スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導

Developmental Biology

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Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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Abstract

刺胞動物、具体的にHydraは 、損傷を受けたり、切断構造を再生するために示した第一の動物であった、そして実際にこのような研究は間違いなく250年以上前にトレンブレーの仕事を通じて、現代生物学的調査を開始しました。現在再生の研究では、両方の「クラシック」の再生などヒドラ 、プラナリアやUrodelesのような生物、ならびに海綿から哺乳動物を介して、後生動物の範囲を、スパニング種の拡大スペクトルを用いて復活を見ています。生物学的現象としての本質的な関心に加えて、再生は様々な種でどのように機能するかを理解することは、再生プロセスは、共通の特徴および/または種またはコンテキスト固有の細胞および分子メカニズムを共有しているかどうかをお知らせします。女優のイソギンチャク、Nematostella vectensisは 、再生のための新たなモデル生物です。 ヒドラのように、Nematostellaは古代の門、刺胞動物のメンバーですが、トン内彼のクラス花虫綱、進化的により基礎であるヒドロ虫の姉妹クレード。したがってNematostellaでの再生の側面は、比較し、 ヒドラ及びその他の刺胞動物のものと対比するために興味深いものになります。この記事では、我々は、二等分観察し、physaと呼ばれるNematostella大人の尾方端の再生を分類する方法を提示します。 physaは自然に無性生殖の手段として、核分裂を起こし、自然核分裂またはphysaの手動切断のいずれかは、複雑な形態の再成長と改革をトリガします。ここでは、Nematostella再生ステージングシステム(NRSS)におけるこれらの単純な形態学的変化を成文化しています。私たちは、クロロキンの効果、リソソーム機能ブロックのオートファジーの阻害剤をテストするためにNRSSを使用しています。結果は、自食作用が阻害されたときにポリープ構造、特に腸間膜の再生が異常であることを示しています。

Introduction

単一ヒドラにおける再生の観察は、実験科学の1,2のような生物学の出現で精液のイベントでした。再生は、生物学者に非常に広くアピールの現象のままと同様に人を置きます。人間の再生の限界を理解し、克服する発生生物学者、臨床医、生物医学科学者や組織のエンジニアの可能性はより本質的に興味深いより再生生物学になります

さて、このようなゲノム配列決定およびゲインと機能ツールの損失などの新たな技術を使用して、フィールドが回生機構を離れていじめるために、最終的に他の人がすることはできませんが再生成することができますどのように様々な種を理解する態勢を整えています。 、分子細胞性および形態学的応答における共通の度合いはまだ解明されていないが、今のところ再生することができる動物の間の基本的な応答がimagiであったであろうよりも類似していると思われますNEDのみ一昔前3。

特に、刺胞動物は、形態的多様性の広いスペクトルの中で、ほぼすべての身体の部分のを再生するに容易です。孤独な淡水ポリープから、ハイドラは、ポルトガル人-O-戦争のような複雑な植民地siphonophoresに、広大なサンゴ礁を構築小さな海洋ポリープと共に、再生はのための機構に加えて、多くの場合、再生モードであり、怪我や捕食に起因する破損や紛失の体の部分を修理または改。刺胞動物門の多様な種が再生のために類似または異なるメカニズムを使用するかどうかを根本的に興味深い質問4-6です。

私たち、そして他の人が再生7-17のモデルとして花虫類、Nematostella vectensisを開発てきました。我々は最近、aboraから二分組織の形態学的に均一な片から体全体の再生を記述するためのステージングシステムを開発しましたポリープ10のリットルの終わり。任意のレベルで二分したときNematostellaポリープを再生成することができますが、我々はこれが自然な無性分裂18の通常の平面に近いため一部では、ほとんどの形態学的に単純な地域、physaで尾方の位置で大人をカットすることを選んだ、ともあるため体全体が最も単純な形態学的構成要素から組み立て直されているかを観察し、分子解析を可能にします。

Nematostella再生ステージングシステム(NRSS)は、通常の培養条件下で、切断physaによって再生のいずれかの態様の進捗状況を採点するために使用することができる形態学的ベンチマークの比較的単純なセットを提供したり、実験的にそのような小分子治療、遺伝子操作などの状況を摂動しました、または環境の変化。予想通り、NRSSは再生の細胞および分子事象を参照することが可能な形態学的足場として採用されつつあります10。

最後に、切断の我々の方法は、最近の研究17で使用されるピンポイント穿刺よりも数桁大きいぽっかりと穴を生成し、まだ両方の傷は6時間の周りで癒します。創傷閉鎖の視覚的に逮捕した別個のフェーズを文書化することは傷の大きさと、それを閉じるのにかかる時間の見かけ上の独立性を説明するために実験的アプローチを示唆している必要があります。したがって、このプロトコルによって提供される尾方切断プロセスのより深い視覚的理解は、このモデル再生システムにさらなる研究を支援し、Nematostella vectensisのを使用してこの病期分類システムの適用を拡大します。

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Protocol

温度、栄養および明/暗サイクルのための動物の1コンディショニング

  1. 世界中の数多くのNematostellaラボの1、または非営利業者からNematostella vectensis成人を得る( 表1)
  2. 千あたり12部(PPT)の塩分で「1/3× "人工海水(ASW)で、暗闇の中で(典型的には18と21°C)一定温度でNematostellaを維持します 。一般的に250 mlまたは1.5 L容量11、シンプルなソーダライムガラス培養皿で培養を維持します。
    注:これらの単純な培養条件は、一般的にNematostellaを研究ラボの中で使用されているが、文化のケアも19を自動化することができます。
  3. 週4倍- 2ノープリウスNematostella新しく孵化したアルテミアを養います。フル強度(36 PPT)または1/3倍の浅い長方形のガラス皿20内またはで30℃、でASWでハッチアルテミアシスト小規模、商業や自家製ブラインシュリンプ孵化場の数のいずれか。インキュベーターが使用できない場合は、エビはRTで孵化が、よりゆっくりとそうなります。
    注:これは、多くの場合、完了のために24時間以上を必要とします。
  4. 少なくとも週に一度アネモネ培養水を交換してください。最高の大人の健康のために、徹底的にクリーン(石鹸なし)文化が一度コートボウルと缶トラップ食べ残しや廃棄物の蓄積粘液分泌、の週をボウル、動物を絡ませます。

栄養的に馴化動物の2.選択とリラクゼーション

  1. ほぼ同じ長さの大きさがマッチしたポリープを選択(3〜5センチメートルを、ときに自然にリラックスした)前切断に3日間コロニーから分離ボウルに配置します。
    注:切断のために選択された動物の数は、実験によって決定されますもちろん、行われているが、一般的に、我々は6反復でサンプル点当たり少なくとも5匹の動物をお勧めします。このように、典型的な実験では30匹の動物の最小値は、事前に選択されたことになります。 (下記参照)不規則な切断術の後スコアに影響を与えることができるので、一般には、より多くの最小数(30)より選択することが賢明です。
  2. 切断する前に少なくとも1時間室内光にインキュベーターから選択した動物の食器を削除します。
    注:室内光とハンドリングの振動への曝露は、おそらく動物が収縮する原因となりますので、実験台上でのインキュベーションによって適合または「リラックス」する必要があります。動物は触れるために、耐火及び露光となり、その時点での穏やかなピペッティングして移動することができます。
  3. オプション:(1/3×ASWに)7.5%のMgCl 2を追加することにより、動物を麻酔。静かに標準的なプラスチック5 mLのピペットでボウルへのMgCl 2溶液を追加します。
    注:動物は、最終的に光へと物理的な操作に慣れになるだろうが、維持またはトンを「修正」するために動物を麻酔することが有利な場合があります彼らは細長い16,21,22となった後、彼は状態を緩和しました。
  4. 12 PPTのASWを含む直径100mmの滅菌ガラス切断皿の底に、切断されるように、プールから5匹の動物(1/3×ASWに)転送するために広い口径(> 0.5センチメートル)プラスチックピペットを使用してください。 40X - 10の間に可変倍率の実体顕微鏡のステージに上の皿を置きます。
    注:動物は、切断のために麻酔をかけ、リラックスされていない場合、彼らはまだ触れないように対応し、ステレオスコープの照明ので、再びリラックスになるために数分を必要とする場合があります。

3.切断術

  1. 滅菌メスを使用して、約限り、それは広いと全く腸間膜を含まないあるようですphysaのセクションを得ることを目標に、各ポリープから尾方physaを切断します。
    注:理想的な切断部位は、腸間膜の終了にちょうど尾方です。切断面に薄いリットルに対して適切腸間膜からの移行がありますINESは、各腸間膜挿入( 図1参照、矢印)に対応します。それは穴17,30 'を差し込む」容易にすることができる粘液を生成するので、腸間膜の不在は重大です。
    1. 切断の所望の部位での動物と接触したメスの刃を配置します。 (フリーハンド)補助なし、または静かに#5鉗子(デュモンスタイルまたは類似)で動物の体を把握することでこのいずれかの操作を行います。
    2. 体全体の「ロッキング」運動にメスの湾曲した刃を活用することで、組織を通ってカット。
      注:組織は、メスが揺動されるようにきれいに切断し、ドナーからphysaの所望の部分を解放する必要があります。組織の小片がまだ体とphysaを接続する場合は、メスでそれをカット。これはphysaに損傷を与える可能性として、引っ張ることにより、接続された作品を分離しようとしないでください。
  2. 皿から各切断「ドナー」ポリープを削除し、SEPAに戻します「プールされた切断者」の標識率ボウル。日付ボウルとストック培養物に戻します。
    注:切断ポリープ日以内に尾方の傷を癒してくれるし、その後正常に供給することができます。彼らは、必要に応じてphysaが再び切断することができ、その時点で2週間以内に通常見physaを再生成します。
  3. 12 PPT ASWで切断皿に残って切除したphysaをすすぎ、その後、すでに各ウェルに12 PPT ASWの10ミリリットルを持つマルチウェル細胞培養プレートに別々の無菌ウェルに各physaを転送します。
    注:この例では、各ウェル海水の10 mL及び5切除したphysaを保持して、6ウェルプレートを使用しています。一般海水でハンドリングし、潜在的な蒸発に起因する動きに空気への暴露を避けるために十分physaをカバーする必要があります。プレートまたはウェルは、蓋を持っている必要があります。
  4. 各実験治療のために、各ウェルの予約で少なくとも5 physaを収集するために、3.3 - 繰り返して、3.1を繰り返します。
  5. 箴ます温度でphysaをインキュベート計画された実験的な取調べのための再生の最高の速度をIDE。再生の所望の速度によって決定される一定の温度で、温度調節インキュベーターにphysaを含むプレートを置きます。
    注:physaが欠落した組織を再生し、15と27℃の間の温度でインキュベートした場合、完全なポリープを形成することになります。再生の速度は、最初の2つのステージを除いて、温度依存性です。全ての温度のための段階4に到達するための平均日は、切断後7日であり、これはまた、21℃における再生と一致します。 27℃では、ステージ4は、約3日早く到達し、15℃で、ステージ4は、21°C(参照文献10)で再生と比較して約3 dだけ遅延されます。

4. Nematostella再生ステージングシステム(NRSS)で再生を評価します

  1. 変数壮麗なステレオ-化合物顕微鏡を用いてphysaスコアエーション(10 - 80X)。ステージ0のように新鮮にカットNematostellaの physaスコアと同時に、NRSS 10を使用して、毎日ポスト切断術(DPA)をスコアリングを続けます。
    注:キーのステージング基準や詳細についてはリファレンス10を参照してください。
    1. オープン創傷部位で、弛緩性バルーンに似ているcup-形の質量はそう見えるようたてカットphysaが表示された場合、ステージ0(開いた傷口)としてphysaスコア。
      注:傷のエッジがまた最初から一緒に固執する可能性がありますが、組織はまだ崩壊され、剛性が不足しています。開放創のエッジは、創傷治癒のような半径方向の収縮を受けて観察することができます。
    2. 切断術創が閉じて表示された場合(閉鎖した創傷)第1段階としてphysaスコア。
      注:創傷場所は、将来の経口極に対応させていただきます。将来の経口ポールの周りの外表面は、基礎となる放射対称内胚葉腸間膜の挿入に対応する明確なアーチを表示し始める可能性があります。
    3. スコアのpHYSAステージ2(ラジアルアーチ)などの経口極の表面が放射状に対称なパターンに配置された8つの隆起したアーチを明らかにし、膨張した溝によって分離された表示されます。アーチの頂点に小さな半球状のブレブを守ってください。彼らは広い、おそらく一過性のように背の高い、と最初は単一の外胚葉細胞層によって構成についてになります。
      注:いくつかのケースでは二重層ブレブを安定化させることができます。注:この以降の段階で粘液層がphysa膜状の「鞘」で( 図2)をカプセル化するために表示されることがあります。このカプセル化材料は、スコアリングを容易にするために削除する必要があります。
    4. 内胚葉と外胚葉組織層を含む触手の芽を安定的に、少なくともいくつかの半径方向のアーチの経口端部に形成されている場合には、ステージ3(触手)としてphysaスコア。
      注:触手は、彼らが広く、最小限の運動性よりも長くなっています。腸間膜の基礎が可視になるようにphysaは増加したが、変数インフレ率が表示されます体腔(腔腸)に腸間膜の挿入から延びるible。
    5. physaは、彼らが接続されているように見えたところから測定その2倍の半径方向の幅よりもある口腔尾方の長さで、体壁に挿入から腔腸中に延びる8明確な、目に見える腸間膜が含まれている場合は、ステージ4(リニア腸間膜)としてphysaスコアその尾方端(enterostome)で咽頭へ。
      注:4つ以下の腸間膜には、「プリーツ」内部の自由縁を持っています。咽頭が表示されます。以上8触手は、運動性表示され、時には彼らは体内に収縮します。
    6. physaはプリーツとつ以上の腸間膜を有しており、プリーツは、動物はほとんど "通常の"大人の外観を持っていますが、目に見えるはありませんステージ4でより完全かつしなやかである場合、ステージ5(主にプリーツ腸間膜)としてphysaスコア生殖細胞。

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Representative Results

切断されたphysaで再生中の形態学的イベントの進行は、各NRSS段階でphysaの代表的な景色を備えて、図1Aに示されています。典型的なphysa切断部位は、成人(矢じり)に示されています。 図1Aの写真は完全に形成されたポリープを介して新鮮にカットphysaから口頭と身体構造のプログレッシブ再生を示しています。 図1B、Cにはそれぞれ、ステージ4、ステージ5で、腸間膜を内部セプタムの配置を示します。第4段階でいくつかの腸間膜が「プリーツ」を欠くが、大部分はプリーツを開発している必要があり、ステージ5のように修飾することに注意してください。 図1Dは、鉗子( 図1E)を用いて除去することができる粘液の膜に包まphysaを示しています。再生に有害な通常ではないが(それが不当に動物をトラップしない限り)、膜はphysaを得点妨げと行うことができますこのような分子/生化学分析のための顕微鏡検査、サンプルの固定や収穫などの実験操作を、る。これは最高のステージ1の後に除去、または後で場合は改革されています。

図2は、病期分類システムは、オートファジーを阻害する効果を評価するための実験の結果を獲得するために使用することができる方法を示しています。 Physaを切断し、10、50及び100μMでクロロキンで処理された、またはphysaは、未処理(対照)でした。クロロキンは、オートファジーのために必要とされるリソソーム機能を阻害します。 NRSS基準は、 図2Eにプロットした再生及び結果かけphysaを獲得するために使用しました。代表的な制御( 図2A)とクロロキン処理したphysa( 図2 B - D)の写真は、コントロールがステージに到達したとき5.クロロキン処理された動物は、ステージ4を超えて進行しなかった、と彼らは一般的に不完全な腸間膜regeneraを示し行われましたン(最も欠けていたプリーツ)、短い触手のサイズ、およびいくつかのケースではショートボディの長さ。

図1
再生の 1. 特長 (A)経口およびボディ構造を再生physaの例としては、NRSSに応じて上演しました。 大人のラベルされたパネルは、触手(t)は咽頭(ペーハー)、腸間膜(m)および腸間膜挿入(マイル)との成熟した動物の特徴を示しています。白矢印は、腸間膜の挿入に腸間膜転移、尾方末端まで延びる内胚葉の尾根のプリーツ地域を示します。この領域はphysaを構成しています。黄色の矢印は、理想的なphysaの二分のサイトを表示します。 パネル 0は、二分後に5 physaの分を示しており、 パネル 0」のステージ0を定義し、中央に開いた傷を持つものphysaの1の拡大図であり、NRSS。 ( - 2口端の図であり、パネル0) パネル 1は、第1ステージパネル 2はステージ2に対応し、下記の膨張した組織で、経口ポールの周りの隆起したラジアルアーチとphysaを示して定義する、創傷とphysaは終了いたしました示しています。 パネル3は、細長いと膨張physaの経口極に現れる触手芽が(向かって右)、今の段階で3注初歩的な腸間膜の要素が表示され、咽頭、経口終わりに暗い領域に形成されることを示しています。 パネル 4は、4リニア腸間膜が膨張しphysaに表示されているステージを定義し、真の触手の出現、ならびに経口ポールの過渡「ブレブ'を示します。ポリープ内部の目に見える大きな丸い塊は、未知の起源のものであり、口から排出されます。 パネル5は、以上の4プリーツ腸間膜、完全に形成されたpH値によって特徴付けほぼ完全な再生を示していますarynx、ステージ5のようにそれを定義する8以上の触手、。 (B、C)個々のphysaの反口側の見解は、腸間膜の二放射相称の配置や形態を示しています。このビューでは、プリーツ腸間膜は、組織途中の膨らみ(緑の矢印)を持っているように見えます。ステージ4 physaは4以下プリーツ腸間膜を有し、ステージ5 physaはつ以上の(C)を有しています。プリーツの有無にかかわらず腸間膜は、それぞれ、緑や黄色の矢印で示されています。 (C)中の黒矢印は、半径方向に拡張したプリーツ腸間膜を指します。 physaから粘液シースの(D、E)の除去が示されています。白い矢印は、再生をスコアリングする前に、(E)のよう除去すべきであるphysa(D)を取り囲む粘膜シースを示しています。時には、残留組織(黄色矢印)シース内に捕捉することができ、これはまた、除去されるべきです。アスタリスクは、どこマーク経口極を示し、エド。レッドサイズバーは、A5以外のすべてのパネルで0.5ミリメートル(1.0ミリメートル)です。 パネル Bおよびこの図のCリファレンス 10から変更し、許可を得て転載されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
再生に対するクロロキンの 2. 影響。 NRSSの適用を実証するために、我々は、クロロキン、オートファジー阻害剤の効果を試験しました。 Physaを切断し、直ちに10、50、100μMで、0.1%DMSO(コントロール)またはクロロキンを含有する1/3×ASW中に入れました。 PhysaはNRSSを使用して、24時間間隔で記録しました。 (A)は、ステージ5に達したときのコントロールを撮影した代表的エンドポイントの画像。 - D)ステージ4クロロキンの「回生プラトー」に達しクロロキン処理したphysaの代表的な画像は、試験した全ての用量で再生において同様の欠陥を引き起こしました。最も顕著な問題は、腸間膜と触手の完全な再生の欠如でした。異常な体の形態( 例えば、発育阻害)も時折(C)に認められました。プレゼンス(白矢印)とクロロキン処理したphysaでプリーツの欠如(黒矢印)はD(触手が部分的に引き抜かれる)に示されています。 (E)すべてphysaのステージングデータは、(23℃で)時間の関数としてプロットしました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3.概要NRSS段階の主な機能。この図は、NRSSの各段階を定義するキーの形態学的変化を示しています。運動の方向は緑の矢印で赤い矢印と機能によって示されています。ステージ0は、単に(A)、およびt)を切断した後に開いた傷を描いています。創傷縁部は中心部(B)に向かって閉鎖ラジアル収縮を受けます。ステージ1は、創傷(C)および経口向きの尾根(D)間のアーチの上昇の完全閉鎖することを特徴とします。口腔表面の中央部(矢印)が押されています。ステージ2は、口腔表面(矢じり、E)の顕著なアーチを持っています。 physaは細長く、(F)狭くなるアーチ(矢頭)の頂点に見える触手の芽とブレブとすることから始まります。第3段階は、安定した触手の芽(矢じり、G)を有し、再生咽頭、口腔ポール(オレンジ質量、H中の矢印で密度として見られるかもしれません(I ')の接合部で背が高いようであるべき線形およびunpleated腸間膜(I)の存在を示しています。腸間膜フィラメント(J、J ') - 4つ以下の腸間膜は、その内縁にプリーツ加工することができます。ステージ5は最高の尾方端(K ')から見ることによって評価することができるつ以上のプリーツ腸間膜(K)、ことを特徴としています。再印刷リファレンス10から許可を得て、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

創傷治癒および再生のモデルとしてNematostellaの使用は、ますます人気が高まっています。したがって、効果的な細胞および分子分析は、割り当てと比較することができる前に、特定のプロトコルの形態学的パターンを可視化できることが重要です。生活の後プラヌラの段階で、ほぼすべての場所で切断し、不足している構造を改革することができるという、回生「柔軟性」の高い学位を持っているNematostella。このように、様々な研究者らは、異なる年齢やサイズ7-18で、再生切断から生じるまたはポリープの異なる領域に負傷を検討しました。

ここで説明したステージングシステムは、生殖組織を欠いている解剖学的に完全な若年性ポリープに大人の尾方端から切断physaの形態学的に均一な部分の変換を、(これらの回生少年が性的メートルになったときに、我々はまだ決定していない以下のature)。このアプローチは、最大に近い複雑さの一つに組織の簡単な原基から再生を調べます。最小グループサイズは、潜在的な個体差と生存のために正規化することをお勧めしますように5 physa含みます。もちろん、この数は、特定の実験の目的に合わせて調整することができるが、NRSSプロトコルはphysaあたり培地2mlをヒドラ23に再生に影響することが報告されているもののような潜在的な「ボリューム効果」を否定することを可能にします。

Nematostella再生を研究するための他のアプローチは大人二分半ば体を使用するか、または経口終わりに、または若年4触手ステージポリープは半ば体7,11-18を二分しています。二つの研究は最近、NRSS 8,9で浮上している自然核分裂16,18によって遊離physaで再生を検討し、切断physaを使用して近づいてきました。これらの多様なアプローチのそれぞれが独自のメリットがあり、regeneratiについてのユニークな質問に対応することができます別の切断または創傷体制の下で、および異なる高齢の動物の間で発生するプロセスをVEの。本研究で示されphysaの切断およびスコアリングのためのNRSSプロトコルは、系統的な研究のためのphysaの比較的均一なセットを生成し、physaの大きさの変化、組織組成、および天然横核分裂18,24で観察された再生のその後の進行を回避することができます。 physa切断術がNematostellaで無性生殖の固有モードに多少対応するが、分子の違いは半ば体で、またはphysa 16,18,24で自然核分裂や切断から生じる回生の間で注目されています。かどうかは、ここで説明した切断の方法により製造さphysaまたは自然核分裂ショーなどの違いが決定されていません。

ここで説明するいくつかの飼育切断の成功のために重要である問題、およびスコアリング技術があります。切断のショウのために選択されたポリープ(後者は系統的に段階の進行の変化に年齢効果があるかどうかを決定するためにテストされていないが)、同じ温度に維持physaサイズ、栄養履歴及び可能であれば年齢を一致させるLD。 physaが膨張され、メスの湾曲した刃は成体組織の上に揺動されると、湾曲ブレードを持つシャープな滅菌メスで開いた傷口を取得することは、それが切断され、ステージ0、ステージ1の間の創傷治癒の形態学的観察のために重要です一つの動きで、すぐに料理を切断からも治療に転送することができます。腸間膜を含むか、または切断術は、広範な物理的操作の結果が破棄されるべきです。

集団内の個人差の感覚を得るために、未処理のphysaステージング練習はテストされています。個々のphysa間の変動は、初期段階のため、少なくともです。たとえば、すべてのphysaは0 DPAでステージ0です。同様に、すべてのphysaステージに到達します1 DPAで同期して1。ステージ2の外観は「インフレは「ばらつきの少ない2 DPAによって、しかし、達成された相対的な状態であるため、観察者が識別するために難しくなることがあります。真の触手の外観は再生触手は下の触手芽の可視化を妨げる膜状の「繭」の出現によって不明瞭にすることができるステージ3への進行をマーク。膜状のカバーは以前に削除されていない場合、それは今では行うべきです。微細な先端ピンセットで膜の除去は、再生physaを解放します。ステージ4と5の間の区別はプリーツ腸間膜の数です。ステージ4は、4個以下のプリーツ腸間膜があり、ステージ5は、5〜8個のプリーツ腸間膜を持っています。プリーツは側面図で観察することができるが、プリーツ腸間膜の正確な数は、尾方のビューとのより良い観察されます。

PHYから大人Nematostella再生を研究する上で一つの課題、そして実際、他の切断部位から切り出した組織とのsa原基は、生体組織の様々明快です。 physaの電球がそのまま大人に比較的明確であるが、それが原因で切断後の組織収縮にむしろ不透明になります。クラリティは、徐々に(ステージ2)創傷閉じると(ステージ1)を返し、動物は拡大が開始されるが、その後も組織や構造は積極的にやや密な組織(特にステージ3)によって隠さ遺跡を再生している創傷部位の周囲の領域。増加したインフレ率は、通常、光明確に続いて、ステージ4と5の固定がほぼ確実経口最後に何が起こっているかを解決するが、より有益になります付属のライブであってもよいし、蛍光を監視し、より簡単に、15を可視化することができる組織特異的トランスジェニック記者25-30。

それは(消化腺を抱い)触手、口や腸間膜を欠いているので、切断physaは明らかにこのようrequiが、フィードすることはできません行方不明の身体構造のリング再生は非食料源からの栄養引当金を動員することによって達成されます。潜在的にこれを達成することができるphysaは、細胞質、細胞小器官および他の細胞成分は、細胞内に包まと同化プロセス31-33のためのエネルギーと化合物を生成するリソソーム依存性機構によって処理される、オートファジーによるものです。リソソーム阻害剤でphysaの治療、クロロキンは、オートファジーは、経口および身体構造の通常の再生に必要であることを示す、腸間膜と触手の異常な再生、および一般的な身体の形態を引き起こすことを私たちを見つけます。オートファジーは、細胞の機能34-36幹調節し、プラナリア、 ヒドラで再生に重要な役割を果たしており、ゼブラフィッシュ37-41。さらなる分析は、オートファジーは、細胞および分子レベルでNematostella再生に影響を与えるが、私たちの最初のパスの実験はNRを使用しての有用性を示しているかを理解するために必要とされます再生に影響を与える可能性のある小分子のための高速スクリーニング法としてSS。

Nematostellaで再生を制御する、分子遺伝学および細胞プロセスは、理解の初歩的な段階にあるが、再生のため、この緊急モデルは、ゲノムや遺伝子発現解析のためのツールの成長のレパートリーを持っています。その注釈付きのゲノム、地域や組織特異的遺伝子マーカーの過多、および遺伝子組換え、突然変異誘発、組織学および顕微鏡検査のための堅牢な方法では、Nematostellaは花虫綱刺胞動物門の再生を支配するメカニズムを明らかにし、その再生過程は、刺胞動物と後生動物間で類似または一意であるかどうかを明らかにすることを約束します一般に。

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Acknowledgements

この作品は、GHTにニューヨーク幹細胞科学(NYSTEM C028107)グラントによってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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