Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cnidarios, y en concreto Hydra, fueron los primeros animales indicado para regenerar estructuras dañadas o cortadas, y de hecho podría decirse que este tipo de estudios en marcha la investigación biológica moderna a través de la obra de Trembley hace más de 250 años. En la actualidad el estudio de la regeneración ha visto un resurgimiento usando ambos organismos regenerativas "clásicos", como la hidra, planaria y Urodeles, así como un espectro ensanchamiento de las especies que abarcan la gama de metazoos, a través de las esponjas mamíferos. Además de su interés intrínseco como un fenómeno biológico, la comprensión de cómo funciona la regeneración en una variedad de especies nos informará acerca de si los procesos regenerativos comparten características y / o especies comunes o mecanismos celulares y moleculares específicas del contexto. La anémona de mar estrella, Nematostella vectensis, es un organismo modelo emergente para la regeneración. Al igual que Hydra, Nematostella es un miembro de la antigua phylum, cnidarios, pero dentro de tque anthozoa clase, un clado hermano a la hidrozoos que es evolutivamente más basal. Así, los aspectos de la regeneración en Nematostella será interesante comparar y contrastar con los de Hydra y otros cnidarios. En este artículo, presentamos un método para dividir en dos, observar y clasificar a la regeneración del extremo aboral del adulto Nematostella, que se llama el Physa. El Physa sufre naturalmente fisión como medio de reproducción asexual, y, o bien la fisión natural o amputación manual de la Physa desencadena re-crecimiento y la reforma de morfologías complejas. Aquí hemos codificado estos cambios morfológicos simples en un Sistema de estadificación Nematostella Regeneración (la NRSS). Usamos la NRSS para poner a prueba los efectos de la cloroquina, un inhibidor de la función lisosomal que bloquea la autofagia. Los resultados muestran que la regeneración de estructuras de pólipos, en particular los mesenterios, es anormal cuando se inhibe la autofagia.

Introduction

La observación de la regeneración en un solo hydra fue el evento seminal en el advenimiento de la biología como un 1,2 ciencia experimental. La regeneración sigue siendo un fenómeno extraordinariamente amplia de apelación al biólogo y laico por igual. La posibilidad de que los biólogos del desarrollo, médicos, científicos e ingenieros biomédicos de tejido para comprender y superar los límites de la regeneración humana hace que la biología de regeneración más intrínsecamente interesante.

Ahora, con el uso de las tecnologías emergentes, tales como la secuenciación del genoma y la ganancia y pérdida de función de las herramientas, el campo está a punto de burlarse de los mecanismos regenerativos aparte y para entender en última instancia cómo varias especies pueden regenerarse mientras que otros no pueden. El grado de coincidencia en las respuestas moleculares, celulares y morfológicos que queda por esclarecer, pero hasta el momento parece que las respuestas básicas entre los animales que pueden regenerar es más similar que habría sido ImagiNed hace sólo una década 3.

Cnidarios en particular, son fácil a la regeneración casi todas las partes del cuerpo en medio de un amplio espectro de diversidad morfológica. Desde el pólipo solitario agua dulce, Hydra junto con los pequeños pólipos marinos que construyen inmensos arrecifes de coral, a los sifonóforos coloniales complejos, tales como el portugués Man-O-War, la regeneración es a menudo un modo de reproducción, además de un mecanismo para la reparación o la reforma de las partes del cuerpo dañados o perdidos como resultado de la lesión y la depredación. Si las diversas especies de cnidarios utilizan mecanismos similares o diferentes para la regeneración es una pregunta interesante, fundamentalmente, 4-6.

Nosotros, y otros han estado desarrollando la anthozoan, Nematostella vectensis como modelo para la regeneración 7-17. Recientemente hemos desarrollado un sistema de clasificación para describir la regeneración de un cuerpo entero de un pedazo de tejido morfológicamente uniforme dividido en dos de los ABORAl final del pólipo 10. Mientras que los pólipos Nematostella pueden regenerarse cuando queda dividido en dos en cualquier nivel, se optó por cortar los adultos en una posición aboral en la región más morfológicamente simple, el Physa, en parte porque este está cerca del plano normal de la fisión asexual natural de 18 años, y también porque permite la observación y análisis moleculares de cómo un cuerpo entero se vuelve a montar a partir de los componentes morfológicos simples.

El sistema de estadificación Nematostella Regeneración (NRSS) proporciona un conjunto relativamente simple de los puntos de referencia morfológicas que podrían ser utilizados para marcar el progreso de cualquier aspecto de la regeneración por un Physa amputada, en condiciones de cultivo normales o experimentalmente perturbado situaciones tales como tratamientos de molécula pequeña, la manipulación genética o alteración ambiental. Como se preveía, el NRSS se está adoptado como un andamio morfológica en la que puede hacer referencia a los eventos celulares y moleculares de la regeneración10.

Finalmente nuestro método de corte produce un enorme agujero de varios órdenes de magnitud mayor que la punción punto de terminales que se utiliza en un estudio reciente 17, sin embargo, ambas heridas se curan en torno a 6 horas. Documentación de las fases visualmente llamativas y distintas de cierre de la herida debe sugerir enfoques experimentales para explicar la aparente independencia del tamaño de una herida y el tiempo que toma para cerrar. Por lo tanto, una comprensión visual más profunda del proceso de amputación aboral, proporcionada por este protocolo, ayudará a nuevas investigaciones sobre este sistema de regeneración de modelo y de ampliar la aplicación de este sistema de estadificación usando Nematostella vectensis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Acondicionamiento de animales con la temperatura, la nutrición y la Luz del ciclo oscuro /

  1. Obtener adultos Nematostella vectensis de uno de los numerosos laboratorios de todo el mundo Nematostella, o un proveedor sin fines de lucro (Tabla 1)
  2. Mantener Nematostella a temperatura constante (típicamente entre 18 y 21 ° C) en la oscuridad, en "1 / 3x" Artificial Agua de Mar (ASW) a una salinidad de 12 partes por mil (ppt). Mantener los cultivos en placas de cultivo simples vidrio de sosa-cal, por lo general de 250 ml o 1,5 capacidad de 11 l.
    Nota: Estas condiciones de cultivo simples se usan comúnmente entre los laboratorios que estudian Nematostella, pero el cuidado de cultivo también pueden automatizarse 19.
  3. Alimentar Nematostella Artemia recién nacidas nauplios 2 - 4x por semana. Hatch Artemia quistes en toda su fuerza (36 ppt) o 1 / 3x ASW a 30 ° C, en un recipiente de vidrio rectangular poco profunda 20 o encualquiera de una serie de pequeña escala, los criaderos de camarón de salmuera comerciales o caseros. Si una incubadora no está disponible, camarones eclosionan a temperatura ambiente, pero lo hacen más lentamente.
    Nota: Esto requiere a menudo más de 24 horas para su finalización.
  4. Cambie el agua de cultivo anémona al menos una vez a la semana. Para obtener la mejor salud de los adultos, completamente limpio (sin jabón), el cultivo cuencos una vez por semana de las secreciones mucosas acumuladas, que cubra el recipiente y pueden atrapar los alimentos no consumidos y los residuos, y enredar a los animales.

2. Selección y relajación de los Animales Nutricionalmente acondicionado

  1. Seleccione los pólipos de tamaño con ajuste de aproximadamente la misma longitud (3 - 5 cm, cuando, naturalmente, relajado) y colocarlos en un recipiente separado de la colonia durante tres días antes de la amputación.
    Nota: El número de animales seleccionados para el corte será determinado por el experimento está llevando a cabo, por supuesto, pero en general se recomienda un mínimo de cinco animales por punto de muestreo con seis repeticiones. Así,En un experimento típico de un mínimo de 30 animales se preselecciona. En general, es aconsejable seleccionar más que el número mínimo (30), ya que las amputaciones que son irregulares (véase más adelante) puede afectar a más de puntuación.
  2. Retirar la cápsula de animales seleccionados de la incubadora en la luz de la habitación al menos una hora antes de la amputación.
    Nota: La exposición a la luz de la sala y las vibraciones de la manipulación probablemente hará que los animales se contraigan, por lo que necesitan ser adaptados o "relajado" por incubación en la mesa de laboratorio. Los animales serán refractarios al tacto ya la exposición a la luz y en ese momento puede ser movido por pipeteo suave.
  3. Opcional: Anestesie los animales mediante la adición de 7,5% de MgCl2 (en 1 / 3x ASW). Añadir suavemente la solución de MgCl2 en el recipiente con un plástico de 5 ml pipeta estándar.
    Nota: Aunque los animales con el tiempo habituado a la luz y a la manipulación física, puede ser ventajoso para anestesiar a los animales para mantener o "arreglar" tse relajó estado después de que se han convertido en 16,21,22 alargada.
  4. Utiliza una amplia perforación (> 0,5 cm) pipeta de plástico para transferir (en 1 / 3x ASW) de cinco animales de la piscina a ser amputada, en el fondo de un plato de corte de vidrio estéril de 100 mm de diámetro que contiene 12 partes por mil ASW. Coloque el plato en el escenario de un microscopio estereoscópico con aumento variable entre 10 - 40X.
    Nota: Si los animales no han sido anestesiado y relajado para el corte, aún pueden responder al tacto y la iluminación estereoscopio y por lo tanto puede necesitar unos minutos para convertirse relajado de nuevo.

3. La amputación

  1. Con un bisturí estéril, amputar la Physa aboral de cada pólipo, con el objetivo de obtener una sección de la Physa que es aproximadamente el tiempo que es ancho y que no contiene mesenterio.
    Nota: El sitio de corte ideal es sólo aboral a la terminación del mesenterio. En el plano de corte hay una transición de mesenterio adecuada para diluir lines correspondiente a cada inserción mesenterial (véase la Figura 1, las flechas). La ausencia de mesenterio es crítica, ya que produce mucosa que pueden facilitar 'tapar' el agujero 17,30.
    1. Coloque la hoja de bisturí en contacto con el animal en el sitio deseado de la amputación. Para ello, sin necesidad de asistencia (a pulso), o agarrando suavemente el cuerpo del animal con unos fórceps # 5 (estilo Dumont o similares).
    2. Cortar a través del tejido mediante el aprovechamiento de la hoja curva del bisturí en un movimiento de "oscilación" a través del cuerpo.
      Nota: El tejido debe cortar limpiamente como el bisturí se sacudió y liberar la sección deseada de Physa del donante. Sin embargo, si una pequeña porción de tejido sigue conectando el cuerpo y el Physa, cortar con el bisturí. No intente separar las piezas conectadas tirando, ya que esto puede dañar el Physa.
  2. Retire cada pólipo "donante" amputada del plato y devolverlo a una SEPAtazón dosis de etiqueta 'amputados puestas en común »; la fecha, el cuenco y devolverlo al cultivo de reserva.
    Nota: Los pólipos amputados se cura la herida aboral en un día y luego pueden ser alimentados normalmente. Ellos se regenerarán un Physa aspecto normal dentro de dos semanas y en ese momento la Physa puede ser amputada de nuevo si lo desea.
  3. Enjuague el Physa extirpado que permanecen en el plato de corte en 12 ASW ppt, a continuación, transferir cada Physa a un pocillo estéril independiente en una placa de cultivo celular de múltiples pozos que ya cuenta con 10 ml de 12 partes por mil ASW en cada pocillo.
    Nota: En este ejemplo se utiliza una placa de seis pocillos, cada pocillo con la celebración de 10 ml de agua de mar y cinco Physa extirpado. En general, el agua de mar que debe cubrir los Physa lo suficiente como para evitar la exposición al aire debido al movimiento en el manejo y la evaporación potencial. La placa o pozos deben tener una tapa.
  4. Repita los pasos 03.01 a 03.03 para recoger al menos 5 Physa en cada pocillo reservada para cada tratamiento experimental.
  5. Incubar la Physa a una temperatura que provide la mejor tasa de regeneración de los interrogatorios experimentales planificadas. Colocar la placa que contiene el Physa en una incubadora de temperatura regulada, a una temperatura fija determinada por la velocidad deseada de regeneración.
    Nota: El Physa regenerará tejidos que faltan y formar un pólipo completo cuando se incuban a temperaturas entre 15 y 27 ° C. La tasa de regeneración es dependiente de la temperatura a excepción de las dos primeras etapas. El día medio para llegar a la etapa 4 para todas las temperaturas es de 7 d después del corte y esto también coincide con la regeneración a 21 ° C. A 27 ° C, Etapa 4 se alcanza alrededor de 3 días antes y a 15 ° C, Etapa 4 se retrasa en aproximadamente 3 días, en comparación con la regeneración a 21 ° C (también véase la referencia 10).

4. La evaluación de la regeneración con el sistema de clasificación de Nematostella Regeneración (NRSS)

  1. Anotar el Physa usando un microscopio estéreo-compuesto con magnífica variablesación (10 - 80X). Anotar el Physa Nematostella recién cortada que en la Etapa 0 y continuar anotando al mismo tiempo cada día después de la amputación (dpa) utilizando el NRSS 10.
    Nota: Para los criterios clave de parada y los detalles se refieren referencia 10.
    1. Puntuación Physa que en la Etapa 0 (herida abierta) si un Physa recién cortada aparece como una masa en forma de copa se asemeja a un globo flácida, con una zona de la herida abierta es probable visible.
      Nota: Los bordes de la herida también podrían permanecer juntos desde el principio, pero estarán colapsado el tejido y la falta de rigidez. Los bordes de la herida abierta se pueden observar de someterse a la contracción radial como la herida se cura.
    2. Puntuación Physa que en la Etapa 1 (herida cerrada) si la herida de la amputación aparece cerrado.
      Nota: La ubicación de la herida se corresponderá con el futuro polo oral. La superficie exterior en torno al futuro polo oral puede comenzar a mostrar arcos distintos que corresponden a las inserciones subyacentes mesenterial endodermales radialmente simétrica.
    3. ph puntajeYSA que en la Etapa 2 (de los arcos radiales) si la superficie del polo oral parece infla, revelando ocho arcos elevadas dispuestas en un patrón radialmente simétrica y separadas por ranuras. Observe ampollas pequeñas, hemisféricas en el vértice de los arcos. Ellos serán casi tan alto como ancho transitoria, probablemente, e inicialmente compuesto por una sola capa de células ectodérmicas.
      Nota: En algunos casos, las vesículas de doble capa pueden estabilizarse. Nota: En esta etapa hacia adelante una capa mucosa puede parecer que encapsular el Physa (Figura 2) en una 'vaina' membranosa. Este material de encapsulación se debe quitar para facilitar la puntuación.
    4. Puntuación Physa que en la Etapa 3 (tentáculo) si los brotes de los tentáculos que contienen capas de tejido endodérmico y ectodérmicas se forma estable formado en el extremo oral de al menos algunos arcos radiales.
      Nota: Los tentáculos son más largos que anchos y están mínimamente móviles. El Physa mostrarán un aumento, pero la inflación variable de modo que rudimentos mesenterio puede llegar a ser visIble que se extiende desde la inserción mesenterial en la cavidad corporal (celenteron).
    5. Puntuación Physa que en la Etapa 4 (mesenterios lineal) si el Physa contiene ocho mesenterios distintas, visibles que se extienden en la celenteron de inserciones en la pared del cuerpo, con longitudes orales-aboral que son más del doble de su anchura radial medida desde donde aparecen para conectar a la faringe en su extremo aboral (enterostome).
      Nota: Cuatro o menos mesentenos tienen bordes libres internos "plisados". La faringe es visible. Más de ocho tentáculos son visibles, móviles y, a veces se contraen en el cuerpo.
    6. Puntuación Physa que en la Etapa 5 (Predominio plisados ​​mesenterio) si el Physa tiene más de cuatro mesenterio con plisado, y el plisado es más completa y sinuoso que en la Etapa 4. El animal tiene una apariencia casi adulta "normal", pero no hay visibles células gonadales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La progresión de los acontecimientos morfológicos durante la regeneración en Physa cortada se muestra en la Figura 1A, que incluye vistas representativas de Physa en cada etapa NRSS. El sitio típico Physa corte se indica en el adulto (puntas de flecha). Las fotografías muestran en la Figura 1A regeneración progresiva de las estructuras orales y corporales de Physa recién cortada a través de pólipos completamente formado. Figura 1B, C muestran la disposición de los septos internos, los entresijos, en la etapa 4 y la etapa 5, respectivamente. Tenga en cuenta que algunos entresijos de la Etapa 4 carecerán de "plegado", pero para calificar como una etapa 5 la mayoría debe haber desarrollado pliegues. La figura 1D muestra una Physa envuelto en una membrana mucosa de los que se pueden quitar con una pinza (Figura 1E). Aunque por lo general no es perjudicial para la regeneración (a menos que irrazonablemente atrapa el animal), la membrana puede impedir meter el Physa y hacering manipulaciones experimentales, como la microscopía, la fijación de la muestra o la cosecha para el análisis molecular / bioquímica. Esto se elimina mejor después de la etapa 1, o más tarde si las reformas.

La Figura 2 muestra cómo el sistema de estadificación se puede utilizar para marcar los resultados de un experimento para evaluar los efectos de la inhibición de la autofagia. Physa se cortaron y se trató con cloroquina en 10, 50 y 100 mM, o Physa fueron no tratadas (controles). La cloroquina inhibe las funciones lisosómicas, que son necesarios para la autofagia. Los criterios de NRSS se utilizaron para anotar el Physa en el transcurso de la regeneración y resultados se representaron en la Figura 2E. Fotografías de control de representante (Figura 2A) y tratados con cloroquina Physa (Figura 2 B - D) se hicieron controles cuando alcanzaron la etapa 5. tratado de cloroquina animales no progresó más allá de la etapa 4, y por lo general exhiben Regenera mesenterio incompletación (plisado más carecido), el tamaño de tentáculos cortos, y en algunos casos la longitud del cuerpo corto.

Figura 1
Figura 1. Características de la regeneración. (A) Ejemplos de Physa la regeneración de las estructuras orales y corporales realizaron de acuerdo con la NRSS. Panel de marcado adulta muestra características de un animal maduro con tentáculos faringe (t) (ph), mesenterio (m) y las inserciones mesenterio (mi). Las flechas blancas muestran región donde plisada del mesenterio transición a la inserción del mesenterio, un canto de endodermo se extiende hasta el extremo aboral. Esta región constituye el Physa. Las flechas amarillas indican el sitio Physa bisección ideal. Panel de 0 muestra cinco minutos después de physa bisección, y el Panel 0 'es una vista ampliada de un uno de los Physa, con la herida abierta en el centro, que define la etapa 0 de laNRSS. Panel 1 muestra una Physa con la herida ya está cerrado, la definición de la Etapa 1. Grupo 2 muestra Physa con arcos radiales planteadas alrededor del polo por vía oral, con tejidos inflados por debajo, lo que corresponde a la Etapa 2 (paneles a 0 - 2 son vistas del extremo bucal). Grupo 3 muestra los brotes emergentes de tentáculos en el polo oral (hacia la derecha) de la Physa alargada e inflando, ahora en la etapa 3. Nota elementos mesenterio rudimentaria son visibles y la faringe se está formando en el área oscura en el extremo oral. Grupo 4 muestra la aparición de verdaderos tentáculos, así como las ampollas '' transitorios en el polo oral, que definen Etapa 4. mesentenos lineales son visibles en la Physa inflado. La gran masa redonda visible en el interior del pólipo es de origen desconocido y será expulsado por la boca. Grupo 5 muestra la regeneración casi completa que se caracteriza por más de cuatro mesentenos plisadas, un pH completamente formadoarynx y ocho o más tentáculos, que lo define como la fase 5. (B, C) vistas aboral de Physa individuo ilustran la disposición biradial y la morfología de los mesenterios. En este punto de vista, mesenterio plisadas parecen tener una protuberancia de tejido a medio camino (punta de flecha verde). Un Physa Etapa 4 tiene cuatro o menos mesentenos plisadas y una Physa la etapa 5 tiene más de cuatro (C). Mesenterio con o sin plegado se indican mediante puntas de flecha verde o amarillo, respectivamente. Punta de flecha en negro (C) apunta a un mesenterio plisada que se ha extendido radialmente. (D, E) La eliminación de una vaina mucosa de la Physa se representa. Las flechas blancas indican una vaina que rodea a la mucosa Physa (D) que debe ser eliminado como en (E) antes de anotar la regeneración. A veces tejido residual (flechas amarillas) puede quedar atrapado dentro de la vaina, y esto también debe ser eliminado. El asterisco indica polos orales, donde la marcaed. Barras rojas son de tamaño 0,5 mm en todos los paneles excepto A5 (1,0 mm). Los paneles B y C de esta figura se han modificado y reimpreso con el permiso de Referencia 10. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Efectos de la cloroquina sobre la regeneración. Para demostrar una aplicación de la NRSS, hemos probado los efectos de una cloroquina, un inhibidor de la autofagia. Physa fueron amputadas e inmediatamente colocado en 1 / 3x ASW que contiene 0,1% de DMSO (control) o la cloroquina en 10, 50, 100 mM. Physa se anotó en intervalos de 24 horas utilizando el NRSS. (A) Imágenes de punto final representativas tomadas de los controles cuando llegaron a la etapa 5. - D) Imágenes representativas de Physa cloroquina tratados que alcanzaron una "meseta regenerativa" de la etapa 4. La cloroquina causaron defectos similares en la regeneración en todas las dosis probadas. El problema más notable fue la falta de regeneración completa del mesenterio y tentáculos. Morfología anormal del cuerpo (por ejemplo, retraso del crecimiento) se tomó nota también de vez en cuando (C). Presencia (flecha blanca) y la falta (flecha negro) de pliegues en un Physa cloroquina tratados se muestra en D (tentáculos se retiran parcialmente). (E) Los datos de parada para todos Physa representan como una función del tiempo (a 23 ° C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Resumen de laslas características clave de las etapas NRSs. Este diagrama muestra los cambios morfológicos claves que definen cada etapa de la NRSS. Dirección de los movimientos se indican con flechas rojas y las características de las puntas de flecha verde. Etapa 0 representa herida abierta justo después del corte (A), y t). Los bordes de la herida se someten a cierre de contracción radial hacia el centro (B). Etapa 1 se caracteriza por el cierre completo de la herida (C) y la elevación de los arcos entre las crestas de cara orales (D); el centro de la superficie oral (punta de flecha) es deprimido. Etapa 2 tiene un arco pronunciado de la superficie oral (punta de flecha, E); la Physa empieza a alargarse y convertirse en estrecha (F) con los brotes de tentáculos y ampollas visibles en el ápice de los arcos (puntas de flecha). Etapa 3 tiene brotes estables tentáculo (punta de flecha, G) y la regeneración de la faringe puede ser visto como una densidad en el polo oral (masa naranja, punta de flecha en H (I) que deben ser al menos el doble de tiempo, ya que son altos en la salida de la faringe (I '). Cuatro o menos mesentenos pueden ser plisadas en su borde interior - el filamento mesenterial (J, J '). Etapa 5 se caracteriza por más de cuatro mesenterios plisadas (K), que pueden ser mejor evaluados mediante la visualización desde el extremo aboral (K '). Vuelva a imprimir con permiso de Referencia 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El uso de Nematostella como modelo de curación y regeneración de la herida se está convirtiendo cada vez más popular. Por lo tanto, es importante ser capaz de visualizar los patrones morfológicos de un protocolo particular antes de los análisis celulares y moleculares eficaces pueden ser asignados y comparación. Nematostella tener un alto grado de regeneración "flexibilidad", siendo capaz de reformar casi cualquier estructura que falta amputada en cualquier lugar, en las etapas posteriores a la plánula de la vida. De este modo, varios investigadores han examinado la regeneración resultante de la amputación o hiriendo en diferentes regiones de pólipos, a diferentes edades y tamaños 7-18.

El sistema de clasificación descrito aquí sigue la transformación de una sección morfológicamente uniforme de Physa, amputada desde el extremo aboral de un adulto, a un pólipo juvenil anatómica completa, sólo falta tejido reproductivo (que todavía no hemos determinado cuando estos jóvenes se vuelven sexualmente regeneradas mtura). Este enfoque examina la regeneración de un simple rudimento de tejido a una de complejidad máximo cerca. Incluyendo cinco Physa como se recomienda un mínimo de personas para normalizar la variabilidad potencial y la supervivencia del individuo. Por supuesto, este número se puede ajustar para adaptarse a los objetivos experimentales particulares, pero el protocolo NRSS permite 2 ml de medio por Physa para negar una potencial "efecto de volumen 'como la que se ha informado que afecta a la regeneración en hydra 23.

Otros enfoques para estudiar Nematostella regeneración han utilizado adultos bisectados mitad del cuerpo o en el extremo oral, o de menores pólipos etapa 4-tentáculo bisecado mitad del cuerpo 7,11-18. Dos estudios han examinado la regeneración en Physa liberada por la fisión natural de 16,18, y estrategias que usan Physa amputada han surgido recientemente con la NRSS 8,9. Cada uno de estos diversos enfoques tiene sus propios méritos y puede responder a preguntas únicas sobre regeneraticinco procesos que tienen lugar bajo diferentes regímenes de amputación o herir, y entre los animales de manera diferente edad. El protocolo para la amputación NRSS Physa y puntuación, que se muestra en el presente estudio, genera un conjunto relativamente uniforme de Physa para el estudio sistemático y evita la variación en el tamaño Physa, la composición del tejido y el posterior avance de la regeneración observada con la fisión transversal naturales 18,24. Aunque la amputación Physa corresponde tanto al modo natural de reproducción asexual en Nematostella, diferencias moleculares se han observado entre la regeneración resultante de la fisión natural y la amputación en la mitad del cuerpo o en el Physa 16,18,24. Ya sea Physa producido por el método de la amputación se describe aquí o un programa de fisión naturales tales diferencias queda por determinar.

Hay algunas cuestiones que son críticas para el éxito con la amputación de cría, y las técnicas de calificación que se describen aquí. Los pólipos seleccionados para shou amputaciónld se mantuvo a la misma temperatura, adaptado para el tamaño Physa, historia nutricional y si es posible la edad (aunque este último no se ha probado de forma sistemática para determinar si hay una edad de efecto de la variación en la progresión etapa). La obtención de una herida abierta con un bisturí estéril afilada que tiene una hoja curva es importante para las observaciones morfológicas de la cicatrización de heridas entre 0 y Etapa Etapa 1. Cuando el Physa se infla y la hoja curva del bisturí se balanceó sobre el tejido adulto, se amputó en un solo movimiento y se puede transferir rápidamente al tratamiento bien de corte plato. Amputaciones que incluyen mesenterio o que son el resultado de una extensa manipulación física debe ser desechada.

La práctica puesta en escena Physa sin tratar de tener una idea de la variación individual en la población se está probando. Variación entre Physa individuo es menos para las primeras etapas. Por ejemplo, todos los Physa están en la etapa 0 a 0 dpa. De la misma manera todos Physa llegar Etapa1 en sincronía a la 1 DPA. La aparición de la etapa 2 puede ser más difícil para el observador discernir porque "inflación" es una condición relativa que se logra, sin embargo, por 2 a dpa con poca variación. La aparición de la verdadera progresión marcas tentáculos a la etapa 3. Los tentáculos de regeneración pueden ser oscurecida por la aparición de un "capullo" membranoso que impide la visualización de la yema tentáculo debajo. Si la cubierta membranosa no ha sido retirado previamente, se debe hacer ahora. La eliminación de la membrana con pinzas de punta fina liberará a la Physa regeneradora. La distinción entre la fase 4 y 5 es el número de mesenterios plisadas. Etapa 4 tiene cuatro o menos mesentenos plisadas, y la Etapa 5 tiene de cinco a ocho mesentenos plisadas. Mientras plisado se puede observar en una vista lateral, el número exacto de mesentenos plisadas se observa mejor con una vista aboral.

Un desafío en el estudio de adulto Nematostella regeneración de un physa rudimento, y de hecho con los tejidos cortados de otros sitios de amputación, es variada la claridad de los tejidos vivos. El bulbo de la Physa es relativamente clara en el adulto intacto, pero se vuelve más opaca debido a la contracción del tejido después de la amputación. Claridad vuelve gradualmente (Etapa 2) una vez que se cierra la herida (Etapa 1) y el animal comienza a inflarse, pero incluso entonces la región alrededor del sitio de la herida, donde los tejidos y estructuras están regenerando activamente restos algo oscurecida por los tejidos densos (especialmente de la etapa 3). El aumento de la inflación suele acompañar a la Etapa 4 y 5. La fijación seguido de una aclaración óptica es casi seguro que resolver lo que está sucediendo en el extremo oral, pero más informativo puede ser reporteros transgénicos en vivo, específicos de tejido que pueden ser monitoreados por fluorescencia y más fáciles de visualizar 15, 25-30.

Un Physa amputada, obviamente, no puede alimentarse ya que carece de tentáculos, la boca y mesenterio (que albergan las glándulas digestivas), por lo tanto requila regeneración del anillo de las estructuras del cuerpo que faltan que se lleva a cabo mediante la movilización de las reservas de nutrientes a partir de fuentes no alimentarias. El Physa potencialmente puede lograr esto es por la autofagia, en el que el citoplasma, orgánulos y otros componentes celulares son engullidas intracelularmente y procesados por un mecanismo dependiente de lisosoma para producir energía y compuestos para los procesos anabólicos 31-33. Encontramos que el tratamiento con el inhibidor de Physa lisosoma, cloroquina, hace que la regeneración anormal de mesenterios y tentáculos, y la morfología general del cuerpo, lo que indica que se requiere la autofagia para la regeneración normal de las estructuras orales y corporales. La autofagia regula las funciones celulares 34-36 tallo, y desempeña un papel esencial en la regeneración en Hydra, planaria, y el pez cebra 37-41. Se requieren más estudios para comprender cómo influye la autofagia Nematostella la regeneración en los niveles celular y molecular, pero nuestro primer experimento pase demuestra la utilidad de usar la NRSS como método de cribado rápido para las pequeñas moléculas que podrían afectar a la regeneración.

Los procesos genéticos, moleculares y celulares que regulan la regeneración en Nematostella son sólo en una etapa rudimentaria de entendimiento, pero este modelo emergente para la regeneración tiene un repertorio creciente de herramientas para el análisis de la expresión génica y la genómica. Con su genoma anotado, un gran número de marcadores genéticos regionales y específicos de tejido, y los métodos robustos para la transgénesis, mutagénesis, histología y microscopía, Nematostella promete revelar los mecanismos que regulan anthozoan regeneración de los cnidarios y descubrir si sus procesos regenerativos son similares o único entre los cnidarios y metazoos en general.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una de Células Madre de Nueva York Ciencia (NYSTEM C028107) Subvención a GHT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. The Boxwood Press. (1986).
  2. Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. Jean & Herman Verbeek. (1744).
  3. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11, (10), 710-722 (2010).
  4. Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56, (6-8), 411-423 (2012).
  5. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233, (1-2), 53-66 (2013).
  6. Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226, (2), 257-267 (2003).
  7. Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16, (12), 28449-28471 (2015).
  8. Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10, (4), e0124578 (2015).
  9. Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227, (3), 211-220 (2014).
  10. Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242, (11), 1320-1331 (2013).
  11. Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8, (5), 916-923 (2013).
  12. Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2, (2), 217-226 (2013).
  13. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
  14. Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240, (12), 2673-2679 (2011).
  15. Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (1), 104-108 (2010).
  16. Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219, (2), 79-87 (2009).
  17. DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
  18. Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
  19. Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212, (2), 99-103 (2002).
  20. Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83, (3), 33-40 (2016).
  21. Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
  22. Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215, (12), 618-630 (2005).
  23. Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87, (2-3), 191-203 (2007).
  24. Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
  25. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
  26. Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
  27. Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370, (1684), (2015).
  28. Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139, (2), 347-357 (2012).
  29. Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141, (24), 4681-4689 (2014).
  30. DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
  31. Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (8), 461-472 (2015).
  32. Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47, (10), 2065-2088 (2015).
  33. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221, (1), 3-12 (2010).
  34. Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73, (3), 475-496 (2016).
  35. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, (6), 830-849 (2013).
  36. Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70, (1), 89-103 (2013).
  37. Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
  38. Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21, (4), 547-556 (2014).
  39. Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15, (3), 279-292 (2010).
  40. Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
  41. Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14, (2), 116-125 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics