Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, H., Huang, J., Liu, X., Zhu, P., Li, Z., Li, X. Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54625, doi:10.3791/54625 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Alle dieren gebruik worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Boston Children's Hospital.

1. Monstervoorbereiding

  1. Timed paring
    1. Plaats een C57Bl6 wild type man en een vrouw samen in dezelfde kooi.
    2. Controleer voor de vorming van een paring stekker begin volgende ochtend. De paring stekker (aka, vaginaal of copulatie stekker) is een geharde gelatine-achtige afzetting dat blokkeert de vagina.
    3. Stel de stekker datum als embryonale dag 0,5 (e0.5).
  2. Isolatie van muizenembryo's
    1. Euthanaseren zwangere vrouwtjes door CO 2 stikken.
    2. Zet muizen liggende op een absorberend kussen en spuit buikstreek met 70% ethanol.
    3. Til de huid en maakt een eerste 5 mm incisie in het caudale buikstreek met behulp van chirurgische schaar. Snijd en verwijder de buikhuid om de interne organen volledig bloot
    4. Snijd de buurt vagina om de gehele baarmoeder verwijderen.
    5. Knip tussen implantatie bezienswaardigheden langs de baarmoeder hoorn. Elk segment of conceptus zou slechts één embryo binnen te hebben.
    6. Houd de baarmoeder segmenten 1x ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. embryo dissectie
    1. Plaats elke conceptie in een aparte schaal met ijskoud PBS onder een stereoscoop.
    2. Verwijder de baarmoeder weefsels, placenta en vruchtvliezen sequentieel met behulp van fijne ontleden tang.
    3. Breng de ontleed embryo naar een 50 ml buis met 1x ijskoud PBS met een grote overdracht pipet. Vermijd het oppakken van embryo rechtstreeks met een tang om weefselschade te minimaliseren.
  4. bevestiging
    1. Bevestig de embryo ontleed in 10% neutraal gebufferde formaline oplossing bij 4 ° C gedurende meer dan 24 uur met ten minste 10 monstervolumes fixatief.
  5. voorbehandeling
    1. Bereid de Clearing Oplossing: 4M ureum, 10% glycerol, 4% natriumdodecylsulfaat (SDS) in dubbel gedestilleerd water.
    2. Vervang het fixeermiddel met de Clearing Solution.
    3. Voorzichtig zwenken het monster op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 weken. Ruil de Clearing Solution eenmaal op de tweede en de derde dag. Het monster wordt langzaam helder en doorzichtig.
    4. Vervang de Clearing Solution met 10% formaline en laat op een rocker voor 2 dagen.
  6. uitdroging
    1. Was de voorbehandelde monsters met 1x PBS 3 maal gedurende 5 minuten elk.
    2. Dehydrateren monsters in een oplopende reeks ethanol bij kamertemperatuur op een zachte rocker. Voor E15.5 embryo Gebruik een oplopende ethanolreeks zoals 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% en 100% ethanol, 2 uur elke stap. Voor oudere embryo's, de incubatietijd te worden verhoogd.
  7. kleuring
    1. Bereid kleuring Oplossing: voeg 0,1375 gram Eosine Y Disodium Salt en 0,0275 gram Acridineoranje hemi (zinkchloride) zout aan 50 ml 100% ethanol. Roer gedurende 2 uur. Filter met een papieren filter. Bewaar bij kamertemperatuur en licht te vermijden door het bedekken met aluminiumfolie.
    2. Transfer monster tot het kleuroplossing gedurende 1 uur.
    3. Vervang met verse kleuroplossing en vlek 's nachts.
  8. infiltratie
    1. Bereid Infiltratie Oplossing: combineer 100 ml van oplossing A van JB-4 inbedding kit, 1,25 g katalysator C, 0,275 g eosine Y dinatriumzout en 0,055 g Acridineoranje hemi (zinkchloride) zout. Roer te mengen (200 rpm) in een ijsemmer gedurende 2 uur, en vervolgens filteren met de filter papier.
    2. Bewaar de Infiltration oplossing bij 4 ° C en licht te vermijden door het bedekken met aluminiumfolie.
    3. Breng de embryo infiltratie oplossing: kleuroplossing (1: 1), en incuberen gedurende ten minste 3 uur op een rocker bij 4 ° C.
    4. Breng de embryo's infiltratie oplossing en incubeer gedurende 3 uurr op een rocker in een koude kamer.
    5. Vervang Infiltratie oplossing eenmaal per dag, en laat in een koude kamer op een zachte rocker nog drie dagen.

2. Embedding

  1. Houd Oplossing B en Infiltration Solution op ijs.
  2. Maak Embedding Solution (1:25 van de oplossing B en Infiltration Solution) onmiddellijk voor het inbedden.
  3. Orient het model in een inbedding mal en giet koud Embedding Oplossing in de inbedding mal voorzichtig. Re-oriënteren met een pin als dat nodig is.
  4. Gebruik een pen om te onderzoeken of de Embedding Solution is gestold. Duw het monster blok, en trim deze indien nodig.
  5. Heroriënteren het monster blok met de aparte vorm van een kruis oriëntatie te verkrijgen.
  6. Liep blokhouder bovenop de matrijs insluiten. Giet Embedding Oplossing in de mal totdat de schimmel en het blok houder worden overspoeld door insluiten Solution.
  7. Houd het monster in een secundaire container en laat hetop ijs gedurende 3-4 uur in een zuurkast.
  8. Bewaar de gestolde monsters in een 4 ° C.
  9. Afpellen de inbedding mal. Zet het blok onder de stereomicroscoop met schuine verlichting om de positie van het model in het blok te inspecteren. Op het blok gezicht, mark rasterlijnen rond het monster.
  10. Trim het blok om de toegang hoeveelheid te verwijderen van het inbedden van materiaal met behulp van de gemarkeerde rasterlijnen als gevonden.

3. Image Acquisition

  1. Klem het monster blok aan het microtoom en het verkrijgen van een vers gesneden oppervlak. Stel coupedikte (bv e9.5-10.5, 1,5 micrometer, e11.5-12.5, 2,0 micrometer, e13.5-15.5, 2,5 micrometer, E16.5-ouder, 3 pm). Houd het monster / blok aan de uitgangspositie van de microtoom.
  2. Monteer de stereo zoom microscoop horizontaal tegenover het blok oppervlak van het monster.
  3. Zet de computer en de microscoop, en beginnen met het beeld acquisitie software.
  4. Visualiseren en de focus van de optiek om het blok-faceonder de "live view" -modus van imaging software.
  5. Lijn microscoop en microtoom indien nodig opdat het blok-face is in het centrum van zoeker.
  6. Stel de zoom in zodat het hele blok-gezicht is in de zoeker.
  7. Kies groen fluorescerend eiwit (GFP) filter (excitatie 470 ± 20 nm, dichroic 495 nm, emissie 525 ± 25 nm) en te heroriënteren indien nodig.
  8. Meet en stel de belichtingstijd handmatig (bijvoorbeeld, 80-400 mini sec).
  9. Acquire beelden van het blok-face na elke vers gesneden en afbeeldingen automatisch op te slaan, indien mogelijk.
  10. Record belangrijke parameters zoals resolutie, coupedikte en zoom.
  11. Na het afronden van het gehele monster, export en converteren van alle beeldbestanden naar JPEG-formaat indien nodig.
  12. Omkeren alle originele beelden met behulp van een imaging processing software, en de helderheid en het contrast aan te passen.
  13. Bewaar alle bewerkte beelden in een aparte map.

4. 3Dvisualisatie

  1. Upload alle bewerkte beelden naar een 3D-visualisatie software volgens de instructies.
  2. Input-resolutie en coupedikte om alle beelden te volumetrische gegevens (dwz, voxel grootte) converteren en opslaan van de 3D-bestand.
  3. Lijn alle foto's met behulp van de automatische modus. Stel afzonderlijke beelden handmatig indien nodig.
  4. Sla de uitgelijnde afbeelding voor een nieuwe bestandsnaam.
  5. Analyseer morfometrische kenmerken van het model met behulp van de 3D-visualisatie software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben hoge kwaliteit HREM beelden van muizenembryo's tussen E9.5 en E13.5 8 gerapporteerd. Beeldkwaliteit van de late gefaseerde embryo echter aanzienlijk aangetast door de beperkte penetratie van de fluorescente kleurstof eosine. Om de kleuring efficiëntie te verhogen, hebben we verschillende voorbehandeling methoden die compatibel zijn met fluorescerende beeldvorming 11 zijn getest. In het bijzonder werden de E15.5 muis embryo's behandeld met SCA / e A2 12 of Whole-Body CUBIC 13. We hebben ook getest de vereenvoudigde formule, de Clearing oplossing (4 M ureum, 10% glycerol en 4% natriumdodecylsulfaat). Alle voorbehandelingsmethoden verhoogde kleuring efficiëntie. Embryo's werden doorschijnend na 1 week van de behandeling met de Clearing Solution. Geen duidelijke weefselschade werd waargenomen na de behandeling. De voorbehandelde embryo's werden verwerkt door middel van stappen met inbegrip van uitdroging, vlekken en infiltratie voordat ze embedded in de plastic inbedding media. HREM beelden werden overgenomen van de ingesloten monster zoals hierboven beschreven in paragraaf 3 (Image Acquisition) en weergegeven met behulp van een 3D-visualisatie software. Een voorbeeld van hele bevestigingsvlak gezien E15.5 embryo aangetoond gedetailleerde morfologische eigenschappen van de huid zoals whiskers pads en ontwikkelen haarfollikels (figuur 1). Resolutie van de virtuele doorsnede vergelijkbaar met histologische coupe (figuur 2).

Figuur 1
Figuur 1:. 3D Surface Uitzicht op E15.5 Embryo Het toont de gedetailleerde morfologische kenmerken van de huid. De ontwikkeling van haarzakjes (kleine witte stippen) zijn duidelijk zichtbaar, waaruit blijkt een hoge resolutie van het beeld. Klik hier om te zien een grotere version van dit cijfer.

Figuur 2
Figuur 2:. De Virtual doorsnede van Midline afdeling van het E15.5 Embryo De interne structuren, met inbegrip van het hart, de lever, darmen en blaas zijn duidelijk zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een gemodificeerd protocol gebruikt routine laboratoriumapparatuur serial HREM op die compatibel zijn voor een snelle 3D visualisatie en morfometrische analyse van complexe structuren te verkrijgen. Omdat de beelden met hoge resolutie direct uit het blok gezicht in plaats van afzonderlijke secties worden genomen, worden de fijne morfologische kenmerken bewaard gebleven en snel digitaal gereconstrueerd in een 3D-visualisatie programma.

3D beeldvorming biedt belangrijke voordelen visualiseren en begrijpen van complexe morfologische kenmerken. De meeste 3D-imaging technieken zijn afhankelijk van gespecialiseerde apparatuur 1-4. Daarentegen EFIC en HREM imaging gebruik alleen standaard laboratoriumuitrusting waaronder een stereomicroscoop uitgerust met een digitale camera en een microtoom 14. Functionele koppeling tussen microscoop en microtoom maakt automatisering van het beeld overname stelt automatisering van het gehele beeld overnameproces. Wij hebben echter aangetoond datfunctionele koppeling is niet verplicht 8. In plaats daarvan, we gewoon mount de stereomicroscoop horizontaal, zodat het direct gezichten aan het blok gezicht van een standaard microtoom in de rust aanslag. De belangrijkste beperking van deze eenvoudige opstelling is dat de HREM afbeeldingen handmatig worden genomen. We hebben geschat dat het duurt ongeveer 5 seconden per beeld op het gemiddelde. Een andere beperking is dat individuele afbeelding kan van de ene positie naar de andere, maar dit is geen probleem omdat zij gemakkelijk in 3D-reconstructie worden uitgelijnd.

Met de HREM technologie, hebben we een reeks 3D-beelden van muizenembryo's van E9.5 tot E13.5 geanalyseerd en ontdekt een nieuw mechanisme waardoor de solitaire embryonale cloaca transformeert in twee afzonderlijke structuren, het distale spijsverteringskanaal en de lagere urinewegen traktaten 8. Kwaliteit van de HREM beelden van de late geënsceneerde embryo's is beperkt te wijten aan inefficiënte penetratie van eosine (gegevens niet getoond). Om weefsel Wand en vergrotenatie van E15.5 en E18.5 embryo's, hebben we gebruik gemaakt van twee verschillende voorbehandeling methoden die compatibel zijn met fluorescerende beeldvorming 11 bent en testte een nieuwe formule, de Clearing Solution (4 M ureum, 10% glycerol en 4% SDS). Al deze werkwijzen hebben aanzienlijke verbetering van de penetratie en eosine kleuring getoond. Een belangrijke overweging voor en na voorbehandeling is dat het specimen gevoelig voor huid opzwellen of krimpen door osmotische druk. Om de plotselinge verandering van de osmotische druk te beperken daardoor verminderen weefsel vervorming, raden wij geleidelijke uitwisseling van de oplossing. Daarnaast vonden we dat het opnemen van ethanol aanzienlijk helpt (de stap 1.5.4). Gedurende infiltratie en inbedding stappen, is het belangrijk om het monster tegen licht en bij 4 ° C.

Collectief, dit protocol gebruikt routine laboratoriumapparatuur om HREM beelden, die geschikt is voor een hoge resolutie 3D-visualisatie en morfometrische analyse te verwerven. Het protocol should gemakkelijk worden aangepast in een standaard laboratorium setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson Laboratory C57BL6
Ethyl Alcohol Pharmco-Aaper 111000200 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin Sigma HT501128-4L
Urea Sigma U5128 Clearing Solution
Glycerol Fisher scientific G33-4 Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate Invitrogen 15525-017 Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt Fisher scientific BP241925 Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt Sigma A6014 Infiltration Solution
Whatman paper GE 3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A Polysciences, Inc. 0226A-800 Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B Polysciences, Inc. 0226B-30 Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst Polysciences, Inc. 02618-12 Infiltration Solution
Embedding Molds Polysciences, Inc. 23185-1 16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds Polysciences, Inc. 18986-1 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences, Inc. 15899
Disposable Graduated Transfer Pipes VWR 414004-014
Petrl Dish VWR 25384-088 Embryo dissection
Forceps Inox Tip  ROBOZ RS-5015 Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep  ROBOZ RS-5153 Embryo dissection
Delicate Operating Scissor  ROBOZ RS-6700 Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes Falcon 352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes Falcon 352098
Ice Bucket Magic Touch Iceware International Corp. R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats VWR 89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats VWR 89106-770
Sodium Chloride MP Biomedicals 102892 PBS Solution
Potassium Chloride Sigma P0662 PBS Solution
Potassium phosphate monobasic Sigma P5405 PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S9390 PBS Solution
Digital Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Microtome Leica RM2265
Illuminator Carl Zeiss HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope Carl Zeiss Axio Zoom.V16
Stereo Microscope Olympus SZX16
Fiber Optic Light Source Leica KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade VWR 95057-832
Single Edge Dispenser Personna 62-0330-0000
ZEN Carl Zeiss pro 2012
Photoshop Adobe CS6 v13.0
Amira 3D Software Visage Imaging 5.4
Computer Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers VWR 40000-304
Standard Hot Plate Stirrer VWR 12365-382
Analytical Balance Mettler Toledo AB54-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. 681-682 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics