बहुकोशिकता। इस के अलावा, पतली झिल्ली परख एक प्रयोग में एक एकल कोशिका-संस्कृति multidish थाली में या तो पूर्व स्टार्टर शर्तों या छोटे अणु सांद्रता का एक सीमा का परीक्षण करने के लिए अनुकूल है। हालांकि, बी subtilis पतली झिल्ली गठन के पूर्व संस्कृति की स्थिति के प्रति संवेदनशील है (उदाहरण के लिए, पूर्व संस्कृति के विकास का माध्यम है और इसके विकास के चरण), टीका अनुपात और पूर्व संस्कृति के माध्यम से हटाने की। इसलिए हम पहले एक प्रयोगात्मक सेटअप है कि हमें डी-leucine से पतली झिल्ली निषेध पुन: पेश करने की अनुमति के लिए जांच की। हमारे परिणाम बताते हैं कि डी-leucine द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पतली झिल्ली निषेध यदि कोशिकाओं झटकों के साथ 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मध्य लघुगणक विकास के चरण (3 मिलीलीटर लेग में एक कॉलोनी को अपरिभाषित, अमीर लेग माध्यम में पूर्व सुसंस्कृत प्राप्त किया जा सकता ), नीचे काता और एक 1 से पहले परिभाषित MSgg माध्यम में फिर से निलंबित: 1,000 inoculatआयन (चित्रा 3 ए)। जब कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए 1 मिलीलीटर लेग में मध्य लघुगणक विकास के चरण (एकल कॉलोनी को MSgg माध्यम में बड़े हो रहे थे, फिर से पतला 1: 100 3 मिलीग्राम MSgg करने के लिए, और 5 घंटे के लिए उगाया 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 पर झटकों के साथ आरपीएम), पूर्व संस्कृति के माध्यम से हटाने डी-leucine गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं था। स्थिर विकास के चरण के लिए विकसित कोशिकाओं (2 घंटे के लिए 1 मिलीलीटर लेग में एकल कॉलोनी, फिर से पतला 1: 100 3 मिलीग्राम MSgg करने के लिए, और कमरे के तापमान पर एक रोलर में करने के लिए 20 घंटे के लिए बड़े हो) और पहले MSgg माध्यम में धोया टीका कम संवेदनशील थे। हालांकि, डी-leucine की पतली झिल्ली निषेध प्रभाव के प्रति प्रतिरोध में इस वृद्धि के पूर्व संस्कृति के उच्च सेल घनत्व के कारण हो सकता है, टीका अनुपात बढ़ रही है। MSgg माध्यम में स्थिर विकास, यानी करने के लिए पूर्व-संस्कृति का टीका अनुपात, 1: 500 या 1: 1,000, डी-leucine की गतिविधि रेंज और पतली झिल्ली विकास के समय (चित्रा 3 बी) को प्रभावित किया। डी-leucine से पतली झिल्ली निषेध हुआविभिन्न विकास तापमान (23 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस, चित्रा -3 सी) पर। महत्वपूर्ण बात है, जबकि डी-leucine के लिए कोशिकाओं की संवेदनशीलता को प्री-संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है, अलग तापमान पर घटना के reproducibility यह दर्शाता है कि छोटे अणु डी-leucine से पतली झिल्ली निषेध मजबूत सुविधाओं की है।

चित्र तीन
पूर्व संस्कृति के विकास से प्रदूषणों से (ए) को हटाने: चित्रा 3. उदाहरण परिणाम है कि डी-leucine से पतली झिल्ली निषेध पर विभिन्न प्री-संस्कृति की स्थिति के प्रभाव को दिखाने के कई मापदंडों सहित एक मजबूत प्रयोगात्मक स्थापना, प्राप्त करने के लिए मूल्यांकन किया जाना है मध्यम (बनाम धोया धोया नहीं), पूर्व संस्कृति के विकास मध्यम (अमीर, अपरिभाषित लेग माध्यम या परिभाषित biofilm उत्प्रेरण MSgg मध्यम), और पूर्व संस्कृति के विकास राज्य (बनाम स्थिर विकास के चरण लघुगणक), (प्री-संस्कृति की 500) अंतिम पतली झिल्ली मध्यम विकास में, और (सी) विकास तापमान (23 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 30 डिग्री सेल्सियस) बी: बी) टीका अनुपात (1: 1,000 बनाम 1। subtilis NCIB 3610 कोशिकाओं (धोया मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस पर या झटकों के साथ रात भर में कमरे के तापमान (ओ / एन) में 4 घंटे के लिए संकेत दिया है (पौंड या MSgg) में बड़े हो रहे थे, और पूर्व संस्कृति के माध्यम MSgg द्वारा बदल दिया गया था, तो संकेत दिया या नहीं धोया)। अंत में, स्टार्टर संस्कृति 1 inoculated किया गया था: 1,000 नहीं तो अन्यथा न कहा और pellicles तीन दिनों के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर शर्तों के तहत बड़े हो रहे थे। ऊपर से नीचे तस्वीरों एक कैमरा के साथ हासिल किया गया। खैर व्यास 22 मिमी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्री-संस्कृति की स्थिति की पहचान और एक प्रयोगात्मक सेटअप है कि डी के एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गतिविधि श्रृंखला के लिए अनुमति देने के बादपतली झिल्ली गठन पर -leucine (पूर्व संस्कृति एक मध्य लघुगणक विकास के चरण, MSgg में धोया पौंड में हो, 1 पतला: 1,000 और तीन दिनों के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर होता है) जो प्रभाव इसकी मजबूती के लिए परीक्षण किया गया था। उस प्रयोजन के लिए, पतली झिल्ली गठन पर डी-leucine की गतिविधि विभिन्न संशोधित MSgg मीडिया (चित्रा 4) में मूल्यांकन किया गया था। पतली झिल्ली निषेध में डी-leucine की गतिविधि सीमा पांच मीडिया में लगातार परीक्षण किया गया था, और पता चलता है कि पतली झिल्ली गठन पर डी-leucine के प्रभाव मजबूत है। ऐसा ही एक प्रवृत्ति डी-Tyrosine, जहां एकाग्रता में पतली झिल्ली निषेध रेंज के लिए 2 माइक्रोन कई संशोधित MSgg मीडिया (कम लोहे की एकाग्रता और अमोनियम क्लोराइड या ग्लूकोज के साथ कार्बन स्रोत, डेटा नहीं के साथ नाइट्रोजन स्रोत के प्रतिस्थापन में लगातार था के साथ मनाया गया दिखाया गया है)।

चित्रा 4
चित्रा 4 डी-leucine के प्रति संवेदनशीलता में होता हैविभिन्न विकास मीडिया। दिखाया बी के ऊपर से नीचे तस्वीरें हैं subtilis NCIB 3610 pellicles, परिभाषित, biofilm उत्प्रेरण MSgg माध्यम में या अलग संशोधित MSgg मीडिया (कार्बन स्रोत 0.5% ग्लूकोज में 23 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर शर्तों के अधीन हो; नाइट्रोजन स्रोत 0.5% (एनएच 4) 2 अतः 4; उच्च लौह 250 सुक्ष्ममापी FeCl 3; तीन दिनों के लिए कम ग्लिसरॉल 0.125% ग्लिसरॉल), वैकल्पिक नाइट्रोजन स्रोत मध्यम (जहां pellicles या तो बिना या संकेत दिया सांद्रता में डी-leucine के साथ पांच दिनों के लिए बड़े हो रहे थे) को छोड़कर। स्टार्टर संस्कृतियों अपरिभाषित, अमीर लेग माध्यम में झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे। टीका करने से पहले, कोशिकाओं centrifugation द्वारा धोया और इसी पतली झिल्ली मध्यम विकास में resuspended थे। स्टार्टर संस्कृति 1 पतला था: 1,000, अच्छी तरह से व्यास 22 मिमी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक वैकल्पिक तरीका बी अध्ययन करने के लिए subtilis बहुकोशिकता ठोस MSgg माध्यम पर biofilm कॉलोनी परख है। pellicles की तरह, इस परख spatiotemporal प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है। एक बार जब छोटे अणु अवरोधकों के सक्रिय सीमा पतली झिल्ली प्रणाली में चुना गया है, biofilm कॉलोनी गठन पर उनके प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है। इस अध्ययन में, biofilm कालोनियों, स्टरलाइज़ एजेंटों के लिए biofilm कालोनियों के प्रतिरोध पर डी-leucine के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया क्योंकि biofilm कालोनियों कम नाजुक होते हैं और ठोस पृष्ठभूमि पर, वे हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं। डी-leucine के साथ इलाज किया biofilm कालोनियों 10 मिनट के लिए 50% इथेनॉल के लिए सामने आ रहे हैं, जीवित कोशिकाओं का प्रतिशत नाटकीय ढंग से इलाज अंश (चित्रा 5) की तुलना में बूँदें। इस विधि अन्य छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव और जीवाणुनाशक एजेंटों के लिए प्रतिरोध पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है (STERILizing एजेंट या एंटीबायोटिक)।

चित्रा 5
एक स्टरलाइज़ एजेंट के खिलाफ इलाज या इलाज biofilm कॉलोनी प्रतिरोध की चित्रा 5. उदाहरण का परिणाम है। बी के Biofilm कालोनियों subtilis NCIB 3610 ठोस, परिभाषित माध्यम पर साथ या बिना 0.5 मिमी डी-leucine, 30 डिग्री सेल्सियस पर 68 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे। दो बराबर हिस्सों में कालोनियों को काटने के बाद, एक आधा पीबीएस (आंतरिक नियंत्रण) और 50% इथेनॉल या पीबीएस (नियंत्रण) के साथ दूसरे आधे के साथ इलाज किया गया था। हल्के sonication, सीरियल कमजोर पड़ने, चढ़ाना और कॉलोनी बनाने इकाइयों की गिनती के बाद, आंतरिक नियंत्रण की तुलना में जीवित बचे लोगों का प्रतिशत गणना की गई। दिखाया गया हैं दो (ए) या तीन (बी, सी) replicates और उनके मानक विचलन के औसत के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों का परिणाम है। कृपया यहाँ क्लिक करें टीओ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक शक्तिशाली उपकरण है कि biofilm कॉलोनी झुर्रियां, बहुतायत और ईपीएस के स्थानीयकरण और एकल कक्ष आकृति विज्ञान 31 के स्थानिक संरचना पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। SEM इमेजिंग के नमूने है कि उच्च वैक्यूम के तहत imaged किया जा सकता की आवश्यकता है। उच्च वैक्यूम की स्थिति के तहत नमूने की जांच करने के लिए, सभी थोक पानी के अणुओं को हटा दिया है, और इसलिए, SEM इमेजिंग नमूना इमेजिंग के लिए पहले की निर्जलीकरण की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, नमूने पर्यावरण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ESEM), जहां हाइड्रेटेड नमूना धीरे खुर्दबीन कक्ष में सूख जाता है के द्वारा गीला मोड में कम निर्वात की स्थिति के तहत imaged किया जा सकता है। biofilm कॉलोनी वास्तुकला, ईपीएस संगठन और सेल आकृति विज्ञान पर छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, नमूना निर्जलीकरण के तीन अलग अलग प्रकार की तुलना में थे: गीला मो तहत माइक्रोस्कोप में सुखानेडी की स्थिति (ESEM), हवा सूखे एक विलायक या महत्वपूर्ण बिंदु (सीपी) से संक्रमण के तरल पदार्थ के रूप में कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर ड्राइड। इलाज और डी-leucine इलाज बी में subtilis biofilm कालोनियों अलग हाइड्रेशन चरणों इस्तेमाल किया विधि के अनुसार मनाया जा सकता है। ESEM द्वारा गीला मोड में कम निर्वात की स्थिति के तहत इमेजिंग biofilm कॉलोनी के बहुत ही स्वाभाविक राज्य संरक्षित। हालांकि, एकल कोशिका आकृति विज्ञान और ईपीएस बहुतायत और वास्तुकला के बारे में जानकारी, दुर्लभ था के रूप में ईपीएस अभी भी पूरी तरह से हाइड्रेटेड थे और कोशिकाओं ईपीएस में एम्बेडेड थे (डेटा) नहीं दिखाया। निर्जलीकरण के संदर्भ में, सीपी सुखाने सबसे कड़े प्रक्रिया थी। यह ऊतक से सबसे संरचनात्मक रूप से बाध्य और थोक पानी के अणुओं को हटा दिया, 30-70% की मात्रा घटाने के लिए लेखांकन, ऊतक 32 के आधार पर। इसके विपरीत, हवा सुखाने बाध्य पानी के अणुओं को संरक्षित। उदाहरण के लिए एक भ्रूण ऊतक अस्थिर विलायक इथेनॉल से हवा सुखाने के बाद इसकी मात्रा का 18% खो दिया है और 59% के बाद सीपी सुखाने 32 (चित्रा 6A) । Biofilm कालोनियों कि इथेनॉल और साथ निर्जलित थे भी सी.पी. सूखे उनके तीन आयामी संरचना संरक्षित है, और EPS एक मकड़ी के जाल (चित्रा 6C) की तरह दिखाई दिया। हवा सूखे और सी.पी. सूखे नमूनों में biofilm कॉलोनी वास्तुकला पर छोटे अणु अवरोध डी-leucine का प्रभाव, एकल कोशिका आकृति विज्ञान और ईपीएस संरचना स्पष्ट (चित्रा 6B और डी) थे। biofilm डी-leucine की उपस्थिति में वृद्धि हुई कॉलोनियों में छोटे थे और झुर्रियों को कम स्पष्ट थे। डी-leucine इलाज कोशिकाओं लम्बी कर रहे थे, एक phenotype कि obse हैसेल की दीवार को लक्षित अणुओं 33 के साथ इलाज किया कोशिकाओं में rved। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं स्पष्ट रूप से कम ईपीएस के साथ कवर किया गया और कसकर ईपीएस इलाज biofilm कालोनियों के रूप में देखा के माध्यम से अपने पड़ोसी की कोशिकाओं से जुड़ा नहीं है। प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि biofilm कॉलोनी निर्जलीकरण के दोनों तरीकों, हवा सूखे इथेनॉल या से कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर सी.पी. सूखे के रूप में संक्रमण तरल पदार्थ एकल कक्ष आकृति विज्ञान पर छोटे अणुओं के प्रभाव पर बहुमूल्य अंतर्दृष्टि दे, साथ ही ईपीएस बहुतायत पर और वास्तुकला।

चित्रा 6
चित्रा 6 छोटे अणुओं biofilm कॉलोनी वास्तुकला के बड़े और छोटे पैमाने बदल सकते हैं। बी के Biofilm कालोनियों subtilis NCIB 30 डिग्री सेल्सियस पर अनुपस्थिति में 3610 हो (ए और डी) या (बी और डी) 72 घंटे के लिए 0.5 मिमी डी-leucine की उपस्थिति मेंठोस MSgg माध्यम पर के रूप में निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित और इथेनॉल से सूखे के रूप में उतारना चाहते थे: (ए और बी) हवा सूखे और (सी और डी) CP-सूखे संक्रमण तरल पदार्थ के रूप में कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर। दिखाया biofilm कालोनियों के दूरबीन छवियों (छोड़ दिया, ऊपरी पैनल) नीचे ऊपर हैं, सूखे biofilm कालोनियों की तस्वीरों के नीचे शीर्ष इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्टब्स पर मुहिम शुरू की सोने-पैलेडियम कोटिंग (छोड़ दिया है, कम पैनल), निम्न और उच्च आवर्धन करने से पहले SEM द्वारा अधिग्रहीत छवियों biofilm कॉलोनी झुर्रियां या एकल कक्ष आकृति विज्ञान / ईपीएस संगठन के 3 डी वास्तुकला दिखाने के लिए। स्केल सलाखों बाएं से दाएं:। 5 मिमी, 100 माइक्रोन, 2 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1.925 मिमी मटकाassium फॉस्फेट अकेले आधार
3.075 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय
100 मिमी 3- (एन -morpholino) propanesulfonic एसिड, पीएच 7.1
2 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate
700 सुक्ष्ममापी कैल्शियम क्लोराइड निर्जल
50 माइक्रोन के एक लोहे (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate
125 माइक्रोन के बी
1 माइक्रोन जस्ता क्लोराइड निर्जल
2 माइक्रोन thiamine हाइड्रोक्लोराइड
50 माइक्रोग्राम / एमएल नियासिन
50 माइक्रोग्राम / एमएल फेनिलएलनिन
50 माइक्रोग्राम / एमएल threonine
0.5% (वी / वी) ग्लिसरॉल निर्जल
0.5% (w / v) एल glutamic एसिड मोनोसोडियम लवण हाइड्रेट
पतली झिल्ली परख के लिए एक; biofilm परख के लिए

तालिका 1. अंतिम 1x MSgg इस अध्ययन में इस्तेमाल रचना।

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Discussion

बेसिलस subtilis रूपों मजबूत और उच्च संरचित biofilms तरल में दोनों (pellicles) और ठोस माध्यम पर (कालोनियों)। इसलिए, यह विशिष्ट biofilm अवरोधकों की कार्रवाई की विधा को चिह्नित करने के लिए एक आदर्श मॉडल जीव के रूप में कार्य करता है। ठोस मीडिया पर, कोशिकाओं विशिष्ट सुविधाओं है कि pellicles में स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, किनारे करने के लिए केंद्र से radiating झुर्रियों की तरह साथ बहुकोशिकीय संरचनाओं के रूप में। इस प्रकार, pellicles और कालोनियों बी अध्ययन करने के लिए पूरक व्यवस्था कर रहे हैं subtilis बहुकोशिकता।

इस अध्ययन का लक्ष्य एक बी को विकसित करने के लिए है biofilm (pellicles और कालोनियों) निषेध के लिए subtilis मॉडल प्रणाली। कई कदम biofilm अशांति निबंध के reproducibility के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक पहला महत्वपूर्ण कदम पुष्टि करने के लिए कि biofilm गठन पर प्रभाव planktonic जीवन शैली में उगाया बैक्टीरिया के लिए एक सामान्य विषाक्तता की वजह से नहीं है। इस रूप का एक दिया एकाग्रता के प्रभाव की तुलना द्वारा विचार किया जा सकताplanktonic विकास पर इस अणु के प्रभाव के सापेक्ष biofilm निषेध पर मॉल अणु अवरोध करनेवाला। biofilm विकास पर एक नाटकीय रूप से मजबूत प्रभाव लक्ष्य तंत्र है कि biofilms के विकास के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं की पहचान सुनिश्चित कर सकते हैं। इसके अलावा, यहाँ बताया अध्ययन pellicles के विकास और छोटे अणुओं को उनकी संवेदनशीलता को प्री-संस्कृति की स्थिति के महत्व को दर्शाता है। छोटे अणुओं, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत प्रयोगात्मक शर्तों (जैसे, पतली झिल्ली विकास तापमान और मीडिया रचना के प्रति संवेदनशीलता की कमी) उनके प्रभाव का परीक्षण करने के प्रभाव निस्र्पक पहले परिभाषित किया जाना चाहिए। इस तरह की स्थितियों को खोजने के लिए प्री-संस्कृति हालत की मीडिया, पूर्व संस्कृति, पूर्व संस्कृति मीडिया को हटाने, विकास तापमान और विकास मीडिया के विकास के चरण पर विचार किया जाना चाहिए।

एक बड़ी चुनौती है, एक बार biofilm गठन के लिए एक विशिष्ट अवरोध पाया जाता है, मात्रात्मक मिल रहा हैऔर गुणात्मक तरीकों जो biofilm विकास और प्रतिरोध पर इन छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव की विशेषताएँ। इधर, दो महत्वपूर्ण तरीके विस्तार है कि इस तरह के अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में वर्णित हैं। सबसे पहले, हम एक सरल तरीका है कि मात्रात्मक reproducibly बनाम इथेनॉल जैसे bactericides को इलाज कॉलोनी biofilms, इलाज के प्रतिरोध की जांच कर सकते हैं परिचय। प्रतिनिधि परिणाम 50% इथेनॉल के लिए डी-leucine इलाज biofilm कालोनियों की संवेदनशीलता के लिए दिखाए जाते हैं। हालांकि, इस निबंध को आसानी से अलग स्टरलाइज़ एजेंट या एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग से संशोधित किया जा सकता है। दूसरा, एक SEM विधि विस्तार है कि biofilm कई पूरक के स्तर में छोटे अणु अवरोध की वजह से कॉलोनी में परिवर्तन के उच्च संकल्प परीक्षा की अनुमति देता में वर्णित है: समग्र संरचना, संगठन और ईपीएस मैट्रिक्स की बहुतायत और उसके घटकों, और biofilm भर में एकल कोशिका morphologies। हम ध्यान दें dehydrati की है कि दो तरीकों(100% इथेनॉल या सीपी सुखाने संक्रमण तरल पदार्थ के रूप में कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करने से हवा सुखाने) पर एक biofilm कॉलोनी के SEM नमूना तैयार करने के दौरान समान रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है biofilm नमूना के सफल निर्धारण काफी हद तक biofilm कॉलोनी के hydrophobicity पर निर्भर करता है। इस hydrophobicity बी का अभिन्न विशेषता है subtilis हाइड्रोफोबिक सतह परत 10,34 के कारण biofilms।

कई दृष्टिकोण पहले से इस्तेमाल किया गया था बी के साथ biofilm विधानसभा और विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में 35 subtilis। स्वतंत्र अध्ययन का एक नंबर biofilm विकास 36-38 पर मीडिया रचना के प्रभाव का प्रदर्शन किया। अब तक हालांकि, biofilm निषेध पर मीडिया रचना के प्रभाव की एक व्यवस्थित मूल्यांकन हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए किया गया था, कमी है। यह अध्ययन यह दर्शाता है कि जब बी के पतली झिल्ली निषेध छोटे अणुओं द्वारा subtilis पूर्व संस्कृति की स्थिति के प्रति संवेदनशील है, यह ऊना हैतापमान और मीडिया रचना, और इस तरह छोटे अणु अवरोधकों के व्यवस्थित स्क्रीन के लिए उपयोगी के प्रभाव से ffected। इसके अलावा, हम एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक विधि की स्थापना की जीवाणुरोधी एजेंटों के इलाज या छोटे अणु अवरोध का इलाज biofilm कालोनियों के प्रतिरोध का आकलन करने के लिए, वर्तमान में biofilm मॉडल जीव बी में कमी subtilis।

फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ संयोजन में बी subtilis biofilms छोटे अणु अवरोधकों कि biofilm गठन की या तो एक विशिष्ट विकासात्मक कदम या biofilm के भीतर कोशिकाओं की एक विशिष्ट उप-जनसंख्या के लक्ष्य के लिए देखने के लिए आगे ले जाया जा सकता है। इस के साथ साथ वर्णित विधि biofilm भीतर जीन अभिव्यक्ति के मामले में एकल कक्ष संकल्प प्रदान नहीं करते। बी भीतर ईपीएस मैट्रिक्स जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए तरीके एकल कोशिका के स्तर पर subtilis biofilms सफलतापूर्वक 39 स्थापित किए गए थे।

बैक्टीरियल biofilms crucia के हैंकृषि, औद्योगिक और नैदानिक ​​सेटिंग में एल महत्व। एक कृषि संदर्भ में क्षमता biofilms फार्म के लिए कई संयंत्र के संयंत्र मेजबान बसाना रोगज़नक़ों 40, और एक नैदानिक संदर्भ में, biofilms स्वाभाविक रोगाणुरोधी एजेंटों 21 के लिए प्रतिरोधी रहे हैं और कई लगातार और क्रोनिक बैक्टीरियल संक्रमण के मूल में हैं बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह अब स्वीकार किया है कि biofilms उद्योग को भारी लागत निहितार्थ हैं के रूप में वे दूर करने के लिए बेहद मुश्किल हो जाता है और 41 नियंत्रित करते हैं। इस प्रकार, माइक्रोबियल biofilm अवरोधकों के अध्ययन के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचे के विकास के लिए महत्वपूर्ण कृषि 42,43, 21,44 नैदानिक, और तकनीकी 45-47 प्रगति प्रदान करेगा।

मौजूदा तरीकों बी को सीमित कर रहे हैं subtilis। हम साथ ही अन्य प्रजातियों में biofilm-विशिष्ट छोटे अणु अवरोधकों अध्ययन करने के लिए वर्णित मात्रात्मक और गुणात्मक अवधारणाओं निम्नलिखित प्रोत्साहित। इसके साथ - साथ इस अध्ययन डी-leucine द्वारा biofilm निषेध के लिए एक विशिष्ट उदाहरण से संबंधित है, कई विशिष्ट biofilm अवरोधकों से बाहर पहले से 17 प्रकाशित किया। महत्वपूर्ण बात है, डी-leucine पहले से ही संयंत्र रोगज़नक़ Xanthomonas citri 48 में एक विरोधी biofilm अणु के रूप में होती थी, संयंत्र उपनिवेशवाद और biofilm गठन के बीच संभव समानता पेश किया। Biofilm गठन (पतली झिल्ली और झुर्रीदार कॉलोनी गठन) भी आम है मानव रोगजनकों में (जैसे, Pseudomonas aeruginosa 49-51 और uropathogenic कोलाई 52,53)। वर्णित विधि विशिष्ट दवाओं है कि biofilm गठन को बाधित और नैदानिक ​​अनुसंधान के क्षेत्र में रोगाणुरोधी एजेंटों के लिए biofilm की मध्यस्थता प्रतिरोध को कम करने के लिए खोज करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, तरीकों यहाँ वर्णित एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रजातियों में biofilm-विशिष्ट छोटे अणु अवरोधकों अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक अवधारणाओं को विकसित करने के लिए।

NT "> सारांश में, हम एक सरल और उपयोगी उपकरण बॉक्स है कि biofilm अवरोधकों का अध्ययन करने के बी subtilis का उपयोग करने में संभावित शक्तियों और उससे होने वाले नुकसान को दर्शाता है प्रदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth, Lennox Difco 240230
Bacto Agar Difco 214010
potassium phosphate monobasic  Sigma, 136.09 g/mol P0662-500G
potassium phosphate dibasic  Fisher Scientific, 174.18 g/mol BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Fisher Scientific, 209.27 g/mol BP308-500
magnesium chloride hexahydrate  Merck, 203.30 g/mol  1.05833.0250
calcium chloride anhydrous J.T. Baker, 110.98 g/mol 1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma, 197.91 g/mol 31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate  Sigma, 270.30 g/mo) F2877-500G
zinc chloride anhydrous  Acros Organics, 136.29 g/mol 424592500
thiamine hydrochloride Sigma, 337.27 g/mol T1270-100G
L-tryptophan Fisher Scientific, 204.1 g/mol BP395-100
L-phenylalanine Sigma, 165.19 g/mol P5482-100G
L-threonine Sigma, 119.12 g/mol T8625-100G
glycerol anhydrous Bio-Lab Itd 712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate  Sigma, 169.11 g/mol G1626-1KG
D-leucine Sigma, 169.11 g/mol 855448-10G
ethanol anhydrous Gadot 830000054
razor blade Eddison NA
circular cellulose filter papers Whatman, 90 mm 1001-090
glutaraldehyde EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water 16220
paraformaldehyde  EMS, 16% in water 15710
sodium cacodylate Merck, 214.05 g/mol  8.2067
calcium chloride 2-hydrate Merck, 147.02 g/mol  1172113
stub-aluminium mount EMS, sloted head 75230
carbon adhesive tape EMS 77825-12
Shaker 37 °C New Brunswick Scientific Innowa42 NA
Centrifuge Eppendorf table top centrifuge 5424 NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip Branson NA
Incubator 30 °C Binder NA
Incubator 23 °C Binder NA
Filter System, 500 ml, polystyrene Cornig Incorporated NA
Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II Boekel NA
S150 Sputter Coater  Edwards NA
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC NA
Environmental Scanning Electron Microscope XL30 ESEM FEG Philips (FEI) NA

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References

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