स्टारलेट समुद्री एनीमोन की एबोरल Physa से पूरा नाकड़ा पुनर्जनन उत्प्रेरण

Developmental Biology

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Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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Abstract

निडारियंस, और विशेष रूप से हाइड्रा, क्षतिग्रस्त या कटे संरचनाओं, और वास्तव में यकीनन Trembley के काम के माध्यम से आधुनिक जैविक जांच की तुलना में अधिक 250 साल पहले शुरू इस तरह के अध्ययन को पुनर्जीवित करने के लिए दिखाया पहली जानवरों के थे। वर्तमान में उत्थान के अध्ययन स्पंज से स्तनधारियों के माध्यम से एक पुनरुत्थान ऐसे हाइड्रा, planaria और Urodeles के रूप में दोनों "क्लासिक" पुनर्योजी जीवों का उपयोग कर, साथ ही Metazoa की सीमा में फैले प्रजातियों में से एक को चौड़ा स्पेक्ट्रम, देखा गया है। एक जैविक घटना के रूप में अपनी आंतरिक ब्याज इसके अलावा, समझ कैसे उत्थान प्रजाति की एक किस्म में काम करता है के बारे में हमें पुनर्योजी प्रक्रियाओं आम सुविधाओं और / या प्रजाति या संदर्भ विशेष सेलुलर और आणविक तंत्र का हिस्सा है कि क्या सूचित करेंगे। स्टारलेट समुद्री एनीमोन, Nematostella vectensis, उत्थान के लिए एक उभरती हुई मॉडल जीव है। हाइड्रा की तरह, Nematostella प्राचीन जाति, cnidaria का एक सदस्य है, लेकिन टी के भीतरवह वर्ग anthozoa, हाइड्रोज़ोआ evolutionarily अधिक बेसल है कि करने के लिए एक बहन क्लेड। इस प्रकार Nematostella में उत्थान के पहलुओं की तुलना और हाइड्रा और अन्य निडारियंस के उन लोगों के साथ इसके विपरीत करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा। इस अनुच्छेद में, हम, दोटूक पालन और Nematostella वयस्क, जो physa कहा जाता है की एबोरल अंत के उत्थान वर्गीकृत करने के लिए एक तरीका मौजूद है। physa स्वाभाविक रूप से अलैंगिक प्रजनन के एक साधन के रूप में विखंडन की प्रक्रिया से गुजरते हैं, और या तो प्राकृतिक विखंडन या physa के मैनुअल विच्छेदन चलाता है फिर से विकास और जटिल morphologies के सुधार। यहाँ हम एक Nematostella पुनर्जनन मचान प्रणाली (NRSS) में इन सरल morphological परिवर्तन संहिताबद्ध है। हम NRSS का उपयोग क्लोरोक्वीन के प्रभाव, लाइसोसोमल समारोह है कि ब्लॉक भोजी के एक अवरोध का परीक्षण करने के लिए। परिणाम बताते हैं कि नाकड़ा संरचनाओं, विशेष रूप से mesenteries, के उत्थान असामान्य है जब भोजी हिचकते हैं।

Introduction

एक भी हाइड्रा में उत्थान के अवलोकन के एक प्रायोगिक विज्ञान 1,2 के रूप में जीव विज्ञान के आगमन में लाभदायक घटना थी। पुनर्जनन जीवविज्ञानी को असाधारण व्यापक अपील की एक घटना बनी हुई है और व्यक्ति को समान रूप से निहित है। विकासात्मक जीव, चिकित्सकों, जैव चिकित्सा वैज्ञानिकों और इंजीनियरों के ऊतकों को समझते हैं और मानव उत्थान पर सीमा पर काबू पाने के लिए संभावित उत्थान जीव विज्ञान आंतरिक रूप से दिलचस्प और अधिक से अधिक बनाता है।

अब, इस तरह के जीनोम अनुक्रमण और लाभ और समारोह उपकरणों की हानि के रूप में उभरती प्रौद्योगिकियों के उपयोग के साथ, क्षेत्र के अलावा पुनर्योजी तंत्र तंग करने के लिए तैयार है और अंत में समझने के लिए कैसे विभिन्न प्रजातियों पुनर्जीवित कर सकते हैं, जबकि दूसरों को नहीं कर सकते। आणविक, सेलुलर और रूपात्मक प्रतिक्रियाओं में समानता की डिग्री elucidated जाना बना रहता है, लेकिन अभी तक ऐसा लगता है कि जानवरों के बीच बुनियादी प्रतिक्रियाएं कि पुनर्जीवित कर सकते हैं और अधिक समान से Imagi हो गया होता हैनेड केवल एक दशक पहले 3।

विशेष रूप से निडारियंस रूपात्मक विविधता का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के बीच अपने शरीर के अंगों के लगभग सभी regenerating पर सतही हैं। एकान्त ताजा पानी नाकड़ा से, हाइड्रा छोटे समुद्री जंतु कि अपार प्रवाल भित्तियों का निर्माण, ऐसे पुर्तगाली मैन-ओ-युद्ध के रूप में जटिल औपनिवेशिक siphonophores, करने के साथ-साथ, उत्थान अक्सर प्रजनन की एक विधा है, इसके अलावा में के लिए एक तंत्र है मरम्मत या क्षतिग्रस्त या खो शरीर की चोट और शिकार से उत्पन्न भागों में सुधार। चाहे नीडेरिया की विभिन्न प्रजातियों के उत्थान के लिए समान या अलग तंत्र का उपयोग एक मौलिक दिलचस्प सवाल 4-6 है।

हम, और दूसरों anthozoan विकसित किया गया है, Nematostella उत्थान 7-17 के लिए एक मॉडल के रूप में vectensis। हमने हाल ही में ऊतक के एक आकृति विज्ञान एक समान टुकड़ा abora से bisected से एक पूरे शरीर के उत्थान वर्णन करने के लिए एक मचान प्रणाली विकसित कीनाकड़ा 10 के एल अंत। यह भी है क्योंकि जब किसी भी स्तर पर bisected Nematostella जंतु पुनर्जीवित कर सकते हैं, वहीं हम सबसे आकृति विज्ञान सरल क्षेत्र, physa में एक एबोरल स्थिति में वयस्कों में कटौती करने, भाग में, क्योंकि इस प्राकृतिक अलैंगिक विखंडन 18 के सामान्य विमान के करीब है चुना है, और परमिट अवलोकन और कैसे एक पूरे शरीर सरलतम रूपात्मक घटकों से reassembled है आणविक विश्लेषण।

Nematostella पुनर्जनन मचान प्रणाली (NRSS) सामान्य संस्कृति की शर्तों के तहत, रूपात्मक मानक है कि एक काट physa द्वारा उत्थान के किसी भी पहलू की प्रगति स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अपेक्षाकृत सरल सेट प्रदान करता है या प्रयोगात्मक इस तरह के छोटे अणु उपचार, आनुवंशिक हेरफेर के रूप में स्थितियों परेशान , या पर्यावरण परिवर्तन। के रूप में प्रत्याशित, NRSS एक रूपात्मक पाड़ जिस पर उत्थान के सेलुलर और आणविक घटनाओं संदर्भित किया जा सकता के रूप में अपनाया जा रहा है10।

अंत में काटने की हमारी विधि पिन बिंदु एक ताजा अध्ययन में 17 में इस्तेमाल किया पंचर से अधिक परिमाण के एक दूरी छेद कई आदेशों का उत्पादन, अभी तक दोनों घाव 6 घंटे के आसपास में चंगा। घाव बंद की नेत्रहीन को गिरफ्तार करने और अलग चरणों दस्तावेजीकरण प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सुझाव है कि एक घाव के आकार और समय इसे बंद करने के लिए लेता है की स्पष्ट व्याख्या करने के लिए स्वतंत्रता चाहिए। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की एबोरल विच्छेदन प्रक्रिया की एक गहरी समझ दृश्य, इस मॉडल के उत्थान प्रणाली में आगे की जांच के लिए सहायता और इस मचान Nematostella vectensis का उपयोग कर प्रणाली के आवेदन व्यापक होगा।

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Protocol

तापमान, पोषण और / प्रकाश अंधेरे चक्र के लिए पशुओं की 1. कंडीशनिंग

  1. कई Nematostella प्रयोगशालाओं में से एक दुनिया भर में, या एक गैर लाभ आपूर्तिकर्ता से प्राप्त Nematostella vectensis वयस्कों (तालिका 1)
  2. अंधेरे में लगातार तापमान (18 और 21 के बीच आम तौर पर डिग्री सेल्सियस) पर Nematostella बनाए रखें, में "1 / 3x" कृत्रिम समुद्र जल प्रति हजार (पीपीटी) 12 भागों की एक लवणता पर (ASW)। , 250 मिलीलीटर या 1.5 एल क्षमता 11 साधारण सोडा, नींबू कांच संस्कृति बर्तन में संस्कृतियों को बनाए रखने में आम तौर पर।
    नोट: ये सरल संस्कृति की स्थिति आमतौर पर प्रयोगशालाओं कि Nematostella अध्ययन में उपयोग किया जाता है, लेकिन संस्कृति देखभाल भी 19 स्वचालित किया जा सकता है।
  3. फीड Nematostella हौसले रची Artemia nauplii 2 - 4x प्रति सप्ताह। हैच Artemia 30 डिग्री सेल्सियस पर पूरी ताकत (36 पीपीटी) या 1 / 3x ASW में अल्सर, एक उथले आयताकार गिलास पकवान 20 में या मेंछोटे पैमाने पर, वाणिज्यिक या घर का बना नमकीन चिंराट हैचरी के एक नंबर के किसी भी। एक मशीन उपलब्ध नहीं है, तो झींगा आरटी पर पक्षियों के बच्चे, लेकिन इतना अधिक धीरे से करना होगा।
    नोट: इस बार पूरा करने के लिए अधिक से अधिक 24 ज की आवश्यकता है।
  4. एक सप्ताह में कम से कम एक बार एनीमोन संस्कृति पानी बदलें। सबसे अच्छा वयस्क स्वास्थ्य के लिए, अच्छी तरह से साफ (साबुन बिना) संस्कृति एक बार संचित श्लेष्मा स्राव के एक सप्ताह है, जो कोट कटोरा और जाल uneaten खाना और अपशिष्ट, और जानवरों को उलझाना कर सकते हैं कटोरे।

2. चयन और पोषण वातानुकूलित पशु की छूट

  1. चयन आकार से मिलान लगभग एक ही लंबाई के जंतु (3 - 5 सेमी, जब स्वाभाविक रूप से आराम) और उन्हें एक कटोरा विच्छेदन के लिए पहले तीन दिनों के लिए कॉलोनी से अलग में जगह है।
    नोट: काटने के लिए चुने गए जानवरों की संख्या प्रयोग द्वारा निर्धारित किया जाएगा, निश्चित रूप से आयोजित किया जा रहा है, लेकिन सामान्य तौर पर हम छह अनुकरण के साथ नमूना बिंदु के अनुसार कम से कम पांच जानवरों सलाह देते हैं। इस प्रकार,एक ठेठ प्रयोग में 30 जानवरों की एक न्यूनतम चुने हुए किया जाएगा। सामान्य में, यह न्यूनतम संख्या (30) amputations कि अनियमित (देखें नीचे) बाद में स्कोरिंग को प्रभावित कर सकते हैं, क्योंकि तुलना में अधिक का चयन करने के लिए बुद्धिमान है।
  2. कम से कम एक घंटे कक्ष प्रकाश में इनक्यूबेटर से चयनित जानवरों के पकवान हटाने विच्छेदन करने से पहले।
    नोट: कमरे प्रकाश और हैंडलिंग के कंपन के संपर्क में होने की संभावना जानवरों अनुबंध करने के लिए कारण होगा, तो वे या अनुकूलित किया जा करने के लिए "आराम" प्रयोगशाला बेंच पर ऊष्मायन द्वारा की जरूरत है। पशु को छूने के लिए आग रोक और प्रकाश जोखिम हो जाएगा और उस बिंदु पर कोमल pipetting द्वारा ले जाया जा सकता है।
  3. वैकल्पिक: (1 / 3x ASW में) 7.5% 2 MgCl जोड़कर जानवरों anesthetize। धीरे से एक मानक प्लास्टिक 5 एमएल विंदुक के साथ गेंदबाजी करने के लिए 2 MgCl समाधान जोड़ें।
    नोट: हालांकि जानवरों के अंत में रोशनी करने के लिए और शारीरिक हेरफेर करने के आदी हो जाते हैं, यह लाभप्रद जानवरों anesthetize को बनाए रखने या "ठीक" हो सकता है टीवह राज्य में ढील के बाद वे लम्बी 16,21,22 बन गए हैं।
  4. पांच जानवरों (1 / 3x ASW में) पूल से स्थानांतरण करने के लिए काट होने के लिए, 100 मिमी 12 पीपीटी ASW युक्त व्यास का एक बाँझ कांच काटने डिश के तल में एक विस्तृत बोर (> 0.5 सेमी) प्लास्टिक पिपेट का प्रयोग करें। 40X - पकवान 10 के बीच चर बढ़ाई के साथ एक stereomicroscope के मंच पर रखें।
    नोट: जानवरों anesthetized नहीं किया गया है और काटने के लिए आराम से, वे अभी भी फिर से आराम बनने के लिए कुछ ही मिनटों की आवश्यकता हो सकती स्पर्श और त्रिविमदर्शी रोशनी करने के लिए जवाब है और इस तरह हो सकती है।

3. विच्छेदन

  1. एक बाँझ छुरी का प्रयोग, एबोरल physa प्रत्येक नाकड़ा से, लक्ष्य के साथ physa है कि लगभग रूप में लंबे समय से यह विस्तृत और कोई अन्त्रपेशी युक्त है के रूप में के एक वर्ग प्राप्त करने के लिए काटना।
    नोट: आदर्श कट साइट अभी अन्त्रपेशी की समाप्ति के लिए एबोरल है। काटने के विमान में वहाँ अन्त्रपेशी से एक संक्रमण पतली एल करने के लिए उचित हैइनेस प्रत्येक mesenterial प्रविष्टि (चित्रा 1 देखें, तीर) के लिए इसी। अन्त्रपेशी की अनुपस्थिति महत्वपूर्ण है क्योंकि यह श्लेष्मा कि सुविधा हो सकती है 'plugging' छेद 17,30 उत्पादन होता है।
    1. विच्छेदन के वांछित स्थल पर जानवर के साथ संपर्क में छुरी ब्लेड रखें। यह या तो बेबस (मुक्तहस्त), या धीरे से एक # 5 संदंश (Dumont शैली या समान) के साथ पशु के शरीर लोभी द्वारा।
    2. शरीर में एक 'कमाल' प्रस्ताव में छुरी की घुमावदार ब्लेड का इस्तेमाल करके ऊतकों के माध्यम से कट।
      नोट: ऊतक सफाई से तोड़ चाहिए के रूप में छुरी को हिलाकर रख दिया जाता है और दाता से physa के वांछित अनुभाग को आजाद कराने। हालांकि, अगर ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा अभी भी शरीर और physa जोड़ता है, यह छुरी के साथ काटा। के रूप में इस physa नुकसान हो सकता है, खींच से जुड़े हुए टुकड़े को अलग करने का प्रयास न करें।
  2. डिश से प्रत्येक काट 'दाता' नाकड़ा निकालें और यह एक SEPA करने के लिए वापसदर कटोरा लेबल 'जमा amputees'; कटोरा तारीख और यह शेयर संस्कृति में लौटने।
    नोट: काट जंतु एक दिन के भीतर एबोरल घाव भर जाएगा और उसके बाद सामान्य रूप से खिलाया जा सकता है। वे दो सप्ताह के जो बिंदु पर physa फिर से काट जा सकता है अगर वांछित भीतर एक सामान्य लग physa पुनर्जन्म होगा।
  3. excised physa कि 12 पीपीटी ASW में काटने डिश में रहने कुल्ला, तो एक बहु अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पहले से ही अच्छी तरह से प्रत्येक में 12 पीपीटी ASW के 10 एमएल है में एक अलग बाँझ अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक physa हस्तांतरण।
    नोट: इस उदाहरण के समुद्री जल की हर अच्छी तरह पकड़े 10 एमएल और पांच excised physa साथ एक छह अच्छी तरह से थाली का उपयोग करता है। सामान्य समुद्री जल में हैंडलिंग और संभावित वाष्पीकरण में आंदोलन की वजह से हवा के संपर्क से बचने के लिए पर्याप्त रूप से physa कवर किया जाना चाहिए। प्लेट या कुओं एक ढक्कन होनी चाहिए।
  4. दोहराएँ कदम 3.1 के - 3.3 प्रत्येक प्रयोगात्मक उपचार के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सुरक्षित में कम से कम 5 physa इकट्ठा करने के लिए।
  5. एक तापमान है कि prov जाएगा physa सेतेयोजना बनाई प्रयोगात्मक पूछताछ के लिए उत्थान की दर सबसे अच्छा आईडीई। एक तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में physa युक्त थाली प्लेस, उत्थान के वांछित दर से निर्धारित एक निश्चित तापमान पर।
    नोट: physa लापता ऊतकों को पुनर्जीवित और जब 15 और 27 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर incubated एक पूर्ण नाकड़ा बनेगी। उत्थान की दर पहले दो चरणों के लिए छोड़कर तापमान निर्भर है। सभी तापमान के लिए स्टेज 4 तक पहुँचने के लिए औसत दिन काटने के बाद 7 डी है और यह भी 21 डिग्री सेल्सियस पर उत्थान के साथ मेल खाता है। 27 डिग्री सेल्सियस पर, स्टेज 4 के बारे में 3 दिन पहले तक पहुँच जाता है और 15 डिग्री सेल्सियस पर, स्टेज 4 21 डिग्री सेल्सियस (देखें भी संदर्भ 10) पर उत्थान की तुलना के बारे में 3 डी देरी हो रही है।

4. Nematostella पुनर्जनन मचान प्रणाली के साथ उत्थान का आकलन (NRSS)

  1. स्कोर physa चर Magnific के साथ एक स्टीरियो-यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोगव्यावहारिक (10 - 80X)। स्टेज 0 के रूप में स्कोर ताजा कटौती Nematostella physa और एक ही समय में प्रत्येक दिन के बाद विच्छेदन (डीपीए) NRSS 10 का उपयोग कर स्कोरिंग जारी है।
    नोट: कुंजी मचान मानदंड और विवरण का उल्लेख के लिए संदर्भ में 10।
    1. स्टेज 0 (खुला घाव) के रूप में physa स्कोर एक ताजा कटौती physa एक कप के आकार का बड़े पैमाने पर एक गुब्बारा झूलता हुआ दिखने के रूप में प्रकट होता है, तो एक खुला घाव साइट के साथ होने की संभावना दिख रही है।
      नोट: घाव किनारों को भी शुरू से एक साथ रहना सकता है, लेकिन अभी भी ऊतक ढह जाएगा और कठोरता की कमी है। खुले घाव के किनारों घाव भर देता है के रूप में रेडियल संकुचन के दौर से गुजर देखा जा सकता है।
    2. स्टेज 1 (घाव बंद) यदि विच्छेदन घाव बंद प्रतीत होता है जैसे physa स्कोर।
      नोट: घाव स्थान भविष्य मौखिक पोल के अनुरूप होगा। भविष्य मौखिक पोल के आसपास बाहरी सतह अंतर्निहित त्रिज्यात सममित endodermal mesenterial सम्मिलन के लिए इसी अलग मेहराब प्रदर्शित करने के लिए शुरू कर सकते हैं।
    3. स्कोर पीएचYSA स्टेज 2 (रेडियल मेहराब) मौखिक ध्रुव की सतह फुलाया प्रकट होता है, आठ उठाया एक त्रिज्यात सममित पैटर्न में व्यवस्थित और खांचे से अलग कर दिया मेहराब खुलासा के रूप में। मेहराब के शीर्ष पर छोटे, अर्धगोल blebs का निरीक्षण करें। वे के रूप में लंबा के रूप में व्यापक हैं, आमतौर पर क्षणिक के बारे में हो जाएगा, और शुरू में एक ही बहिर्जनस्तरीय सेल परत से शामिल थे।
      नोट: कुछ मामलों में डबल स्तरित blebs को स्थिर कर सकता है। नोट: इस पर या बाद के चरणों एक चिपचिपा परत physa (चित्रा 2) एक झिल्लीदार 'म्यान' में encapsulate करने के लिए प्रकट हो सकता है। इस encapsulating सामग्री स्कोरिंग की सुविधा के लिए हटा दिया जाना चाहिए।
    4. के रूप में मंच 3 (मूंछ) physa स्कोर अगर endodermal और बहिर्जनस्तरीय ऊतक परतों से युक्त जाल की कलियों स्थिरतापूर्वक कम से कम कुछ रेडियल मेहराब की मौखिक अंत में बनते हैं।
      नोट: जाल अब से वे चौड़ा कर रहे हैं और न्यूनतम गतिशील होते हैं कर रहे हैं। physa वृद्धि हुई दिखाई देंगे, लेकिन चर मुद्रास्फीति इतना है कि अन्त्रपेशी आरंभ की तुलना में हो सकता हैशरीर गुहा (coelenteron) में mesenterial सम्मिलन से देने ible।
    5. स्टेज 4 (रैखिक Mesenteries) यदि physa आठ अलग, दिखाई mesenteries कि मौखिक एबोरल लंबाई है कि दो बार उनके रेडियल चौड़ाई जहां वे कनेक्ट करने के लिए प्रकट से मापा की तुलना में अधिक कर रहे हैं के साथ शरीर की दीवार में सम्मिलन से coelenteron में विस्तार होता है, के रूप में physa स्कोर इसकी एबोरल अंत (enterostome) पर ग्रसनी करने के लिए।
      नोट: चार या इससे कम mesenteries "pleated" आंतरिक मुक्त किनारों है। ग्रसनी दिख रहा है। आठ से अधिक जाल दिखाई, गतिशील होते हैं और कभी-कभी वे शरीर में अनुबंध।
    6. स्टेज 5 (मुख्य रूप से Pleated Mesenteries) यदि physa pleating के साथ अधिक से अधिक चार mesenteries है, और pleating अधिक पूर्ण और स्टेज 4. पशु लगभग एक "सामान्य" वयस्क रूप दिया है की तुलना में टेढ़ा है के रूप में physa स्कोर है, लेकिन वहाँ कोई दिखाई दे रहे हैं जननांगों कोशिकाओं।

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Representative Results

कटे physa में उत्थान के दौरान रूपात्मक की घटनाओं की प्रगति चित्रा 1 ए है, जो प्रत्येक NRSS चरण में physa के प्रतिनिधि दृश्य भी शामिल है में दिखाया गया है। ठेठ physa कटौती साइट वयस्क (तीर) पर संकेत दिया है। चित्रा 1 ए में तस्वीरों के माध्यम से पूरी तरह से बनाई नाकड़ा ताजा कटौती physa से मौखिक और शरीर संरचनाओं के प्रगतिशील उत्थान दिखा। चित्रा 1 बी, आंतरिक सेप्टा, mesenteries की व्यवस्था, क्रमशः दिखाने सी स्टेज 4 और स्टेज 5 पर। ध्यान दें कि स्टेज 4 में कुछ mesenteries "pleating" की कमी होगी, लेकिन एक स्टेज 5 बहुमत pleats विकसित किया है चाहिए के रूप में अर्हता प्राप्त करने के लिए। चित्रा -1 एक physa श्लेष्मा जो संदंश (चित्रा 1E) के साथ हटाया जा सकता है की एक झिल्ली में छा पता चलता है। आम तौर पर उत्थान के लिए हानिकारक नहीं है (जब तक कि यह अनुचित रूप से पशु जाल), झिल्ली physa स्कोरिंग में बाधा और कर सकते हैंजैसे माइक्रोस्कोपी नमूना निर्धारण या आणविक / जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए कटाई के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़, आईएनजी। यह सबसे अच्छा है या चरण 1 के बाद हटा दिया जाता है, बाद में इसे अगर सुधारों।

चित्रा 2 से पता चलता है कि कैसे मचान प्रणाली एक प्रयोग के परिणामों स्कोर करने के लिए भोजी बाधा के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Physa काट रहे थे और 10, 50 और 100 सुक्ष्ममापी पर क्लोरोक्वीन के साथ इलाज, या physa अनुपचारित (नियंत्रण) थे। क्लोरोक्विन लाइसोसोमल कार्य है, जो भोजी के लिए आवश्यक हैं रोकता। NRSS मानदंड उत्थान और परिणाम के पाठ्यक्रम पर physa चित्रा 2 ई में प्लॉट किए जाते थे स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रतिनिधि नियंत्रण (2A चित्रा) और क्लोरोक्वीन इलाज किया physa (चित्रा 2 बी - डी) के फोटोग्राफ जब नियंत्रण पहुँच चरण 5. क्लोरोक्विन इलाज जानवरों चरण 4 से परे प्रगति नहीं था बना रहे थे, और वे आमतौर पर अधूरा अन्त्रपेशी regenera का प्रदर्शनtion (सबसे कमी रह गई थी pleating), लघु मूंछ आकार, और कुछ मामलों में लघु शरीर की लंबाई।

आकृति 1
चित्रा 1. उत्थान की विशेषताएं। (ए) physa मौखिक और शारीरिक सरंचना regenerating के उदाहरण NRSS के अनुसार मंचन किया। लेबल एडल्ट पैनल के साथ जाल (टी) ग्रसनी (पीएच), mesenteries (एम) और अन्त्रपेशी सम्मिलन (एमआई) एक परिपक्व जानवर की सुविधाओं से पता चलता। व्हाइट तीर अन्त्रपेशी प्रविष्टि के लिए mesenteries संक्रमण, endoderm एबोरल टर्मिनस तक विस्तार देने के एक रिज की जहां pleated क्षेत्र दिखा। इस क्षेत्र में physa का गठन किया। पीले तीर आदर्श physa द्विभाजन साइट दिखाने के लिए। पैनल 0 द्विभाजन के बाद पांच मिनट physa पता चलता है, और पैनल 0 ', केंद्र पर खुला घाव के साथ उन लोगों physa की एक एक के एक बढ़ाया देखने के लिए, है की स्टेज 0 परिभाषितNRSS। पैनल 1 से पता चलता घाव के साथ एक physa अब बंद कर दिया, परिभाषित स्टेज मौखिक पोल के आसपास उठाया रेडियल मेहराब, नीचे फुलाया ऊतकों के साथ साथ 1. पैनल 2 से पता चलता physa, 2 (पैनलों 0 - 2 मौखिक अंत के विचार कर रहे हैं) स्टेज के लिए इसी। पैनल 3 अब चरण 3. नोट अल्पविकसित अन्त्रपेशी तत्वों पर मौखिक ध्रुव पर उभरते लम्बी और inflating physa की (सही सामना करना पड़), मूंछ कलियों दिखाई दे रहे हैं पता चलता है और ग्रसनी मौखिक अंत में अंधेरे क्षेत्र में बनाने है। पैनल 4 मौखिक ध्रुव पर सच जाल के उद्भव, साथ ही क्षणिक 'blebs' से पता चलता है, को परिभाषित स्टेज 4. रैखिक mesenteries फुलाया physa में दिखाई दे रहे हैं। बड़े दौर में बड़े पैमाने पर नाकड़ा अंदर दिखाई अज्ञात मूल की है और मुंह के माध्यम से निष्कासित कर दिया जाएगा। पैनल 5 और अधिक से अधिक चार pleated mesenteries, एक पूरी तरह से बनाई पीएच की विशेषता लगभग पूरा उत्थान से पता चलता हैarynx और आठ या उससे अधिक जाल है, जो यह स्टेज 5 के रूप में परिभाषित करता है। (बी, सी) व्यक्तिगत physa की एबोरल विचारों biradial व्यवस्था और mesenteries की आकृति विज्ञान को दर्शाते हैं। इस दृश्य में, pleated mesenteries ऊतक मिडवे के एक उभार (हरी नोक) दिखाई देते हैं। एक स्टेज 4 physa चार या उससे कम pleated mesenteries है, और एक स्टेज 5 physa अधिक से अधिक चार (सी) है। के साथ या बिना pleating Mesenteries क्रमशः, हरे या पीले तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। (सी) एक pleated अन्त्रपेशी कि त्रिज्यात बढ़ा दिया गया है करने के लिए अंक में काले नोक। (डी, ई) physa से एक चिपचिपा म्यान से निकालना दिखाया गया है। सफेद तीर उत्थान स्कोरिंग से पहले physa (डी) में (ई) के रूप में हटा दिया जाना चाहिए आसपास के एक श्लेष्मा म्यान से संकेत मिलता है। कभी कभी अवशिष्ट ऊतक (पीले तीर) म्यान के अंदर फंस जा सकता है, और यह भी हटाया जाना चाहिए। Asterisk मौखिक डंडे इंगित करता है, जहां निशानईडी। लाल आकार सलाखों A5 (1.0 मिमी) को छोड़कर सभी पैनलों में 0.5 मिमी हैं। पैनल बी और यह आंकड़ा के सी संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ reprinted संदर्भ से 10 से यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा उत्थान पर क्लोरोक्विन की 2. प्रभाव। NRSS का एक आवेदन प्रदर्शित करने के लिए, हम एक क्लोरोक्वीन, भोजी के एक अवरोध के प्रभाव का परीक्षण किया। Physa काट रहे थे और तुरंत 10 में 0.1% DMSO (नियंत्रण) या क्लोरोक्वीन, 50, 100 सुक्ष्ममापी युक्त 1 / 3x ASW में रखा। Physa 24 घंटे NRSS का उपयोग कर अंतराल पर रन बनाए थे। (ए) प्रतिनिधि समापन बिंदु छवियों नियंत्रण का लिया जब वे स्टेज 5 पर पहुंच गया। - डी) उस मंच 4. क्लोरोक्विन की एक "पुनर्जन्म का पठार" पहुँच क्लोरोक्वीन इलाज physa की छवियों प्रतिनिधि परीक्षण सभी खुराक पर उत्थान में इसी प्रकार के दोष के कारण होता है। सबसे उल्लेखनीय समस्या mesenteries और जाल से भरा उत्थान की कमी थी। असामान्य शरीर आकृति विज्ञान (जैसे, stunting) भी कभी कभी उल्लेख किया गया था (सी)। उपस्थिति (सफेद तीर) और एक क्लोरोक्वीन इलाज physa में pleats की कमी (काला तीर) डी में दिखाया गया है (जाल आंशिक रूप से वापस ले लिया जाता है)। (ई) सभी physa के लिए मचान डेटा समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट (23 डिग्री सेल्सियस)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. का सारांशNRSS चरणों की प्रमुख विशेषताओं। इस चित्र कुंजी रूपात्मक बदलाव है कि NRSS में प्रत्येक चरण को परिभाषित चलता। आंदोलनों की दिशा लाल तीर और हरे रंग का तीर से सुविधाओं के संकेत हैं। स्टेज 0 बस (ए), और टी) काटने के बाद खुले घाव को दर्शाया गया है। घाव किनारों केंद्र (बी) की ओर बंद रेडियल संकुचन से गुजरना। चरण 1 घाव (सी) और मौखिक का सामना करना पड़ लकीरें (डी) के बीच मेहराब की ऊंचाई के पूर्ण बंद की विशेषता है; मौखिक सतह (नोक) के केंद्र उदास है। स्टेज 2 मौखिक सतह (नोक, ई) की एक स्पष्ट arching है; physa मूंछ कलियों और blebs मेहराब (तीर) के शीर्ष पर दिखाई बढ़ाना और संकीर्ण हो जाते हैं (एफ) शुरू होता है। स्टेज 3 स्थिर मूंछ कलियों (नोक, जी) और regenerating ग्रसनी मौखिक ध्रुव पर एक घनत्व के रूप में देखा जा सकता है (नारंगी जन, नोक एच में है (मैं) कि कम से कम दो बार के रूप में लंबे समय के रूप में वे ग्रसनी (मैं ') के जंक्शन पर लंबा हो जाना चाहिए की मौजूदगी से पता चलता है। Mesenterial रेशा (जम्मू, जम्मू ') - चार या इससे कम mesenteries उनकी अंदरूनी किनारे पर pleated जा सकता है। स्टेज 5 से अधिक चार pleated mesenteries (कश्मीर), जो सबसे अच्छा एबोरल अंत (कश्मीर) से देखने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता की विशेषता है। फिर से प्रिंट संदर्भ से 10 से अनुमति के साथ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

घाव भरने और उत्थान की एक मॉडल के रूप में Nematostella का उपयोग तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है। इस प्रकार, यह सौंपा और तुलना की जा सकती महत्वपूर्ण है प्रभावी सेलुलर और आणविक विश्लेषण करने से पहले एक विशेष प्रोटोकॉल का रूपात्मक पैटर्न कल्पना करने में सक्षम हो। Nematostella, पुनर्योजी "लचीलापन" के एक उच्च डिग्री है लगभग किसी भी लापता संरचना किसी भी स्थान पर काट सुधार करने के लिए, जीवन के बाद के चरणों में planula कर रहा है। इस प्रकार, विभिन्न जांचकर्ताओं अलग अलग उम्र में उत्थान विच्छेदन से उत्पन्न या जंतु के विभिन्न क्षेत्रों में लोग घायल हो गए जांच की, और 7-18 आकार है।

मचान प्रणाली यहाँ वर्णित केवल प्रजनन ऊतक कमी physa की एक आकृति विज्ञान वर्दी खंड के परिवर्तन, एक वयस्क के एबोरल छोर से काट, एक anatomically पूरा किशोर नाकड़ा (हम अभी तक निर्धारित नहीं किया है जब इन पुनर्जीवित किशोरों के यौन मीटर हो जाते हैं इस प्रकार हैature)। इस दृष्टिकोण के पास अधिकतम जटिलता से एक के लिए ऊतक के एक सरल आरंभ से उत्थान परख होती है। पांच physa सहित के रूप में एक न्यूनतम समूह आकार संभावित व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता और उत्तरजीविता के लिए सामान्य करने के लिए सिफारिश की है। बेशक, इस संख्या में विशेष रूप से प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है, लेकिन NRSS प्रोटोकॉल जो हाइड्रा 23 में पुनर्जनन को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है कि जैसे एक संभावित 'की मात्रा प्रभाव' को नकारना physa प्रति मध्यम 2 एमएल की अनुमति देता है।

Nematostella उत्थान अध्ययन के लिए अन्य तरीकों मौखिक अंत में वयस्कों bisected मध्य शरीर का इस्तेमाल किया है या नहीं, या किशोर 4-मूंछ चरण जंतु bisected मध्य शरीर 7,11-18। दो अध्ययनों प्राकृतिक विखंडन 16,18 से मुक्त कराया physa में उत्थान की जांच की है, और काट physa का उपयोग दृष्टिकोण हाल ही में NRSS 8,9 के साथ उभरी है। इन विविध तरीकों में से हर एक की अपनी योग्यता के आधार है और regenerati के बारे में अद्वितीय सवालों को संबोधित कर सकते हैं, और अलग आयु वर्ग के जानवरों के बीच अलग अलग विच्छेदन या लोग घायल हो गए व्यवस्थाओं के तहत होने वाली प्रक्रियाओं ve। Physa विच्छेदन और स्कोरिंग के लिए NRSS प्रोटोकॉल, वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है, व्यवस्थित अध्ययन के लिए physa की एक अपेक्षाकृत वर्दी सेट उत्पन्न करता है और physa आकार में भिन्नता है, ऊतक संरचना, और प्राकृतिक अनुप्रस्थ विखंडन 18,24 के साथ मनाया उत्थान के बाद प्रगति से बचा जाता है। हालांकि physa विच्छेदन Nematostella में अलैंगिक प्रजनन के प्राकृतिक मोड के लिए कुछ हद तक मेल खाती है, आणविक मतभेद उत्थान के मध्य शरीर पर या physa 16,18,24 में प्राकृतिक विखंडन और विच्छेदन से उत्पन्न बीच उल्लेख किया गया है। चाहे विच्छेदन यहाँ वर्णित या प्राकृतिक विखंडन शो में इस तरह के मतभेद की विधि द्वारा उत्पादित physa निर्धारित किया जाना बना रहता है।

वहाँ कुछ मुद्दों है कि पालन विच्छेदन के साथ सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं, और स्कोरिंग तकनीक यहाँ वर्णित हैं। विच्छेदन दिवा के लिए चयनित किया जंतुएलडी physa आकार, पोषण इतिहास के लिए मिलान किया, उसी तापमान पर रखा जाना है और यदि संभव हो तो उम्र (हालांकि बाद व्यवस्थित अगर वहाँ चरण प्रगति में एक उम्र के प्रभाव भिन्नता पर है निर्धारित करने के लिए परीक्षण नहीं किया गया)। एक घुमावदार ब्लेड वाले एक तेज बाँझ स्केलपेल के साथ एक खुला घाव प्राप्त स्टेज 0 और स्टेज 1 के बीच घाव भरने की रूपात्मक टिप्पणियों के लिए महत्वपूर्ण है जब physa फुलाया जाता है और छुरी की घुमावदार ब्लेड वयस्क ऊतक खत्म हिलाकर रख दिया है, यह काट रहा है एक प्रस्ताव में और जल्दी से अच्छी तरह से पकवान काटने से उपचार के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है। Amputations कि अन्त्रपेशी में शामिल हैं या कि व्यापक भौतिक हेरफेर का परिणाम खारिज किया जाना चाहिए रहे हैं।

अभ्यास इलाज physa मंचन जनसंख्या में व्यक्तिगत भिन्नता की भावना पाने के लिए परीक्षण किया जा रहा है। व्यक्तिगत physa के बीच भिन्नता जल्द से जल्द चरणों के लिए कम से कम है। उदाहरण के लिए, सभी physa 0 डीपीए पर स्टेज 0 में हैं। उसी तरह सभी physa स्तर तक पहुँचने1 डीपीए पर synchrony में 1। स्टेज 2 की उपस्थिति कठिन पर्यवेक्षक विचार करने के लिए है क्योंकि 'मुद्रास्फीति' एक रिश्तेदार शर्त यह है कि हासिल की है, हालांकि, थोड़ा बदलाव के साथ 2 डीपीए के द्वारा होता है हो सकता है। सच जाल निशान प्रगति की उपस्थिति स्टेज 3. regenerating जाल एक झिल्लीदार "कोकून" कि मूंछ कली के दृश्य के नीचे में बाधा उत्पन्न की उपस्थिति से छिप जा सकता है। झिल्लीदार को कवर पहले से हटाया नहीं गया है, तो यह तो अब किया जाना चाहिए। ठीक इत्तला दे दी चिमटी से नोचना साथ झिल्ली का हटाया regenerating physa आजाद होगा। स्टेज 4 और 5 के बीच भेद pleated mesenteries की संख्या है। स्टेज 4 चार या इससे कम pleated mesenteries है, और स्टेज 5 पांच से आठ pleated mesenteries है। pleating एक पार्श्व दृश्य में मनाया जा सकता है, pleated mesenteries की सही संख्या एक एबोरल दृश्य के साथ बेहतर मनाया जाता है।

एक बनावट से वयस्क Nematostella उत्थान के अध्ययन में एक चुनौतीSA आरंभ, और वास्तव में अन्य साइटों से विच्छेदन कटौती ऊतकों के साथ, जीवित ऊतकों के विभिन्न स्पष्टता है। physa का बल्ब बरकरार वयस्क में अपेक्षाकृत स्पष्ट है, लेकिन यह विच्छेदन के बाद ऊतक संकुचन के कारण नहीं बल्कि अपारदर्शी हो जाता है। स्पष्टता धीरे-धीरे रिटर्न (स्टेज 2) एक बार घाव बंद कर देता है (स्टेज 1) और पशु बढ़ करने के लिए शुरू होता है, लेकिन फिर भी घाव साइट है जहाँ ऊतकों और संरचनाओं के लिए सक्रिय रूप से कुछ हद तक घने ऊतकों (विशेष रूप से स्टेज 3) से छिप अवशेष regenerating कर रहे हैं के आसपास के क्षेत्र। वृद्धि मुद्रास्फीति आमतौर पर स्टेज 4 और 5 के निर्धारण ऑप्टिकल स्पष्टीकरण के द्वारा पीछा लगभग निश्चित रूप से हल होगा क्या मौखिक अंत में हो रहा है के साथ जुडा हुआ है, लेकिन अधिक सूचनात्मक रहते हैं, ऊतक विशेष ट्रांसजेनिक संवाददाताओं से कहा कि प्रतिदीप्ति के लिए नजर रखी जा सकती है और अधिक आसानी से 15 से देखे जा सकते हैं, 25-30।

एक काट physa जाहिर फ़ीड नहीं कर सकते, क्योंकि यह जाल, मुंह और mesenteries (जो पाचन ग्रंथियों हार्बर) का अभाव है, इस प्रकार requiलापता शरीर संरचनाओं की अंगूठी उत्थान गैर खाद्य स्रोतों से पोषक तत्व भंडार जुटाने के द्वारा पूरा किया जाना है। Physa संभवतः यह पूरा कर सकते हैं, भोजी के द्वारा होता है, जिसमें कोशिका द्रव्य, अंगों और अन्य सेलुलर घटकों intracellularly घिरा हुआ है और एक lysosome निर्भर तंत्र द्वारा संसाधित उपचय प्रक्रियाओं 31-33 के लिए ऊर्जा और यौगिकों का उत्पादन करने के लिए कर रहे हैं। हम पाते हैं कि lysosome अवरोध, क्लोरोक्वीन, साथ physa इलाज mesenteries और जाल की असामान्य उत्थान, और सामान्य शरीर आकृति विज्ञान का कारण बनता है, यह दर्शाता है कि भोजी मौखिक और शरीर संरचनाओं के सामान्य उत्थान के लिए आवश्यक है। भोजी सेल कार्यों 34-36 स्टेम नियंत्रित करता है, और, हाइड्रा में उत्थान में आवश्यक भूमिका निभाता है planaria, और zebrafish 37-41। आगे के विश्लेषण से समझने के लिए कैसे भोजी सेलुलर और आणविक स्तर पर Nematostella उत्थान प्रभावित करती है की आवश्यकता होती है, लेकिन हमारे पास पहले प्रयोग एनआर के उपयोग की उपयोगिता से पता चलता हैछोटे अणुओं है कि उत्थान प्रभावित कर सकता है के लिए एक तेजी से जांच पद्धति के रूप एसएस।

आनुवंशिक आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं है कि Nematostella में पुनर्जनन को विनियमित केवल समझने की एक अल्पविकसित अवस्था में हैं, लेकिन उत्थान के लिए इस आकस्मिक मॉडल जीनोमिक और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपकरणों की एक बढ़ती प्रदर्शनों की सूची है। इसकी Annotated जीनोम, क्षेत्रीय और ऊतक विशिष्ट आनुवंशिक मार्करों के ढेर सारे, और transgenesis, म्युटाजेनेसिस, ऊतक विज्ञान और माइक्रोस्कोपी के लिए मजबूत तरीकों के साथ, Nematostella anthozoan cnidarian उत्थान गवर्निंग तंत्र प्रकट और उजागर चाहे इसके पुनर्योजी प्रक्रियाओं समान या निडारियंस और मेटाजोअन के बीच अद्वितीय हैं करने का वादा किया सामान्य रूप में।

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Acknowledgements

यह काम एक न्यू यॉर्क में स्टेम सेल साइंस (NYSTEM C028107) अनुदान GHT द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

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References

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