Fremstilling af ekstracellulært matrixprotein fibre til Brillouin Spektroskopi

1School of Physics and Astronomy, University of Exeter, 2Department of Physics and Geology, University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR, Unità di Perugia
Published 9/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., et al. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Brillouin-lysspredning (BLS) virkning blev opdaget af Léon Brillouin i 1922. 1 Den består af uelastisk spredning af synligt lys ved termisk aktiverede akustiske fononer i et materiale. I faststoffysik, akustiske fononer er sammenhængende vibrationer af alle atomer i et gitter. En endimensional kæde af to skiftende typer af atomer i et gitter er en simpel model, der illustrerer forskellen mellem akustiske fononer, afsløret af BLS og optiske fononer, probet ved IR absorption og Raman-spredning (figur 1). Akustiske fononer er i fase bevægelser af atomer i kæden med en forskydning langs retningen af ​​formering (langsgående akustiske fononer) eller vinkelret på udbredelsesretningen (tværgående akustiske fononer), mens optiske fononer er ud-af-fase bevægelser af atomerne producerer et oscillerende elektrisk dipolmoment (langsgående eller tværgående tilstande).

BLS Spectroscopy har været anvendt i analytisk videnskab siden 1920'erne; dog kun siden 1980'erne har høj kontrast målinger været muligt ved anvendelse af tandem multipass Fabry-Perot spektrometer. Siden da et stigende antal af forskud i BLS til analytiske applikationer i faste stoffer (hvor foton-phonon interaktion udnyttes) 2-4 og magnetiske materialer (gennem foton-Magnon interaktion) 5 er blevet bragt om. Skelsættende værker om biomedicinske anvendelser 6-8 har banet vej til udvikling af forskellige tilgange, herunder den anvendte her og den tidligere beskrevne 9 ved hjælp af en reflekterende substrat i en trombocyt-lignende konfiguration til at opnå den fulde beskrivelse af elasticitet tensor af en prøve.

I det foreliggende arbejde, anvender vi BLS spektroskopi til de grundlæggende bestanddele af den ekstracellulære matrix i bindevæv, de fibrøse proteiner elastin og type I-collagen. Type I collagen er et stift, tredobbelt spiralformet molekyle, som samler tværs og på langs med omfattende tværbinding til dannelse i det væsentlige stive fibre i væv, såsom sener. Netværk af kollagen ofte sameksistere med netværk af elastin, et protein, der, usædvanligt, genererer langtrækkende elasticitet gennem en kombination af entropi og hydrofobe interaktioner med sine omgivelser og er afgørende for de funktioner af væv, såsom lunge og hud. Begge fibre er modelleret ved hjælp af en sekskantet krystal model i den aktuelle forskning. 9 I del 1 beskriver vi protokollen til at udtrække fibrene fra animalske væv og forberede prøven til spektroskopiske målinger. I del 2 er proceduren for opsætning af Brillouin apparat og erhverve spektre fra fibrene præsenteret. Del 3 indeholder oplysninger om dataanalyse anvendes på Brillouin spektre at udtrække de relevante mekaniske oplysningerne heri. Derefter er repræsentative resultater præsenteres og discussed.

Protocol

Forsigtig: Kontakt biologiske sikkerhed protokoller og alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Laseren beskæftiget i disse eksperimenter er et klasse 3B laser; overensstemmelse med lokale regler for en sikker brug af systemet er påkrævet. Brug venligst alle passende sikkerhedsforanstaltninger, når du udfører en laser spektroskopi måling herunder brug af personlige værnemidler (beskyttelsesbriller).

Tail sener blev opnået 7-8 uger gamle Wistar rotter aflivet til andre formål i overensstemmelse med EU-forordning 1099/2009 og The dyrevelfærd (slagte- eller aflivningstidspunktet) Regulations 1995. Bovine nakkestivhed ledbånd blev indhentet fra en lokalt slagteri.

1. Udarbejdelse af Sample Fibers

BEMÆRK: Protein fibre af den ekstracellulære matrix kan ekstraheres fra forskellige væv, ved anvendelse af forskellige procedurer. Protokoller blev raffineret baseret på almindeligt anvendte procedurer.

  1. Ofre en rotte ved intra-peritoneal injektion af 100 mg / kg legemsvægt natriumpentobarbiton. Derefter sever halen direkte ved punktet for kontakt med kroppen, trykke ned med en enkelt kant barberblad. Wrap halen i cling film og gemme det nedfrosset ved -20 ° C indtil brug.
  2. Saml halen fra fryseren, skæres en 20 mm langt segment fra den proximale ende, mens de stadig frosne og derefter lader det til at tø i en petriskål fyldt med phosphatpufret saltvand (PBS) opløsning (pH 7,4) ved stuetemperatur.
  3. Når halen optøs, lave et snit langs længden af ​​segmentet ved hjælp af en skalpel til at splitte huden. Derefter skrælle at afsløre fire beklædte sener bundter omkring halen ryghvirvel.
  4. Brug fine pincet og være omhyggelig med ikke at anvende nogen pre-stammen, forsigtigt trække hver fiber ud af skeden og placere den i et hætteglas indeholdende destilleret vand med 0,01% w / v natriumazid (NaN 3) til prbegivenhed bakterievækst, og opbevar i køleskab. En enkelt hale giver omkring tredive sene fibre.
  5. For at opnå ren fibrøst type I collagen, anvende en tre del enzymatisk fordøjelse proces 10 til senefibrene at fjerne proteoglycaner og alle andre kollagenøse materiale.
    1. Først nedsænkes fibrene i 0,125 U / ml chondroitinase ABC i 0,05 M Tris-buffer og 0,06 M natriumacetat (CH3 COONa) ved pH 8,0 i 24 timer ved 37 ° C i en rysteinkubator ved 200 rpm.
    2. Derefter nedsænkes fibrene i 1 U / ml Streptomyces hyaluronidase i 0,05 M Tris-buffer og 0,15 M natriumchlorid (NaCl) ved pH 6,0 og vende tilbage til rysteinkubator i 24 timer ved 37 ° C.
    3. Endelig nedsænkes fibrene i 1 mg / ml trypsin i 0,05 M natriumphosphat (NaHPO 4) og 0,15 M NaCl ved pH 7,2 i 16 timer i rysteinkubator ved 37 ° C.
  6. Opbevar de rensede fibre kølede i hætteglas indeholdende destilleret vand, with 0,01% NaN3 for at forhindre bakterievækst, til de skal måling.
  • Udvinding af elastin fibre fra kvæg nakkestivhed ledbånd
    1. Opnå kvæg nakkestivhed ledbånd fra slagteriet, pak det ind i husholdningsfilm og opbevar det frosset ved -20 ° C indtil brug.
    2. For at producere ren elastin, indsamle ligament fra fryseren, lad den tø op ved stuetemperatur, affedte det ved hjælp af en skalpel og fordøje ledbånd i et kogende vandbad i henhold til Lansing procedure, 11 som følger.
      1. Der fremstilles en 0,1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH) i destilleret vand og føje den til den affedtede ligament i en konisk kolbe, der dækker vævet.
      2. Kog kolben i et vandbad ved 95 ° C i 45 minutter.
      3. Fjern ligamentet fra fordøjelsen kolben og vask det uopløselige vævsblokken gentagne gange i destilleret vand, indtil pH 7,0 (overvåget ved anvendelse af et pH-meter) opnås.
      4. Fjern vævet fra den endeligevask løsning, og nedsænkes i destilleret vand (blandet med 0,01% NaN3 for at forhindre bakterievækst) i en lukket beholder, og opbevar den i køleskab.
    3. Saml vævet ud af køleskabet og, og pas på ikke at anvende for meget kraft og præ-stammen, bruge pincet til forsigtigt at trække mindre elastin segmenter (20 til 50 mm lange, ca 2 mm tyk) væk fra den større blok og placere dem i en petriskål med PBS-opløsning (pH 7,4).
    4. Ved hjælp af fine pincet, forsigtigt drille bundter små fibre omkring 1 mm tyk og skær dem til længder af et par mm ved hjælp af en skalpel.
    5. Fibrene overføres til hætteglas indeholdende destilleret vand (med 0,01% NaN3 for at forhindre bakteriel vækst) og gemme dem i køleskab indtil påkrævet til måling.
  • Montering fibrene onto reflekterende substrat
    1. Ved hjælp af en diamant cutter, skære et stykke af reflekterende silikone dias.
    2. For at oprette en hydreret rum firent, skære en strimmel af Parafilm til at passe over silicone objektglasset med en hul skåret i midten (stor nok til at passe en fiber) og placere den på silikone substrat.
      BEMÆRK: Til tørre fiber målinger, skære parafilm i en U-form, således at en af ​​de fire sider forbliver åben til luften ved forseglet i trin 1.3.4.
    3. Fjern fibrene fra køleskabet, skal du bruge et par fine pincet til at indsamle en enkelt fiber fra lagerløsning og læg den i en lille petriskål fyldt med rent vand ved stuetemperatur i 5 min at vaske prøven. Derefter indsamle fiberen og overføre den til midten af ​​parafilm hule på silicone substrat.
      Forsigtig: Undgå at beskadige fiberen ved at strække det under denne operation, og undgå at omlægge prøven på underlaget da dette kan medføre en ændring i mekaniske egenskaber.
    4. Placer en tynd dækglas over fiber og forsegle kammeret ved at lede en opvarmet loddekolbe forsigtigt over glasoverfladen til at smelte parafilm underglasset.
      Forsigtig: Undgå at beskadige fiberen ved ikke at bringe loddespids for tæt eller opvarmning af underlaget overdrevent.
    5. Placer forseglede kammer på en flad overflade under en lille vægt og overlade det til omkring 12 timer for at opnå en god kontakt mellem prøven og silicium substrat samtidig undgå skader på prøven.
    6. Fjern vægten og fastgør kammeret på plads på underlaget, ved hjælp af skruer.
  • 2. Opsætning af Brillouin Experiment og Erhvervelse Fiber Spectra

    1. Klargøring af prøve rum
      1. Monter prøven forberedt som under del 1.3 på en lodret holder udstyret med en goniometer at aktivere i-planet rotation af prøven og samtidig opretholde en konstant spredning vinkel (2 Φ = 90 °, se figur SI-1) og spredning volumen position.
      2. Udfør en præcis fokusering justering af laserlyset på prøven gennem lens. 9
        Forsigtig: Laseren udgangseffekt kan være for høj, og producere en forbrænding i prøven. Sørge for, at det er sat tilstrækkeligt højt til at give en god følsomhed, men ikke for højt til at undgå beskadigelse af prøven. Her brugte vi en effekt på ca. 76 mW på prøven. Dette var tilstrækkeligt til at få en god følsomhed uden at brænde prøven, også i betragtning af at det er tyndt og i kontakt med et substrat, der hjælper sprede varme, der genereres ved hjælp af laser belysning.
      3. Anbring prøven i en 45 ° vinkel (Φ) til den indfaldende laserstråle ved hjælp af en Vernier skala. Opnå optimal positionering ved at køre en måling og maksimere intensiteten af ​​toppene i spektret (se nedenfor).
    2. Opsætning af spektrometer
      1. Åbn softwaren til erhvervelse og manipulation af data og oprette erhvervelse af en Brillouin spektrum af prøven 12. Den her beskrevne procedure finder anvendelse ved multipass tandem interferometer (fig SI-1A).
      2. Juster de to Fabry-Perot (FP) interferometre uafhængigt skiftende spændingerne anvendes på piezo af styreenheden. Til denne pre-alignment procedure, observere lyset reflekteres af hver FP. Når intensiteten reflekteres af to rammeprogrammerne tendens til nul, er det korrekt justering nået.
      3. Kalibrer spektrum: den tilgængelige frekvensområde, eller frie spektrale område (FSR), er afhængig af afstanden mellem de to spejle af den første FP hulrum, L, gennem FSR = c / 2 L, hvor c er lysets hastighed og L måles ved en dial gauge.
      4. Synkroniser scanninger af de to FP interferometre og skifte det optiske system til tandem multipass konfiguration. En feedback-styring af den transmitterede laserlys intensitet vil automatisk vedligeholde opretningen af ​​de to rammeprogrammer under målingen.
    3. Måling of Brillouin Spectra
      Forsigtig: Brillouin spektrum er meget afhængig af temperaturen og hydratisering af prøven og så omhyggelig styring af disse parametre er nøglen til at opnå reproducerbar spektre.
      1. Start erhvervelsen af ​​en Brillouin spektrum af prøven og køre det indtil et godt signal-til-støj-forholdet er opnået. Dette kan tage flere minutter afhængig af spredning tværsnit, koncentration og tykkelsen af ​​prøven.
        BEMÆRK: Der er ikke en tommelfingerregel for signal-til-støj-forhold, men den spektrale kvalitet kontrolleres af eksperimentator baseret på den specifikke prøve analyseret. Der er en afvejning mellem spektral kvalitet og varighed af målingen, skal derfor vælges i henhold til den specifikke applikation de eksperimentelle parametre.
      2. Til måling af en tørvægt, tage successive spektre - for hver af dem, efter trin 2.3.1 - indtil ingen ændringer i placeringen af ​​toppene is overholdes. Dette opnås, når prøven er i ligevægt med værelset atmosfære og ingen yderligere tørring vil påvirke spektret.
      3. Vælg lyset polarisering (VV eller VH V står for vertikal og H til horisontal retning af lyset polarisering i forhold til spredning plan) og erhverve spektre ved hver vinkel til fiberaksen (θ; Figur SI-1) ved at rotere prøven i plan i hånden.
      4. Gem Brillouin spektre til at indgive efterfølgende behandling.

    3. Analyse af Brillouin Spectra

    BEMÆRK: Fit analyse af Brillouin toppe kan udføres ved anvendelse af forskellige funktioner. En dæmpet harmoniske oscillator (DHO) -funktionen 4,13 blev valgt, da dette er en gyldig model for toppe stammer fra dæmpede akustiske modes i viskoelastiske medier.

    1. Fit analyse af Brillouin toppe
      1. Vælg den spektrale område for toppen af ​​interesse i the Brillouin spektrum.
      2. Aktiver en baseline i pasform, hvis spektrale baggrund er meget højere end nul.
        BEMÆRK: baseline kan variere mellem spektre. Sørg for, at korrektionen anvendes på en systematisk og reproducerbar måde.
      3. Påfør en detaljeret mindste kvadraters passer ved hjælp af en DHO-funktion 4,13 til Brillouin toppen af interesse iterativt indtil konvergens opnås, og der opnås den bedst tilpassede kurve. Derefter gemme fit resultater til fil.
      4. Opnå gennemsnitlige værdier fra fit parametre for de to toppe af hver Brillouin dublet.
      5. Beregn den akustiske bølgehastighed fra toppen frekvens (ved hjælp af udtrykket nedenfor).
      6. Indtegnes den fit resultater gennem grafer, f.eks, akustisk bølge hastighed vs. vinkel til fiberaksen, θ Og anvende relevante modeller (f.eks, for akustisk anisotropiske systemer 9) for at udtrække mekaniske mængder såsom elasticitet tensor koefficienter.

    Representative Results

    Brillouin spektroskopi apparat anvendt i dette eksperiment (figur SI-1A) er tidligere blevet beskrevet. 9 Det anvender en single-mode 532 nm solid-state laser med 76 mW udgangseffekt ved prøven. En 20 cm akromatisk linse fokuserer laserlyset ned på prøven og indsamler det spredte lys fra prøven i en backscattering geometri. En tandem multipass Fabry-Perot interferometer anvendes til filtrering af spredt lys, som derefter påvises ved en støjsvag fotodiode detektor. Denne tilgang giver ekstremt høj kontrast (ca. 120 dB) og stabilitet gennem selvjusterende piezo-scanning af etaloner. En polarisator og analysator er indført for at vælge polariseringen af ​​hændelsen og spredte lys. Spectra opnås sædvanligvis med polarisatoren holdt fast vælge den lodrette (V) retning af det indfaldende lys polarisering og analysatoren vælge alternativt den lodrette (V) or vandrette (H) retning af det spredte lys polarisering. I denne konfiguration er langsgående og tværgående akustiske modes detekteret henholdsvis.

    En typisk Brillouin spektrum har en intens central top på grund af elastisk spredning og et eller flere sæt af lige flyttet toppe eller Brillouin dubletter, som er underskrevet af mekanikken i prøven. I disse målinger, kan det spredte lys stammer både fra bulk fononer rejser kvasi-ortogonal til prøven, og efter refleksion af indfaldende lys ved prøven-substrat interface, fra bulk fononer rejser parallelt med overfladen (PS tilstande). 9

    Figur 2 viser BLS spektre af tørre og hydratiserede trypsinlignende fordøjet collagenfibre opnået med VV polarisering ved 0,2 GHz opløsning, med en 30 GHz frie spektrale område og ca. 10 min samling tidpr spektrum. Hvert spektrum svarer til en specifik drejningsvinkel, θ (Figur SI-1C). I tørt collagen fiber ved θ = 0 °, langsgående tilstande giver anledning til en bulk top ved (18,92 ± 0,02) GHz mens PS-funktionen er på (9,85 ± 0,03) GHz (figur 2A). De PS peak skifter til lavere frekvenser som θ går fra 0 ° (Phonon sondering den aksiale orientering af fiber) til 90 ° (Phonon sondering den radiale retning), hvorimod hovedparten peak kun lidt rød-skift upon skiftende θ i det samme område (Phonon sondering en kvasi-radial retning i rotation). Ved våd collagen fiber, de to toppe på grund langsgående fononer er væsentlige uændret under hele forsøget, med hovedparten top ved ca. 10,5 GHz og PS top ved 4,9 GHz (figur 2B). Dette indikerer en reduktion på 80 til 100% i peak frekvens (i forhold til dataene fra 18,92og 9,85 GHz, henholdsvis), og dermed stivhed i materialet, som følge af hydratisering. Bemærk, at bulk- og PS former for hydreret collagen ligger tæt i frekvens over de former for rent vand, hvilket tyder på, at dets elastiske konstanter er en kombination af vand- og fiber bidrag, med en dominerende rolle, som vand spiller.

    Figur 3 viser et spektrum af tør trypsin-spaltet kollagen fiber målt ved θ = 30 ° med VH polarisering; en lækage af VV polarisering muliggør PS og bulk toppe til stadig observeres. Tværgående tilstande udgør et højdepunkt på (4,1 ± 0,2) GHz = 0 °), som lidt blå-skift som θ ændringer fra 0 ° til 90 °. Fit resultater for både den tværgående og PS toppe er også vist. Peak parametre blev ekstraheret og akustiske hastigheder blev afledt som VL = v λ / √2, hvor q s = 2 k in his (Φ); Figur SI-1b, c), således hvilket gør denne fremgangsmåde særlig fordelagtig.

    Figur 4 er et plot af de akustiske hastigheder opnået fra langsgående og tværgående tilstande (PS og T toppe) som funktion af vinklen θ . Fit analyse til en model af Hexagonal symmetrisk elastisk faststof 7 - Ligninger A1 og A2 nedenfor - giver de fem bestanddele af elasticiteten tensor af tør trypsin-spaltet type I collagen fibre (tabel 1).

    9

    ligning 1 (A1)

    ligning 2 , (A2)

    hvor ρ er massefylden af materialet, og c 11, C 33, C 44 og C 13 er fire af de fem elastiske konstanter, som karakteriserer systemer med en sekskantet symmetri. Den femte konstant, C12, kan udledes af det omtrentlige forhold c 12 ~ c 11 -. 2 c 44 7

    Koefficienter svarer til dem, der tidligere er fremstillet af urenset collagen fibers. 9 En mærkbar forskel opstår for koefficienten c 13, der er afspejlet i tilsvarende værdier af den elastiske moduli E ǁ og E vinkelret (Ca. 7,2 og 7,7 GPa) for oprenset collagen.

    Figur 5 er en afbildning af den langsgående akustiske bølgehastighed af våd collagen versus θ . I dette tilfælde er der ikke observeret nogen periodisk ændring i frekvens, hvilket giver en konstant hastighed inden fejlen. Figur 6 viser spektrene af tørre og hydratiserede elastin fibre målt på θ = 0 °. Tværgående tilstande blev ikke påvist for disse prøver. I tør elastin, hovedparten top forekommer ved 16,8 GHz, mens PS tilstand ved 8,2 GHz 9 (13 og 20% lavere end de tilsvarende toppe af tør kollagen). Våde elastin fibre præsentere en bulk pEAK på (12.30 ± 0.01) GHz (37% lavere i frekvens end hovedparten top af tør elastin). PS-funktionen af ​​våd elastin er ikke synlige i spektret på grund af den intense halen af ​​den elastiske top ved disse frekvenser. På den anden side er toppen ved ca. 7,5 GHz tilskrives størstedelen af vandet.

    Figur 7 viser afhængigheden af akustisk bølgehastighed i tør elastin fiber på θ. Ud fra disse data blev elasticitet tensor komponenter (og mekanisk moduler) opnået (tabel 1). 9 Som i våd collagen, der er tegn på isotropi i den mekaniske modulus på hydratiserede elastinfibre. Disse resultater indikerer, hvordan Brillouin spektroskopi kan give relevante oplysninger om stivhed, sammensætning og strukturelle aspekter af et materiale.

    figur 1
    Figur 1. akustiske og optiske fononer i endimensional kæde af atomer. Skematisk diagram af akustiske og optiske vibrationer i et endimensionalt diatomiske kæde. Atomer har masse m 1 og m 2 og vekslede. Pile angiver forskydningerne af atomer. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2. Brillouin spektre af trypsin-oprenset type I collagen fibre fra rottehalesene. Spektre af (A) tør fiber og (B) hydreret fiber fra VV målinger ved forskellige vinkler til fiberaksen θ, i grader. Et spektrum af rent destilleret vand er også vist. Spectra blev normaliseret til intensiteten (højde) af bulk-top. Etiketter B og PS betegner toppe relateret til bulk og parallelle-til-overflade modes, hhv. Fejl søjler indikerer standardfejlen (kvadratroden af antallet af tællinger). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3. Brillouin spektrum af tør trypsin-oprenset type I collagen fibre fra rottehalesene. Spectrum fra et VH måling ved θ = 30 °. Etiketter T, PS og B betegner toppe relateret til tværgående, parallelle-til-overflade og bulk modes, hhv. Resultater af fit-analyse under anvendelse af en dæmpet harmonisk oscillator (DHO) model for både T og PS-tilstande er også vist. Fejlsøjler angiver standardfejlen (kvadratroden af ​​antallet af tællinger)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4. Plot af den akustiske bølgehastighed i tør trypsin-oprenset collagen vs vinkel til fiberaksen. Langsgående og tværgående akustisk bølge hastigheder af tørt collagen fiber afledt af fit analyse af Brillouin toppe. Data er monteret på en model af Hexagonal symmetrisk elastisk fast. Rød linje: Ligning A1 (R2 = 0,99); blå linje: Ligning A2 (R2 = 0,36). Fejllinjer angiver standardafvigelser opnået fra kvadratroden af de diagonale elementer af kovariansmatricen efter en Levenberg-Marquardt lineær mindste kvadraters tilpasning af Brillouin spektre. Klik her for at se et større versi på denne figur.

    Figur 5
    Figur 5. Plot af den langsgående akustiske bølgehastighed i våd trypsin-oprenset collagen vs vinkel til fiberaksen. Langsgående akustisk bølgehastighed af hydratiseret collagen fiber afledt af fit analyse af Brillouin toppe. Den viste linie er en vejledning til øjet og giver den gennemsnitlige værdi af den akustiske bølge hastighed i dette interval. Fejllinjer angiver standardafvigelser opnået fra kvadratroden af de diagonale elementer af kovariansmatricen efter en Levenberg-Marquardt lineær mindste kvadraters tilpasning af Brillouin spektre. Klik her for at se en større version af dette tal.

    jpg "/>
    Figur 6. Brillouin spektre af elastin fibre fra bovin nakke ligament. Spektre af tørt og hydreret fiber ved θ = 0 °. Spectra blev normaliseret til intensiteten (højde) af bulk-top. Etiketter B og PS betegner toppe relateret til bulk og parallelle-til-overflade modes, hhv. B F og B W refererer til bulk toppe af fiberen og vand hhv. Fejl søjler indikerer standardfejlen (kvadratroden af antallet af tællinger). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 7
    Figur 7. Plot af den langsgående akustiske bølgehastighed i tør elastin vs vinkel til fiberaksen. Langsgående akustisk bølgehastighed af tør elastin fibER afledt fit analyse af Brillouin toppe. Data er monteret på en model af Hexagonal symmetrisk elastisk fast. Rød linje: Ligning A1 9 (R2 = 0,74). Fejllinjer angiver standardafvigelser opnået fra kvadratroden af de diagonale elementer af kovariansmatricen efter en Levenberg-Marquardt lineær mindste kvadraters tilpasning af Brillouin spektre. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Supplerende Figur 1

    Figur SI-1. Skematisk af Brillouin opsætning og BLS scattering geometri. (A) Hændelsen lys udsendt af en solid-state laser sendes til prøven gennem en akromatisk linse. Den spredte lys fra akustiske fononer og af dem som følge af REFLfdeling af lys ved substratoverfladen, som er i kontakt med prøven, opsamles ved linsen, filtreret af et tandem-multipass Fabry-Perot interferometer og detekteres af en fotomultiplikator. FP1 og FP2 angiver de to interferometre der udgør tandem set-up. En polarisator vælger polariseringen af ​​indfaldende lys, og en analysator anvendes til at vælge polarisationen af ​​spredt lys. (B) BLS geometri med en prøve i kontakt med overfladen af en reflekterende siliciumsubstrat. Et objektglas (ikke vist) er placeret over prøven for at tætne rummet, og blide tryk påføres gennem puder i hjørnerne af substratet. Det indfaldende lys (Kj) passerer gennem linsen, brydes ved luft-prøve-grænsefladen (k 'i) og fokuseret på prøven-substrat interface. Det spredte lys opsamles af den samme linse (k 's) resultater fra samspil med både bulk- fononer (qb), og dem, der rejser PS af prøven (q s). . Vinkler mellem retninger af lys og vinkelret på overfladen er angivet som Φ og Φ (C) Skematisk diagram af prøven og den vedtagne koordinatsystem; z definerer den ekstraordinære akse parallel med retningen af fibrene. Angles θ og α er dem mellem retningen af fononer q s og q b for at z-aksen, henholdsvis Ki, k 'i, k s, k' s:. Bølgetal om hændelsen og spredte lys q b, q s, bølge vektorer af bulkvarer og PS-tilstande, hhv. (Gengivet fra ref 9.) Klik her for at se en større version af dette tal.

    Tabel 1. Elastisk tensor koefficienter afledt fit analyse af de akustiske bølge hastigheder Elastiske tensor koefficienter af tør trypsin-renset type I collagen fibre (. dette arbejde) og elastin fibre (ref 9).

    prøve elastiske koefficienter (GPa)
    trypsin-spaltet kollagen c 33 18,7 ± 0,1
    c 11 14,4 ± 0,2
    c 44 3.4 ± 0.1
    c 12 7,2 ± 0,2
    c 13 11,2 ± 0,3
    elastin c 33 11,5 ± 0,2
    c 11 10,4 ± 0,1
    c 44 1,9 ± 0,2
    c 12 6,6 ± 0,2
    c 13 6,8 ± 0,3

    Discussion

    Brillouin spredning spektroskopi er et unikt værktøj, hvormed de enkelte komponenter i elasticiteten tensor af et protein fiber kan karakteriseres i hidtil uset detalje. Desuden kan målingerne foretages på en mikroskopisk skala, og dermed vil give os nye indsigter i de mikro-skala mekanik biologiske strukturer, så vi for første gang, for at forstå de mekaniske, og sandsynligvis funktionel, betydning af kompleksiteten i matrix arkitektur og biokemi som er blevet afsløret i de senere år.

    Teknikken måler mekaniske egenskaber i en GHz frekvensområdet. Dette domæne er aldrig blevet undersøgt før for strukturelle biopolymerer og det både hæver og tilvejebringer midlet til at besvare fundamentale spørgsmål om molekylære mekanismer i elasticitet.

    Vi beskrev de skridt til at udtrække kollagen og elastin fibre fra animalske væv og til at måle Brillouin scattering spektre ved hjælp af en reflekterende underlag for at opnå den fulde beskrivelse af fiber biomekanik. Kritiske trin i protokollen, er dem, der sikrer, at der opnås oprensede fibre og passende eksperimentelle betingelser er til stede for reproducerbare målinger af de fibrøse proteiner. Dog skal det erindres, at de ekstraktionsprocedurer kan ændre de mekaniske egenskaber af fibrene.

    Modifikationer af teknikken involverer kobling med optisk mikroskopi for microfocused Brillouin spredning og kortlægning tilgange 13 og den mulige kombination med komplementære teknikker (fx Raman-spredning). Aktuelle anvendelser af teknikken er hovedsagelig fokuseret på udskårne biologiske materialer, men vigtige udviklinger, f.eks dem, der bygger på flere VIPA etaloner 14, gør det muligt at oversættelsen af denne teknik fra stationære til sengen med en række applikationer, der allerede dæmonstrated 15,16 herunder potentiale in vivo-applikationer. Den VIPA tilgang er et alternativ til det, vi beskrive; det har hurtigere erhvervelse tid, men ikke nødvendigvis er hensigtsmæssig i tilfælde af uigennemsigtige prøver såsom de her analyserede. Endvidere er anvendelsen af ​​et reflekterende substrat er ikke praktisk i set-ups, der bruger VIPA etaloner fordi deres kontrast ikke ville være tilstrækkeligt til at afvise kvasi-elastisk lys. Begrænsninger i forbindelse med hastigheden af ​​erhvervelse af en spektral datasæt og i sagens natur svage spredning tværsnit af materialet kan begrænse ansøgninger til dynamiske biologiske systemer og til erhvervelse af data fra dybt i væv, men tekniske raffinementer kan forbedre nuværende resultater.

    BLS tegner til at blive et vigtigt redskab i fundamental biofysisk forskning i den ekstracellulære matrix og derved at frembringe nye indsigter i udviklingen af ​​mekaniske egenskaber under matrix vækst og deres tab i patologiskedegeneration. Det er dog vigtigt at huske, at målingerne er noninvasive og kunne derfor blive gennemført in vivo. Faktisk har denne allerede er opnået i hornhinden 16 og dette arbejde kan udgøre en platform for udvikling af nye diagnostiske værktøjer til en bred vifte af bindevæv.

    Ultralyd elastografi og atomic force mikroskopi (AFM) er alternative metoder til mikromekanisk måling, men BLS teknik giver bedre rumlig opløsning (på en subcellulære skala) end den tidligere og i modsætning AFM, pålægger ingen mekaniske kræfter på prøven, og er ikke begrænset til analysen kun af overfladetræk. Brillouin moduli af kollagen og elastin er i GPa interval, mens Youngs moduli fra makroskopiske stammer er af størrelsesordenen MPa (yderligere detaljer vil blive rapporteret andetsteds). Dette resultat indikerer en differentiel elasticitetsmodul med en stærk afhængighed af ekscitationsfrekvens på grund afden viskoelastiske opførsel af fibrene. BLS kan anvendes på en lang række problemer og materialer i biomedicinsk videnskab. Det kan hjælpe med at besvare spørgsmål om fysiologi og patologi af biologiske væv, samt give et fysisk redskab til grundlæggende forståelse af materialer og interaktioner på det molekylære niveau.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
    Tris Buffer Fluka 93358
    Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
    PBS Sigma-Aldrich P4417
    Sodium Azide Fisher Scientific S2002
    Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
    Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
    Trypsin Sigma-Aldrich T4665
    Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
    Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
    Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced in-house
    Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced in-house from water still
    Euthatal Merial  J01601A 
    Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
    Freezer Lec TU55144
    Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
    Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
    Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
    Clamp Stand VWR  241-0093
    Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
    Cling Film Sainsbury's 7650540
    Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
    Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request.
    Cover Glass VWR 631-1571
    Conical Flask VWR 214-1175
    Beaker VWR 213-0469
    Measuring Cylinder VWR 612-3838
    Vial VWR 548-0051 & 548-0863
    Petri Dish VWR 391-0441
    Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
    Diamond Scribe RS Instruments 394-217
    Soldering Iron RS Instruments 231-5332
    Fine Forceps VWR 232-0188
    Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
    pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
    Orbital Shaker IKA  0002819000

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
    2. Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141, (21), 214901 (2014).
    3. Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8, (15), 4235-4243 (2012).
    4. Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. Solid State Physics. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).
    5. Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6, (10), 635-638 (2011).
    6. Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267, (5608), 285-287 (1977).
    7. Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135, (1), 39-51 (1979).
    8. Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284, (5755), 489-491 (1980).
    9. Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11, (101), (2014).
    10. Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399, (1), 29-35 (2006).
    11. Leon, W. C. Methods in Enzymology. 144, Academic Press. 196-214 (1987).
    12. Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
    13. Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139, (4), 729-733 (2014).
    14. Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19, (11), 10913-10922 (2011).
    15. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101, (6), 1539-1545 (2011).
    16. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20, (8), 9197-9202 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats