Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare

Developmental Biology

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Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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Abstract

Cnidari, e in particolare Hydra, sono stati i primi animali indicati per rigenerare le strutture danneggiate o mozzate, e in effetti questi studi probabilmente lanciati indagine biologica moderna attraverso il lavoro di Trembley più di 250 anni fa. Attualmente lo studio della rigenerazione ha visto una rinascita utilizzando entrambi i microrganismi rigenerativi "classici", come l'Hydra, planaria e urodeli, nonché uno spettro ampliamento di specie che misurano la gamma di metazoi, dalle spugne attraverso mammiferi. Oltre al suo interesse intrinseco come fenomeno biologico, la comprensione di come la rigenerazione lavora in una varietà di specie ci illustrerà se i processi rigenerativi condividono caratteristiche e / o specie comuni o meccanismi cellulari e molecolari specifici al contesto. L'anemone di mare starlet, Nematostella vectensis, è un organismo modello emergente per la rigenerazione. Come Hydra, Nematostella è un membro delle antiche phylum, Cnidaria, ma all'interno di tLa classe Anthozoa, un clade sorella al Hydrozoa che è evolutivamente più basale. Così gli aspetti della rigenerazione in Nematostella sarà interessante mettere a confronto con quelli di Hydra e altri cnidari. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per bisect, di osservare e classificare la rigenerazione della fine aboral dell'adulto Nematostella, che si chiama il Physa. Il Physa subisce naturalmente la fissione come mezzo di riproduzione asessuata, e sia la fissione naturali o amputazione manuale del Physa innesca ricrescita e la riforma delle morfologie complesse. Qui abbiamo codificato questi semplici cambiamenti morfologici in un sistema di gestione temporanea Nematostella rigenerazione (il NRSS). Usiamo il NRSS per testare gli effetti di clorochina, un inibitore della funzione lisosomiale che blocca l'autofagia. I risultati mostrano che la rigenerazione delle strutture polipo, in particolare i mesenteri, è anormale quando autofagia è inibita.

Introduction

L'osservazione della rigenerazione in un unico idra è stato l'evento seminale l'avvento della biologia come scienza sperimentale 1,2. Rigenerazione rimane un fenomeno di straordinariamente ampio ricorso al biologo e laico allo stesso modo. Il potenziale di biologi dello sviluppo, medici, scienziati e ingegneri biomedici tessuti per comprendere e superare i limiti di rigenerazione umana rende biologia rigenerazione più di intrinsecamente interessante.

Ora, con l'uso di tecnologie emergenti come il sequenziamento del genoma e il guadagno e la perdita di strumenti di funzione, il campo è pronta a prendere in giro i meccanismi rigenerativi a parte e in ultima analisi, per capire come le varie specie in grado di rigenerare, mentre altri non possono. Il grado di comunanza di risposte molecolari, cellulari e morfologiche rimane da chiarire, ma finora sembra che le risposte di base tra gli animali che possono rigenerare è più simile di quanto sarebbe stato Imagined solo un decennio fa 3.

Cnidari in particolare, sono facile a rigenerare quasi tutte le loro parti del corpo in mezzo a un ampio spettro di diversità morfologica. Dal solitari polipo acqua dolce, Hydra insieme con i minuscoli polipi marini che costruiscono enormi coralli, alle complesse sifonofore coloniale, come il portoghese Man-O-Guerra, la rigenerazione è spesso una modalità di riproduzione, in aggiunta a un meccanismo di la riparazione o la riforma parti del corpo danneggiate o perse derivanti da un infortunio e predazione. Se le diverse specie di Cnidaria utilizzano meccanismi simili o differenti per la rigenerazione è una domanda interessante fondamentalmente 4-6.

Noi e altri abbiamo sviluppato il antozoo, Nematostella vectensis come modello per la rigenerazione 7-17. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema di stadiazione per descrivere la rigenerazione di un intero corpo da un pezzo morfologicamente uniforme di tessuto tagliato in due dai Aboral fine del polipo 10. Mentre polipi Nematostella possono rigenerare quando attraversata a qualsiasi livello, abbiamo scelto di tagliare adulti in posizione aboral nella regione più morfologicamente semplice, il Physa, in parte perché questo è vicino al piano normale della naturale fissione asessuata 18, ed anche perché permessi osservazione e analisi molecolari di come un intero corpo viene ricomposto dai componenti morfologiche semplici.

Il Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) fornisce una relativamente semplice serie di parametri morfologici che potrebbero essere utilizzati per segnare il progresso di qualsiasi aspetto della rigenerazione da un Physa amputata, in condizioni di coltura normali o sperimentalmente perturbato situazioni come trattamenti di piccole molecole, manipolazione genetica o alterazione ambientale. Come anticipato, il NRSS sta diventando adottato da impalcatura morfologica su cui è possibile fare riferimento gli eventi cellulari e molecolari della rigenerazione10.

Infine il nostro metodo di taglio produce un Gaping fori diversi ordini di grandezza superiore alla puntura fenomenale utilizzato in uno studio recente 17, ma entrambe le ferite guariscono in circa 6 ore. Documentare le fasi visivamente arrestando e distinti di chiusura della ferita dovrebbe suggerire approcci sperimentali per spiegare l'apparente indipendenza della dimensione di una ferita e il tempo necessario per chiuderla. Così, una più profonda comprensione visiva del processo di amputazione aboral, fornita da questo protocollo, sarà di aiuto ulteriori indagini in questo sistema di rigenerazione del modello e ampliare l'applicazione di questo sistema di stadiazione utilizzando Nematostella vectensis.

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Protocol

1. preparare gli animali per la temperatura, la nutrizione e la luce / buio ciclo

  1. Ottenere Nematostella vectensis adulti da uno dei numerosi laboratori Nematostella in tutto il mondo, o un fornitore senza scopo di lucro (Tabella 1)
  2. Mantenere Nematostella a temperatura costante (tipicamente tra 18 e 21 ° C) al buio, in "1 / 3x" artificiale del mare (ASW) ad una salinità di 12 parti per mille (ppt). Mantenere le culture in semplici soda-calce piatti di coltura in vetro, in genere da 250 ml o da 1,5 L di capacità 11.
    Nota: Queste semplici condizioni di coltura sono comunemente utilizzati tra i laboratori che studiano Nematostella, ma la cura della cultura possono anche essere automatizzati 19.
  3. Alimentare Nematostella Artemia appena schiusi naupli 2 - 4 volte a settimana. Hatch Artemia cisti a piena forza (36 ppt) o 1 / 3x ASW a 30 ° C, in un poco profondo piatto di vetro rettangolare 20 o inqualsiasi di un certo numero di piccola scala, gli incubatoi di salamoia gamberetti commerciale o fatti in casa. Se un incubatore non è disponibile, il gambero si schiudono a temperatura ambiente, ma lo fanno più lentamente.
    Nota: Questo richiede spesso più di 24 ore per il completamento.
  4. Sostituire l'acqua cultura anemone, almeno una volta alla settimana. Per una migliore salute degli adulti, pulire accuratamente (senza sapone) la cultura bocce una volta alla settimana di secrezioni mucose accumulati, che rivestire la ciotola e possono intrappolare resti di cibo e rifiuti, e impigliare gli animali.

2. Selezione e rilassamento degli animali Nutrizionalmente condizionata

  1. Selezionare i polipi di dimensioni corrispondenza di circa la stessa lunghezza (3 - 5 cm, quando naturalmente rilassato) e metterli in una ciotola separata dalla colonia per tre giorni prima di amputazione.
    Nota: Il numero di animali selezionati per il taglio sarà determinata dall'esperimento condotto, naturalmente, ma in generale si consiglia almeno cinque animali per punto di campionamento con sei repliche. Così,in un tipico esperimento un minimo di 30 animali sarebbe preselezionato. In generale, è consigliabile selezionare più di un numero minimo (30) dal amputazioni che sono irregolari (vedi sotto) in seguito possono influenzare punteggio.
  2. Rimuovere il piatto di animali selezionati dal termostato in luce ambiente almeno un'ora prima amputazione.
    Nota: L'esposizione alla luce artificiale e vibrazioni di movimentazione probabilmente causerà gli animali a contrarsi, così hanno bisogno di essere adattati o "rilassato" di incubazione sul banco di laboratorio. Animali diventeranno refrattari al tatto e l'esposizione alla luce e, a quel punto può essere spostato delicatamente pipettando.
  3. Opzionale: Anestetizzare gli animali con l'aggiunta di 7,5% MgCl 2 (in 1 / 3x ASW). Delicatamente aggiungere la soluzione MgCl 2 alla ciotola con uno standard di plastica 5 ml pipetta.
    Nota: Anche se gli animali finirà per diventare abituati alla luce e alla manipolazione fisica, può essere vantaggioso per anestetizzare gli animali per mantenere o "fissare" tsi rilassò stato dopo la loro entrata 16,21,22 allungata.
  4. Utilizzare un ampio foro (> 0.5 cm) pipetta di plastica per il trasferimento (in 1 / 3x ASW) cinque animali dalla piscina essere amputata, sul fondo di un piatto sterile taglio del vetro del diametro di 100 mm contenente 12 ppt ASW. Porre la capsula sul palcoscenico di uno stereomicroscopio con ingrandimento variabile tra i 10 - 40X.
    Nota: Se gli animali non sono stati anestetizzati e rilassato per il taglio, essi possono ancora rispondere al tatto e l'illuminazione stereoscopio, e quindi potrebbe essere necessario qualche minuto per diventare di nuovo rilassato.

3. Amputazione

  1. Usando un bisturi sterile, amputazione l'Physa aboral da ciascun polipo, con l'obiettivo di ottenere una sezione del Physa che è circa fintanto che è ampia e non contenente mesentere.
    Nota: Il sito taglio ideale è solo aboral alla cessazione del mesentere. Al piano di taglio c'è una transizione da mesentere propria sottile lines corrispondente ad ogni inserzione mesenterial (vedere Figura 1, frecce). L'assenza di mesentere è fondamentale perché produce muco che possono facilitare 'collegare' il buco 17,30.
    1. Posizionare il bisturi in contatto con l'animale al sito desiderato di amputazione. Fate questo sia autonomamente (a mano libera), oppure afferrando delicatamente il corpo dell'animale con un # 5 pinze (stile Dumont o simili).
    2. Tagliare il tessuto sfruttando la lama curva del bisturi in un movimento 'dondolo' in tutto il corpo.
      Nota: Il tessuto deve recidere pulito come il bisturi viene scosso e liberare la sezione desiderata Physa dal donatore. Tuttavia, se un piccolo pezzo di tessuto collega ancora il corpo e la Physa, tagliare con il bisturi. Non tentare di separare i pezzi collegati tirando, in quanto ciò potrebbe danneggiare il Physa.
  2. Rimuovere ogni 'donatore' polipo amputato dal piatto e restituirlo ad un sepaciotola tasso etichettato 'amputati messe in comune; data la ciotola e restituirlo al magazzino della cultura.
    Nota: polipi amputate guarirà la ferita aboral entro un giorno e quindi può essere alimentato normalmente. Saranno rigenerare un normale Physa cercando entro due settimane a questo punto il Physa può essere amputata di nuovo se lo si desidera.
  3. Risciacquare il Physa asportato che rimangono nel piatto di taglio 12 ppt ASW, quindi trasferire ciascuna Physa ad un pozzo sterile separata in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo che ha già 10 mL di 12 ppt ASW in ciascun pozzetto.
    Nota: Questo esempio utilizza una piastra ben sei, con ogni ben di detenzione di 10 ml di acqua di mare e cinque Physa asportato. In acqua marina generale dovrebbe coprire il Physa in misura sufficiente a evitare l'esposizione all'aria a causa di movimenti durante la movimentazione e il potenziale di evaporazione. La piastra o pozzetti devono avere un coperchio.
  4. Ripetere i passaggi 3,1-3,3 per raccogliere almeno 5 Physa in ogni pozzetto riservato per ogni trattamento sperimentale.
  5. Incubare la Physa ad una temperatura che si provide il miglior tasso di rigenerazione per gli interrogatori sperimentali previste. Posizionare la piastra contenente la Physa in un incubatore temperatura regolata, ad una temperatura fissa determinata dal tasso desiderato di rigenerazione.
    Nota: Il Physa sarà rigenerare i tessuti mancanti e formare un polipo pieno quando incubate a temperature comprese tra 15 e 27 ° C. Il tasso di rigenerazione dipende dalla temperatura eccezione per le prime due fasi. Il giorno medio per raggiungere la fase 4 per tutte le temperature è 7 d dopo il taglio e questo coincide anche con rigenerazione a 21 ° C. A 27 ° C, la fase 4 è raggiunto circa 3 giorni prima e a 15 ° C, la fase 4 è in ritardo di circa 3 d rispetto alla rigenerazione a 21 ° C (vedi anche Riferimento 10).

4. Valutare rigenerazione con la Staging System Nematostella Regeneration (NRSS)

  1. Punteggio ottenuto il Physa utilizzando un microscopio stereo composto con magnifica variabilezione (10 - 80X). Punteggio ottenuto il Physa Nematostella appena tagliata come Stadio 0 e continuare segnando allo stesso tempo ogni amputazione dopo giorno (dpa) utilizzando il NRSS 10.
    Nota: Per i criteri di stadiazione chiave e informazioni si riferiscono riferimento 10.
    1. Punteggio Physa come Stadio 0 (ferita aperta) se un Physa appena tagliata appare come una massa a forma di tazza- simile ad un palloncino flaccida, con un sito ferita aperta è probabile visibile.
      Nota: I bordi della ferita potrebbe anche stare insieme fin dall'inizio, ma il tessuto sarà ancora crollato e la mancanza di rigidità. I bordi della ferita aperta possono essere osservati in fase di contrazione radiale come la ferita guarisce.
    2. Punteggio Physa come fase 1 (Wound chiuso) se la ferita amputazione appare chiusa.
      Nota: posizione della ferita sarà conforme a futuro polo orale. La superficie esterna intorno al futuro polo orale può iniziare a visualizzare archi distinti corrispondenti ai sottostanti radialmente simmetrica endodermico inserimenti mesenterial.
    3. punteggio physa come Fase 2 (radiali Archi) se la superficie del polo orale appare gonfiato, rivelando otto archi sollevate disposti in uno schema radialmente simmetrica e separate da scanalature. Osservare piccoli, blebs emisferiche all'apice delle arcate. Saranno circa alto come ampia, probabilmente transitoria, e inizialmente composta da un singolo strato di cellule ectodermica.
      Nota: In alcuni casi, vesciche a doppio strato possono stabilizzarsi. Nota: A questo o poi mette in scena uno strato mucoso può apparire per incapsulare il Physa (figura 2) in una 'guaina' membranosa. Questo materiale inglobante dovrebbe essere rimosso per facilitare competenza.
    4. Punteggio Physa come Fase 3 (Tentacle) se le gemme dei tentacoli contenenti endodermico e ectodermiche strati di tessuto sono stabilmente formate alla fine orale di almeno alcuni archi radiali.
      Nota: I tentacoli sono più lunghi che larghi e sono minimamente mobili. Il Physa manifestano una maggiore, ma l'inflazione variabile in modo che rudimenti mesentere può diventare visbile estende dall'inserzione mesenterial nella cavità del corpo (coelenteron).
    5. Punteggio Physa come Fase 4 (Mesenteri lineari) se il Physa contiene otto distinti, mesenteri visibili che si estendono nel coelenteron dal inserimenti nella parete del corpo, con lunghezze orali-aboral che sono più di due volte la loro larghezza radiale misurata dal punto in cui compaiono per la connessione alla faringe alla sua estremità aboral (enterostome).
      Nota: quattro o meno mesenteri hanno "pieghe" bordi liberi interni. La faringe è visibile. Più di otto tentacoli sono visibili, mobili e talvolta si contraggono nel corpo.
    6. Punteggio Physa come Fase 5 (prevalentemente Pieghe Mesenteri) se il Physa ha più di quattro mesenteri con pieghe, e la pieghettatura è più piena e sinuosa che in fase 4. L'animale ha un quasi "normale" aspetto adulto, ma non ci sono visibili cellule gonadica.

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Representative Results

La progressione degli eventi morfologici durante la rigenerazione in Physa tagliata è mostrato in figura 1A, che include viste rappresentativi di Physa in ciascuna fase NRSS. Il sito tipico Physa taglio è indicato l'adulto (punte di freccia). Le fotografie di Figura 1A mostrano progressiva rigenerazione delle strutture orali e corpo da Physa appena tagliata attraverso polipo completamente formato. Figura 1B, C mostrano la disposizione dei setti interni, le mesenteri, in fase 4 e fase 5, rispettivamente. Si noti che alcuni mesenteri a Fase 4 mancheranno "plissettatura", ma per qualificarsi come uno Stage 5 la maggioranza deve aver sviluppato pieghe. Figura 1D mostra una Physa avvolti da una membrana mucosa che può essere rimosso con una pinza (Figura 1E). Anche se di solito non è nocivo per la rigenerazione (a meno che non intrappola irragionevolmente l'animale), la membrana può impedire segnando il Physa e fareing manipolazioni sperimentali, come la microscopia, la fissazione del campione o la raccolta per l'analisi molecolare / biochimica. Questo è meglio rimosso dopo la fase 1, o in seguito, se lo riforme.

La figura 2 mostra come il sistema di stadiazione può essere utilizzato per segnare i risultati di un esperimento per valutare gli effetti di inibizione autofagia. Physa sono stati tagliati e trattati con clorochina a 10, 50 e 100 pM, o Physa erano non trattati (controlli). La clorochina inibisce le funzioni lisosomiali, che sono necessarie per l'autofagia. I criteri NRSS stati usati per segnare il Physa nel corso della rigenerazione e risultati sono stati riportati nella Figura 2E. Fotografie di controllo rappresentativi (Figura 2A) e clorochina trattati Physa (Figura 2 B - D) sono state fatte quando i controlli raggiunto la fase 5. Chloroquine animali trattati non progredire oltre la fase 4, e che in genere esposti incomplete rigenerazione mesenteryzione (pieghettatura più mancava), dimensioni tentacolo breve, e in alcuni casi breve lunghezza del corpo.

Figura 1
Figura 1. Caratteristiche di rigenerazione. (A) Esempi di Physa rigenerare strutture orali e corpo in scena secondo il NRSS. Pannello etichettato adulto mostra caratteristiche di un animale maturo con tentacoli (t) faringe (ph), mesenteri (m) e inserimenti mesentere (mi). frecce bianche indicano regione in cui pieghe di mesenteri transizione verso l'inserimento mesentere, una cresta di endoderma si estende fino al capolinea aboral. Questa regione costituisce il Physa. Le frecce gialle indicano sito ideale Physa bisezione. Pannello 0 mostra cinque minuti dopo Physa di bisezione, e Panel 0 'è una vista ingrandita di un uno di quelli Physa, con ferita aperta al centro, la definizione di fase 0 delNRSS. Pannello 1 mostra una Physa con la ferita ormai chiuso, che definisce Fase 1. Pannello 2 spettacoli Physa con sollevate archi radiali attorno al polo orale, con i tessuti gonfiati sotto, corrispondente alla fase 2 (pannelli 0-2 sono viste alla fine orale). Pannello 3 mostra gemme tentacolo emergenti al polo orale (verso destra) del Physa allungata e gonfiare, ora in fase 3. Nota elementi rudimentali mesentere sono visibili e la faringe si sta formando nella zona scura alla fine orale. Pannello 4 mostra la nascita di veri e propri tentacoli, così come 'blebs' transitori al polo orale, che definiscono Fase 4. mesenteri lineari sono visibili nella Physa gonfiato. La grande massa rotonda visibile all'interno del polipo è di origine ignota e verrà espulso attraverso la bocca. Pannello 5 mostra la rigenerazione quasi completa caratterizzata da più di quattro mesenteri a pieghe, un ph completamente formatoarynx e otto o più tentacoli, che la definisce come Fase 5. (B, C) viste aboral di Physa individuale illustrano la disposizione biradial e la morfologia di mesenteri. In questa prospettiva, mesenteri pieghe sembrano avere un rigonfiamento del tessuto a metà strada (punta di freccia verde). Una Fase 4 Physa ha quattro o meno mesenteri a pieghe, e un Physa fase 5 ha più di quattro (C). Mesenteri con o senza plissettatura sono indicati da frecce verdi o giallo, rispettivamente. Arrowhead nero in (C) indica un mesentere pieghe che ha esteso radialmente. (D, E) Rimozione di una guaina mucoso dal Physa è raffigurato. Le frecce bianche indicano una guaina mucosa che circonda l'Physa (D) che deve essere rimosso come in (E) prima di segnare rigenerazione. A volte tessuto residuo (frecce gialle) può essere intrappolato all'interno della guaina, e anche questo deve essere rimosso. L'asterisco indica pali orali, dove Marked. Dimensioni barre rosse sono 0,5 mm in tutti i pannelli eccetto A5 (1,0 mm). Pannelli B e C di questa figura sono stati modificati e ristampato con il permesso di riferimento 10. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Effetti della clorochina sulla rigenerazione. Per dimostrare un'applicazione del NRSS, abbiamo testato gli effetti di una clorochina, un inibitore di autofagia. Physa stati amputata e immediatamente posto in 1 / 3x ASW contenente 0,1% DMSO (controllo) o clorochina a 10, 50, 100 pM. Physa sono stati segnati a 24 h intervalli utilizzando il NRSS. (A) le immagini endpoint rappresentative tratte di controlli quando hanno raggiunto la fase 5. - D) Immagini rappresentative della Physa clorochina-trattati che hanno raggiunto un "plateau rigenerativa" di fase 4. La clorochina causato difetti simili a rigenerazione a tutti i dosaggi testati. Il problema più importante è stata la mancanza di una piena rigenerazione di mesenteri e tentacoli. La morfologia del corpo anomalo (ad esempio, arresto della crescita) è stato anche occasionalmente rilevato (C). Presenza (freccia bianca) e la mancanza (freccia nera) di pieghe in un Physa clorochina trattato è mostrato in D (tentacoli sono parzialmente ritirate). (E) I dati di sosta per tutti Physa riportati in funzione del tempo (a 23 ° C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Sintesicaratteristiche fondamentali degli stadi NRSS. Questo diagramma mostra i principali cambiamenti morfologici che definiscono ogni fase del NRSS. Direzione dei movimenti sono indicati da frecce rosse e le caratteristiche di punte di freccia verde. Fase 0 raffigura ferita aperta solo dopo il taglio (A), e T). I bordi della ferita subiscono chiusura radiale contrazione verso il centro (B). Fase 1 è caratterizzato da chiusura completa della ferita (C) ed elevazione degli archi tra creste orali rivolti (D); il centro della superficie orale (freccia) è premuto. Fase 2 ha un inarcamento pronunciata della superficie orale (punta di freccia, E); il Physa inizia ad allungarsi e diventare stretta (F) con i germogli tentacolo e vesciche visibili al vertice degli archi (frecce). Fase 3 ha gemme stabili tentacolo (punta di freccia, G) e la faringe rigenerazione può essere visto come una densità al polo orale (massa arancio, punta di freccia in H (I) che dovrebbero essere almeno il doppio del tempo in quanto sono alti allo svincolo di faringe (I '). Quattro o meno mesenteri possono essere pieghe al loro bordo interno - il filamento mesenterial (J, J '). Fase 5 è caratterizzato da più di quattro mesenteri pieghettato (K), che possono essere meglio valutati osservando dall'estremità aboral (K '). Re-stampa con il permesso di riferimento 10. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'utilizzo di Nematostella come modello di guarigione delle ferite e la rigenerazione sta diventando sempre più popolare. Pertanto, è importante essere in grado di visualizzare i modelli morfologici di un particolare protocollo prima analisi cellulari e molecolari efficaci possono essere assegnati e confrontati. Nematostella hanno un alto grado di rigenerazione "flessibilità", potendo riformare quasi ogni struttura mancante amputati in qualsiasi luogo, nelle fasi post-planula di vita. Così, diversi ricercatori hanno esaminato la rigenerazione derivanti da amputazione o ferire in diverse regioni di polipi, a diverse età e dimensioni 7-18.

Il sistema di stadiazione descritto qui segue la trasformazione di una sezione morfologicamente uniforme Physa, amputato dalla fine aboral di un adulto, a un polipo giovanile anatomicamente completa manca solo tessuto riproduttivo (non abbiamo ancora deciso quando questi giovani rigenerati diventano sessualmente mtura). Questo approccio esamina la rigenerazione da un semplice rudimento di tessuto ad uno dei vicini massima complessità. Di cui cinque Physa come si raccomanda una dimensione minima di gruppo per normalizzare per il potenziale variabilità individuale e sopravvivenza. Naturalmente, questo numero può essere regolato per adattarsi gli obiettivi sperimentali particolari ma il protocollo NRSS permette 2 ml di terreno per Physa per negare un potenziale 'effetto volume' come quello che è stato segnalato per influenzare la rigenerazione in Hydra 23.

Altri approcci per studiare la rigenerazione Nematostella hanno usato adulti bisecato a metà del corpo o alla fine per via orale, o giovanile polipi fase 4 tentacoli diviso in due metà del corpo 7,11-18. Due studi hanno esaminato la rigenerazione in Physa liberata da fissione naturale 16,18, e approcci utilizzando Physa amputata sono recentemente emerse con la NRSS 8,9. Ognuno di questi approcci variegati ha i suoi meriti e possono rivolgere domande uniche di regenerative processi che si verificano in diversi regimi di amputazione o ferire, e tra gli animali in modo diverso età. Il protocollo NRSS per Physa amputazione e di punteggio, indicato nel presente studio, genera un insieme relativamente uniforme di Physa per studio sistematico ed evita variazione nelle dimensioni Physa, composizione del tessuto, e la successiva progressione della rigenerazione osservato con la fissione trasversale naturale 18,24. Anche se Physa amputazione corrisponde un po 'al modo naturale di riproduzione asessuata in Nematostella, le differenze molecolari sono state notate tra rigenerazione derivante dalla fissione naturale e amputazione a metà del corpo o al Physa 16,18,24. Sia Physa prodotti con il metodo di amputazione descritto qui o fissione spettacolo naturale tali differenze ancora da determinare.

Ci sono alcuni problemi che sono cruciali per il successo con l'amputazione di allevamento, e le tecniche di scoring qui descritte. I polipi selezionati per l'amputazione should essere mantenuta alla stessa temperatura, abbinato per dimensioni Physa, storia nutrizionale e, se possibile, l'età (anche se quest'ultimo non è stato testato sistematicamente per determinare se vi è un età effetto sulla variazione di progressione fase). Ottenere una ferita aperta con un bisturi sterile tagliente avente una lama ricurva è importante per le osservazioni morfologiche di guarigione delle ferite tra la fase 0 e Fase 1. Quando il Physa è gonfiato e la lama ricurva del bisturi è scosso il tessuto adulto, si è amputato in un unico movimento e possono essere rapidamente trasferiti al trattamento e dal taglio piatto. Amputazioni che includono mesentere o che sono il risultato di un'ampia manipolazione fisica deve essere eliminata.

La pratica messa in scena Physa non trattata per ottenere un senso della variazione individuale nella popolazione in fase di test. Variazione tra Physa individuo è almeno per le prime fasi. Ad esempio, tutti Physa sono in fase 0 a 0 dpa. Allo stesso modo tutti Physa raggiungere Fase1 in sincronia a 1 dpa. L'aspetto della Fase 2 può essere più difficile per l'osservatore discernere perché 'inflazione' è una condizione relativa che si ottiene, tuttavia, da 2 dpa con piccole variazioni. La comparsa di vera progressione marchi tentacoli per stage 3. I tentacoli di rigenerazione possono essere oscurati dalla comparsa di un "bozzolo" membranosa che impedisce la visualizzazione del bocciolo tentacolo sotto. Se il rivestimento membranoso non è stato precedentemente rimosso, dovrebbe essere fatto ora. La rimozione della membrana con multa pinzetta a punta libererà il Physa rigenerante. La distinzione tra la fase 4 e 5 è il numero di mesenteri pieghettate. Fase 4 ha quattro o meno mesenteri a pieghe, e la fase 5 ha cinque a otto mesenteri pieghe. Mentre pieghettatura può essere osservato in una vista laterale, il numero esatto di mesenteri pieghettato è meglio osservato con una vista aboral.

Una sfida a studiare la rigenerazione Nematostella adulto da un PHYsa rudimentale, e anzi con tessuti tagliati da altri siti amputazione, è variata chiarezza dei tessuti viventi. Il bulbo della Physa è relativamente chiara nell'adulto integro, ma diventa piuttosto opaca a causa della contrazione dei tessuti dopo l'amputazione. Chiarezza ritorna gradualmente (fase 2) una volta che si chiude ferita (fase 1) e l'animale inizia a gonfiare, ma anche allora la regione intorno al sito della ferita, dove i tessuti e le strutture sono attivamente rigenerando rimane un po 'oscurate da tessuti densi (soprattutto stadio 3). L'aumento dell'inflazione di solito accompagna la fase 4 e 5. Fissazione seguito da chiarificazione ottica quasi certamente risolvere ciò che sta accadendo alla fine orale, ma più informativo può essere in tensione, i giornalisti transgenici tessuto-specifici che possono essere monitorati per la fluorescenza e più facili da visualizzare 15, 25-30.

Un Physa amputata, ovviamente, non può alimentare dal momento che manca tentacoli, bocca e mesenteri (che ospitano ghiandole digestive), quindi requila rigenerazione anello di strutture del corpo mancanti per essere realizzato attraverso la mobilitazione di riserve di sostanze nutritive da fonti non alimentari. Il Physa potenzialmente in grado di raggiungere questo obiettivo è da autofagia, in cui citoplasma, organelli e altri componenti cellulari sono inghiottiti nelle cellule ed elaborati da un meccanismo di lisosoma-dipendente per la produzione di energia e di composti per i processi anabolici 31-33. Troviamo che il trattamento con l'inibitore Physa lisosomi, clorochina, provoca la rigenerazione anomala di mesenteri e tentacoli, e la morfologia generale del corpo, che indica che l'autofagia è necessaria per la normale rigenerazione delle strutture orali e per il corpo. L'autofagia regola staminali funzioni cellulari 34-36, e svolge un ruolo essenziale nella rigenerazione a Hydra, planaria, e zebrafish 37-41. Ulteriori analisi è necessaria per capire come autofagia influenza rigenerazione Nematostella a livello cellulare e molecolare, ma il nostro primo esperimento passaggio dimostra l'utilità di utilizzare il NRSS come metodo di screening rapido per le piccole molecole che potrebbero influenzare la rigenerazione.

I processi genetici, molecolari e cellulari che regolano la rigenerazione in Nematostella sono solo in una fase rudimentale di comprensione, ma questo modello emergente per la rigenerazione ha un repertorio sempre crescente di strumenti per l'analisi di espressione genomica e genetica. Con il suo genoma Annotated, una pletora di marcatori genetici regionali e tessuto specifico e metodi robusti per transgenesi, mutagenesi, istologia e microscopia, Nematostella promette di rivelare i meccanismi che regolano antozoo rigenerazione cnidarian e scoprire se i suoi processi rigenerativi sono simili o unico fra cnidari e metazoi in generale.

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Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da una Stem Cell Science di New York (NYSTEM C028107) Concessione di GHT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

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References

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