Измерение Жесткость

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Артериальная жесткость является существенным фактором риска и биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и признаком старения. Методами атомно - силовой микроскопии (AFM) является универсальным аналитическим инструментом для определения характеристик вязкоупругих механических свойств для различных материалов , начиная от жестких (пластик, стекло, металл и т.д.) поверхности для ячеек на любой подложке. Он широко используется для измерения жесткости клеток, но реже используются для измерения жесткости аорте. В этой статье мы опишем процедуры использования AFM в режиме контакта для измерения ех естественных условиях модуль упругости незагруженных артерий мыши. Мы опишем нашу процедуру для изоляции аорте мыши, а затем предоставить подробную информацию для анализа AFM. Это включает в себя шаг за шагом инструкции для выравнивания лазерного луча, калибровка жесткость пружины и чувствительности отклонения зонда АСМ, и приобретение кривых силы. Мы также предоставляем подробный протокол для Analy данныхлиз кривых силы.

Protocol

Работа для животных в этом исследовании была одобрена Institutional животных по уходу и использованию комитетов Университета Пенсильвании. Методы были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. Подготовка мыши и выделение аорте

  1. Обезболить мышь с кетамином (80 - 100 мг / кг), ксилазина (8 - 10 мг / кг) и ацепромазина (1 - 2 мг / кг) внутрибрюшинно. Подтвердите наркоз с помощью теста хвоста пинч. После того, как мышь полностью под наркозом, эвтаназии мышь шейки дислокации.
  2. Поместите мышь на его спине и прикрепить мышь к рассечение борту. Очистите область живота с 70% (об / об) этанола салфетки.
  3. Сожмите кожу в средней линии и сделать небольшой первоначальный надрез среднего размера микрохирургических ножницами в животе. Удерживая кожу щипцами, используйте среднего размера микрохирургические ножницы, чтобы разрезать кожу и брюшину от живота к грудине.
  4. Срежьте ребра на бПр стороны с средними микрохирургических ножницами. Осторожно удалите легкие и печень с небольшими размерами микрохирургических ножницами, и оставить сердце и аорту. Перенесите мышь и рассечение доску рассекает микроскопом.
  5. Возьмитесь жир, окружающий аорту с мелкими пинцетом и использовать маленькие ножницы, чтобы тщательно срезать жир вокруг аорты.
  6. Осторожно захватить аорту пинцетом, разрезайте с небольшими размерами микрохирургических ножницами в начале восходящей аорты и другой разрез в конце нисходящей аорты, как раз над брюшной аорты.
  7. Передача расчлененный аорту на 60-мм чашку, содержащую 1x фосфатно-солевой буфер (PBS, без кальция и магния).
  8. Продолжайте отсечь все оставшиеся жировой ткани от аорты с использованием небольших размеров микрохирургические ножницы. Используйте маленькие ножницы, чтобы открыть аорту в продольном направлении.
  9. Использование небольших размеров микрохирургические ножницы, чтобы вырезать небольшой кусочек (~ 2 х 4 мм) нисходящей аорты и aortiс аркой для анализа AFM (Рисунок 1). Поместите ткань в пластиковую чашку 60 мм и держать его влажным в капле PBS.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Изображение , показывая на расположение различных сегментов в аорты Мыши Аорта была изолирована от сердца к диафрагме, и небольшая часть нисходящей аорты и дуги аорты были использованы для определения модулей упругости. Масштаб бар, 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Подготовка ткани Образцы для АСМ измерений

  1. Осторожно удалите PBS с помощью лабораторного протирать, не касаясь аорту. Будьте уверены, что полостную сторона ткани лицевой стороной вверх.
  2. Аккуратно приклеить каждый конец открытой аорте к пластине с помощью стандартного Инг 5 - 10 мкл цианакриловым клея с гелем-наливного наконечника (рисунок 2).
    Примечание: Количество клея необходимо , чтобы прочно прикрепить ткань на каждом конце должны быть определены эмпирически. Очень важно, что аорта не растягивается во время этого процесса.
  3. Проверьте приклеенную аорту, чтобы убедиться, что она не сложена или плавающая. После воздушной сушки клея на аорте (30 - 60 сек), осторожно добавить PBS и погрузить образец.
    Примечание: Подготовка АФМ (шаги 3 - 5) может быть осуществлено в то время как ткань подготавливается для анализа.

фигура 2
Рисунок 2: Мультфильм аортального сегмента наклеенных на блюдо культуры 60-мм с использованием Цианакрилатный клей Клей цианакриловый прикладывается к краю образца аорты в рамках подготовки к АСМ измерений..COM / файлы / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Загрузка Probe

  1. Установите держатель зонда жидкости на подставку датчика нагрузки.
  2. С помощью пинцета, слайд из нитрида кремния зонда АСМ (0,06 Н / м) зондовым с шаровым наконечником (мы использовали диаметр 1 мкм SiO 2 чэстиц но более крупные размеры также могут быть использованы) на держателе зонда. Убедитесь, что AFM зонд прочно прикреплен к держателю зонда.
  3. Сдвиньте держатель зонда на Z-сканера крепление головки AFM, и убедитесь, что держатель зонда надежно закреплен.

4. Выравнивание лазера на зонд

  1. Откройте программу AFM. Выберите тип эксперимента на программное обеспечение; Эксперимент Категория для контакта, режим экспериментальной группы в контактном режиме в жидкости и эксперимента в контактном режиме в жидкости. Нажмите Load ехрeriment в программном обеспечении; это включит лазер.
  2. Добавьте 3 мл дистиллированной воды до 50 мм со стеклянным дном тарелки и поместить в блюдо на стадии блока выравнивания лазера. Это устройство упрощает процесс фокусировки лазерного луча на обратной стороне кантилевера.
  3. Закрепите головку AFM в вертикальном положении на блок выравнивания лазера и мощности на блоке выравнивания лазера. Добавить приблизительно 50 мкл дистиллированной воды с образованием капли на кончике АФМ.
  4. С помощью джойстика, опустите голову AFM, таким образом наконечник AFM вступает в контакт с водой в чашке. Если контакт не сделан между наконечником и АФМ воды в блюдо, осторожно поднимите тарелку до контакта не предпринималась. Отрегулируйте фокус, яркость и положение XY, так что наконечник AFM в поле зрения на ЖК-дисплее устройства выравнивания.
  5. Установите лазерное пятно на кончик зонда АСМ, регулируя лазерное позиционирование ручки головки AFM. С помощью ручки позиционирования детектора на головке AFM, отрегулируйте Постулироватьиона фотодиода до значений между 0 и -1 V получены для вертикального отклонения и ~ 0 V получается для горизонтального отклонения.
  6. Проверьте, чтобы обеспечить сигнал лазера сумма максимальна. При необходимости, повторите шаг 4,5, чтобы повторно отрегулировать положение лазерного луча на кончике AFM и положением на фотодиод для получения максимального суммарного сигнала.
    Примечание: Может возникнуть необходимость изменить положение зонда АСМ на держателе зонда , чтобы получить максимальный суммарный сигнал , даже если шаг 4,5 повторяется.

5. Калибровка Прогиб чувствительности и жесткости пружины зонда АСМ

  1. Сделайте царапину на культуральной чашке 60 мм с и заполнить силы р блюдо с дистиллированной водой. Место культуры блюдо на держателе образца пластины. В этом случае, установите блюдо на стадии инвертированного микроскопа моторизованный XY сканирования.
  2. Поместите магнитный держатель пластин на верхней части пластины, чтобы держать его безопасным во время съемки.
  3. Нажмите Примечание: Этот шаг очень важен , поскольку он позволяет избежать разрушения наконечника AFM.
  4. Установите головку AFM на столике микроскопа.
  5. Используйте микроскоп, чтобы сосредоточиться на пустом месте на пластине. С помощью джойстика или нажмите стрелку "вниз" в меню навигации, медленно и осторожно опустите AFM зонд в PBS. Расположите голову чуть выше нуля в пластине.
    Примечание: Если начальное положение головки AFM ближе к образцу, то время заниматься будет значительно сокращен.
  6. Перед включением, повторно отрегулировать положение лазерного луча на кончике AFM и положением на фотодиод для получения максимального суммарного сигнала по мере необходимости.
  7. Выберите тип наконечника, нажав кнопку Изменить зонд в меню настройки. Нажмите кнопку Проверить параметры и установить параметры: Размер сканирования 0, скорость сканирования до 1 Гц, частота дискретизации / линии 256 и Прогиб заданного значения до 20 нм. Нажмите Engage. Engage Окно статуса будет оставаться открытым до тех пор, пока зонд вступает в контакт с поверхностью пластины. После привлечения зонда, нажмите Ramp.
  8. Нажмите кнопку Расширенный режим в меню панели инструментов сканирования и установить параметры: пандус Размер в диапазоне от 500 нм до 1 мкм, Ramp Rate 2 Гц, количество образцов 256, Совет радиус до 500 нм, коэффициент отбора проб Пуассона 0.5 (принимает материал чтобы измерить совершенно несжимаема), Совет Половина угла 0, режим триггера для относительного и порог срабатывания до от 20 до 100 нм.
  9. Нажмите Ramp Непрерывный в меню Ramp панели инструментов для obtaв силовой кривой на плате (фиг.3А). В этой силовой кривой, установите канал 1 для ошибки отклонения.
    Примечание: Это позволит программное обеспечение для графического результаты в виде вертикального отклонения против позиции г.
    1. Нажмите на левой или правой концах кривой силы и перетащите курсор , чтобы охватить линейную область силовой кривой (рис 3А, пунктирные красные линии). Используйте эти две линии, чтобы отметить границы наклонного региона быть в хорошей форме с прямой линией.
  10. Выберите Ramp в панели инструментов и нажмите кнопку Обновить чувствительность. Запишите значение и повторить этот шаг еще четыре раза. Выберите Калибровать на панели инструментов , а затем нажмите Detector. Входное среднее значение из пяти измерений в поле Прогиб чувствительности.
  11. Нажмите Вывод 2 - 3 раза , чтобы поднять голову AFM. Этот шаг важен для предотвращениявзаимодействие между зондом AFM и пластины во время процесса термического мелодией. Нажмите Термическое Настройтесь на панели инструментов.
  12. Установить Thermal Tune диапазоне 1 - 100 кГц (Эта информация может быть получена из каталога изготовителя) и величина отклонения чувствительности к коррекции 1.144 для V-образных кантилеверов и 1.106 для прямоугольных кантилеверов.
  13. В меню Thermal Tune, нажмите кнопку получения данных для получения тепловой кривой мелодия (рис 3B). С помощью программного обеспечения AFM, место красная пунктирные линии по обе стороны от кривой (как показано на фигуре 3В), перемещая мышь от края графика , чтобы определить границы для установки. Выберите либо Лоренцевы (Air) или простого гармонического осциллятора (Fluid) модель в зависимости от которой лучше соответствует данным.
  14. Нажмите Fit Data, а затем Вычислить Spring K и сохранить это значение. реторфа пружины калибровок несколько раз и использовать среднее значение. Нажмите Вывести несколько раз.
  15. Снимите головку AFM со сцены микроскопа и поместите его на блок выравнивания. Снимите блюдо из столика микроскопа.

Рисунок 3
Рисунок 3: Кривые AFM сила , используемая при калибровке AFM Probes. (А) представитель AFM силовой кривой (калибровочная кривая). Расширение часть силовой кривой между вертикальной красной пунктирной линии был использован для определения чувствительности кантилевера. (B) простой гармонической осциллятора подходят график , используемый для расчета жесткости пружины кантилевера , как описано выше 20. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть увеличенная версия этой фигуры.

Ex Vivo

  1. Поместите 60-мм культуры блюдо, содержащий аортальный ткани на столике микроскопа, и закрепите пластину с держателем магнитной пластины.
  2. Установите головку AFM на столике микроскопа. Убедитесь, что АФМ зонд не соприкасается с аортой, но осторожно, вступает в контакт с PBS и образует мениск. При необходимости, поместите головку AFM на блоке выравнивания и нажмите кнопку Вывод , пока не будет достаточно свободного пространства , чтобы предотвратить контакт, а затем поместите голову AFM на столике микроскопа.
  3. Нажмите Navigate. С помощью джойстика или нажав "вниз" стрелку, медленно опустите AFM зонд , чтобы определить местонахождение кантилевера над аортой. Отрегулируйте положение фотодиод с помощью позиционирования детектора ручки на головке AFM в случае необходимости.
  4. Нажмите Engage , чтобы кантилевер , чтобы вступить в контакт с аортой.
  5. Однаждыаорта занимается, убедитесь , что пьезоэлектрический центр является стабильным и нажмите Ramp. Если пьезоэлектрический центр колеблется, это может быть результатом ложного зацепления. Вытащите щуп и увеличить вертикальное смещение лазера на фотодиод малыми приращениями (~ 0,5 В) и вновь вступить в бой.
    1. Кроме того, если зонд находится далеко над поверхностью образца, вручную опустить зонд ближе к поверхности образца до повторного зацепления. Если предыдущие шаги не устраняют колебания, попробуйте замены зонда.
  6. Установите Ramp размер до 3 мкм, триггерный режим с относительными и порога срабатывания до 100 нм и нажмите Ramp Непрерывный. Заметим, что точка контакта между зондом и образцом происходит приблизительно в центре к нижнему ¾ цикла Z рампы. Если этого не наблюдается, абстрагироваться от образца, регулировать размер Ramp по мере необходимости, и повторно включите образец.
  7. Нажмите Микроскоп в строке меню , а затем Engage Settings. Изменение SPM Вывод до 30 мкм. Нажмите Ramp Непрерывный в меню Ramp панели инструментов.
  8. После наблюдения за силовой кривой, нажмите кнопку Захват в строке меню , а затем захват файла. Введите нужное имя файла с окончанием ".000" (это позволит дополнительно захваченные файлы к увеличению числа на 1). Выберите обозначенную-папку и сохранить данные.
  9. Нажмите Capture в меню панели инструментов Capture. Нажмите Вывод и затем Navigate. С помощью джойстика или управления программного обеспечения для позиционирования кантилевера над другой участок аорты (рядом с первоначально измеренной точки, см рисунок 4).
  10. Нажмите Engage, Ramp и Ramp Непрерывный, соответственно. После наблюдения за силовой кривой, нажмите кнопку Остановить Capture.
  11. Повторите шаги 6.9 - 6.10. Захват по меньшей мере , 5 измерений в области , как показано на рисунке 4 Примечание: Как правило , мы собираем 15 - 25 кривых силу с 3 - 5 разных местах в каждой ткани , как показано на рисунке 4, соответственно..

Рисунок 4
. Рисунок 4: Мультфильм кантилевера Приближаясь и отступов ткани (область 1) Это измерение AFM повторяется до 15 - 25 раз от 3 - 5 разных местах (зоны 1 - 5) в каждой артерии , чтобы получить жесткость общая образец ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

7. Анализ данных

  1. Открытая сила анализ кривой программного обеспечения.
  2. ClИк Найдите и откройте в строке меню, и дважды щелкните на файле для анализа.
  3. Нажмите Изменить параметры Force в меню панели инструментов , чтобы проверить чувствительность отклонения, пружины, кончик радиуса, кончик половинный угол и коэффициент Пуассона. Для изменения параметров установите флажок рядом с ним и введите правильные значения в новом столбце значений. Затем нажмите кнопку Выполнить.
  4. Если силовые кривые шумные, нажмите Boxcar фильтр и установить входы для направления Продлить Средние очки 3 и порядок фильтров до 0 - го. Нажмите Выполнить для сглаживания данных.
  5. Нажмите коррекции базовой линии в строке меню и установить входы для направления для того чтобы расширить, участок земли единиц к силе, Тип для разделения, коррекция для того , чтобы 1 - го и расширение основной источник Выполнить.
  6. Нажмите отступа в меню панели инструментов и установите входы для активной кривой до Extended, подходящего метода для контакта координаты точки, координаты контактного алгоритма для лечения , как Fit переменной, Включить силы адгезии к Нет, Макс Force Fit границы до 30%, Min Force Fit границы до 0% и Fit Модель для Герца (сферическая).
    Примечание: В наших измерениях, редко наблюдается значительное сцепление между зондом и образцом (отрицательное отклонение кантилевера на кривой обратного хода). В тех случаях , когда наблюдается такая адгезия, соответствующая модель (DMT или ДКР) следует использовать для анализа 18,19.
  7. Сохраните значения модуля Юнга. Анализировать (эластичный) модуль Юнга каждого из 3- 5 областей (5 силовых кривых на единицу площади) , принятые в пределах небольшого расстояния друг от друга , как показано на рисунке 4.
    Примечание: Чтобы удалить артефакты, исключить модули Юнга> 100 кПа (обычно ~ 10% от общего числа измерений) из анализа.
  8. Вычислить среднее значение модуля Юнга для каждого из 3 - 5 областей (которые были измерены) и использовать эти значения для вычисления среднего значения модуля упругости для аорты в целом.
    Примечание: По крайней мере , 3 и чаще 4 - 6 используются отдельные Аорты для получения точной оценки артериальной жесткости. Окончательные результаты представлены в виде среднего значения + SEM из "п" независимых экспериментов. Точное количество необходимых аорте будет, конечно, зависеть от уровня требуемой точности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На фиг.5А показан фазовый контраст изображения нисходящей (грудной) аорты от 6 месяцев, самцы C57BL / 6 мыши. Консольная AFM находится в месте непосредственно над тканью и готовы к выемке. На рисунках 5В и демонстрируют типичные кривые силы , полученные с помощью AFM отступа в контактном режиме. Зеленые линии , показанные на фигурах 5В и представляют лучшие кривые подходят , полученные с использованием модели Герца для сферы. На рисунке 5d, средняя жесткость нисходящей аорте и дуги аорты были определены из трех отдельных мышей , как описано в тексте. Обратите внимание, что нисходящая аорта и дуги аорты представляют собой области ламинарного и возмущенного потока, соответственно. Тем не менее, их (механически выгрузили) модули упругости похожи, как определено AFM.

0 / 54630fig5.jpg "/>
Рисунок 5: Кривые анализируемом Force-отступов и Жесткость (А) фазового контраста данных микрофотография , показывающая кантилевера AFM над мышью нисходящей аорте ех естественных условиях.. Масштаб бар, 100 мкм. (BC) Набор из двух репрезентативных кривых сила-отступов , приобретенных для (B) нисходящей аорты и (С) дуги аорты. (D) Средняя жесткость мыши нисходящей аорты и дуги аорты была определена как описано выше. Столбики ошибок показывают среднее + SEM; п = 3 независимых биологических повторностей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

АФМ отступа может быть использован для характеристики жесткости (модуль упругости) клеток и тканей. В этой статье мы приводим подробные шаг за шагом протоколов для изоляции нисходящей аорты и дуги аорты у мышей и определяют модули упругости этих артериальных регионов бывших естественных условиях. Теперь мы подвести итоги и обсудить технические проблемы и ограничения метода, описанного в этой статье.

Некоторые технические проблемы могут возникнуть в выделении и анализе аорте мышей, учитывая их маленький и тонкий характер. Когда убираются артерии открываются в продольном направлении, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не нарушить интиму (полостную поверхность), где собраны данные модуля упругости. Избыток PBS в конечном образце блюдо препятствует правильному склеивание артерий на блюдо, и это необходимо тщательно удалить с помощью бумажной салфетки, не касаясь артерии перед склеиванием. Однако следует отметить, что изолированная артерия может прилипнуть к WHI папиросной бумагиле попытке удаления избытка PBS, и это может привести к повреждению образца. В то время как склеивание артерии к культуре блюдо, чрезвычайно важно, что артерии не растягивается и что только небольшое количество клея применяется бит за битом, чтобы каждый конец артерии. При выполнении AFM-отступы, крайне важно, чтобы избежать зондирования на концах артерии, где была применена клей. И наконец, так как только что выделенные артерии используются для измерения модуля упругости, время, прошедшее с момента уборки до измерения должны быть сведены к минимуму.

Так как сферические наконечники, используемые в этом исследовании, имеют радиус 500 нм, глубиной вдавливания до 500 нм может быть точно проанализированы с использованием модели Герца. Эта глубина вдавливания будет коррелировать с верхним слоем эндотелиальных клеток , расположенных в интиме 21. Для того, чтобы исследовать механику суб-эндотелиальной слоев артериальных образцов, более крупные коллоидные зонды (10 - 20 мкм в диаметре) могут быть использованыдля отступов и изменений в расчетной жесткости с глубиной отступа может быть определена 22,23. Кроме того , так как биологические образцы, как правило , вязкоупругого , а не чисто упругим, измерения релаксации напряжений ( с измерением затухания в приложенной силы на постоянной глубине отступа) может быть использован для определения вязкой компоненты артериальных механических свойств 24,25.

Потенциальным ограничением анализа AFM является размер участка сканирования, которая измеряет только малую область ткани. Большинство биологических образцов, в том числе артерий и клеток, не топографически и биомеханические однородными, и эта неоднородность потенциально может привести к artifactually иметь место изменение модуля упругости в зависимости от гладкости участка вдавливания, глубину вдавливания, и величина силы, приложенной к образцу поверхность. Чтобы получить представительную среднее значение общего модуля упругости, важно выполнить повторное АФМ-отступомт несколько случайных местах через артерии, как показано на рисунке 4. Кроме того, мы используем соответствующего размера сферического наконечника, как и предыдущие исследования показали , что АФМ-отступы с острым наконечником пирамидальной привело к росту оценок модуля упругости и повреждения мягких биологические образцы 26,27.

Даже если наши бывшие естественных условиях измерения AFM артериальной жесткости , по всей видимости , хорошо согласуются с молекулярными маркерами гладких мышечных клеток жесткости 2, важно понимать , что эти артериальные образцы механически не загружены, и механические нагрузки, вероятно, играют важную роль в целом артериальные механика. Сравнения жесткости артерий, определяемые AFM, миографии (бывший естественных условиях метод совместим с механической нагрузкой) 28 и скорости пульсовой волны (измерении в естественных условиях артериальной жесткости) 29, скорее всего , обеспечит наиболее полное представление о ArterIAL механика.

Мы описали AFM в контактном режиме для измерения ех естественных условиях жесткости артерий мыши. Этот метод оценивает среднюю жесткость ткани путем случайного отступов на несколько зон аорты. Для изучения пространственного распределения жесткости из больших областей тканей, в последнее время бумага используется AFM в режиме форс-громкости 30. Такой подход одновременно получили карту вариаций жесткости и высокой разрешающей способностью изображение топографической поверхности ткани. Помимо измерения жесткости образцов тканей, АФМ в режиме силы объема можно использовать в клетках , чтобы контролировать пространственное распределение внутриклеточного жесткости 10,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. e3733 (2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics