Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México
Published 10/21/2016
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Biochemistry

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Summary

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

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Gijsbers, A., Nishigaki, T., Sánchez-Puig, N. Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54640, doi:10.3791/54640 (2016).

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Abstract

interacções proteína-proteína desempenham um papel fundamental na função de um organismo vivo. Uma vez que uma interacção tem sido identificadas e validadas, é necessário caracterizar-la ao nível estrutural e mecânica. Existem vários métodos bioquímicas e biofísicas para tal finalidade. Entre eles, Anisotropia de fluorescência é uma técnica poderosa particularmente utilizado quando a intensidade de fluorescência de uma proteína marcada com fluoróforo permanece constante após a interacção proteína-proteína. Nesta técnica, uma proteína marcado com fluoróforo é animado com luz polarizada verticalmente de um comprimento de onda apropriado que excita selectivamente um subconjunto dos fluoróforos de acordo com a sua orientação em relação com o feixe de entrada. A emissão resultante também tem uma direcionalidade cujo relacionamento nos planos vertical e horizontal define anisotropia (r) como segue: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), onde eu VV e eu

Introduction

As células contêm um grande número de biomacromoléculas constantemente que interagem uns com os outros. Esta associação dá origem a complexos que participam nas vias celulares responsáveis ​​para o seu funcionamento na transdução de sinal, a regulação da expressão do gene e a migração de células, entre outros. Todas as interacções proteína-proteína que ocorrem numa célula compreendem uma rede conhecida como a interactoma. Em Saccharomyces cerevisiae foram mostrados mais do que 70% das suas proteínas de ter parceiros interactuantes 1. Compreender o interactome de uma célula e suas funções fornecem informações relevantes sobre a complexidade e diversidade dos organismos vivos. Várias metodologias têm sido descritos para identificar e caracterizar as interacções proteína-proteína. Diferente alta através de métodos colocados como a levedura de dois híbridos 2, ensaios de complementação de proteína-fragmento de 3, 4 purificação por afinidade acoplada a espectrometria de massa e microarra proteínays são utilizados para identificar uma interacção 5,6. Uma vez identificado, é necessário para a sua validação e pode variar numa base de caso-a-caso. Tipicamente, estas experiências envolvem interromper a interacção si ao nível dos membros individuais do par de interacção, por exemplo, por deleção do gene ou a superexpressão de uma das proteínas, e, em seguida, à procura de mudanças nas propriedades ou a função do outro membro do nível celular. Subsequentemente, as técnicas biofísicas 7 são usados para caracterizar a interacção proteína-proteína, a nível molecular. Para este fim, a estrutura dos complexos de proteína são determinadas por cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e microscopia crio-electrões enquanto calorimetria e espectroscopia de fluorescência são usadas para quantitativamente e mecanisticamente os descrever.

Neste trabalho, Anisotropia de fluorescência foi usada como uma técnica para caracterizar a interacção entre a GTPase EFL1 e SBDproteína S. Estas proteínas participam na síntese de ribossomas, promovendo a libertação do factor de iniciação eucariótico 6 a partir da superfície das subunidade ribossomal 60S 8. A proteína SBDS está mutado em uma doença conhecida como síndrome de Shwachman- diamante 9 e actua como um factor de troca do nucleótido guanina para EFL1 diminuindo a sua afinidade para o difosfato de guanosina 10,11. mutações doença em SBDS abolir a interação com EFL1 e, assim, evitar a sua activação.

Anisotropia de fluorescência é comumente utilizado em aplicações biológicas para estudar proteína-péptido ou interacções proteína-ácido nucleico. Baseia-se no princípio de que um fluoróforo excitado com resultados de luz polarizada em uma emissão parcialmente polarizado. anisotropia de fluorescência é definido pela Equação 1:

equação1

onde VV e VH são osintensidades de fluorescência da vertical (VV) e horizontal (VH) polarizado emissão quando a amostra está animado com verticalmente luz polarizada 12. Anisotropia de fluorescência é sensível a factores que afectam a taxa de difusão de rotação do fluororo e, portanto, depende da temperatura, da viscosidade da solução e o tamanho molecular aparente do fluoróforo. O tamanho aparente de uma proteína que contém um fluoróforo aumenta quando ele interage com uma outra proteína e em seguida, tal mudança pode ser avaliada como uma alteração na anisotropia. Mais especificamente, um fluoróforo, que roda lentamente em solução em relação ao seu tempo de vida de fluorescência terá um grande valor I VV e o valor pequeno I VH e, por conseguinte, irá apresentar uma relativamente grande anisotropia. Para fluoróforos que caem rapidamente em relação ao seu tempo de vida de fluorescência, eu VV e VH I será semelhante eo seu valor de anisotropia será pequeno 12 (Figura 1). Além disso, para um bom sinal de anisotropia para medição de ruído, é necessário ter um fluoróforo com um tempo de vida de fluorescência similar ao tempo de correlação rotacional da molécula de interesse. Caso contrário, não é possível registar com precisão a diferença de anisotropia entre a proteína livre e que, no complexo. Por exemplo, a anisotropia de uma sonda fluorescente, com um tempo de vida perto de 4 ns, tais como fluoresceína ou rodamina ligados a um composto de baixo peso molecular de 100 Da é 0,05. A ligação a uma molécula de 160 kDa vai aumentar o seu valor de anisotropia de 0,29; uma diferença que pode ser medido com precisão. Em contraste, a mesma sonda fluorescente envolvido numa reacção de ligação cuja aumento no tamanho molecular varia de 65 a 1000 kDa só vai resultar numa alteração de anisotropia de 0,28 a 0,3, o que é demasiado pequeno para ser medido com precisão. Neste cenário, uma sonda com uma vida útil de 400 nanossegundos seria mais adequado 12.


Figura 1. Representação esquemática do equipamento utilizado para medir a anisotropia de fluorescência e o procedimento. Representação esquemática do equipamento utilizado para realizar uma medição de fluorescência anisotropia experimento interacção proteína-proteína. Fluoróforos que caem rápido pequena anisotropia de exibição que aumenta após ligação a um parceiro de interação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

aplicações de fluorescência requerem a presença de um fluoróforo em qualquer uma das moléculas estudadas. Para estudar as interacções proteína-proteína, existem três tipos de fluoróforos: 1) os resíduos de triptofano presentes nas proteínas, 2) fluoróforos ligados quimicamente e 3) parceiros de fusão fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) e a sua derivativas. A maioria das proteínas têm resíduos de triptofano na sua estrutura, portanto, a forma mais fácil de medir uma interacção é através da monitorização das alterações na espectros de fluorescência correspondente ou por monitorização das alterações na intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. No entanto, os resíduos de triptofano podem estar presentes em ambas as proteínas que complicam a análise. Por outro lado, para um fluoróforo para alterar as suas propriedades fluorescentes, devido a uma interacção precisa de ser localizado em ou perto do local de ligação e que poderia interferir com a própria interacção. Este precisa de atenção especial quando se utiliza fluoróforos volumosos, como GFP Se nenhum destes fluoróforos podem ser utilizados para estudos de ligação é necessário, em seguida, introduzir fluoróforos extrínsecos ao uma das proteínas envolvidas. Existem muitos fluoróforos quimicamente sintetizados e podem ser ligados covalentemente a proteínas através dos seus grupos reactivos tais como os grupos amina da cadeia lateral (de lisinas ou no terminal N) e os grupos tiol na cisteína. Fderivados luorophore com ésteres de succinimidilo e isotiocianato de reagir com grupos de amida, enquanto a iodoacetamida e maleimida são grupos 13-tiol reactivos. Os corantes mais comuns usados ​​em aplicações de fluorescência são derivados da fluoresceína e rodamina os corantes verdes, cumarinas, e corantes BODIPY fluoróforos Alexa Fluor. Uma lista detalhada de fluoróforos disponíveis comercialmente e a sua utilização pode ser encontrada em referências 14,15. Para a marcação com êxito, o grupo reactivo deve ser expostos na superfície da proteína, mas, devido ao grande número de grupos funcionais reactivos, tipicamente presentes em polipéptidos, é muito difícil conseguir a modificação específica do local. A proteína de interesse neste estudo, SBDS, contém 5 cisteínas livres e 33 lisinas que podem resultar na marcação de vários sites. rotulagem não uniforme pode afectar a ligação e vai complicar a análise de dados como moléculas fluoróforo diferentes podem provocar diferentes sinais de intensidade de fluorescência após a ligação. para overcome esse problema, foi utilizado o fluoróforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína com o selo de site direto da proteína SBDS. Este é um corante arsenoxide com uma elevada afinidade para quatro cisteínas espaçadas num motivo conhecido como FLASH-tag que consiste na sequência de CCXXCC onde X é qualquer aminoácido excepto cisteína 16,17. Este motivo tetraciste�a é adicionado à extremidade N ou C-terminal da proteína através da engenharia genética juntamente com um ligante apropriado para evitar o rompimento da dobragem global da proteína. O par constituído por corante flash e-tag foi originalmente concebido para proteínas de etiquetas específicas do local em células 17 que vivem, mas também pode ser usado para rotular proteínas purificadas in vitro, como é exemplificado aqui. Além disso, as estratégias enzimáticas também têm sido desenvolvidos para permitir a funcionalização do local específico de proteínas 18.

Nesse artigo, procuramos descrever a utilidade da fluorescência anisotropia umferramenta sa para estudar as interações proteína-proteína. A ligação pode ser avaliada através de uma simples inspecção da forma da curva de ligação enquanto que a informação quantitativa pode ser obtida a partir do ajuste dos dados experimentais.

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Protocol

1. SBDS-flash Expressão Tag e purificação de proteínas

NOTA: Para as experiências de anisotropia, uma FLASH-tag que corresponde à sequência Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys foram adicionados ao C-terminal da sequência de codificação SBDS humanos por PCR Esta construção foi subclonado no vector de expressão pRSET-A e transformada em células C41 de Escherichia coli para expressar uma proteína que codifica uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal (His-tag), as SBDS humanos e uma sequência C-terminal 10 Flash tag de codificação.

  1. A expressão da proteína SBDS-flash
    1. Transformar E. competente coli C41 com o plasmídeo pRSET-HisSBDS-flash usando um protocolo de choque térmico padrão de 19. Placa as células em meios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. LB composição meio sólido consiste em 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levedura, 10 g de triptona e 20 g de agar para o volume de 1 litro.
    2. Culturas de bactérias transformadas a 37 ° C atéabsorvância a 600 nm (A 600) atinge 0,5-0,7 em 1 L de meio líquido LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina.
    3. Induzir a expressão da proteína por adição de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido para a cultura e a incubação continua durante mais 5 h.
    4. Recolha a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas.
  2. Purificação de proteínas SBDS-flash
    NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de cromatografia líquida (FPLC) de proteína rápida ou uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni 2+ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 ml. cromatografia de troca aniônica usa um 5 ml forte coluna de permutador de sulfopropil cação. Uma taxa de fluxo de 3 ml / min foi usado para todos os passos cromatográficos.
    1. Ressuspender as células em 35 ml de lise b SBDSpode ser prejudicado (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado com fluoreto de 1 mM de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e lise por sonicação durante um tempo total de 4 minutos com ciclos de 10 segundos ligado e 30 segundos desligado, a 4 ° C.
    2. Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.
    3. Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares.
    4. Equilibrar a coluna de afinidade de Ni 2+ com 3 volumes de coluna (CV) de tampão de lise e SBDS introduzir a totalidade clarificada sobrenadante na coluna.
    5. Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise SBDS e eluir com 3 CV de tampão de eluição SBDS (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM).
    6. Dilui-se a proteína 6 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM pH 6,5 e remover possíveis agregados por filtração através de uma membrana de celulose de 0,22 um.
    7. Equilibrar a coluna sulfopropil cátion trocador com 3 CV de baixo teor de sal coluna Stampão (tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introduzir a amostra de proteína a partir do passo anterior.
    8. Lave o material não ligado com 3 CV de tampão de baixo teor de sal coluna de S e elui-se a proteína num único passo, com tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 1 M.
    9. Dilui-se a proteína de 3,3 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM de pH 6,5. Concentra-se a proteína com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazená-lo a -80 ° C até à sua utilização.
    10. Verifique a pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie 20.

2. EFL1 Protein Expression and Purification

NOTA: EFL1 foi expressa sob a regulação da Gal 1/10 promotor divergente 21 e o Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR no pRS426 vetor. A proteína recombinante codifica a isoforma humana EFL1 1 fundido com uma protease de vírus do tabaco Etch (TEV) local de reconhecimento e um tag de hexa-histidina na extremidade C-terminal.

  1. A expressão da proteína EFL1
    1. Transformar S. células cerevisiae BCY123 com o plasmídeo pRS426-EFL1TevHis utilizando um protocolo de acetato de lítio padrão 22. Placa todas as células transformadas em queda para fora sintético sem uracilo meios (SD-URA) suplementado com 2% (w / v) de glucose. Composição dos meios SD-URA consiste de 8 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, casaminoácidos 11 g, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, leucina 60 mg e 60 mg de triptofano para o volume de 1 litro.
    2. Cultura de levedura transformadas a 30 ° C até 600 um atinge 1,8 em 1 L de meio SD-URA suplementado com 0,5% (w / v) de glucose.
    3. Induzir a expressão da proteína por adição de 2,8% de galactose (v / w) para a cultura e a incubação continua durante mais 18 h a 30 ° C.
    4. Recolha a suspensão de levedura por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas.
  2. Purificação de proteínas EFL1
    NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de FPLC ou de uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni 2+ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 mL a uma taxa de fluxo de 3 mL / min. A cromatografia de exclusão de tamanho usa uma coluna de 125 ml de pré-embalada com resina Superdex 200 com um caudal de 1 ml / min.
    1. Ressuspender as células em 50 ml de EFL1 tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, MgCl 5 2, 10% glicerol) suplementado com PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM e à dissociação das células por atrito sobre um batedor de grânulo usando esferas de vidro (o = 0,5 mm) durante um tempo total de 6 min, utilizando ciclos de 2 minutos a 15 minutos e DESLIGADO, a 4 ° C.
    2. Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.
    3. Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares. Equilibrar a coluna de afinidade de Ni 2+ com 3 CV de tampão de lise e EFL1 introduzir todo o sobrenadante clarificado numa coluna.
    4. Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise EFL1 e eluir com 3 CV de tampão de eluição EFL1 (50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl 2 5, 10% de glicerol).
    5. Equilibrar a coluna de exclusão de tamanho, com 1,5 VC de tampão de anisotropia (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, MgCl 2 5, 10% de glicerol, 5 mM de β-mercaptoetanol).
    6. Concentra-se a 1 ml da proteína EFL1 eluído a partir da coluna de afinidade de Ni 2+ com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg para o volume desejado. Introduzir a amostra na coluna de exclusão de tamanho.
    7. Recolha a proteína eluida e concentra-se por ultrafiltração até uma concentração final de cerca de 30 uM. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Verifique the pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie 20.

3. Rotulagem de SBDS-flash com o flash corante fluorescente 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Fluoresceína

  1. Misturar 3 nmol de proteína SBDS-flash com 3 nmol do 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) corante f luoresceína em volume de 5 ul de tampão de anisotropia.
  2. Deixe a reacção prosseguir durante 8 horas a 4 ° C. Diálise da amostra contra tampão Anisotropy durante a noite para remover o corante livre.
  3. Usar a lei de Lambert-Beer para quantificar a% de proteína marcada. Medir a absorvância a 280 nm e 508 nm num espectrofotómetro usando uma cuveta de quartzo de volume apropriado. NOTA: Considere os seguintes coeficientes de absorção molar (M -1 cm -1):
    Equation1B
  4. Calcular a concentração de proteína SBDS-flash marcado usando a Equação 2.
    Equation2
  5. Calcular a concentração de proteína total SBDS usando a Equação 3, substituindo o calculado C SBDS-flash a partir do passo anterior.
    Equation3
  6. Calcular a percentagem de proteína marcada usando a Equação 4.
    Equation4

4. Experiências de Anisotropia de fluorescência

NOTA: Anisotropia experiências foram feitas em um espectros luorómetro equipado com uma caixa de ferramentas de polarização e recolha de dados foi realizada utilizando o programa de anisotropia fornecida no software do equipamento. O comprimento de onda de excitação foi fixado em 494 nm com uma largura de banda espectral de 8 nm e a emissão foi registada utilizando um filtro passa-banda de 530 ± 25 nm. As medições foram realizadas a 25 ° C em 200 ul de uma cuvete com um comprimento do percurso 10 5 milímetros.

  1. Em uma tina de fluorescência, coloque 200 mL de 30 nm SBDS flashes em tampão anisotropia e titular 2 ul de EFL1 30? M. Misture bem e deixe a reacção repousar durante 3 min antes de medir o valor de anisotropia.
  2. Repetir o passo 4.1 até um volume total de 40 ul de EFL1 foi adicionado.

Análise 5. Os dados

  1. Ajustar os dados para o modelo de encadernação adequada usando um algoritmo de regressão por mínimos quadrados não-linear. As equações para os modelos mais comuns de ligação são apresentados na Tabela 1.
  2. Avaliar o melhor modelo que descreve a interação entre as proteínas inspecionando os resíduos do ajuste 23. Apoiar o modelo escolhido com experimentos adicionais.

Tabela 1. Modelos de ligação comum de interação proteína-proteína e as equações matemáticas que os descrevem.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
tabela 1

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Representative Results

Para realizar qualquer experiência anisotropia é importante para descartar grandes mudanças na intensidade de fluorescência do fluoróforo uma vez que a anisotropia observada de uma mistura de espécies é representado pela Equação 5:

Equation5

onde F i representa a fluorescência fraccionada de cada componente e r i é a anisotropia correspondente. A fluorescência fraccionada de cada componente depende de ambas, a sua concentração e a sua fluorescência relativa, a qual é definida pela Equação 6:

Equation6

em que X i representa a fracção molar de the i th espécie e Ø i é o rendimento quântico do i th espécie.

Assim, se a intensidade de fluorescência muda dramaticamente ao longo da titulação é melhor, quer medir a formação do complexo como uma função da alteração no sinal da fluorescência e não do sinal de anisotropia, ou corrigir o valor da anisotropia observadas por encaixe, tanto a intensidade da fluorescência e da anisotropia dados. A fluorescência de SBDS-flash muda não perceptível após ligação a EFL1 (Figura 2), sugerindo que a anisotropia de fluorescência é adequado para a medição da ligação entre as duas proteínas.

Figura 2
Figura 2. A emissão de fluorescência de SBDS-flash com titulação de concentrações crescentes de EFL1. As alterações na emissão de fluorescência do fluoróforo são negligible e aleatória ao longo da titulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um exemplo da fluorescência curva obtida a partir da titulação do EFL1 para SBDS-flash ligação anisotropia é mostrado na Figura 3. Qualitativamente, a forma do gráfico mostra claramente que as duas proteínas interagem como evidenciado por um aumento no sinal de anisotropia por adição de EFL1. Além disso, os valores de anisotropia atingido um patamar sugerindo que, no final da titulação toda a proteína SBDS-flash estava presente num complexo com EFL1. É possível, então, para descrever quantitativamente a interação entre essas proteínas e ajustar os dados usando mínimos quadrados não linear de regressão a um modelo de ligação presumido e obter a dissociação correspondente constante de equilíbrio. Montagem de um modelo de local de ligação que não gostaram aprodiatamente descrever os dados experimentais (Figura 3A). Isto é evidente não só do traço encaixe na curva de ligação, mas também de os desvios dos resíduos do ajuste (a diferença entre os dados teóricos e experimentais) que são significativos e não aleatória. Isto concorda bem com o facto de um único modelo de local de ligação é descrito matematicamente por uma curva hiperbólica e não uma curva sigmoidal que a observada para os dados experimentais apresentados na Figura 3. Por outro lado, os modelos, tais como dois idênticos ou dois de ligação diferente sites de descrever melhor os dados experimentais e os resíduos do show ajuste nenhum desvio sistemático apoiar um modelo de associação de dois locais (Figura 3B-C). Na ausência de qualquer outra informação experimental é difícil determinar qual dos dois modelos corresponder ao mecanismo de ligação entre EFL1 e SBDS. No entanto, SBDS e EFL1 são ambas proteínas monoméricas, por isso é difficult prever um modelo de dois locais de ligação idênticos.

Figura 3
. Figura isotérmica de ligação 3. Fluorescência anisotropia da interação entre EFL1 e SBDS-flash A linha contínua em cada uma das parcelas superiores corresponde ao ajuste dos dados para diferentes modelos de ligação: (A) em um único local, (B) dois locais idênticos e (C) dois locais não idênticos. Parcelas inferiores representam os resíduos do ajuste com o modelo correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A maioria das experiências bioquímicas com proteínas requerem não só proteína pura, mas também uma grande quantidade deles, independentemente da técnica utilizada. Por esta razão, as proteínas utilizadas para este tipo de experiências são obtidos por expressão heteróloga, como era o caso aqui apresentado. espectroscopia de fluorescência requer a presença de um fluoróforo na molécula estudada. resíduos aromáticos constituem os fluoróforos intrínsecas de uma proteína, no entanto, utilizando o seu sinal para estudar as interacções proteína-proteína complica a análise uma vez que são comuns à maioria das proteínas e estaria presente em ambos, a proteína do receptor e do ligando. Além disso, o tempo de vida de triptofano é muito curta para experimentos de fluorescência de anisotropia. Por esta razão, é comum adicionar fluoróforos extrínsecos para uma das proteínas estudadas. Para este fim, um fluoróforo foi adicionada à extremidade C-terminal de SBDS através de uma ligação de coordenação entre o corante 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluorescein com um motivo tetraciste�a introduzida na proteína por meio de engenharia genética. Escolhendo a proteína que descobre o fluoróforo não é uma questão aleatória. Devido ao tamanho das proteínas estudadas (SBDS 29 kDa e EFL1 127 kDa), que se espera uma mudança maior na anisotropia entre livre marcado com SBDS e que no complexo com EFL1, em comparação com a variação esperada entre livre marcado com EFL1 e que ligado a SBDS. Tendo isto em mente, uma tag flash foi introduzido em SBDS ao invés de EFL1. Outro parâmetro importante a considerar quando da criação de uma experiência de fluorescência anisotropia é a absorção das soluções utilizadas. A densidade óptica da solução na cuvete não deve ser superior a 0,1 no comprimento de onda de excitação e emissão, e deve permanecer constante ao longo de toda a titulação. Caso contrário, o efeito de filtro interno pode interferir na medição e devem ser corrigidos para. Na experiência aqui apresentado, as proteínas estudadas não absorver no comprimento de onda de excitatião ou de emissão do 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) corante f luoresceína; portanto, efeito de filtro interno não representa um problema.

Em relação à coleta de dados, e, posteriormente, encaixar corretamente os dados, é necessário ter linhas de base bem definidas inferiores e superiores, com diversos pontos de dados através da transição ao longo da curva de ligação. Caso contrário, a montagem de dados é impreciso e informações sobre o modo de ligao pode ser perdido. Para descrever uma curva de ligação aceitável é necessário que a concentração de ligando livre difere em duas unidades logarítmicas abaixo e acima da constante de dissociação, no entanto, experimentalmente este pode ser difícil de alcançar. No limite inferior, problemas com a sensibilidade do equipamento podem surgir em particular quando a afinidade entre as proteínas é muito elevado, enquanto que grandes concentrações pode não ser possível, devido a problemas de solubilidade do ligando. Isto foi claramente exemplificado ao testar a interacção entre o SBDSS143L mutante doença e EFL1. Este mutante interrompida a ligação ao EFL1 de tal maneira que não era possível obter uma curva de ligação adequada desde EFL1 só pode ser concentrada até 70? M e a proteína fica diluído ≈ 5 vezes durante a titulação 10. Assim, é necessário ter uma estimativa aproximada da afinidade para optimizar o regime de titulação e certificar-se de que salta da concentração de ligando não ocorrer em posições que iria causar um ajuste menos precisa. Por exemplo, faltando os pontos iniciais da curva de ligação apresentado na Figura 3 vai fazer com que pareça uma hipérbole enganar o pesquisador no sentido de um modelo único local de ligação.

Uma vez recolhidos, os dados foram ajustados a um modelo de ligação presumível. Em comparação com a fluorescência de dados, os dados de anisotropia pode ser utilizado sem posterior manipulação e não precisa de correcção para os efeitos de diluição. As equações apresentadas na Tabela 1 considerar que [L] ≈[L] 0 em todos os pontos da titulação. Isto pode não acontecer quando a afinidade entre as proteínas é muito elevado de tal modo que nos primeiros pontos da depleção ligando titulação ocorre. Neste cenário, as equações quadráticas mais complexos descritos noutro local 23 são necessários para ajustar os dados. No experimento descrito aqui, o EFL1 ligando estava sempre em grande excesso em relação à concentração de SBDS-flash e a mudança na concentração EFL1 em ​​cada ponto da titulação pode ser desconsiderada. Como discutido na secção de resultados, um modelo de dois locais de ligação não-idêntica melhor descrita os dados experimentais (Figura 3C). informação bioquímica adicional obtida no grupo apoia a ideia de que este é o modelo correcto para descrever a interacção entre EFL1 e SBDS (dados não mostrados). Este modo de interacção é comum em proteínas com vários domínios, tais como EFL1 e SBDS são, e existem vários exemplos na literatura 24-26. No entanto, é umlso importante para afastar uma interação não-específica que pode aparecer como um modelo de interação de sítios de ligação distintos com diferentes afinidades para o seu ligando. Para este fim, um gráfico de Scatchard é muito útil. Em comparação com outras técnicas, sinal de fluorescência anisotropia relata a quantidade de complexo formado e, assim, é possível construir um gráfico de Scatchard com os dados. Uma curva convexa de Scatchard sugere um modelo de dois sítios de ligação diferentes com cooperatividade negativa ou a ligação não específica, enquanto que um gráfico de Scatchard côncava implica um modelo de dois sítios de ligação diferentes com cooperatividade positiva ou instabilidade ligando (Figura 4). Análise dos dados experimentais mostraram um gráfico de Scatchard com uma forma côncava de suporte ao modelo de dois sítios de ligação independentes para EFL1 e SBDS (Figura 4D). Além disso, a cooperatividade positiva foi confirmada após realização de uma análise de Hill que resultou num valor de coeficiente de Hill de 1,8 ± 0,02 (dados não mostrados).


Figura 4. Modelos gráficos de Scatchard para a ligação proteína-proteína diferente. (A) local de ligação única ou múltipla sítios idênticos que não interagem. (B) Os vários locais de ligação diferentes com cooperatividade negativa ou a ligação não específica. (C) Vários sítios de ligação diferentes, com cooperatividade positiva ou instabilidade ligando. Plot (D) Scatchard resultante da análise dos dados de anisotropia experimentais obtidos a partir da titulação da EFL1 para SBDS-Flash. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Anisotropia de fluorescência é uma técnica à base de solução, verdadeiro-equilíbrio que requer as moléculas estudadas para permanecerem em solução, nas condições testadas. Ele pode ser usado para estudar não sobreLY a interacção entre as proteínas de comprimento completo mas também a interacção entre domínios proteicos, proteínas mutantes ou mesmo péptidos com modificações pós-traducionais. Além disso, Anisotropia de fluorescência também pode ser utilizado para medir a ligação de proteínas a membranas lipídicas utilizando sondas fluorescentes sensíveis membranas. Esta abordagem tem sido utilizada com êxito para estudar o efeito que tem a-sinucleína em vesículas sinápticas embalagem 27. Uma das principais vantagens da anisotropia de fluorescência é que ele proporciona informação quantitativa sobre a ligação das moléculas estudadas tais que os verdadeiros constantes de dissociação pode ser obtido em conjunto com a informação mecanicista. Embora outras técnicas biofísicas, também pode ser usado para obter tal informação, Anisotropia de fluorescência requer pequenas quantidades de amostra e pode ser não realizada apenas em equilíbrio, tal como apresentado aqui, mas também usando a cinética rápida, como a fluorometria de fluxo parado, para se obter a associação e taxa de dissociação(constantes k on e k off, respectivamente) 28. Uma tabela comparativa com as vantagens e desvantagens de anisotropia de fluorescência em relação a outras técnicas biofísicas é apresentada na Tabela 2. Todos os métodos descritos são técnicas verdadeira-equilíbrio, desde que nenhuma delas inclui um processo de separação mecânica das fracções livre e ligada. Tal como mencionado na secção de resultados, se a intensidade de fluorescência de uma proteína marcada muda-largamente da interacção, esta propriedade pode, então, ser utilizada para quantificar a afinidade da ligação. No entanto, alterações na intensidade de fluorescência resultantes da interacção sugerir uma possível interferência do fluoróforo extrínseca na interacção molecular em si; ou seja, uma possível alteração do valor da constante de dissociação (K d) das proteínas não-rotulados correspondentes. Como tal, a fluorescência anisotropia pode ser considerada uma técnica menos invasiva do que changes na intensidade de fluorescência já que a primeira deve ser aplicada quando a intensidade de fluorescência não muda após a interação. Neste sentido, embora sejam necessárias grandes quantidades da proteína, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) pode fornecer um verdadeiro valor de K d da interacção molecular, uma vez que é um método livre etiqueta. Por outro lado, a informação mecanicista não é obtido porque as diferenças de calor única informar sobre a entalpia do processo, e não a quantidade de complexo formado 29.

Em comparação, em métodos in vivo, tais como os ensaios de levedura de dois híbridos ou de complementação fragmento não necessitam de proteínas purificadas, mas que apenas fornecem informação semi-quantitativa sobre o modo de ligação. Apesar do facto de na levedura técnica de dois híbridos é possível exprimir a força das unidades Miller de ligação usando, este não é um verdadeiro equilíbrio factores constantes e muito fora do controle do investigador pode alterar isso.

Tabela 2. Vantagens e desvantagens das técnicas biofísicas comumente usadas para estudar as interações proteína-proteína. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
mesa 2

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Base Formedium TRIS01 Ultra pure
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein ThermoFischer Scientific LC6090 This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline IBI Shelton Scientific, Inc IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous Formedium GLU03
D(+)-Galactose Formedium GAL03
L-Leucine Formedium DOC0157
L-Tryptofan  Formedium DOC0189
Bezamidine hydrochloride Sigma-Aldrich B6506-5G
PMSF Gold Biotechnology, Inc P-470-25 Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl Formedium NAC02 Sodium Chloride 
Glycerol Tecsiquim, S.A. de C.V. GT1980-6
MgCl2 Merck Millipore Corporation 1725711000 Magnesium Chloride
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-500G
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786-500G Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139-500G Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Yeast extract Formedium YEM03 Micro Granulated
L-Tyroisne Formedium DOC0193
Adenine sulphate Formedium DOC0230
Casamino acids Formedium CAS03
Tryptone IBI Shelton Scientific, Inc IB49182
IPTG Formedium IPTG025
Filtration units Merck Millipore Corporation UFC901096 Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter Merck Millipore Corporation GSWP04700 Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column QIAGEN 30760 Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column GE Healthcare Life Science 17-5157-01 HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column GE Healthcare Life Science 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell Hellma Analytics 111-057-40
Spectrophotometer Agilent Technologies G6860AA Cary 60 UV-Vis
Shaker ThermoFischer Scientific SHKA4000-7 MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge ThermoFischer Scientific 75004271 Heraeus Megafuge 16R
FPLC Pharmacia Biotech Discontinued FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer Olis No applicable Olis DM 45 with Polarization Toolbox

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References

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