작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도

Developmental Biology

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Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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Abstract

자포 동물, 특히 히드라가 손상되거나 절단 구조 및 참으로 틀림없이 250 개 이상의 년 전 Trembley의 작품을 통해 현대 생물학의 질문을 출시 이러한 연구를 다시 생성하는 것으로 첫 번째 동물했다. 현재 재생의 연구는 스폰지에서 포유 동물을 통해 같은 히드라, planaria 및 Urodeles 등 모두 "고전적인"재생 생물을 이용하여 부활뿐만 아니라, 후생 동물의 범위에 걸쳐 종의 확대 스펙트럼을 볼 수있다. 생물학적 현상과 같은 고유의 관심 외에도, 재생이 종의 다양한 작동 방식을 이해하는 재생 과정이 일반적인 기능 및 / 또는 종 또는 상황에 특정 세포 및 분자 메커니즘을 공유하는지 여부에 대한 정보를 통보하는 것입니다. 작은 별의 말미는 Nematostella의 vectensis는 재생을위한 신흥 모델 생물이다. 히드라처럼, Nematostella하지만 t에서, 고대 문, 자포 동물의 구성원 인그는 클래스 산호충 강, 진화 적으로 더 기초 인 히드로 충에 자매 계통 군. Nematostella에서 재생의 따라서 측면을 비교하고 히드라 등 자포 동물의 것과 대조 흥미로운 일이 될 것이다. 이 글에서, 우리는 이등분 관찰하고 physa 호출되는 Nematostella 성인의 반구 끝의 재생을 분류하는 방법을 제시한다. physa 자연스럽게 무성 생식의 수단으로 분열을 거쳐, 자연 분열 또는 physa 수동 절단 중 하나는 복잡한 형태학의 재 성장과 개혁을 트리거합니다. 여기서 우리는 Nematostella 재생 준비 시스템합니다 (NRSS)에 다음의 간단한 형태 학적 변화를 성문화했다. 우리는 클로로퀸의 효과, 리소좀 기능 블록의 자식 작용의 억제제를 테스트 할 NRSS를 사용합니다. 결과는 자식 작용이 억제 될 때 용종 구조, 특히 장간막의 재생이 비정상이라고 나타낸다.

Introduction

하나의 히드라의 재생의 관찰 실험 과학 1, 2 등 생물학의 출현에 정액 사건이었다. 재생은 생물학에 매우 폭 넓은 매력의 현상 유지와 비슷하게 사람을 누워. 인간의 재생에 한계를 이해하고 극복하기 위해 발달 생물 학자, 의사, 의학자 및 조직 엔지니어를위한 잠재력은 더 본질적으로 재미보다 재생 생물학을합니다.

이제, 이러한 게놈 시퀀싱 및 이득 및 기능 도구의 손실과 같은 새로운 기술의 사용으로, 필드가 떨어져 재생 메커니즘을 애타게 태세 궁극적으로 재생하는 방법을 다양한 종 이해할 수있는 동안 다른 사람은 할 수 없습니다. 분자 세포 및 형태 학적 반응에 공통성의 정도는 밝혀지지 남아 있지만 지금까지 그것을 다시 생성 할 수 있습니다 동물 중 기본 응답이 있었다 imagi있는 것보다 더 유사하다는 것을 나타납니다NED 만 10 년 전 3.

특히 자포 동물은 형태 학적 다양성의 폭 넓은 스펙트럼 속에서 거의 모든 신체 부위의 재생에서 손쉬운 있습니다. 고독한 신선한 물 용종에서 히드라는 포르투갈 사람-O-전쟁과 같은 복잡한 식민지 siphonophores에, 거대한 산호초를 구축 작은 해양 폴립과 함께, 재생을위한 메커니즘 이외에, 자주 재생하는 모드입니다 수리 또는 부상 포식으로 인해 손상되거나 손실 된 신체 부위를 개혁. 자포 동물의 다양한 종의 재생을 위해 유사하거나 다른 메커니즘을 사용할지 여부를 근본적으로 흥미로운 질문 4-6이다.

우리와 다른 사람들이 anthozoan을 개발 한 Nematostella는 재생 7-17 모델로 vectensis. 우리는 최근 abora부터 타개 조직의 형태 학적으로 균일 한 편에서 전신의 재생을 설명하기위한 스테이징 시스템을 개발폴립 (10)의 리터 끝. 모든 수준에서 양분 때 Nematostella 용종이 다시 생성 할 수 있지만, 우리는이 자연 무성 분열 (18)의 정상 평면에 가까운 때문에 부분적으로 가장 형태 학적으로 단순한 지역의 physa의 반구 위치에 성인을 삭감하기로 결정하고, 또한 때문에 허가 관찰하고 몸 전체가 단순한 형태 구성 요소에서 재 조립하는 방법의 분자 분석.

Nematostella 재생 스테이징 시스템 (NRSS)은 일반 배양 조건에서, 절단 physa에 의해 재생의 모든 측면의 진행을 득점하는 데 사용할 수 형태 벤치 마크의 비교적 간단한 세트를 제공하거나 실험적으로 같은 작은 분자 치료, 유전자 조작으로 상황을 교란 , 또는 환경 변경. 예상 된 바와 같이, 재생은 NRSS의 세포 및 분자 이벤트가 참조 할 수있는 형태소 지지체로서 채택되고10.

마지막으로 절단 우리의 방법은 최근의 연구 (17)에 사용되는 핀 포인트 구멍보다 큰 크기의 벌어진 구멍 여러 주문을 생산하고, 아직 모두 상처를 6 시간의 주위에 치유. 상처 봉합의 시각 체포와 별개의 단계를 문서화하는 것은 상처의 크기와이 종료하는 데 걸리는 시간의 외관상의 독립성을 설명하는 실험 방법을 제안한다. 따라서,이 프로토콜에 의해 제공되는 반구 절단 공정의 깊은 시각적 이해는,이 모델은 재생 시스템으로 추가 조사를 돕고 Nematostella의 vectensis를 사용하여이 스테이징 시스템의 적용 범위를 확장 할 것이다.

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Protocol

온도, 영양과 빛 / 어둠의 사이클에 대한 동물의 1. 컨디셔닝

  1. 전 세계적으로 수많은 Nematostella 연구소 중 하나, 또는 비영리 업체에서 Nematostella vectensis 성인을 얻습니다 (표 1)
  2. 에, 어둠 속에서 일정한 온도 (일반적으로 사이 18 및 21 ° C)에서 Nematostella 유지 "/ 배 1"인공 해수 천 (PPT) 당 12 부품의 염분에서 (ASW). 일반적으로, 간단한 소다 석회 유리 배양 접시에 250 mL의 1.5 L 용량 (11) 문화를 유지한다.
    참고 :이 간단한 배양 조건은 일반적으로 Nematostella을 연구 실험실들 사이에서 사용되지만, 문화주의는 19 자동화 할 수 있습니다.
  3. 일주일에 4 배 - 2 노 플리 우스 Nematostella 갓 부화 아테 피드. 얕은 직사각형 유리 접시 (20) 또는 30 ° C에서 전체 강도 (36 PPT) 또는 1 / 3 배 ASW에서 해치 아테 미아는 낭종,소규모, 상업적 또는 집에서 소금물 새우 부화장의 수의. 인큐베이터를 사용할 수없는 경우, 새우 RT에서 부화하지만 그래서 더 느리게 할 것입니다.
    참고 :이 종종 완성을위한 이상 24 시간을 필요로한다.
  4. 적어도 일주일에 한 번 말미잘 배양 물을 교체합니다. 최고의 성인 건강을 위해, (비누)없이 철저하게 깨끗한 문화 트랩 먹지 않는 음식 폐기물, 그리고 동물을 얽히게 할 수 코트 그릇과 축적 된 점액 분비물의 일주일에 한 번 그릇.

영양 금연실 동물 2. 선택 및 휴식

  1. 거의 같은 길이의 선택 크기 일치 용종 (3-5cm, 때 자연적으로 완화) 이전 절단에 사흘 동안 식민지에서 분리 한 그릇에 배치합니다.
    주 : 절삭 선정 동물의 수는 실험에 의해 결정된다 물론 진행되고 있지만, 일반적으로 우리는 여섯 복제 샘플 포인트 당 적어도 다섯 동물을 추천한다. 그러므로,전형적인 실험에서 30 동물의 최소 미리 선택 될 것이다. 일반적으로, 나중에 점수에 영향을 줄 수 있습니다 (아래 참조) 불규칙 절단 이후 최소 수 (30) 이상을 선택하는 것이 현명합니다.
  2. 이전에 절단에 실내 조명에 인큐베이터에서 한 시간 이상을 선택 동물의 접시를 제거합니다.
    실내 조명 및 취급의 진동에 노출 가능성이 동물이 수축하게됩니다, 그래서 그들은 적응 또는 실험실 벤치에 배양하여 "완화"할 필요합니다. 동물 접촉하는 내화물과 빛에 노출이 될 것이며, 그 시점에서 부드러운 피펫 팅에 의해 이동 될 수있다.
  3. 선택 사항 : (1 / 3X ASW에서) 7.5 %의 MgCl 2를 첨가하여 동물을 마취. 부드럽게 표준 플라스틱 5 mL를 피펫으로 그릇에의 MgCl 2 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
    동물은 결국 빛을 물리적 조작에 길들여 될 것입니다 있지만, 그것은 t "수정"유지하거나 동물을 마취하는 것이 유리할 수있다 : 참고그들은 긴 16,21,22하게 한 후 그 상태를 편안합니다.
  4. 12 PPT의 ASW를 포함 100mm 직경의 멸균 유리 절단 접시의 바닥에, 절단 할 수있는 풀에서 다섯 동물 (1 / 3 배 ASW에서) 전송 넓은 구멍 (> 0.5 cm) 플라스틱 피펫을 사용합니다. 40X - 10 사이의 가변 배율의 실체 현미경의 무대에 접시를 놓습니다.
    참고 : 동물 마취 및 절단 완화되지 않은 경우, 그들은 여전히 ​​다시 편안하게하는 데 몇 분 정도 필요할 수 있습니다 따라서 터치 입체경 조명에 응답하고있다.

3. 절단 수술

  1. 멸균 메스를 사용하여, 약 한이 넓고 더 장간막을 포함하지 않는 그대로입니다 physa의 섹션을 얻을 목적으로, 각각의 폴립에서 반구 physa을 절단.
    참고 : 이상적인 컷 사이트가 장간막의 종료에 불과 반구입니다. 절단의면에 얇은 리터에 적절한 장간막에서 변화가있다아이 네스는 각 mesenterial 삽입 (그림 1, 화살표)에 대응. 이 구멍 17,30를 '연결'용이하게 할 수있다 점액을 생산하기 때문에 장간막의 부재는 매우 중요하다.
    1. 절단의 원하는 사이트에서 동물과 접촉 메스 블레이드를 배치합니다. 이 중 비 보조 (프리 핸드)를 수행하거나 부드럽게 # 5 포셉 (뒤몽 스타일 또는 유사한)와 함께 동물의 몸을 파악하여.
    2. 몸에 걸쳐 '흔들'운동에 메스의 곡선 블레이드를 활용하여 조직을 잘라.
      참고 : 조직이 메스가 요동으로 깨끗하게 절단 및 기증자로부터 physa의 원하는 부분을 해방해야합니다. 조직의 작은 조각들이 여전히 본체와 연결 physa 경우, 메스로 절단. 이것은 physa에 손상을 줄 수 있으므로, 당겨 연결 부분을 분리하지 마십시오.
  2. 접시에서 각 절단 '기증자'용종을 제거하고 SEPA에 반환'풀 절단 수술'라고 표시된 속도 그릇; 그릇 날짜 및 주식 문화에 반환.
    참고 : 절단 용종이 정상적으로 공급 될 수 후 하루 내에 반구 상처를 치유하고 있습니다. 그들은 원하는 경우 physa 다시 절단 할 수있는 시점에서 2 주 이내에 정상적인 찾고 physa를 다시 생성합니다.
  3. 다음, 이미 각 웰 12의 PPT ASW의 10 ㎖를 갖는 멀티 웰 세포 배양 접시에 별도 멸균 웰에 각각 physa 전송할 12의 PPT ASW 절삭 접시에 남아 절제 physa 린스.
    참고 :이 예에서는 각 해수 잘 잡고 10 mL의 다섯 적출 physa으로, 여섯 웰 플레이트를 사용합니다. 일반적으로 해수에 의한 처리 및 잠재 증발의 움직임에 공기에 노출을 방지하기 위해 충분히 physa을 포함해야한다. 플레이트 또는 우물 뚜껑이 있어야합니다.
  4. 3.3 각각의 실험적인 치료를 위해 각 웰 예약에 적어도 5 physa를 수집 - 반복 3.1 단계를 반복합니다.
  5. 잠하는 온도에서 physa을 품어계획된 실험 심문에 대한 재생의 최고 속도를 IDE. 중생의 원하는 속도에 의해 결정되는 고정 된 온도에서 온도 조절 배양기에 physa을 포함하는 판을 놓습니다.
    참고 : physa이 누락 된 조직을 재생, 15 및 27 ° C 사이의 온도에서 배양 할 때 전체 용종을 형성 할 것이다. 재생 속도는 처음 두 단계 제외한 온도 의존적이다. 모든 온도에 대해 4 단계에 도달 평균 하루는 절단 후 7 일 이내입니다,이 또한 21 ° C에서의 재생과 일치한다. 27 ° C에서 4 단계는 약 3 일 이전에 도달하고 15 ° C에서, 4 단계는 21 ° C (또한 참조 참조 10)에서 재생에 비해 약 3 일 지연됩니다.

4. Nematostella 회생 준비 시스템과 재생을 평가 (NRSS)

  1. 변수 magnific와 스테레오 화합물 현미경을 사용하여 physa 점수ATION (10 - 80X). 스테이지 0으로 갓 잘라 Nematostella의 physa 점수와 동시에 NRSS (10)를 사용하여 매일 포스트 절단 (DPA)에 점수를 계속합니다.
    참고 : 키 준비 기준 및 세부 사항 참조 (10)를 참조하십시오.
    1. 갓 잘라 physa이 이완 풍선을 닮은 컵 - 모양의 덩어리로 나타나는 경우 열려있는 상처 부위로, 스테이지 0 (오픈 상처) 등 physa 점수 것은 가능성을 볼 수 있습니다.
      주 : 상처의 가장자리는 처음부터 뭉쳐 수 있지만, 티슈 계속 축소되고 강성이 부족하다. 오픈 상처의 가장자리는 상처 치유 등의 방사형 수축을 겪고 관찰 할 수있다.
    2. 절단 상처가 닫혀 나타나는 경우 1 단계 (폐쇄 상처) 등 physa 점수.
      주 : 상처 위치가 미래 경구 자극에 해당 할 것이다. 미래 구두 극 주변의 외부 표면은 기본 방사상으로 대칭 내배엽 mesenterial 삽입에 해당하는 별개의 아치를 표시하기 시작할 수 있습니다.
    3. 점수 산도YSA 구강 극의 표면이 방사상으로 대칭 패턴으로 배열하고 홈으로 구분 팔 제기 아치를 공개, 비정상적으로 나타나는 경우 2 단계 (레이디 얼 아치) 등. 아치의 정점에 작은 반구형 소포을 준수하십시오. 그들은 같은 높이 넓은 가능성 과도 대해, 그리고 초기 단일 외배엽 세포 층에 의해 구성된다.
      참고 : 어떤 경우에는 두 층 소포가 안정 수 있습니다. 참고 :이 이상이 단계에서 점액 층이 physa 멤브레인 '시스'에서 (그림 2) 캡슐화 나타날 수 있습니다. 이 밀봉재 득점을 용이하게 제거되어야한다.
    4. 내배엽과 외배엽 조직 층을 포함하는 촉수의 싹이 안정적으로 적어도 일부 반경 아치의 구두 끝 부분에 형성되어있는 경우 3 단계 (촉수)로 physa 점수.
      참고 : 촉수들이 넓은하고 최소한의 운동성보다 길다. physa 증가 보여하지만, 장간막의 초보가 마주 변수 인플레이션이 될 수 있도록체강 (coelenteron)에 mesenterial 삽입에서 연장 ible.
    5. physa들이 연결 표시되는 위치에서 측정 된 두 배로 반경 폭 이상입니다 구강 - 반구 길이로, 몸 벽에 삽입에서 coelenteron로 연장 팔 구별, 눈에 보이는 장간막이 포함 된 경우 4 단계 (선형 장간막)로 physa 점수 그 반구 끝 (enterostome)에서 인두합니다.
      참고 : 네 개 이하의 장간막은 "주름"내부 무료 가장자리가. 인두 볼 수 있습니다. 이상 팔 촉수는 운동성, 볼 수 있습니다 때때로 그들은 몸으로 계약.
    6. physa이 주름과 개 이상의 장간막을 가지고 있으며, 주름 무대 동물은 거의 "정상"성인 외관이 4보다 더 완전하고 꾸불 꾸불 한 경우 5 단계 (우세 주름 장간막)로 physa 점수 있지만 볼 수는 없다 생식 세포.

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Representative Results

절단 된 physa에서 재생하는 동안 형태 학적 이벤트의 진행은 각 NRSS 단계에서 physa의 대표적인 전망을 포함 그림 1A에 표시됩니다. 전형적인 physa 컷 사이트는 성인 (화살촉)에 표시됩니다. 그림 1A의 사진은 완전히 형성 용종을 통해 갓 잘라 physa에서 구강 및 신체 구조의 점진적 재생을 보여줍니다. 도 1b는 각각 4 단계 및 5 단계에서의 내부 격벽의 장간막의 구성을 표시 하였다. 4 단계에서 일부 장간막은 "주름"을 부족하지만, 대부분은 주름을 개발해야 5 단계로 자격을합니다. 그림 1D는 집게 (그림 1E)를 제거 할 수 있습니다 점액의 막에 싸여 physa을 보여줍니다. (가 부당 동물 트랩 않는) 재생 통상 무해은 멤브레인 physa를 기록하고 방해 할 수 있지만이러한 분자 / 생화학 적 분석을위한 현미경, 샘플 고정 또는 수확 등의 실험 조작을 보내고. 이것은 최고의 1 단계 후에 제거, 또는 나중에 경우 개혁된다.

도 2는 스테이지 시스템은 자식 작용을 억제하는 효과를 평가하기위한 실험 결과의 점수에 어떻게 사용될 수 있는지 나타낸다. Physa 절단, 10, 50, 100 μM에서 클로로퀸으로 처리, 또는 physa는 치료 (컨트롤)이었다 하였다. 클로로퀸은 자식 작용에 필요한 리소좀 기능을 억제한다. NRSS 기준은 그림 2E에 그려진 된 재생 및 결과의 과정을 통해 physa 점수를 사용 하였다. 대표 제어 (그림 2A) 및 클로로퀸 처리 physa (그림 2 B - D)의 사진은 컨트롤이 4 단계 이상 진행하지 않았다 단계 5. 클로로퀸 처리 된 동물에 도달 할 때 만들어, 그들은 일반적으로 불완전 장간막의 regenera을 전시했다기 (대부분의 부족 주름), 짧은 촉수 크기, 어떤 경우에는 짧은 몸 길이.

그림 1
재생 1. 특징을 그림. (A) 경구 및 바디 구조를 재생 physa의 예로는 NRSS에 따라 단계적. 성인 표시 패널 촉수 (t) 인두 (산도), 장간막 (m) 및 장간막 삽입 (마일)과 성숙한 동물의 특징을 보여줍니다. 흰색 화살표는 장간막 삽입에 장간막 전환의 반구 말단에 연장 내배엽의 능선의 주름 영역을 보여줍니다. 이 지역은 physa를 구성한다. 노란색 화살표는 이상적인 physa 이분 사이트를 보여줍니다. 패널 0 이분법 후 5 physa 분을 표시하고 패널 0 '의 무대 0을 정의 센터에서 열린 상처와 그 physa의 하나의 확대도이며,NRSS. 패널 1 상처와 physa 지금 2 (- 2 구강 말들이다 0 패널) 스테이지에 해당하는 단계를 아래 팽창 된 조직과 구강 극 주위 제기 반경 아치, 1. 패널이 쇼의 physa을 정의 폐쇄 보여줍니다. 패널 3가 표시 지금 단계 3. 참고 초보적인 장간막 요소에서, 연장 및 팽창 physa의 (오른쪽 향) 구강 극에 나오는 촉수 싹을하고 있습니다 보여줍니다 인두는 구강 끝에 어두운 영역에 형성된다. 패널 4 정의 단계 4. 선형 장간막이 팽창 physa에서 볼 수 있습니다, 구강 극에서 진정한 촉수의 출현뿐만 아니라 과도 '소포'를 보여줍니다. 폴립 내 눈에 보이는 큰 라운드 질량은 불명이며 입을 통해 배출됩니다. 패널 5 개 이상의 주름 장간막, 완전히 형성 산도 특징 거의 완전한 재생을 보여줍니다5 단계로 정의 arynx 및 8 개 이상의 촉수. (B, C) 개별 physa의 반구보기는 장간막의 biradial 배열과 형태를 보여줍니다. 이보기에서, 주름 장간막 조직의 중간의 팽창 (녹색 화살표)가 나타납니다. 단계 4 physa는 4 개 이하의 주름 장간막을 가지고 있으며, 스테이지 5 physa 이상 사 (C)가 있습니다. 또는 주름없이 장간막은 각각 녹색 또는 노란 화살촉으로 표시됩니다. 반경 방향으로 연장 한 주름 장간막에 (C) 지점에서 검은 색 화살표. physa에서 점액 시스의 (D, E) 제거 묘사된다. 흰색 화살표는 재생을 득점하기 전에 (E)에서와 같이 제거해야 physa (D)를 둘러싸는 점막 피복을 나타냅니다. 때때로 잔여 조직 (노란 화살표) 시스 내에 포획 될 수 있으며, 또한이 제거되어야한다. 별표는 어디 마크 구강 채를 나타냅니다에디션. 레드 크기의 막대는 A5 (1.0 mm)을 제외한 모든 패널에 0.5 mm이다. 패널 B이 그림의 C는 참조 (10)로부터 수정 및 허가 재판 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 재생에 클로로퀸 2. 효과. NRSS의 응용을 증명하기 위해, 우리는 클로로퀸, 자식 작용의 억제제의 효과를 시험 하였다. Physa은 절단하고 즉시 10에서 0.1 % DMSO (대조군) 또는 클로로퀸, 50, 100 μM을 포함하는 1 / 3X ASW에 넣었다. Physa은 NRSS을 사용하여 24 시간 간격으로 획득 하였다. (A)가 단계 5에 도달 할 때 컨트롤의 촬영 대표 엔드 포인트 이미지. - D) 단계 4. 클로로퀸의 "재생 고원"에 도달 클로로퀸 처리 physa의 대표 이미지는 테스트 한 모든 용량에서 재생 유사한 결함을 일으켰습니다. 가장 주목할만한 문제는 장간막과 촉수의 전체 재생의 부족이었다. (예를 들면, 성장을 방해)도 때때로 (C) 기록 된 비정상 체 형태. 현재 (흰색 화살표)과 클로로퀸 처리 physa에서 주름의 부족 (검은 색 화살표)를 D에 표시됩니다 (촉수가 부분적으로 철회된다). (E) 모든 physa위한 스테이징 데이터 (23 ℃에서) 시간의 함수로서 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 요약NRSS 단계의 주요 기능. 이 그림은 NRSS의 각 단계를 정의하는 키 형태 학적 변화를 보여줍니다. 운동의 방향은 녹색 화살촉에 의해 빨간색 화살표와 기능으로 표시됩니다. 스테이지 0은 (A), 및 t)에 절단 후의 열린 상처를 나타낸다. 상처의 가장자리는 중심 (B)를 향해 폐쇄 방사형 수축을 겪는다. 1 단계는 상처 (C) 및 구강을 향한 능선 (D) 사이의 아치 높이의 완전 폐쇄 특징이다; 구두 표면 (화살촉)의 중심은 우울하다. 2 단계는 구두 표면 (화살촉, E)의 뚜렷한 아치있다; physa은 아치 (화살촉)의 정점에서 볼 촉수 새싹과 소포와 (F)를 연장 좁은되기 시작합니다. 3 단계는 H 안정 촉수 새싹 (화살촉, G)와 재생 인두는 구강 극의 밀도로 볼 수있다 (오렌지 질량, 화살촉이 (I ')의 접합에 키가 같이해야 선형 및 unpleated 장간막 (I)의 존재를 보여줍니다. mesenterial 필라멘트 (J, J ') - 네 개 이하의 장간막은 자신의 내부 가장자리에 주름 될 수있다. 5 단계는 가장 반구 끝 (K ')에서 확인하여 평가 될 수 개 이상의 주름 장간막 (K)을 특징으로한다. 다시 인쇄 참조 (10)로부터 권한을 가진 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

상처 치유 및 재생의 모델로 Nematostella의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. 따라서,이 할당과 비교 될 수 효과적인 세포 및 분자 분석 전에 특정 프로토콜의 형태 패턴을 가시화 할 수있는 것이 중요하다. 삶의 포스트 플랜 울라 단계에서, 거의 모든 위치에서 절단 누락 된 구조를 개혁 할 수있는, 재생 "유연성"의 높은 수준을 Nematostella. 따라서, 여러 연구자들은 다른 연령대에, 재생 절단으로 인한 또는 폴립의 다른 지역에서 부상을 조사하고 7-18 크기했다.

여기에 설명 된 준비 시스템은 생식 조직을 부족 해부학 전체 청소년 용종에 성인의 반구 끝에서 절단 physa의 형태 학적으로 균일 한 섹션의 변화를, (이 재생 청소년들이 성적 m가 될 때 우리는 아직 결정하지 않은 다음ature). 이 접근법은 최대 근처 복잡 하나 조직 간단한 퇴화로부터 재생을 조사한다. 최소 그룹 크기가 잠재적 인 개인 변동과 생존에 대한 정상화하는 것이 좋습니다으로 다섯 physa 포함. 물론,이 숫자는 특정 실험 목적에 적합하도록 조절 될 수 있지만, NRSS 프로토콜 이드 (23)의 재생에 영향을 미치는 것으로보고 된 것과 같은 전위의 볼륨 효과 '부정 physa 당 배지 2ml를 할 수있다.

Nematostella 재생을 연구하는 다른 방법은 성인 양분 중간 몸을 사용하거나 구두 끝에서, 또는 청소년 4 촉수 단계 용종 중순 몸 7,11-18을 양분하고있다. 두 연구는 자연 핵분열 (16, 18)에 의해 해방 physa의 재생을 조사했으며, 최근 NRSS 8,9에 등장 절단 physa를 사용하여 접근한다. 이러한 다양한 방법의 각각은 그 자체의 장점을 가지고 있으며 regenerati 대한 고유 질문을 해결할 수그리고 다른 세 동물 중 다른 절단 또는 상처 정권에서 발생하는 프로세스를했습니다. 본 연구에 표시 physa 절단 및 채점에 대한 NRSS 프로토콜은, 체계적인 연구를위한 physa의 비교적 균일 한 세트를 생성하고 physa 크기의 변화, 조직 구성, 천연 가로 분열 18,24 관찰 중생의 후속 진행을 방지 할 수 있습니다. physa 절단이 Nematostella에서 무성 생식의 자연 모드로 다소 해당하지만, 분자 차이 중순 몸이나 physa 16,18,24에서 자연 분열과 절단으로 인한 재생 사이에서 주목되고있다. 여기에 설명 된 절단 또는 천연 분열 쇼와 같은 차이의 방법에 의해 제조 physa가 결정될 남아 있는지.

여기에 설명 된 몇 양육 절단과 성공을위한 중요한 문제 및 채점 방법이 있습니다. 절단의 수오 선택 폴립LD는 physa 크기 영양 역사 유사한, 동일 온도로 유지하고, 가능하면 세 (후자 체계적 스테이지 진행 변동에 노화 효과가 있는지 확인하기 위해 테스트되지 않았지만)한다. physa가 팽창하고 메스의 곡선 블레이드 성인 조직을 통해 누 볐어 때 곡선 블레이드를 갖는 날카로운 멸균 메스와 오픈 상처를 획득하면이 절단되고, 단계 0 단계 1 사이의 상처 치유의 형태 학적 관찰을 위해 중요하다 한 동작과 신속 웰 접시에서 절단 처리로 전달 될 수있다. 장간막을 포함하거나 절단 광범위한 물리적 조작의 결과를 폐기해야합니다.

인구의 개인차의 감각을 얻을 치료 physa을 준비 연습 테스트되고. 개별 physa 사이의 변화는 초기 단계에 대한 이상이다. 예를 들어, 모든 physa 0 DPA에서 스테이지 0에 있습니다. 같은 방법으로 모든 physa이 단계에 도달1 DPA에서 동시성 1. 스테이지 (2)의 모양은 '팽창'이 작은 변화에 의해이 DPA 그러나 달성 상대적인 상태이기 때문에, 관찰자가 구별하기 어려울 수있다. 사실 촉수 마크의 진행의 모양은 재생 촉수는 아래의 촉수 새싹의 시각화를 방해 멤브레인 "누에 고치"의 모양에 의해 가려 될 수있다 3. 스테이지한다. 멤브레인 커버가 이전에 제거되지 않은 경우, 지금 수행해야합니다. 뾰족한 집게로 막 제거는 재생의 physa을 해방한다. 스테이지 (4) 및 (5) 사이의 차이점은 장간막 주름의 수이다. 4 단계는 네 개 이하의 주름 장간막을 가지고 있으며, 5 단계는 5 ~ 8 주름 장간막 있습니다. 주름은 측면도에서 관찰 될 수 있지만, 주름 장간막의 정확한 수는 반구보기 좋은 관찰된다.

PHY에서 성인 Nematostella 재생을 공부 한 도전그리고 실제로, 다른 절단 부위에서 잘라 조직과 SA의 퇴화는 생체 조직의 다양한 선명도입니다. physa의 전구 그대로 성인 비교적 분명하지만 의한 절단 후의 조직 수축 다소 불투명해진다. 선명도가 점차 (2 단계) 상처 폐쇄 한 번 (1 단계)을 반환하고 동물 팽창하기 시작하지만, 그렇다하더라도 조직과 구조를 적극적으로 다소 조밀 한 조직 (특히 3 단계)에 의해 가려진 유적을 재생하는 상처 부위 주변 지역. 증가 인플레이션은 일반적으로 4 단계와 거의 확실 구두 끝에서 무슨 일이 일어나고 있는지 해결할 광 설명 다음 5. 고정 수반하지만, 형광 모니터링보다 쉽게 15 시각화 할 수 있습니다 라이브, 조직 특이 적 유전자 변형 기자가 될 수 있습니다 더 많은 정보를, 25 ~ 30.

이 (소화 분비를 항구) 촉수, 입, 장간막이 부족 년부터 절단 physa 분명히 따라서 requi, 공급 수 없습니다누락 된 신체 구조의 링 재생은 비 식품 소스에서 영양 예비를 동원하여 수행 할 수 있습니다. 잠재적으로 이것을 달성 할 수 physa는 세포질, 세포 소기관 및 기타 세포 성분 및 세포 내 신진 대사 과정 잠겼 31-33 에너지 및 화합물을 생성 리소좀 의존 메카니즘에 의해 처리되는, 자식 작용하는 것이다. 우리는 리소좀 억제제, 클로로퀸과 physa을 치료하는 자식 작용은 구강 및 신체 구조의 정상적인 재생에 필요한 것을 나타내는, 장간막과 촉수의 이상 재생 및 일반 신체 형태를 일으키는 찾을 수 있습니다. 자식 작용은 세포 기능 34-36 줄기 조정하고 planaria, 히드라의 재생에 중요한 역할을하고, 제브라 피쉬 37-41. 또한 분석은 자식 작용은 세포 및 분자 수준에서 Nematostella 재생에 영향을 미치는 방법을 이해하는 것이 필요하지만 우리의 첫 번째 패스 실험은 NR을 사용하는 유틸리티를 보여줍니다재생에 영향을 줄 수있는 작은 분자에 대한 빠른 검사 방법으로 SS.

Nematostella에서 재생을 조절하는 유전자의 분자 및 세포 과정은 이해의 초보적인 단계에 있지만 재생이 응급 모델은 게놈과 유전자 발현 분석을위한 도구의 성장 레퍼토리를 보유하고 있습니다. 그 주석 게놈, 지역 및 조직 특이 적 유전자 마커의 과다 및 형질 전환, 돌연변이 유발, 조직학 및 현미경에 대한 강력한 방법으로, Nematostella는 anthozoan cnidarian 재생을 관리하는 메커니즘을 공개하고 재생 프로세스가 자포 동물과 후생 동물 중 유사하거나 고유 여부를 밝히기 위해서 약속 일반한다.

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Acknowledgements

이 작품은 GHT에 뉴욕 줄기 세포 과학 (NYSTEM C028107) 그랜트에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

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References

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