Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet

Developmental Biology

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Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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Abstract

Cnidaires, et plus particulièrement Hydra, ont été les premiers animaux présentés pour régénérer des structures endommagées ou coupées, et en fait de telles études sans doute lancé l' enquête biologique moderne à travers le travail de Trembley il y a plus de 250 ans. Actuellement , l'étude de la régénération a vu une résurgence en utilisant les deux organismes régénérateurs "classiques", comme l'hydre, planaria et Urodèles, ainsi qu'un éventail d'espèces couvrant la gamme des métazoaires d'élargissement, des éponges par les mammifères. Outre son intérêt intrinsèque comme un phénomène biologique, de comprendre comment la régénération fonctionne dans une variété d'espèces va nous informer si les processus de régénération ont des caractéristiques et / ou des espèces communes ou des mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques au contexte. La starlette anémone de mer, Nematostella vectensis, est un organisme modèle émergent pour la régénération. Comme Hydra, Nematostella est membre du phylum antique, cnidaires, mais à l' intérieur til anthozoa de classe, un clade jumeau du hydrozoaires qui est évolutivement plus basale. Ainsi , les aspects de la régénération dans Nematostella sera intéressant de comparer et contraster avec ceux d'Hydra et d' autres cnidaires. Dans cet article, nous présentons une méthode pour bisect, observer et classer la régénération de la fin aboral de l'adulte Nematostella, qui est appelé le physa. Le physa subit naturellement la fission comme un moyen de reproduction asexuée, et soit la fission naturelle ou amputation manuelle du physa déclenche re-croissance et la réforme des morphologies complexes. Ici , nous avons codifié ces changements morphologiques simples dans un système de stadification Nematostella Régénération (la NRSS). Nous utilisons la NRSS pour tester les effets de la chloroquine, un inhibiteur de la fonction lysosomale qui bloque autophagy. Les résultats montrent que la régénération des structures polype, en particulier les mésos, est anormal lorsque l'autophagie est inhibée.

Introduction

L'observation de la régénération en une seule hydra a été l'événement séminal dans l'avènement de la biologie comme une science expérimentale 1,2. La régénération reste un phénomène de extraordinairement large appel au biologiste et laïc semblables. Le potentiel pour les biologistes du développement, des cliniciens, des chercheurs en sciences biomédicales et des ingénieurs de tissus pour comprendre et surmonter les limites de la régénération humaine rend la régénération de la biologie plus intrinsèquement intéressante.

Maintenant, avec l'utilisation des nouvelles technologies telles que le séquençage du génome et le gain et la perte d'outils de fonction, le champ est prêt à taquiner les mécanismes en dehors de régénération et de comprendre finalement comment diverses espèces peuvent se régénérer tandis que d'autres ne peuvent pas. Le degré de similitude dans les réponses moléculaires, cellulaires et morphologiques reste à élucider, mais jusqu'à présent, il semble que les réponses de base chez les animaux qui peuvent se régénérer est plus semblable que aurait été imagined seulement il y a 3 ans.

Cnidaires en particulier, sont facile à régénérer la quasi-totalité de leurs parties du corps au milieu d'un large éventail de la diversité morphologique. Du polype solitaire d'eau douce, Hydra ainsi que les petits polypes marins qui construisent d'immenses récifs coralliens, les siphonophores coloniales complexes, comme l'Homme-O-War portugais, la régénération est souvent un mode de reproduction, en plus d'un mécanisme de la réparation ou la réforme des parties du corps endommagées ou perdues résultant de blessures et de la prédation. Que les diverses espèces de cnidaires utilisent des mécanismes similaires ou différents pour la régénération est une question fondamentalement intéressante 4-6.

Nous, et d' autres ont mis au point l'anthozoaire, Nematostella vectensis comme un modèle pour la régénération 7-17. Nous avons récemment développé un système de mise en scène pour décrire la régénération d'un corps entier d'un morceau morphologiquement uniforme du tissu bissectrice des Aboral extrémité du polype 10. Alors que les polypes Nematostella peuvent se régénérer quand bissectrice à tous les niveaux, nous avons choisi de couper les adultes à une position aboral dans la région la plus morphologiquement simple, la physe, en partie parce que cela est proche du plan normal de la fission naturelle et asexuée 18, et aussi parce qu'il permet l'observation et des analyses moléculaires de la façon dont un corps entier est remonté à partir des composants les plus simples morphologiques.

Le système de stadification Nematostella Régénération (NRSS) fournit un ensemble relativement simple de repères morphologiques qui pourraient être utilisés pour marquer les progrès de tout aspect de la régénération par une physa amputée, dans des conditions normales de culture ou expérimentalement perturbé des situations telles que les petits traitements de molécules, les manipulations génétiques ou l'altération de l'environnement. Comme prévu, le NRSS est de plus adopté comme un échafaudage morphologique sur lequel les événements cellulaires et moléculaires de la régénération peuvent être référencées10.

Enfin , notre méthode de coupe produit un trou béant de plusieurs ordres de grandeur supérieure à la ponction de point de broches utilisé dans une étude récente 17, mais les deux plaies à guérir dans environ 6 heures. Documenter les phases visuellement saisissantes et distinctes de fermeture de la plaie devrait suggérer des approches expérimentales pour expliquer l'apparente indépendance de la taille d'une blessure et le temps qu'il faut pour fermer. Ainsi, une compréhension visuelle plus profonde du processus d'amputation aboral, fourni par ce protocole, aidera d' autres investigations dans ce système de régénération de modèle et d' élargir l'application de ce système de mise en scène en utilisant Nematostella vectensis.

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Protocol

1. Conditionnement des animaux pour la température, la nutrition et la Lumière Cycle foncé /

  1. Obtenir les adultes Nematostella de l'un des nombreux laboratoires dans le monde entier Nematostella, ou un fournisseur sans but lucratif (tableau 1)
  2. Maintenir Nematostella à température constante (typiquement entre 18 et 21 ° C) dans l'obscurité, dans "1 / 3x" Artificial eau de mer (ASW) à une salinité de 12 parties par millier (ppt). Maintenir les cultures dans des plats simples sodocalcique culture en verre, généralement 250 ml ou 1,5 L capacité de 11.
    Note: Ces conditions de culture simples sont couramment utilisés chez les laboratoires qui étudient Nematostella, mais les soins de culture peuvent également être automatisés 19.
  3. Parasites Nematostella Artemia fraîchement écloses nauplii 2 - 4x par semaine. Kystes Hatch Artemia à pleine puissance (36 ppt) ou 1 / 3x ASW à 30 ° C, dans un plat en verre rectangulaire peu profonde 20 ou dansun nombre quelconque de petite échelle, les couvoirs artémias commerciales ou artisanales. Si un incubateur ne sont pas disponibles, les crevettes vont éclore à la température ambiante, mais le faire plus lentement.
    Remarque: Cela exige souvent plus de 24 h pour l'achèvement.
  4. Remplacer l'eau de culture anémone au moins une fois par semaine. Pour une meilleure santé des adultes, bien propre (sans savon) la culture bols une fois par semaine des sécrétions muqueuses accumulées, qui enrobent le bol et peuvent piéger les aliments non consommés et des déchets, et enchevêtrer les animaux.

2. Sélection et Relaxation des animaux nutritionnellement Conditionné

  1. Sélectionnez les polypes de taille appariés d'environ la même longueur (3 - 5 cm, quand naturellement détendu) et placez-les dans un bol séparé de la colonie pendant trois jours avant l'amputation.
    Remarque: Le nombre d'animaux sélectionnés pour la coupe sera déterminée par l'expérience menée, bien sûr, mais en général, nous recommandons au moins cinq animaux par point d'échantillon avec six répétitions. Ainsi,Dans une expérience typique d'un minimum de 30 animaux seraient choisis. En général, il est sage de choisir plus que le nombre minimum (30) depuis les amputations qui sont irrégulières (voir ci-dessous) peuvent ensuite affecter la notation.
  2. Retirer le plat d'animaux sélectionnés de l'incubateur à la lumière ambiante au moins une heure avant l'amputation.
    Remarque: L'exposition à la lumière et les vibrations de la manipulation ambiante entraînera probablement les animaux à se contracter, de sorte qu'ils doivent être adaptés ou "détendue" par incubation sur le banc de laboratoire. Les animaux deviennent réfractaires au toucher et exposition à la lumière et à ce moment peuvent être déplacés par pipetage doux.
  3. Facultatif: Anesthetize les animaux en ajoutant 7,5% MgCl 2 (en 1 / 3x ASW). Ajouter délicatement la solution de MgCl2 dans le bol avec une pipette en plastique mL 5 standard.
    Remarque: Bien que les animaux finiront par devenir accoutumés à la lumière et à la manipulation physique, il peut être avantageux pour anesthésier les animaux à maintenir ou à «fixer» til se détendit état après ils sont devenus 16,21,22 allongé.
  4. Utilisez un large alésage (> 0,5 cm) de pipette en plastique pour transférer (en 1 / 3x ASW) cinq animaux de la piscine à être amputé, dans le fond d'un plat de coupe de verre stérile de 100 mm de diamètre contenant 12 ppt ASW. Placer le plat sur la scène d'un stéréomicroscope avec grossissement variable entre 10 - 40X.
    Remarque: Si les animaux ne sont pas anesthésiés et détendu pour la coupe, ils peuvent encore répondre au toucher et à l'éclairage de stéréoscope et donc peut-être besoin de quelques minutes pour devenir à nouveau détendu.

3. Amputation

  1. L'utilisation d'un scalpel stérile, amputer la physe aboral de chaque polype, dans le but d'obtenir une partie de la physe qui est à peu près aussi longtemps qu'il est large et ne contenant pas de mésentère.
    Remarque: Le site idéal de coupe est juste aboral à la résiliation du mésentère. Au plan de coupe il y a une transition de mésentère propre à l minceines correspondant à chaque insertion mésentérique (voir la figure 1, des flèches). Absence de mésentère est critique , car elle produit des muqueuses qui peuvent faciliter «brancher» le trou 17,30.
    1. Placer la lame de scalpel en contact avec l'animal à l'emplacement désiré de l'amputation. Pour ce faire, soit sans aide (freehand), ou en saisissant doucement le corps de l'animal avec un # 5 forceps (style Dumont ou similaire).
    2. Couper à travers le tissu en tirant parti de la lame incurvée du scalpel dans un mouvement «à bascule» à travers le corps.
      Remarque: Le tissu doit couper proprement que le scalpel est secoué et de libérer la section désirée de physe du donneur. Toutefois, si un petit morceau de tissu relie encore le corps et la physe, le couper avec le scalpel. Ne pas essayer de séparer les morceaux connectés en tirant, car cela pourrait endommager la physe.
  2. Retirez chaque «donneur» polype amputée de l'antenne et le retourner à un sepabol taux étiqueté «amputés» mis en commun; ce jour, le bol et le retourner à la culture de réserve.
    Note: les polypes Amputé vont guérir la plaie aboral dans un jour et peut ensuite être alimenté normalement. Ils régénérer un physa recherche normale dans les deux semaines à quel point le physa peut être amputé de nouveau si on le souhaite.
  3. Rincer le physa excisée qui restent dans le plat de coupe dans 12 ppt ASW, puis transférer chaque physa à un puits stérile séparé dans une plaque de culture cellulaire multi-puits qui a déjà 10 ml de 12 ppt ASW dans chaque puits.
    Remarque: Cet exemple utilise une plaque de six, avec chaque puits détenant 10 ml d'eau de mer et cinq physa excisée. Dans l'eau de mer générale devrait couvrir la physe suffisamment pour éviter l'exposition à l'air due à la circulation dans la manipulation et l'évaporation potentielle. La plaque ou les puits doivent avoir un couvercle.
  4. Répétez les étapes 3.1 à 3.3 pour recueillir au moins 5 physa dans chaque puits réservé pour chaque traitement expérimental.
  5. Incuber la physe à une température qui fournide le meilleur taux de régénération pour les interrogatoires expérimentaux prévus. Placer la plaque contenant le physa dans un incubateur à température régulée, à une température fixe déterminée par le taux de régénération désiré.
    Remarque: Le physa va régénérer les tissus manquants et former un polype complet lorsqu'ils sont incubés à des températures entre 15 et 27 ° C. Le taux de régénération est dépendante de la température à l'exception des deux premières étapes. La journée moyenne pour atteindre l'étape 4 pour toutes les températures est de 7 jours après la coupe et cela coïncide aussi avec la régénération à 21 ° C. A 27 ° C, l'étape 4 est atteinte environ 3 jours plus tôt et à 15 ° C, l'étape 4 est retardé d'environ 3 d par rapport à la régénération à 21 ° C (voir également référence 10).

4. Évaluer la régénération avec le système de stadification Nematostella Régénération (NRSS)

  1. Score du physa en utilisant un microscope stéréo-composé avec magnific variablesation (10 - 80X). Note de la physe Nematostella fraîchement coupée comme au stade 0 et continuer la notation à la même heure chaque amputation de poste de jour (dpa) en utilisant le NRSS 10.
    Remarque: Pour les critères et les détails de mise en scène clés font référence référence 10.
    1. Note physa comme au stade 0 (Open Wound) si un physa fraîchement coupé apparaît comme une masse en forme de coupelle ressemblant à un ballon flasque, avec un site de plaie ouverte est susceptible visible.
      Remarque: Les bords de la plaie peut aussi coller ensemble dès le départ, mais le tissu sera toujours effondré et manquent de rigidité. Les bords de la plaie ouverte peuvent être observés subissant une contraction radiale que la blessure guérit.
    2. Note physa comme au stade 1 (Wound fermé) si la plaie d'amputation apparaît fermé.
      Remarque: l'emplacement de la plaie correspondra au pôle oral avenir. La surface extérieure autour du pôle oral avenir peut commencer à afficher des arcs distincts correspondant aux endodermiques radialement symétrique insertions mésentériques sous-jacentes.
    3. Score phYSA comme au stade 2 (radial arches) si la surface du pôle apparaît gonflé par voie orale, révélant huit arcs relief disposés selon un motif symétrique radialement et séparées par des rainures. Observer les petites bulles hémisphériques au sommet des arcs. Ils seront à peu près aussi haute que large, de passage probable, et initialement composé d'une couche de cellules ectodermiques unique.
      Remarque: Dans certains cas blebs double couche peuvent se stabiliser. Remarque: À ce ou tard met en scène une couche de mucus peut apparaître pour encapsuler le physa (Figure 2) dans une «gaine» membraneuse. Ce matériau d'encapsulation doit être enlevée pour faciliter la notation.
    4. Note physa comme au stade 3 (Tentacle) si les bourgeons des tentacules contenant des couches de tissus endodermiques et ectodermiques sont formés de manière stable à l'extrémité orale d'au moins quelques arcs radiaux.
      Remarque: Les tentacules sont plus longs que larges et sont peu mobiles. Le physa montrera une augmentation, mais l'inflation variable de sorte que rudiment mésentère peut devenir visible étendant à partir de l'insertion mésentérique dans la cavité du corps (cœlentéron).
    5. Note physa comme au stade 4 (mésos linéaires) si le physa contient huit, mésos visibles distincts qui se prolongent dans le cœlentéron d'insertions dans la paroi du corps, avec des longueurs orales-aboral qui sont plus de deux fois leur largeur radiale mesurée à partir de là où ils semblent se connecter au pharynx à son extrémité aboral (de enterostome).
      Remarque: Quatre ou moins mésos ont des bords libres internes "plissés". Le pharynx est visible. Plus de huit tentacules sont visibles, motile et parfois ils se contractent dans le corps.
    6. Note physa comme au stade 5 (prédominance plissés mésos) si la physe a plus de quatre mésos avec plissage, et le plissage est plus complète et sinueuse qu'à l'étape 4. L'animal a une apparence adulte presque «normal», mais il n'y a pas visible cellules gonadiques.

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Representative Results

La progression des événements morphologiques pendant la régénération en physa coupée est représentée sur la figure 1A, qui comprend des vues représentatives de physa à chaque étape NRSS. Le site typique physa de coupe est indiquée sur l'adulte (pointes de flèches). Les photographies de la figure 1A montrent la régénération progressive des structures orales et le corps de physa fraîchement coupée par polype complètement formé. Figure 1B, C montrent l'agencement des cloisons internes, les mésos, à l' étape 4 et l' étape 5, respectivement. Notez que certains mésos à l'étape 4 manquent "plissage", mais pour se qualifier comme une étape 5, la majorité doit avoir développé des plis. Figure 1D montre un physa enveloppé dans une membrane de mucus qui peuvent être enlevés avec une pince (Figure 1E). Bien que généralement pas nocifs pour la régénération (à moins qu'il ne retient indûment l'animal), la membrane peut gêner en marquant le physa et faireing manipulations expérimentales, telles que la microscopie, la fixation de l'échantillon ou la récolte pour l'analyse moléculaire / biochimique. Le mieux est éliminé après l'étape 1, ou plus tard si elle réformes.

La figure 2 montre comment le système de mise en scène peut être utilisé pour marquer les résultats d'une expérience visant à évaluer les effets de l' inhibition de l' autophagie. Physa ont été coupées et traitées avec de la chloroquine à 10, 50 et 100 pm, ou physe étaient non traités (témoins). Chloroquine inhibe les fonctions lysosomales, qui sont nécessaires pour autophagy. Les critères NRSS ont été utilisés pour marquer le physa au cours de la régénération et les résultats ont été tracés à la figure 2E. Photographies de contrôle représentatif (figure 2A) et la chloroquine traitée physa (Figure 2 B - D) ont été faites lorsque les contrôles ont atteint l' étape 5. chloroquine animaux traités n'a pas progressé au - delà de l' étape 4, et ils généralement exposés incomplète mésentère Regeneration (plissage plus manqué), de courte taille de tentacule, et dans certains cas à court la longueur du corps.

Figure 1
Figure 1. Caractéristiques de régénération. (A) Exemples de régénération physa structures orales et le corps mis en scène selon le NRSS. Panneau étiqueté adulte présente des caractéristiques d'un animal adulte avec des tentacules (t) pharynx (ph), mésos (m) et insertions de mésentère (mi). Les flèches blanches montrent région où plissé mésos transition à l'insertion de mésentère, une crête de l'endoderme étendant jusqu'au terminus aboral. Cette région constitue la physe. Les flèches jaunes montrent idéale le site physa bissectrice. Panel 0 montre cinq minutes de physa après bissectrice et Panel 0 'est une vue agrandie d'une partie de ceux physa, avec plaie ouverte au centre, définissant l' étape 0 de laNRSS. Panel 1 montre un physa avec la plaie maintenant fermée, définissant l' étape 1. Panel 2 montre physa avec des arcs radiaux soulevées autour du pôle oral, avec les tissus gonflés ci - dessous, ce qui correspond à l' étape 2 (panneaux 0-2 sont des vues de la fin par voie orale). Panel 3 montre bourgeons tentacule émergents au pôle oral (vers la droite) de la physe allongée et gonfler, maintenant à 3. Remarque éléments de mésentère rudimentaires de scène sont visibles et le pharynx se forme dans la zone sombre à l'extrémité orale. Panel 4 montre l'émergence de véritables tentacules, ainsi que des «blebs» transitoires au niveau du pôle oral, définissant l' étape 4. mésos linéaires sont visibles dans le physa gonflé. La grande masse ronde visible à l'intérieur du polype est d'origine inconnue et sera expulsé par la bouche. Panel 5 montre la régénération presque complète caractérisée par plus de quatre mésos plissés, un pH entièrement forméarynx huit ou plusieurs tentacules, qui le définit comme étape 5. (B, C) vues aboral de physa individuelle illustrent l'agencement biradial et la morphologie des mésos. Dans cette optique, mésos plissés semblent avoir un renflement de milieu tissulaire (flèche verte). A l' étape 4 physa a quatre ou moins mésos plissés, et un physa stade 5 a plus de quatre (C). Mésos avec ou sans plissage sont indiqués par des flèches vertes ou jaunes, respectivement. Arrowhead Noire en (C) pointe vers un mésentère plissé qui a étendu radialement. (D, E) Enlèvement d'une gaine muqueuse de la physe est représenté. Les flèches blanches indiquent une gaine entourant la muqueuse physa (D) qui doit être supprimé comme dans (E) avant de marquer la régénération. Parfois tissu résiduel (flèches jaunes) peut être pris au piège dans la gaine, et cela devrait également être retiré. Asterisk indique pôles orale, où la marqueed. Les barres rouges de taille sont de 0,5 mm dans tous les panneaux sauf A5 (1,0 mm). Les panneaux B et C de cette figure ont été modifiés et réimprimé avec la permission de Référence 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Effets de la chloroquine sur la régénération. Pour démontrer l'application de la NRSS, nous avons testé les effets d'une chloroquine, un inhibiteur de autophagy. Physa ont été amputées et immédiatement placé en 1 / 3x ASW contenant 0,1% de DMSO (témoin) ou chloroquine à 10, 50, 100 uM. Physa ont été marqués à intervalles de 24 heures à l'aide du NRSS. (A) images finaux représentatifs prises de contrôle quand ils ont atteint l' étape 5. - D) images représentatives de physa chloroquine traités qui ont atteint un «plateau régénérative» de l' étape 4. La chloroquine a causé des anomalies similaires dans la régénération à toutes les doses testées. Le problème le plus notable a été le manque de régénération complète des mésos et tentacules. Abnormal morphologie du corps (par exemple, le retard de croissance) a été aussi parfois noté (C). Présence (flèche blanche) et le manque (flèche noire) de plis dans un physa chloroquine traité est montré dans D (tentacules sont partiellement retirées). (E) Les données de mise en scène pour tous physa tracés en fonction du temps (à 23 ° C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Résumé desles principales caractéristiques des stades NRSS. Ce diagramme montre les changements morphologiques clés qui définissent chaque étape du NRSS. Direction des mouvements sont indiqués par des flèches rouges et caractéristiques par des flèches vertes. Stade 0 représente une plaie ouverte juste après la coupe (A), et t). Les bords de la plaie subissent une contraction radiale de fermeture en direction du centre (B). Étape 1 est caractérisée par la fermeture complète de la plaie (C) et l' élévation des arcs entre les arêtes faisant face par voie orale (D); le centre de la surface buccale (pointe de flèche) est enfoncé. Etape 2 a une voûte prononcée de la surface orale (arrowhead, E); l'physa commence à allonger et à devenir étroit (F) avec des bourgeons tentacule et blebs visibles au sommet des arches (pointes de flèches). Etape 3 a des boutons stables tentacule (tête de flèche, G) et le pharynx régénération peut être considérée comme une densité au niveau du pôle oral (masse d' orange, arrowhead en H (I) qui devraient être au moins deux fois plus longtemps qu'ils sont grands à la jonction du pharynx (I '). Quatre ou moins mésos peuvent être plissées à leur bord intérieur - le filament mésentérique (J, J '). Étape 5 est caractérisé par plus de quatre mésos plissé (K), qui peut être mieux évaluée en observant depuis l'extrémité aborale (K '). Re-print avec la permission de Référence 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Utilisation de Nematostella comme un modèle de cicatrisation des plaies et la régénération devient de plus en plus populaires. Par conséquent, il est important d'être en mesure de visualiser les modèles morphologiques d'un protocole particulier avant les analyses cellulaires et moléculaires efficaces peuvent être affectées et comparées. Nematostella ont un haut degré de régénération "flexibilité", être en mesure de réformer presque toute structure manquante amputée en tout lieu, à des étapes post-Planula de la vie. Ainsi, divers chercheurs ont examiné la régénération résultant de l' amputation ou de blesser dans les différentes régions de polypes, à différents âges et tailles 7-18.

Le système de mise en scène décrite ici suit la transformation d'une section morphologiquement uniforme de physa, amputée de la fin aboral d'un adulte, d'un polype juvénile anatomiquement complet ne manque que les tissus reproducteurs (on n'a pas encore déterminé si ces juvéniles régénérés deviennent sexuellement mature). Cette approche examine la régénération d'un simple rudiment de tissu à une complexité presque maximale. Y compris cinq physa comme une taille minimum de groupe est recommandé pour normaliser la variabilité individuelle potentiel et le taux de survie. Bien sûr, ce nombre peut être ajusté en fonction des objectifs expérimentaux particuliers , mais le protocole NRSS permet 2 mL de milieu par physa pour nier un «effet volume» potentiel comme celui qui a été signalé à affecter la régénération dans hydra 23.

D' autres approches pour étudier la régénération Nematostella ont utilisé les adultes sectionnées mi-corps ou à la fin par voie orale, ou de polypes de stade 4-tentacule juvéniles bissectrice mi-corps 7,11-18. Deux études ont examiné la régénération dans physa libérée par la fission naturelle 16,18, et les approches utilisant physa amputés ont récemment émergé avec le NRSS 8,9. Chacune de ces approches variées a ses propres mérites et peut répondre à des questions uniques sur regenerative processus qui se produisent sous différents régimes d'amputation ou de blesser, et chez les animaux âgés différemment. Le protocole NRSS pour physa amputation et la notation, montré dans la présente étude, génère un ensemble relativement uniforme de physa pour l' étude systématique et évite la variation de la taille de la physe, la composition des tissus, et l' évolution ultérieure de la régénération observée avec transversale naturelle fission 18,24. Bien que physa amputation correspond un peu au mode naturel de reproduction asexuée chez Nematostella, les différences moléculaires ont été notées entre la régénération résultant de la fission naturelle et l' amputation à mi-corps ou à la physe 16,18,24. Que physa produit par la méthode d'amputation décrite ici ou naturelle spectacle de fission ces différences reste à déterminer.

Il y a quelques questions qui sont essentielles pour le succès avec l'amputation de l'élevage et des techniques de notation décrites ici. Polypes sélectionnés pour l'amputation should être maintenu à la même température, adapté à la taille de physa, l'histoire nutritionnelle et si l'âge possible (bien que ce dernier n'a pas été systématiquement testés afin de déterminer s'il y a un effet de l'âge sur la variation de la progression de la scène). L'obtention d'une plaie ouverte avec un scalpel stérile forte ayant une lame courbe est importante pour observations morphologiques de la cicatrisation entre Stade 0 et l'étape 1. Lorsque le physa est gonflé et la lame incurvée du scalpel est basculé sur le tissu adulte, il est amputé en un seul mouvement et peut être transféré rapidement au traitement et de plat de coupe. Amputations qui incluent mésentère ou qui sont le résultat d'une vaste manipulation physique doit être jeté.

Pratique mise en scène physa non traitée pour avoir une idée de la variation individuelle dans la population testée. Variation entre physa individu est moins pour les premières étapes. Par exemple, tous les physa sont à l'étape 0 à 0 dpa. De la même manière tous les physa atteindre le stade1 en synchronie à 1 dpa. L'apparition de la phase 2 peut être plus difficile pour l'observateur de discerner parce que «l'inflation» est une condition relative qui est atteint, cependant, par 2 dpa avec peu de variation. L'apparition d'une véritable progression tentacules de marques à la phase 3. Les tentacules de régénération peuvent être obscurcies par l'apparition d'un "cocon" membraneuse qui empêche la visualisation du bourgeon tentacule dessous. Si le revêtement membraneux n'a pas été préalablement retiré, il devrait être fait maintenant. Enlèvement de la membrane d'une amende tipped tweezer va libérer l'physa régénérant. La distinction entre l'étape 4 et 5 est le nombre de mésos plissés. Etape 4 a quatre ou moins mésos plissés, et le stade 5 a cinq à huit mésos plissés. Alors que le plissage peut être observé dans une vue latérale, le nombre exact de mésos plissés est mieux observée avec une vue aboral.

Un défi à l' étude des adultes Nematostella la régénération d'un physa rudiment, et même avec les tissus découpés à partir d'autres sites d'amputation, est la clarté variée des tissus vivants. L'ampoule de la physe est relativement claire chez l'adulte intact, mais il devient assez opaque en raison de la contraction des tissus après l'amputation. Clarté revient progressivement (étape 2) une fois la fermeture de la plaie (étape 1) et l'animal commence à gonfler, mais même alors, la région autour du site de la plaie où les tissus et les structures se régénèrent activement reste quelque peu obscurcies par les tissus denses (en particulier de l'étape 3). Inflation accrue accompagne habituellement l' étape 4 et 5. Fixation suivie d' une clarification optique sera presque certainement résoudre ce qui se passe à la fin par voie orale, mais plus informatif peut être en direct, les journalistes transgéniques spécifiques des tissus qui peuvent être surveillés pour la fluorescence et plus facilement visualisés 15, 25-30.

Un physa amputé ne peut évidemment pas nourrir car il manque des tentacules, de la bouche et mésos (qui abritent les glandes digestives), ainsi requianneau régénération des structures du corps manquantes à accomplir en mobilisant les réserves de nutriments provenant de sources non alimentaires. La physe peut éventuellement y parvenir est de autophagy, dans lequel le cytoplasme, des organelles et d' autres composants cellulaires sont englouties par voie intracellulaire et traitées par un mécanisme dépendant des lysosomes pour produire de l' énergie et des composés pour les processus anaboliques 31-33. Nous avons trouvé que le traitement avec l'inhibiteur physe lysosome, la chloroquine, provoque une régénération anormale du mésentère et les tentacules et la morphologie générale du corps, ce qui indique que autophagy est nécessaire pour la régénération normale des structures orales et du corps. L' autophagie régule les fonctions des cellules souches 34-36, et joue un rôle essentiel dans la régénération à Hydra, planaria et zebrafish 37-41. Une analyse plus poussée est nécessaire pour comprendre comment l' autophagie influence Nematostella régénération aux niveaux cellulaires et moléculaires, mais notre première expérience de passage montre l'utilité de l' aide de la NRSS comme méthode de dépistage rapide pour les petites molécules qui pourraient influer sur la régénération.

Les processus génétiques, moléculaires et cellulaires qui régulent la régénération dans Nematostella ne sont à un stade rudimentaire de compréhension, mais ce modèle émergent pour la régénération a un répertoire de plus en plus d'outils pour l' analyse de l' expression génomique et génétique. Avec son génome annoté, une pléthore de marqueurs génétiques régionaux et de tissus spécifiques et des méthodes robustes pour la transgénèse, la mutagenèse, l' histologie et de microscopie, Nematostella promet de révéler les mécanismes régissant anthozoaire régénération des cnidaires et de découvrir si ses processus de régénération sont similaires ou unique parmi les cnidaires et les métazoaires en général.

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Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par un New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Subvention à GHT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

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References

  1. Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. The Boxwood Press. (1986).
  2. Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. Jean & Herman Verbeek. (1744).
  3. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11, (10), 710-722 (2010).
  4. Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56, (6-8), 411-423 (2012).
  5. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233, (1-2), 53-66 (2013).
  6. Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226, (2), 257-267 (2003).
  7. Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16, (12), 28449-28471 (2015).
  8. Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10, (4), e0124578 (2015).
  9. Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227, (3), 211-220 (2014).
  10. Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242, (11), 1320-1331 (2013).
  11. Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8, (5), 916-923 (2013).
  12. Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2, (2), 217-226 (2013).
  13. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
  14. Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240, (12), 2673-2679 (2011).
  15. Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (1), 104-108 (2010).
  16. Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219, (2), 79-87 (2009).
  17. DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
  18. Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
  19. Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212, (2), 99-103 (2002).
  20. Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83, (3), 33-40 (2016).
  21. Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
  22. Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215, (12), 618-630 (2005).
  23. Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87, (2-3), 191-203 (2007).
  24. Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
  25. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
  26. Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
  27. Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370, (1684), (2015).
  28. Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139, (2), 347-357 (2012).
  29. Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141, (24), 4681-4689 (2014).
  30. DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
  31. Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (8), 461-472 (2015).
  32. Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47, (10), 2065-2088 (2015).
  33. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221, (1), 3-12 (2010).
  34. Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73, (3), 475-496 (2016).
  35. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, (6), 830-849 (2013).
  36. Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70, (1), 89-103 (2013).
  37. Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
  38. Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21, (4), 547-556 (2014).
  39. Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15, (3), 279-292 (2010).
  40. Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
  41. Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14, (2), 116-125 (2008).

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