Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone

Developmental Biology

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Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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Abstract

Die Nesseltiere und insbesondere Hydra, waren die ersten Tiere gezeigt beschädigt oder durchtrennt Strukturen zu regenerieren, und zwar solche Studien wohl moderne biologische Untersuchung durch die Arbeit von Trembley vor mehr als 250 Jahren. Sowohl mit "klassischen" regenerative Organismen, wie die Hydra, planaria und Urodelen sowie eine Verbreiterung Artenspektrum die den Bereich von Metazoen aus Schwämmen durch Säugetiere Derzeit Studium der Regeneration hat ein Wiederaufleben gesehen. Neben dem Eigeninteresse als ein biologisches Phänomen, das Verständnis, wie die Regeneration in einer Vielzahl von Arten Werke werden uns darüber informieren, ob regenerative Prozesse teilen gemeinsame Merkmale und / oder Arten oder kontextspezifischen zellulären und molekularen Mechanismen. Das Starlet Seeanemone, Nematostella vectensis, ist ein aufstrebender Modellorganismus für die Regeneration. Wie Hydra ist Nematostella ein Mitglied der alten Stamm, Nesseltiere, aber innerhalb von ter Klasse anthozoa, eine Schwester Clade zum hydrozoa, die evolutionär basaleren ist. So Aspekte der Regeneration in Nematostella wird interessant sein , mit denen der Hydra und anderen Nesseltieren zu vergleichen und gegenüberzustellen . In diesem Artikel stellen wir eine Methode zu halbieren, zu beobachten und die Regeneration des aboral Ende des Nematostella Erwachsenen zu klassifizieren, die die Physa genannt wird. Die Physa erfährt natürlich Spaltung als Mittel zur ungeschlechtlichen Fortpflanzung, und entweder natürliche Spaltung oder manuelle Amputation des Physa löst erneute Wachstum und Rückbildung von komplexen Morphologien. Hier haben wir diese einfachen morphologischen Veränderungen in einem Nematostella Regeneration Staging - System (die NRSS) kodifiziert. Wir verwenden die NRSS die Wirkung von Chloroquin zu testen, einen Inhibitor der lysosomalen Funktion blockiert Autophagie. Die Ergebnisse zeigen, dass die Regeneration von Polyp Strukturen, insbesondere der Mesenterien, abnormal ist, wenn autophagy gehemmt wird.

Introduction

Die Beobachtung der Regeneration in einem einzigen hydra war das wegweisendes Ereignis in dem Aufkommen der Biologie als experimentelle Wissenschaft 1,2. Regeneration bleibt ein Phänomen der außerordentlich breiten Appell an Biologe und Laien gleichermaßen. Das Potenzial für die Entwicklungsbiologen, Kliniker, biomedizinische Wissenschaftler und Gewebe - Ingenieure zu verstehen und die Grenzen für die menschliche Regeneration überwinden macht mehr Regenerationsbiologie als eigen interessant.

Jetzt, mit dem Einsatz neuer Technologien wie der Genomsequenzierung und Gewinn und Verlust der Funktion Tools, wird das Feld balanciert auseinander regenerative Mechanismen zu necken und um schließlich zu verstehen, wie verschiedene Arten regenerieren kann, während andere nicht können. Der Grad der Gemeinsamkeit in der molekularen, zellulären und morphologischen Reaktionen ist noch nicht geklärt werden, aber bisher scheint es, dass die grundlegenden Reaktionen bei den Tieren, die mehr ähnlich regenerieren kann, ist als gewesen imagi hättened nur vor einem Jahrzehnt 3.

Die Nesseltiere sind vor allem leicht auf fast alle ihre Körperteile unter einem breiten Spektrum von morphologischen Vielfalt zu regenerieren. Aus dem einsamen Süßwasserpolypen, Hydra zusammen mit den winzigen Meeres Polypen, die immense Korallenriffe, auf die komplexen Kolonial Siphonophoren, wie der portugiesischen Man-O-War bauen, Regeneration ist oft eine Art der Fortpflanzung, zusätzlich zu einem Mechanismus für Reparatur oder beschädigte oder verlorene Körperteile Reformierung von Verletzungen und predation führt. Ob die verschiedenen Arten von Cnidaria verwenden ähnliche oder andere Mechanismen für die Regeneration ist eine grundsätzlich interessante Frage 4-6.

Wir und andere haben die anthozoan entwickelt, vectensis Nematostella als Modell für die Regeneration 17.07. Wir entwickelten kürzlich ein Staging-System zur Beschreibung Regeneration eines gesamten Körpers von einem morphologisch einheitlichen Stück Gewebe aus dem Abora halbiertenl Ende der Polyp 10. Während Nematostella Polypen regenerieren kann , wenn auf jeder Ebene halbierten, haben wir uns für Erwachsene in einer aboral Position in der die meisten morphologisch einfachen Region, die Physa, teilweise zu schneiden , da dies zu der normalen Ebene der natürlichen asexuelle Spaltung 18 in der Nähe ist, und weil es auch erlaubt die Beobachtung und molekulare Analysen, wie ein ganzer Körper von den einfachsten morphologischen Komponenten wieder zusammengebaut.

Die Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) bietet eine relativ einfache Reihe von morphologischen Benchmarks , die verwendet werden könnten , um den Fortschritt von jedem Aspekt der Regeneration von einem amputierten Physa unter normalen Kulturbedingungen zu punkten oder gestört experimentell Situationen wie kleine Molekül - Behandlungen, genetische Manipulation oder Umwelt Veränderung. Wie erwartet, wird immer die NRSS als morphologische Gerüst angenommen, auf dem die zellulären und molekularen Vorgänge der Regeneration verwiesen werden kann10.

Endlich ist unser Verfahren des Schneidens erzeugt ein klaffendes Loch mehrere Größenordnungen größer ist als die Einstichstift Punkt in einer aktuellen Studie verwendeten 17, doch sind beide Wunden heilen in etwa 6 Stunden. Dokumentieren der visuell Arretieren und verschiedene Phasen des Wundverschlusses sollten experimentelle Ansätze schlagen die scheinbare Unabhängigkeit der Größe einer Wunde und der Zeit, um es zu schließen nimmt zu erklären. So kann ein tieferes visuelles Verständnis des aboral Amputation Prozess, durch dieses Protokoll zur Verfügung gestellt wird, unterstützen weitere Untersuchungen in diesem Regenerationssystem Modell und erweitern die Anwendung dieses Staging - System Nematostella vectensis verwenden.

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Protocol

1. Vorbereitung der Tiere für Temperatur, Ernährung und Hell / Dunkel-Zyklus

  1. Erhalten Nematostella vectensis Erwachsene aus einem der zahlreichen Nematostella Labors weltweit, oder Non-Profit - Anbieter (Tabelle 1)
  2. Aufrechterhaltung Nematostella bei konstanter Temperatur (typischerweise zwischen 18 und 21 ° C) im Dunkeln, in "1 / 3x" künstlichem Meerwasser (ASW) in einer Salinität von 12 Teilen pro Tausend (ppt). Pflegen Kulturen in einfachen Kalk-Natron-Glas Kulturschalen, in der Regel 250 ml oder 1,5 l Kapazität 11.
    Hinweis: Diese einfachen Kulturbedingungen werden häufig unter Labors verwendet , die Nematostella studieren, aber Kultur Pflege kann auch 19 automatisiert werden.
  3. Feed - Nematostella frisch geschlüpften Artemianauplien 2 - 4x pro Woche. Hatch Artemia Zysten in voller Stärke (36 ppt) oder 1 / 3x ASW bei 30 ° C, in einem flachen rechteckigen Glasschale 20 oder ineine beliebige Anzahl von kleinen, kommerzielle oder hausgemachte Artemia Brütereien. Wenn ein Inkubator nicht verfügbar ist, Garnelen wird bei RT schlüpfen aber nicht so langsam mehr.
    Hinweis: Dies erfordert oft mehr als 24 Stunden für die Fertigstellung.
  4. Ersetzen Anemone Kultur Wasser mindestens einmal pro Woche. Für beste Erwachsene Gesundheit, gründlich zu reinigen (ohne Seife) Schüsseln die Kultur einmal pro Woche von angesammeltem Schleimabsonderungen, die die Schüssel Mantel und kann Falle Futterreste und Abfall, und die Tiere verstricken.

2. Auswahl und Entspannung der Ernährungsphysiologisch Anlage Tiere

  1. Wählen Sie Größe abgestimmte Polypen von etwa der gleichen Länge (3 - 5 cm, wenn natürlich entspannt) und legen Sie sie in eine Schüssel aus der Kolonie getrennt für drei Tage vor der Amputation.
    Hinweis: Die Anzahl der Tiere zum Schneiden ausgewählt wird durch das Experiment bestimmt werden wird durchgeführt, natürlich, aber im Allgemeinen empfehlen wir mindestens fünf Tiere pro Probenpunkt mit sechs Replikationen. So,in einem typischen Versuch würde ein Minimum von 30 Tieren vorgewählt werden. Im Allgemeinen ist es ratsam, mehr als die Mindestzahl (30) seit Amputationen zu wählen, die unregelmäßig sind (siehe unten) können Scoring später auswirken.
  2. Entfernen Sie die Schale von ausgewählten Tieren aus dem Inkubator in Raumlicht mindestens eine Stunde vor der Amputation.
    Hinweis: Die Exposition gegenüber Raumlicht und Schwingungen der Handhabung wird wahrscheinlich die Tiere verursachen schrumpfen, also müssen sie durch Inkubation auf dem Labortisch angepasst oder "entspannt" werden. Die Tiere werden sich Feuerfest- und Lichtexposition zu berühren und an diesem Punkt kann durch vorsichtiges Pipettieren bewegt werden.
  3. Optional: Anesthetize die Tiere um 7,5% MgCl 2 Zugabe (in 1 / 3x ASW). Sanft fügen Sie die MgCl 2 - Lösung mit einem Standard - Kunststoff - 5 - ml - Pipette in die Schüssel.
    Hinweis: Obwohl Tiere schließlich gewöhnt, wird dem Licht und physikalische Manipulation kann es vorteilhaft sein, Tiere zu betäuben zu erhalten oder zu "reparieren" ter entspannte Zustand , nachdem sie länglichen 16,21,22 geworden sind.
  4. Verwenden Sie eine große Bohrung (> 0,5 cm) Plastikpipette zu übertragen (in 1 / 3x ASW) fünf Tiere aus dem Pool amputiert werden, in den Boden einer sterilen Glasschneideschale von 100 mm Durchmesser mit 12 ppt ASW. Die Schale auf die Bühne eines Stereomikroskops mit variabler Vergrößerung zwischen 10 - 40X.
    Hinweis: Wurden die Tiere nicht betäubt worden und entspannt zum Schneiden, können sie immer noch zu berühren und Stereoskop Beleuchtung reagieren und damit ein paar Minuten brauchen kann wieder entspannt zu werden.

3. Amputation

  1. Mit einem sterilen Skalpell, amputiert die aboral Physa von jeder Polyp, mit dem Ziel, einen Abschnitt des Physa zu erhalten, die etwa so lang ist wie breit und kein Mesenterium enthielt.
    Hinweis: Die ideale Schnittbaustelle zur Beendigung des Mesenteriums nur aboral ist. Auf der Ebene des Schneidens gibt es einen Übergang von Gekröse eigentlichen dünnen lines zu jeder mesenteriales Einfügung entsprechenden (siehe Abbildung 1, Pfeile). Das Fehlen von Gekröse ist kritisch , weil es produziert Schleim, der "Verstopfung" das Loch 17,30 erleichtern kann.
    1. Platzieren Sie die Skalpellklinge in Kontakt mit dem Tier an der gewünschten Stelle der Amputation. Tun Sie dies entweder ohne fremde Hilfe (freihändig) oder durch sanft den Körper des Tieres mit einem # 5 Zange (Dumont Stil oder ähnliches) zu erfassen.
    2. Schneiden durch das Gewebe durch die gebogene Klinge des Skalpells Nutzung in einem Rucken Bewegung über den Körper.
      Hinweis: Das Gewebe sollte sauber durchtrennen, wie das Skalpell geschwenkt wird und befreien den Abschnitt von Physa vom Spender gewünscht. Wenn jedoch ein kleines Stück Gewebe noch den Körper und den Physa verbindet, schneiden Sie es mit dem Skalpell. Versuchen Sie nicht, durch Ziehen der verbundenen Stücke trennen, da dies den Physa beschädigen können.
  2. Entfernen Sie jede amputierte "Spender" Polyp aus der Schale und senden es an einem sepaRate Schüssel "gepoolt Amputierte" markiert; datieren die Schüssel und senden es an Stammkultur.
    Hinweis: Amputierte Polypen wird die aboral Wunde innerhalb eines Tages heilen und dann normal gefüttert werden kann. Sie werden eine normal aussehende Physa innerhalb von zwei Wochen, an welcher Stelle regenerieren die Physa wieder amputiert werden kann, falls gewünscht.
  3. Spülen Sie das exzidiert Physa, die in 12 ppt ASW in der Schneidschale verbleiben, dann Transfer jedes Physa in eine separate sterile auch in einem Multi-Well-Zellkulturplatte, die bereits 10 ml 12 ppt ASW hat in jeder Vertiefung.
    Hinweis: Dieses Beispiel eine sechs-Well-Platte verwendet, mit jedem gut hält 10 ml Meerwasser und fünf excised Physa. Im allgemeinen Meerwasser sollte die Physa decken ausreichend Kontakt mit Luft zu vermeiden, aufgrund der Bewegung in der Handhabung und potentielle Verdunstung. Die Platte oder Brunnen sollte einen Deckel haben.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,3 für jede experimentelle Behandlung mindestens 5 Physa in jeder Vertiefung zurückhaltender zu sammeln.
  5. Inkubieren Sie die Physa bei einer Temperatur, die prov wirdide den günstigsten Preis der Regeneration für die geplanten experimentellen Verhöre. Die Platte, die Physa in einen temperaturgeregelten Inkubator enthält, bei einer festen Temperatur von der gewünschten Rate der Regeneration bestimmt.
    Hinweis: Die Physa regenerieren Gewebe und bilden eine vollständige Polyp fehlen, wenn zwischen 15 und 27 ° C bei Temperaturen inkubiert. Die Regenerationsrate temperaturabhängig ist mit Ausnahme der ersten beiden Stufen. Die durchschnittliche Tag für das Erreichen Stufe 4 für alle Temperaturen 7 d nach dem Schneiden und dies deckt sich auch mit der Regeneration bei 21 ° C. Bei 27 ° C, Stufe 4 wird etwa 3 Tage früher erreicht und bei 15 ° C, Stufe 4 wird von etwa 3 d im Vergleich zu Regeneration bei 21 ° C (siehe auch Referenz 10) verzögert.

4. Bewertung Regeneration mit dem Nematostella Regeneration Staging System (NRSS)

  1. Ergebnis der Physa mit einem Stereomikroskop Verbindung mit variabler magnification (10 - 80X). Ergebnis der frisch geschnittenen Nematostella Physa als Stufe 0 und weiter Scoring zur gleichen Zeit jeden Tag nach der Amputation (dpa) mit dem NRSS 10.
    Hinweis: Für die Schlüssel Inszenierung Kriterien und Details siehe Referenz 10.
    1. Score Physa als Stufe 0 (offene Wunde), wenn ein frisch geschnittenem Physa erscheint als schalenförmige Masse einen schlaffen Ballon ähnelt, mit einer offenen Wunde ist wahrscheinlich sichtbar.
      Hinweis: Die Wundränder können auch zusammenhalten von Anfang an, aber das Gewebe wird noch zusammengeklappt werden, und es fehlt ihnen Steifigkeit. Die Ränder der offenen Wunde kann eine radiale Kontraktion als die Wunde heilt beobachtet werden, unterziehen.
    2. Score Physa als Stufe 1 (Wunde geschlossen), wenn die Amputation Wunde geschlossen erscheint.
      Hinweis: Wund Standort für die Zukunft oralen Pol entsprechen. Die Außenfläche rund um die Zukunft oralen Pol beginnen kann entsprechend den zugrunde liegenden radial symmetrischen endodermaler mesenteriales Einfügungen unterschiedliche Bögen anzuzeigen.
    3. Score physa als Stufe 2 (radiale Bögen), wenn die Oberfläche der Mund pole aufgeblasen erscheint, acht erhöht Bögen in einem radialsymmetrischen Muster angeordnet sind offenbart und durch Rillen getrennt sind. Beobachten kleine, halbkugelige blebs an der Spitze der Bögen. Sie werden in etwa so hoch wie breit, wahrscheinlich vorübergehend sein und zunächst durch eine einzige ektodermale Zellschicht besteht.
      Hinweis: In einigen Fällen doppelschichtigen blebs stabilisieren kann. Hinweis: Bei dieser oder späteren Stadien eine Schleimschicht erscheinen die Physa (Abbildung 2) in einer membranartigen 'Mantel' zu verkapseln. Das Verkapselungsmaterial sollte Scoring zu erleichtern entfernt werden.
    4. Score Physa als Stufe 3 (Tentakel), wenn die Knospen der Tentakeln enthält endodermaler und ektodermalen Gewebeschichten sind stabil in der mündlichen Ende wenigstens einigen radialen Bögen gebildet.
      Hinweis: Die Fühler sind länger als breit sind und sind minimal beweglich. Die Physa wird zeigen, erhöht, aber variable Inflation, so dass Gekröse Rudimente kann vis werdenIVK vom mesenterialen Einführen in die Körperhöhle erstreckt (coelenteron).
    5. Score Physa als Stufe 4 (Linear Mesenterien), wenn die Physa enthält acht verschiedene, sichtbare Gekröse, die in die coelenteron von Einfügungen in der Körperwand erstrecken, mit oral-aboralen Längen, die mehr als das Doppelte ihrer radialen Breite sind gemessen, von wo sie erscheinen zu verbinden zu den Rachen an seinem aboral Ende (enterostome).
      Hinweis: vier oder weniger Gekröse "gefaltete" interne freie Kanten aufweisen. Der Rachen ist sichtbar. Mehr als acht Tentakeln sichtbar sind, beweglich und manchmal in den Körper sie schrumpfen.
    6. Score Physa als Stufe 5 (vorwiegend Plissee Mesenterien), wenn die Physa mehr als vier Gekröse mit Plissee hat, und das Plissee ist voll und gewundenen als in Stufe 4. Das Tier eine fast "normalen" Erwachsenen Aussehen hat, aber es gibt keine sichtbaren Gonadenzellen.

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Representative Results

Der Verlauf der morphologischen Ereignisse während der Regeneration in abgeschlagene Physa ist in 1A gezeigt , die an jedem NRSS Stufe repräsentative Ansichten von Physa umfasst. Der typische Physa Schnitt Seite ist auf den Erwachsenen (Pfeilspitzen) angegeben. Die Fotografien in 1A zeigen progressive Regeneration von Mund- und Körperstrukturen von frisch geschnittenem Physa durch voll ausgebildete Polyp. 1B, C , die die Anordnung der internen Septa zeigen, die Gekröse, in Stufe 4 und Stufe 5. Beachten Sie, dass einige Mesenterien bei Stufe 4 fehlen wird "Plissee", sondern als Stufe 5 die Mehrheit zu qualifizieren, müssen Falten entwickelt haben. 1D zeigt eine Physa in einer Membran Schleimhaut umhüllt , die mit einer Zange (Figur 1E) entfernt werden kann. Während in der Regel nicht schädlich für die Regeneration (es sei denn, es unangemessen, die Tierfallen) kann die Membran behindern die Physa Scoring und tuning experimentelle Manipulationen, wie Mikroskopie, Probenfixierung oder der Ernte für die molekulare / biochemische Analyse. Dies wird am besten nach Stufe 1, oder später, wenn es Reformen.

Figur 2 zeigt , wie das Zwischenspeichersystem verwendet werden kann , die Ergebnisse eines Experiments zu erzielen , die Wirkungen der Hemmung autophagy zu beurteilen. Physa wurden geschnitten und mit Chloroquin bei 10, 50 und 100 & mgr; M oder Physa waren unbehandelt (Kontrolle). Chloroquin inhibiert lysosomale Funktionen, die für autophagy erforderlich sind. Die NRSS Kriterien wurden verwendet , um die Physa über den Verlauf der Regeneration und Ergebnisse zu erzielen wurden in 2E dargestellt. Fotografien von repräsentativen Steuerungs (2A) und Chloroquin behandelt Physa (Abbildung 2 B - D) wurden gemacht , als Kontrollen Stufe 5. Chloroquin behandelten Tieren erreicht hat Fortschritte nicht jenseits der Stufe 4, und sie in der Regel unvollständig Gekröse regenera ausgestellttion (die meisten fehlte Plissee), kurze Tentakel Größe und in einigen kurzen Fällen Körperlänge.

Abbildung 1
Abbildung 1. Merkmale der Regeneration. (A) Beispiele für Physa Mund- und Körperstrukturen regenerieren inszeniert nach dem NRSS. Panel - markierte Erwachsene zeigt Merkmale eines reifen Tier mit Tentakeln (t) des Rachens (ph), Gekröse (m) und Gekröse Einfügungen (mi). Weiße Pfeile zeigen, wo gefaltete Region Mesenterien Übergang zum Gekröse Insertion, einem Grat von endoderm zum aboral Terminus erstreckt. Dieser Bereich bildet den Physa. Gelbe Pfeile zeigen ideal Physa bisection Ort. Panel - 0 fünf Physa Minuten nach dem Halbierungs zeigt, und Panel 0 'ist eine vergrößerte Ansicht eines einer jener Physa, mit offene Wunde in der Mitte, die Definition Stufe 0 derNRSS. Panel 1 zeigt ein Physa mit der Wunde jetzt geschlossen, Bühne definieren 1. Panel 2 zeigt Physa mit erhöhten radialen Bögen um die orale Pol, mit aufgeblasenen Gewebe unten, entsprechend 2 bis Stufe (Platten 0 - 2 aus Blick auf die mündliche Ende sind). Panel 3 zeigt Knospen Tentakel in der mündlichen Pol Schwellen (nach rechts) des langgestreckten und Aufpumpen Physa, jetzt auf Stufe 3. Hinweis rudimentär Gekröse Elemente sichtbar sind und der Rachen ist in der mündlichen Ende im dunklen Bereich zu bilden. Panel 4 zeigt die Entstehung der wahren Tentakeln, sowie transiente 'blebs' in der mündlichen Pol, sind die Definition Stufe 4. Lineare Mesenterien sichtbar im aufgeblasenen Physa. Die große runde Masse sichtbar im Inneren des Polyp ist unbekannten Ursprungs und wird durch den Mund ausgestoßen werden. 5 - Panel zeigt eine nahezu vollständige Regeneration von mehr als vier plissierten Mesenterien gekennzeichnet, voll ausgebildet pharynx und acht oder mehr Tentakeln, die sie als Stufe 5 definiert. (B, C) aboral Ansichten einzelner Physa zeigen die biradiale Anordnung und Morphologie der Mesenterien. In dieser Ansicht erscheinen plissierten Gekröse eine Ausbuchtung des Gewebes auf halbem Weg zu haben (grüne Pfeilspitze). Eine Stufe 4 Physa hat vier oder weniger plissierten Gekröse und eine Stufe 5 Physa hat mehr als vier (C). Mesenterien mit oder ohne Falten werden durch grüne oder gelbe Pfeile angedeutet ist. Schwarze Pfeilspitze in (C) zeigt auf einen plissierten Mesenteriums , die radial verlängert. (D, E) Entfernung einer Schleimhülle aus dem Physa dargestellt. Die weißen Pfeile zeigen eine schleimige Hülle umgebenden Physa (D) , die vor Regeneration scoring wie in (E) entfernt werden sollte. Manchmal Restgewebe (gelbe Pfeile) kann innerhalb der Hülle eingeschlossen werden, und dies sollte auch entfernt werden. Asterisk zeigt orale Pole, wo Zeichened. Red Größe Bars sind 0,5 mm in allen Platten außer A5 (1,0 mm). Panels B und C dieser Figur wurden mit freundlicher Genehmigung von Referenz modifiziert und neu aufgelegt 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Auswirkungen von Chloroquin auf Regeneration. Um eine Anwendung der NRSS zeigen, testeten wir die Wirkungen einer Chloroquin, einem Inhibitor der autophagy. Physa wurden amputiert und sofort in 1 / 3x ASW, enthaltend 0,1% DMSO (Kontrolle) oder Chloroquin bei 10 platziert, 50, 100 uM. Physa wurden bei 24 h Intervallen mit dem NRSS erzielt. (A) Repräsentative Endpunkt Bilder von Kontrollen genommen , wenn sie Stufe 5 erreicht. - D) Repräsentative Bilder von Chloroquin behandelten Physa , die eine "regenerative Plateau" der Stufe 4. Chloroquin verursachte ähnliche Defekte bei der Erneuerung in allen getesteten Dosen erreicht. Das bemerkenswerteste Problem war das Fehlen einer völligen Regeneration von Mesenterien und Tentakeln. Abnormale Körper Morphologie (zB Verkümmerung) wurde ebenfalls gelegentlich bemerkt , (C). Presence (weißer Pfeil) und das Fehlen (schwarzer Pfeil) der Falten in einem Chloroquin behandelten Physa wird in D gezeigt (Tentakeln teilweise zurückgezogen). (E) Die Zwischenspeicherdaten für alle Physa aufgetragen als Funktion der Zeit (bei 23 ° C). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. ZusammenfassungHauptmerkmale der NRSS Stufen. Dieses Diagramm zeigt die wichtigsten morphologischen Veränderungen, die jede Stufe in der NRSS definieren. Richtung Bewegungen werden durch rote Pfeile und Merkmale von grünen Pfeilen gekennzeichnet. Stufe 0 zeigt offene Wunde nur nach dem Schneiden (A), und t). Die Wundränder Schließung radiale Kontraktion in Richtung der Mitte (B) unterzogen werden . Stufe 1 wird durch die vollständige Schließung der Wunde (C) und Höhe der Bögen zwischen Mund gerichteten Rippen (D) gekennzeichnet; das Zentrum der Mundoberfläche (Pfeilspitze) gedrückt wird. Stufe 2 hat eine ausgeprägte Wölbung der Mundoberfläche (Pfeilspitze, E); die Physa beginnt an der Spitze der Bögen (Pfeile) sichtbar mit Tentakelknospen und blebs schmal (F) werden zu verlängern und. Stufe 3 hat stabile Tentakelknospen (Pfeilspitze, G) und die Regeneration des Rachens kann als eine Dichte in der mündlichen Pol (orange Masse, Pfeilspitze in H zu sehen (I) , die als mindestens doppelt so hoch sein sollte , solange sie an der Anschlussstelle des Rachens groß sind (I '). Der mesenteriales Filament (J, J ') - Vier oder weniger Mesenterien kann an ihrem inneren Rand gefaltet werden. Stufe 5 wird von mehr als vier gefaltete Mesenterien (K) aus, die am besten durch Betrachtung von aboraler Ende beurteilt werden kann (K '). Re-Print mit freundlicher Genehmigung von Referenz 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Verwendung von Nematostella als Modell der Wundheilung und Regeneration wird immer beliebter. Somit ist es wichtig, die morphologische Muster eines bestimmten Protokolls vor dem wirksamen zellulären und molekularen Analysen zu können, können zur Visualisierung zugeordnet und verglichen werden. Nematostella haben ein hohes Maß an regenerativen "Flexibilität", fast jedes fehlende Struktur an jeder Stelle amputiert zu reformieren , in der Lage, bei post-Planula Phasen des Lebens. So haben verschiedene Forscher Regeneration geprüft von Amputation resultierenden oder in verschiedenen Regionen von Polypen Verwundung, in verschiedenen Altersstufen und Größen 7-18.

Die Inszenierung hier beschriebene System folgt die Transformation eines morphologisch einheitlichen Abschnitt Physa, vom aboral Ende eines Erwachsenen amputiert, um eine anatomisch komplette juvenile Polyp nur reproduktive Gewebe fehlt (wir haben noch nicht bestimmt, wenn diese regenerierten Jugendlichen m sexuell gewordentur). Dieser Ansatz untersucht die Regeneration von einem einfachen Rudiment des Gewebes zu einer der nahe der maximalen Komplexität. Einschließlich fünf Physa als eine Mindestgruppengröße wird empfohlen, für potentielle individuelle Variabilität und Hinterbliebenenpension zu normalisieren. Natürlich kann diese Zahl auf die besonderen experimentellen Ziele angepasst werden , aber das NRSS Protokoll erlaubt 2 ml Medium pro Physa wie das ein potenzielles "Volumeneffekt" zu negieren , die Regeneration in hydra 23 zu beeinflussen berichtet wurde.

Andere Ansätze Nematostella Regeneration zu untersuchen haben Erwachsene halbierten Mitte Körper oder in der mündlichen Ende verwendet wird , oder juvenile 4-Tentakel Stadium Polypen Mitte Körper 7,11-18 halbierten. Zwei Studien haben die Regeneration in Physa durch natürliche Spaltung 16,18, befreit untersucht und Ansätze amputiert Physa verwenden , haben sich in letzter Zeit mit dem NRSS 8,9. Jede dieser unterschiedlichen Herangehensweisen hat ihre eigenen Vorzüge und ansprechen können einzigartige Fragen zu regenerative Prozesse unter verschiedenen Amputation oder Verwundung Regime auftreten und unter unterschiedlich alten Tieren. Das NRSS Protokoll für Physa Amputation und Ritzen, in der vorliegenden Studie gezeigt, erzeugt eine relativ einheitliche Satz von Physa für systematische Untersuchung und vermeidet Veränderung der Physa Größe, Gewebezusammensetzung und anschließende Fortschreiten der Regeneration mit natürlichen Querteilung 18,24 beobachtet. Obwohl Physa Amputation etwas auf die natürliche Art der ungeschlechtlichen Fortpflanzung in Nematostella entspricht, haben molekulare Unterschiede zwischen Regeneration festgestellt worden , die durch natürliche Spaltung und Amputation in der Mitte des Körpers oder an der Physa 16,18,24. Ob Physa durch das Verfahren der Amputation erzeugt hier beschriebenen oder natürliche Spaltung zeigen solche Unterschiede noch bestimmt werden.

Es gibt ein paar Probleme, die für den Erfolg mit der Aufzucht Amputation kritisch sind, und Scoring-Techniken, die hier beschrieben. Polyp für Amputation shou ausgewähltld bei der gleichen Temperatur gehalten werden, angepasst für Physa Größe, Ernährungsgeschichte und möglichst Alter (obwohl letztere nicht systematisch getestet um zu bestimmen, wurde, wenn es eine alters Wirkung auf Variation in Stufe Progression). eine offene Wunde mit einem scharfen sterilen Skalpell Gewinnung einer gekrümmten Klinge ist wichtig für die morphologische Beobachtungen der Wundheilung zwischen Stufe 0 und Stufe 1. Wenn das Physa aufgeblasen wird und die gekrümmte Klinge des Skalpells wird über die erwachsenem Gewebe geschaukelt, es amputiert in einer Bewegung und schnelle Behandlung von Schneid dish gut übertragen werden können. Amputationen, die Gekröse, oder die das Ergebnis einer umfangreichen physikalische Manipulation umfassen sollte verworfen werden.

Praxis-Inszenierung unbehandeltem Physa ein Gefühl für die individuelle Variation in der Bevölkerung getestet zu bekommen. Variation zwischen den einzelnen Physa ist am wenigsten für den frühesten Stadien. Zum Beispiel sind alle Physa in Stufe 0 bei 0 dpa. In gleicher Weise erreichen alle Physa Bühne1 in Synchronität bei 1 dpa. Das Aussehen der Stufe 2 kann schwieriger sein, für den Beobachter zu erkennen, weil "Inflation" ist ein relativer Zustand, der erreicht wird, jedoch um 2 dpa mit wenig Variation. Das Auftreten von echten Tentakeln Markierungen Progression zu Stufe 3. Die regenerierende Tentakeln durch das Auftreten eines membranartigen "Kokon" verdeckt werden kann, die unter Visualisierung der Tentakel Knospe behindert. Wenn die membranartige Abdeckung zuvor entfernt wurde, sollte es jetzt geschehen. Die Entfernung der Membran mit feinen Spitzen versehenen tweezer die regenerierende Physa befreien. Die Unterscheidung zwischen Stufe 4 und 5 ist die Anzahl der plissierten Mesenterien. Stufe 4 hat vier oder weniger plissierten Gekröse und Stufe 5 hat fünf vor acht plissierten Mesenterien. Während Plissierung kann in einer Seitenansicht zu beobachten, ist die genaue Anzahl der plissierten Mesenterien besser mit einem aboral Ansicht beobachtet.

Eine Herausforderung bei der Untersuchung Erwachsener Nematostella Regeneration von einem PHYsa Rudiment, und zwar mit von anderen Amputation Stellen geschnitten Gewebe, ist die vielfältig Klarheit der lebenden Geweben. Der Kolben der Physa ist relativ klar im intakten Erwachsenen, aber es wird eher undurchsichtig aufgrund von Gewebekontraktion nach der Amputation. Klarheit kehrt nach und nach (Stufe 2), sobald die Wunde schließt (Stufe 1) und das Tier beginnt, aufzublasen aber auch dann der Bereich um die Wunde, wo Gewebe und Strukturen aktiv bleibt etwas verdeckt durch dichtes Gewebe zu regenerieren (insbesondere Stufe 3). Höhere Inflation der Regel begleitet Stufe 4 und 5 durch optische Klärung gefolgt Fixierung wird mit ziemlicher Sicherheit zu lösen , was bei der mündlichen Ende geschieht, aber informativer leben, gewebespezifische transgene Reporter kann sein , dass für die Fluoreszenz überwacht werden können und leichter visualisiert 15, 25-30.

Ein amputierten Physa kann natürlich nicht füttern, da es Tentakeln fehlt, Mund und Gekröse (die Verdauungsdrüsen Hafen), so requiRing Regeneration von fehlenden Körperstrukturen durch die Mobilisierung Nährstoffreserven von Non-Food-Quellen erreicht werden. Die Physa kann potenziell dies zu erreichen ist durch Autophagie, bei dem Zytoplasma, Organellen und andere Zellkomponenten sind verschlungen intrazellulär und von einem Lysosom-abhängigen Mechanismus verarbeitet 31-33 Energie und Verbindungen für anabole Prozesse zu erzeugen. Wir finden, dass Physa mit dem Lysosom-Inhibitor Behandlung, Chloroquin, abnormal Regeneration von Mesenterien und Tentakeln verursacht und allgemeine Körpermorphologie, was darauf hinweist, dass die Autophagie für normale Regeneration von Mund- und Körperstrukturen erforderlich ist. Autophagy regelt 34-36 Zellfunktionen stammen, und spielt eine entscheidende Rolle bei der Regeneration in Hydra, planaria und Zebrabärbling 37-41. Eine weitere Analyse erforderlich ist , um zu verstehen , wie die Autophagie Nematostella Regeneration auf zellulärer und molekularer Ebene beeinflusst, aber unsere ersten Durchlauf Experiment zeigt das Dienstprogramm die NR der VerwendungSS als schnelle Screening-Methode für kleine Moleküle, die Regeneration beeinträchtigen könnten.

Die genetischen, molekularen und zellulären Prozesse , die Regeneration in Nematostella regeln sind nur in einem rudimentären Stadium des Verstehens, aber das emergent Modell zur Regeneration hat eine wachsende Repertoire von Werkzeugen für die Genom- und Genexpressionsanalyse. Mit seiner kommentierten Genom, eine Vielzahl von regionalen und gewebespezifische genetische Marker und robuste Methoden für Transgene, Mutagenese, Histologie und Mikroskopie verspricht Nematostella Mechanismen aufzudecken anthozoan cnidarian Regeneration Lenkungs- und aufzudecken , ob seine regenerative Prozesse sind ähnlich oder einzigartig unter den Nesseltieren und metazoans Im Algemeinen.

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Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von einem New Yorker Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Grant unterstützt GHT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
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