الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أثبتت التطورات الأخيرة من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) أن الخلايا الجسمية الناضجة يمكن ان يعود الى وجود دولة المحفزة غير متمايزة. الآن، ويتم إعادة برمجة مع أنواع مختلفة من الخلايا الجسدية للبالغين: الكيراتينية والخلايا البول، والخلايا الليفية، الخ وعادة ما فعلت التجارب المبكرة مع الخلايا الليفية الجلدية. ومع ذلك، وهذا يتطلب إجراء العمليات الجراحية الغازية للحصول على الخلايا الليفية من المرضى. لذلك، فإن الخلايا تعليق، مثل خلايا الدم والبول، واعتبرت مثالية لإعادة البرمجة وذلك بسبب سهولة الحصول على الخلايا الأولية. هنا، ونحن التقرير بروتوكول كفاءة لتوليد IPSC من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs). بواسطة الطلاء وPBMCs transduced متسلسل ل، لوحة باستخدام الطرد المركزي الجديدة المغلفة المصفوفة، يمكن هذا البروتوكول بسهولة توفير المستعمرات التوجيهية. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على خلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs). وتقدم هذه الدراسة بروت بسيطة وفعالةocol لإعادة برمجة PBMCs وCBMCs.

Introduction

وكانت الخلايا الجذعية واحدة من المواد الأكثر جاذبية في العلاج السريري لمشاركة عدة عقود 1. خصائص جذابة للخلايا الجذعية تعدد القدرات والقدرة على تجديد الذات. في عام 1981، تم عزل أول الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) من جنين فأر 2. ومع ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لأجنة بشرية، واجهت العديد من القضايا الأخلاقية.

في عام 2006، عندما برمجة الدكتور ياماناكا وفريقه أول خلية المحفزة من الخلايا الجسدية الماوس، استعاد مجال الخلايا الجذعية إمكانية ووانتعشت الفائدة 3. من خلال تقديم العديد من العوامل المحددة، وكانت الخلايا الجذعية المحفزة بنجاح "التي يسببها" من الخلايا الجسدية للبالغين، ووهكذا اسمه "الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs)." في عام 2007، تم تطبيق هذا الأسلوب على الخلايا البشرية مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على الخصائص الدقيقة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية ولكن أيا من النقاش الأخلاقي. من الناحية النظرية، الجذعخدمات العملاء يمكن أن تتولد من أي نوع من الخلايا التي تم الحصول عليها من أي فرد أو المريض. iPSCs-مريض معين ترتفع كأداة المحتملة التي يمكن محاكاة الظواهر المرض والظروف جينية من كل مريض على حدة. عن طريق تحرير الجينات أو غيرها من الوسائل التي يمكن عكس حالة المسببة للأمراض، iPSCs المريض محددة يمكن أيضا أن تستخدم في الطب الشخصية 5. وعلاوة على ذلك، فإن أقل المرتبطة iPSCs مع الرفض المناعي لأن لديهم نفس الهوية المناعية مثل المانحة، مما يجعل لصناعة السيارات في زرع أكثر جدوى 6. وبالتالي، أصبحت iPSCs منصة الواعدة في مجال النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات التجدد. ونظرا لهذه الفوائد، وتحسين البروتوكولات التي يمكن أن تعطي أنقى وزيادة الغلة في أقل قدر من الوقت من مصدر خلية أصغر هي دائما تحت التطوير. أحد الاعتبارات الرئيسية في العثور على البروتوكول الأكثر كفاءة لتطبيقها في المستقبل هو نوع من الخلايا الأولية. معظم أوائل IPSC الجيل بروتوهي الأمثل العواميد لخلايا ملتصقة منذ خطوط التوجيهية الأصلية استميلت من الخلايا الليفية الجلد 4. ومع ذلك، فإن العزلة وإعداد هذه الخلايا هي كثيفة العمالة. أيضا، وعزل الخلايا الليفية الجلد وتشمل العمليات الجراحية الغازية التي يمكن أن تصبح أحد أوجه القصور الرئيسية لتطبيقها على نطاق أوسع.

لذلك، لاستخدام المزيد من iPSCs، لا بد من مصدر الخلية مع اكتساب مريحة. ويعتبر الدم كمصدر للخلايا المثالي منذ تم الحصول عليها من خلال إجراء بدلا مينيملي 7-9. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير تعديل بسيط لتوليد hiPSCs من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) البروتوكول. دون عملية التوسع صعبة من نوع خلية معينة، مثل الخلايا CD34 +، وخلايا الدم الكامل أو PBMCs كانت مطلية بشكل متسلسل على لوحات المغلفة مصفوفة بواسطة الطرد المركزي بعد تنبيغ مع فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل ياماناكا. خفضت هذه الطريقة الوقت اللازم لمرفق من الخلايا العائمة transduced وانخفض فقدان الخلايا المعاد برمجتها التي لم تكن قادرة على تولي بمفردهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: وافق هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC12TISI0861).

1. عزل خلايا الوحيدات من الدم

  1. عزل خلايا الوحيدات (يوم -5)
    1. الحصول على ما لا يقل عن 10 مل من الدم النقي من سحب الدم في أنبوب إعداد الخلية (CPT).
    2. نقل الدم إلى أنبوب جديد مخروطي 50 مل وتمييع مع معقمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في نسبة 1: 4.
      ملاحظة: نسبة أعلى من تخفيف يمكن استخدامها لأعلى نقاء.
    3. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام كثافة التدرج إلى أنبوب مخروطي 50 مل الجديد وطبقة بعناية الدم المخفف على رأس وسائل الإعلام التدرج الكثافة. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) بدون فرامل الطرد المركزي.
    4. نقل بعناية الطبقة الشهباء إلى أنبوب مخروطي 50 مل الجديد، إضافة 30 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب، وغسل الخلايا.
    5. الطرد المركزي الخلايا في 515 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </ لى>
    6. تجاهل برنامج تلفزيوني و resuspend الخلايا في 0.5 مل من وسائل الاعلام خلايا الدم.
    7. عد الخلايا ولوحة 1 × 10 6 خلايا لكل بئر من 24 لوحة جيدا. إضافة إلى برنامج تلفزيوني الآبار المحيطة بها لمنع التبخر.
    8. استقرار الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 قبل تنبيغ. إضافة 0.5 مل إضافية من وسائل الإعلام خلية دماء جديدة في الأيام 3-4 من دون إزعاج الخلايا.

2. تنبيغ من سينداي الفيروسات

  1. تنبيغ (يوم 0)
    1. جمع ونقل خلايا الدم إلى أنبوب مخروطي 15 مل ونعدهم باستخدام عدادة الكريات.
    2. إعداد 3 × 10 5 خلايا لكل التنبيغ وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 515 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    3. تجاهل طاف بواسطة الشفط وresuspend الخلايا في 0.5 مل من وسائل الاعلام خلايا الدم.
    4. نقل الخلايا إلى بئر من لوحة غير المغلفة 24-جيدا.
    5. ذوبان الجليد الخليط سينداي الفيروس في الجليد وإضافته إلى سوخلايا سبينديد. إضافة فيروس سينداي الى الخلايا بناء على توصيات الشركة الصانعة.
    6. ختم لوحة مع فيلم الختم وأجهزة الطرد المركزي أنه في 1150 x ج لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.
    7. بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في CO 2 بين عشية وضحاها (O / N) 5٪.
  2. نقل الخلية إلى مصفوفة المغذية (يوم 1)
    1. في اليوم التالي، ومعطف 24 لوحة جيدا مع vitronectin. تمييع الحل vitronectin في برنامج تلفزيوني لتركيز / مل النهائي 5 ميكروغرام. إضافة 1 مل من vitronectin إلى بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان ذلك في RT لا يقل عن 1 ساعة. إزالة طلاء الحل قبل الاستخدام. لوحات مغلفة يمكن تخزينها في RT لمدة 3 أيام.
    2. نقل عن وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا والفيروس إلى المغلفة جيدا.
    3. جمع الخلايا المتبقية مع 0.5 مل إضافية من وسائل الإعلام خلية دماء جديدة وإضافتها إلى الخلية التي تحتوي أيضا.
    4. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1150 x ج لمدة 10 دقيقة في 35 درجة مئوية.
    5. بعد المائةrifugation، وإزالة طاف، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام التوجيهية، والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 O / N.
  3. نقل الخلية الثانية (يوم 2)
    1. معطف الآبار من 24 لوحة جيدا جديدة مع 5 ميكروغرام / مل vitronectin، كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. استخدام بئر واحدة من لوحة لكل ترنسدوكأيشن.
    2. نقل تعليق خلية من اللوحة الأولى إلى لوحة vitronectin المغلفة حديثا.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك حاجة، يمكن التخلص منها خلايا تعليق. الإجراء المنصوص عليه في الخطوة 2.3 يمكن أن تتكرر 2-3 مرات مع الخلايا تعليق. إذا سوف تتكرر الخطوات، حصاد الخلايا.
    3. وفي الوقت نفسه، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام التوجيهية للبئر من لوحة الأولى، لصيانة، واحتضان ذلك عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 O / N.
    4. الحفاظ على خلايا تعلق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 وإجراء تغيير وسائل الاعلام اليومي مع وسائل الاعلام التوجيهية جديدة. سوف تظهر المستعمرات في أيام 14-21 بعد تنبيغ.
    5. Centrifugالبريد لوحة مطلية حديثا تحتوي على خلايا تعليق في 1150 x ج و 35 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    6. بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 O / N.
    7. في اليوم التالي، وإزالة طاف واستبدالها مع وسائل الاعلام التوجيهية جديدة.
      ملاحظة: الإجراء المذكور في الخطوة 2.3 يمكن أن تتكرر 2-3 مرات مع الخلايا تعليق. إذا سوف تتكرر الخطوات، حصاد الخلايا في طاف وكرر الخطوة 2.3.
    8. الحفاظ على خلايا المرفقة مع التغييرات وسائل الإعلام اليومية حتى يتم التوصل إلى 80٪ confluency.

3. إعادة برمجة الصيانة خلية

  1. صيانة مبكرة بعد ثقافة 24 لوحة جيدا
    1. بعد 7-10 أيام تنبيغ، وبمجرد أن الخلايا هي متكدسة، وإعداد، طبق vitronectin المغلفة من عيار 60 ملم. تمييع الحل vitronectin في برنامج تلفزيوني لتركيز / مل النهائي 5 ميكروغرام. إضافة 1 مل من vitronectin إلى الطبق واحتضان ذلك في RT لا يقل عن 1 ساعة.
    2. غسلالخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا.
    3. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة.
    4. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم في 250 x ج و RT لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 3 مل من وسائل الاعلام التوجيهية جديدة.
    5. لوحة كل الخلايا معلق على المغلفة حديثا طبق من عيار 60 ملم.
    6. إضافة 10 ملي RHO كيناز إلى الخلايا والمحافظة عليها عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حتى الخلايا هي 80٪ متموجة.
  2. انقسام لظهور مستعمرة (إعداد استنساخ فرعي)
    1. إعداد، طبق المغلفة vitronectin 100 ملم، كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا.
    3. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة.
    4. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم في 250 x ج و RT لمدة 2 دقيقة.
    5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعداد 1 × 10 4 خلايا في طبق.
    6. الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج و RT لمدة 2 دقيقة.
    7. و resuspend 1 × 10 4 الخلايا في 6 مل من وسائل الاعلام التوجيهية، لوحة لهم على طبق المغلفة 100 ملم، وإضافة 10 ملي RHO كيناز إلى وسائل الإعلام.
    8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة أسبوع حتى تظهر مستعمرات كبيرة.
      ملاحظة: صيانة وتوسيع المستعمرات لاستنساخ فرعي. استنساخ فرعي وعادة ما يتم في أقل من 5 فقرات.
  3. مستعمرة اختيار باستخدام مستعمرة IPSC فصل الحل
    1. وقبل أسبوع من قطف مستعمرة، والبذور 1 × 10 4 خلايا في، طبق المغلفة vitronectin 100 ملم، كما ذكر في الخطوة 3.2.7.
    2. إعداد، طبق المغلفة vitronectin 60 ملم وذلك بإضافة 2 مل من محلول vitronectin وتفرخ على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    3. من خلال مراقبة من خلال المجهر (40X أو 100X التكبير)، بمناسبة المستعمرات مع حدود واضحة باستخدام قلم علامة. إزالة حل vitronectin من لوحة جديدة في الخطوة 3.3.2 وإضافة 6 ملمن IPSC وسائل الإعلام تستكمل مع 10 ملي RHO كيناز.
    4. إزالة مستنبت من خلايا وغسلها مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. إضافة 1 مل من مستعمرة IPSC حل فصل واحتضان لهم لمدة 30 ثانية في RT.
    6. إزالة الحل من لوحة واحتضان ذلك على RT لمدة 30 ثانية إضافية.
    7. باستخدام ماصة P200، رسم 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام من لوحة وفصل المستعمرات المستهدفة من قبل pipetting. نقل المستعمرات المنتشرة على طبق جديد 100 ملم.
    8. احتضان والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
      ملاحظة: بعد الحصول على مستعمرة IPSC نقية، تمت المحافظة على الخلايا حتى وصلوا إلى مرور وقد تم 10. توصيف بعد لا يقل عن 10 الممرات. وترد التخفيفات الأجسام المضادة والمعلومات التمهيدي في الجدولين 1 و 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويعرض هذا البروتوكول طريقة بسيطة لإعادة برمجة PBMCs معزولة من الدم. باستخدام مزيج من الطلاء المسلسل والطرد المركزي، تم إنشاؤها iPSCs بنجاح. مع هذا الأسلوب، يمكن أن تتولد iPSCs مع كمية صغيرة من خلايا الدم كاملة دون عزل أو توسيع نوع خلية معينة. ولدت لنا بنجاح iPSCs من خلايا فقط 1X10 4 في لوحة الثقافة زنزانة صغيرة.

قبل برمجة، تم عزل خلايا الدم باستخدام وسائل الإعلام التدرج الكثافة. تم transduced خلايا الدم بعد 5 أيام العزلة. ويوضح الشكل 1A مخطط طريقة إعادة برمجة للخلايا تعليق. بعد العزلة، وtransduced PBMCs مع سينداي الفيروس تحتوي على عوامل ياماناكا في غير المغلفة جيدا. في اليوم التالي، وكان حصاد الخلايا تعليق ومطلي على طبق من ذهب المغلفة vitronectin باستخدام الطرد المركزي، في حين أن توري خلاياآلم إلى البئر غير المغلفة والتخلص منها. تم الإبقاء على الخلايا المرفقة التي ظهرت على لوحة المغلفة vitronectin ومزيد من التوسع. تمت المحافظة على الخلايا المرفقة مع التغييرات وسائل الإعلام اليومية باستخدام التوجيهية وسائل الإعلام. وتكرر عملية تصفيح مع الطرد المركزي للحصول على الخلايا تعليق المتبقية.

يمكن تمييز iPSCs برمجتها عن طريق التشكل المتميزة عدة أيامهم بعد تنبيغ. ومع ذلك، خلال برمجة، كان من الصعب على توسيع الخلايا المعاد برمجتها في شكل نقي. في المرحلة الأولى من إعادة برمجة، كانت iPSCs مختلطة مع خلايا المرفقة غير برمجتها متباينة (الشكل 2A). السهم في الشكل 2A يبين أنواع الخلايا التوجيهية مثل في الصورة. قبل التوسع، كانت iPSCs وخلايا أخرى من الصعب التمييز. لذلك، تم الحصول على مستعمرة خالصة إلا من خلال عملية قطف مستعمرة. قبل البذر الخلايا في مناطق ذات كثافة منخفضة، والمستعمرات التي كانت لوقد تم الحصول على ما يكفي من الدو لاختيار، كما هو مبين في الشكل 2B. بعد عزل مستعمرة، تم فصلها من كتل الخلايا إلى خلايا واحدة ومثقف (الشكل 2C). شوهد المستعمرات IPSC نقية بعد ذلك (الشكل 2D). بعد أن تم توسيع iPSCs نقية، تم اختبار نوعية الخلايا. كانت ملطخة الخلايا مع الفوسفاتيز القلوية لتأكيد حالة غير متمايزة من iPSCs (الشكل 3A). وأظهرت المستعمرات المستمدة من iPSCs معزولة عن تلطيخ إيجابي. وتأكدت علامات المحفزة بواسطة تلطيخ المناعي، كما هو موضح في الشكل 3B. الخلايا المعاد برمجتها أعربت غاية علامات المحفزة مثل SSEA4، OCT4، SOX2، هيئة تنظيم الاتصالات، 1-81، KLF4، والأهم من ذلك، TRA-1-60. وأكد التعبير عن علامات المحفزة بواسطة RT-PCR، كما هو موضح في الشكل 3C. تم الكشف عن OCT4 وSOX2، كما هو موضح في البيانات مضان. كانت علامات إضافية مثل NANOG، DPPA5، TDGF1 بوزيتيفوأعرب اعل كذلك.

لمزيد من التحليل، تم تحليل النمط النووي. كما هو مبين في الشكل 4A، أظهرت iPSCs لدت نمطا الكروموسومات العادي. لتأكيد تعدد القدرات الحقيقية، والتمييز بين الخلايا في الأدمة، الأديم المتوسط، والأديم الباطن. وiPSCs لدت متباينة بنجاح في جميع الطبقات الجرثومية الثلاث، وينظر في الشكل 4B. منذ يعرف فيروس سينداي لمنشأة سياحية خالية من تكامله، يظهر إزالة الحمض النووي الفيروسي في الشكل 4C. واحدة من ثلاث خلايا يميل لأن يكون الحمض النووي الفيروسي تبقى، حتى بعد العديد من المقاطع. ومع ذلك، كان هذا الجين المتكاملة القابلة للإزالة من قبل عمليات استنساخ فرعي.

في الختام، لقد أظهرنا بروتوكول توليد iPSCs من PBMCs العائمة. أظهر بروتوكول كفاءة عالية ويتطلب سوى كمية صغيرة من الدم. كانت iPSCs لدت تعدد القدرات العالية وتجنب السادس التكامل راؤول.

الشكل (3)
الشكل 1: مخطط للبروتوكول الجيل IPSC من PBMCs. رسم تخطيطي مفصل للبروتوكول مصممة على أساس النوع المتوسط ​​والجدول الزمني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 2: صورة حقل مشرق من iPSCs المتولدة من PBMCs. (أ) التشكل المبكر للخلايا برمجتها. (ب) صورة من مستعمرة قبل اختيار. (C) الخلايا بعد عملية تنقية مستعمرة قطف. (D) مورفولوجية مستعمرة خالصة. وتشير جميع الحانات نطاق 200 ميكرون. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تعدد القدرات من iPSCs المتولدة من PBMCs. (أ) المستعمرات ملطخة الفوسفاتيز القلوية. صورة (B) الإسفار من iPSCs إنشاؤه. يظهر نسبة الأجسام المضادة في تخفيف الجدول 1. تحليل (C) PCR من علامات المحفزة. وترد معلومات التمهيدي في الجدول 2. وتشير جميع الحانات نطاق 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحميل / 54650 / 54650fig4.jpg "/>
الشكل 4: مزيد من التحليل للiPSCs إنشاؤه. (A) karyogram عادي من IPSC. صورة (B) مضان من الخلايا بعد ثلاثة الجرثومية طبقة التمايز. (C) PCR تحليل سينداي ناقلات فيروسية. واستخدمت غير transduced الخلايا عن السيطرة السلبية، والخلايا تحصد بعد يوم واحد كانت تستخدم التنبيغ كما تحكم إيجابية. وترد معلومات التمهيدي في الجدول 2. وتشير جميع الحانات نطاق 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم الأجسام المضادة تركيز
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
هيئة تنظيم الاتصالات 1-60 1: 200
Sox2 1: 100
هيئة تنظيم الاتصالات 1-81 1: 100
Klf4 1: 250
اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) الأجسام المضادة 1: 400
اليكسا فلور 594 الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L) الأجسام المضادة 1: 400

الجدول 1. التخفيفات الأجسام المضادة.

اسم الهدف اتجاه تسلسل التمهيدي حجم
OCT3 / 4 إلى الأمام ACC CCT GGT GTG AA دول مجلس التعاون الخليجي 190
عكسي GGC TGA ATA الدعم المالي المشروط TCC CAواتا
SOX2 إلى الأمام CAG CGC ATG GAC AGT TAC 321
عكسي GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG إلى الأمام AAA GGC AAA الجهاز المركزي للمحاسبات ومجلس التعاون الجمركي ACT 270
عكسي الهيئة العامة للضرائب ATT CTT CGG التقييم القطري المشترك GTT
LIN28 إلى الأمام GTT CGG CTT CCT GTC CAT 122
عكسي CTG CCT CAC CCT CCT TCA
DPPB5 إلى الأمام CGG CTG CTG AAA ATT TT دول مجلس التعاون الخليجي 215
عكسي AGT TTG AGC ATC CCT شركة الخليج المتحدة TC
TDGF1 إلى الأمام TCC عقاري TAC GGA CGG AAC TG 140
عكسي AGA AAT GCC TGA GGA مجموعة الاهلي CA
SEV إلى الأمام GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C 181
عكسي ACC AGA الجهاز المركزي للمحاسبات GAG TTT مجموعة الاهلي AGA TAT GTA TC
كوس إلى الأمام ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
عكسي ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4 إلى الأمام TTC CTG CAT دول مجلس التعاون الخليجي AGA GGA دول مجلس التعاون الخليجي C 410
عكسي AAT GTA TCG مجموعة الاهلي GTG لجنة مكافحة الإرهاب AA

الجدول 2. المعلومات التمهيدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) وأظهرت العديد من أوجه القصور، ويتطلب ضرورة وجود أداة بديلة. لذلك، جاءت تطور الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من خلال ياماناكا تحت الاضواء الدولية. وكان ما يقرب من عقد من الزمان منذ اكتشف ياماناكا أن تعدد القدرات يمكن أن يتسبب ذلك بإضافة أربعة فقط الجينات في الخلايا الجسدية للبالغين. منذ iPSCs هي "يتسبب" من الخلايا الجسمية الناضجة، فإنها يمكن أن تهرب من القضايا الأخلاقية التي كانت ذات يوم القلق المتعلقة المجالس الاقتصادية والاجتماعية. على عكس المجالس الاقتصادية والاجتماعية، iPSCs يمكن أن تتولد من كل فرد. ولذلك، فإنها يمكن أن تستخدم في البحوث الطبية شخصية وغيرها من الدراسات، مثل فحص المخدرات، والنمذجة المرض، أو طب التجديد.

تم إنشاء أول IPSC البشرية من الخلايا الليفية الجلدية في عام 2007. وجماعات مختلفة برمجتها بنجاح هذا نوع من الخلايا، ولكن يحتاج الأمر إلى إجراء العمليات الجراحية الغازية للحصول على هذه الخلية الأولية. لذلك، لم يكن فكرةمصدر ل لتوليد مختلف iPSCs المرض أو تصميم الطب التجديدي. هناك حاجة لبديل وأنواع الخلايا التي تم الحصول عليها بسهولة، مثل الخلايا الكيراتينية، وحيدات البول، وخلايا الدم. ومع ذلك، هذه الخلايا من الصعب التوسع، وبعض منهم لديهم فرصة أكبر للتلوث 10.

في هذه الدراسة، قدمنا ​​البروتوكول الذي يمكن أن تولد iPSCs من خلايا الدم الكاملة مثل PBMCs بنجاح. دون أي عملية التوسع من نوع خلية معينة، ويشير هذا البروتوكول طريقة بسيطة نسبيا لتوليد iPSCs، حتى من كمية صغيرة من خلايا الدم الأولية. مرة واحدة تم عزل PBMCs من الدم، وقد استقرت الخلايا في وسائل الإعلام خلايا الدم لمدة 5 أيام. وكانت الخطوة استقرار قبل تنبيغ حاسمة في هذا البروتوكول. وكانت كفاءة إعادة برمجة أفضل بعد احتضان الخلايا في وسائل الإعلام خلايا الدم. تم استخدام هذه الوسائط لتوسيع خلايا CD34 +. ومع ذلك، عندما خلايا الدم كله وأبقى في هذا ليديا لمدة 5 أيام، وكان عدد الخلايا متطابقة تقريبا مع أول احصاء. باستخدام خلايا الدم كله، كان من الصعب تأكيد ما اذا كان قد تم توسيع الخلايا CD34 +. ومع ذلك، يبدو أن خطوة استقرار لنفسها بأن تكون مهمة لإعادة برمجة ناجحة.

بعد تنبيغ، نحن مطلي متسلسل الخلايا على طبق من ذهب المغلفة vitronectin بواسطة الطرد المركزي. في الأصل، غرق الخلايا المعاد برمجتها إلى قاع البئر بعد تنبيغ. عن طريق زيادة الخلايا مع قوة ميكانيكية أو الطرد المركزي، استطاعت أن نعلق وتتكاثر الخلايا transduced. ومع ذلك، منذ استخدام بروتوكول خلايا الدم كله، أدى النصف من محاولة التجارب مع عينات مختلفة في أنواع مختلفة من الأشكال التضاريسية عندما موسعة. ولذلك، كان عزل المستعمرات IPSC نقية من قطف مستعمرة حاسمة في هذا البروتوكول. وأظهرت الخلايا توسعت من مستعمرة معزولة عن خصائص iPSCs نقية.

على الرغم من الفوائد الأخرى، iPSCs لهاعدة عقبات على التغلب عليها. منذ عدة عوامل ياماناكا معروفة المسرطنة، هناك مخاوف من أن iPSCs يمكن أن تتطور إلى أورام في الجسم الحي. ولذلك، من المهم أن الخلايا المعاد برمجتها ليس لها التعبير الجيني خارجي المتبقي من التكامل. في السنوات الأولى بعد تطوير iPSCs، والفيروسات، مثل الفيروسات وlentiviruses، كانت تستخدم لإعادة البرمجة. وكان معدل إعادة برمجة عالية بنجاح، ولكن هذه الفيروسات تتطلب التكامل عشوائية في جينوم الخلية. لهذا السبب، وقد وضعت العديد من الطرق الأخرى. ومن المعروف أن الفيروسات مثل فيروس سينداي الى تنبيغ الخلايا دون التكامل، وأساليب أخرى باستخدام جزيئات صغيرة وناقلات episomal تم تطويرها كذلك. في هذه الدراسة، كنا فيروس سينداي لإعادة برمجة. وكان معدل التكامل منخفضة نسبيا بالمقارنة مع lentiviruses. أكدنا أيضا أن هناك بعض المكونات الفيروسية المتبقية في iPSCs إنشاؤه. أدى واحدة من ثلاث محاكمات في integratأيون، حتى بعد 15-20 الممرات. ومع ذلك، كان هذا التكامل قابل للإزالة من قبل استنساخ فرعي المستعمرات المشتقة من خلية واحدة. في تجربتنا، وكانت كثافة للحصول على مستعمرة صحية المشتقة من خلية واحدة 1X10 4 خلايا في طبق 100 ملم. تم القبض على المستعمرات التي نتجت في شكل دائري مثالي وتوسعت لPCR إعادة تأكيد المكونات الفيروسية المتبقية. واستمرت المستعمرات المشتقة من الخلايا غير المدمجة لاستخدامها مرة أخرى. مرة واحدة حذف، حافظت خلايا حالة غير متكاملة.

في هذه الدراسة، فإننا نقترح على بروتوكول لإعادة برمجة خلايا الدم. أضفنا العديد من الخطوات، مثل طلاء المسلسل والطرد المركزي، لزيادة معدل إعادة برمجة الخلايا العائمة. وقد تم هذا الأسلوب مع PBMCs والخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs). وقد استخدم هذا البروتوكول لتوليد iPSCs زيجوت متماثلة الألائل في مرافق برنامج الرصد العالمي في كوريا الجنوبية. تبدو مجموعتنا قدما في تسريع عملية إعادة برمجة IPSC باستخدامبروتوكول لدينا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44, (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7, (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2, (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics