Induced pluripotent stamcelle Generation fra Blood Cells hjelp Sendai Virus og sentrifugering

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den siste utviklingen av menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) viste at modne somatiske celler kan gå tilbake til en udifferensiert, pluripotent tilstand. Nå er omprogrammering utført med forskjellige typer av voksen somatiske celler: keratinocytter, urin celler, fibroblaster, etc. Tidlige forsøk ble vanligvis utført med dermale fibroblaster. Men dette krevde en invasiv kirurgisk prosedyre for å oppnå fibroblaster fra pasientene. Derfor suspensjonsceller, for eksempel blod og urin celler, ble ansett som ideell for omprogrammering på grunn av fordelene med å skaffe de primære celler. Her rapporterer vi en effektiv protokoll for IPSC generasjon fra perifere mononukleære blodceller (PBMC). Ved plating de omsatte PBMC serielt til en ny, matrise-belagt plate ved hjelp av sentrifugering, kan denne protokollen lett gi IPSC kolonier. Denne fremgangsmåte er også anvendelig for å navlestreng blod mononukleære celler (CBMCs). Denne studien viser en enkel og effektiv protocol for omprogrammering av PBMC og CBMCs.

Introduction

Stamceller har vært en av de mest attraktive materialer i klinisk terapi for de siste flere tiår 1. De attraktive egenskapene til stamceller er pluripotency og evnen til å fornye seg selv. I 1981 ble den første embryonale stamceller (ESCS) isolert fra mus embryo 2. Men når teknikken ble brukt til menneskelige embryo, det sto overfor flere etiske problemstillinger.

I 2006, da Dr. Yamanaka og hans team omprogrammert den første pluripotent celle fra musesomatiske celler, gjenvant stamcellefeltet sin mulighet og interesse ble taktene tre. Ved å levere flere definerte faktorer, pluripotente stamceller var vellykket "indusert" fra voksne somatiske celler, og ble dermed kåret til "indusert pluripotent stamceller (iPSCs)." I 2007 ble denne teknikken brukt til menneskeceller 4, som gir cellene med de eksakte egenskapene til ESCs men ingen av den etiske debatten. Teoretisk iPSCs kan genereres fra en hvilken som helst celletype hentet fra en hvilken som helst person eller pasient. Pasient-spesifikke iPSCs stiger som en potensiell verktøy som kan simulere sykdommen fenotyper og epigenetiske forhold til hver enkelt pasient. Ved hjelp av genet redigering eller andre metoder som kan reversere den patogene tilstand, kan pasientspesifikke iPSCs også brukes i personlig medisin 5. Videre er iPSCs mindre forbundet med immunavstøtning fordi de har den samme identitet som immun donor, slik at auto-transplantasjon mer gjennomfør 6. Derfor har iPSCs blitt den mest lovende plattformen i sykdom modellering, legemiddelscreening, og regenererende behandling. Gitt disse fordelene, forbedret protokoller som kan gi renere og høyere avkastning på minst mulig tid fra den minste celle kilden er stadig under utvikling. En viktig faktor for å finne den mest effektive protokollen for fremtidig anvendelse er den primære celletype. De fleste av de tidlige IPSC generasjon protokolonner er optimalisert for heft celler siden den originale IPSC linjer ble indusert av hud fibroblaster 4. Imidlertid isolering og fremstilling av disse cellene er arbeidskrevende. Dessuten er isolering av hudfibroblaster omfatter invasive kirurgiske inngrep som kan bli en stor brist for bredere anvendelse.

Derfor, for den videre anvendelse av iPSCs, er en celle kilde med praktisk anskaffelse nødvendig. Blod er å anse som en ideell celle kilde siden det er innhentet gjennom en ganske minimal invasiv prosedyre 7-9. I denne studien, har vi utviklet en enkel modifikasjon av protokollen generere hiPSCs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC). Uten den vanskelige prosessen med utvidelse av en spesifikk celletype, for eksempel CD34 + celler, ble hele blodceller eller PBMC serielt sådd ut på matrix-belagte plater ved sentrifugering etter transduksjon med Sendai-virus inneholdende Yamanaka faktorer. Denne fremgangsmåten reduserer tiden som kreves forfesting av transduserte celler flytende og redusert tap av omprogrammeres celler som ikke var i stand til å feste på egenhånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk Uttalelse: Denne studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of The Catholic University of Korea (KC12TISI0861).

1. Isolering av monocyttiske celler fra blod

  1. Isolering av monocyttiske celler (Dag -5)
    1. Få minst 10 ml friskt blod fra en blod uavgjort i en celle forberedelse tube (CPT).
    2. Overføre blodet til en ny 50-ml konisk rør og fortynne den med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) ved en 1: 4 forhold.
      MERK: En høyere andel av fortynning kan brukes for høyere renhet.
    3. Tilsett 10 ml tettshetsgradient medier til en ny 50-ml konisk rør og nøye lag fortynnet blod på toppen av tetthet gradient media. Sentrifuger ved 750 xg i 30 minutter ved romtemperatur (RT) uten sentrifugering brems.
    4. overføre nøye det brungule sjiktet til en ny 50-ml konisk rør, tilsett 30 ml PBS til røret, og vaske cellene.
    5. Sentrifuger cellene ved 515 xg i 5 minutter ved romtemperatur. </ Li>
    6. Kasser PBS og resuspender cellene i 0,5 ml blodcellemateriale.
    7. Tell cellene og platen 1 x 10 6 celler pr brønn i en 24-brønns plate. Legg PBS til de omkringliggende brønner for å forhindre fordampning.
    8. Stabilisere cellene i 5 dager ved 37 ° C i 5% CO2 før transduksjon. Legg ytterligere 0,5 ml friskt blod celle media på dager 3-4 uten å forstyrre cellene.

2. Transduksjon av Sendai Virus

  1. Transduksjon (dag 0)
    1. Samle og overføre blodcellene til en 15-ml konisk rør og telle dem ved hjelp av en hemocytometer.
    2. Forbered 3 x 10 5 celler pr transduksjon og sentrifuger cellene ved 515 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Kast supernatanten ved sug og resuspender cellene i 0,5 ml blodcellemateriale.
    4. Overfør cellene til en brønn av en ikke-belagte 24-brønners plate.
    5. Tine Sendai virus blandingen i isen og legge den til suspended celler. Legg Sendai virus til cellene basert på produsentens anbefalinger.
    6. Tett plate med en tettende film og den sentrifuge ved 1150 xg i 30 min ved 30 ° C.
    7. Etter sentrifugering, inkubere cellene ved 37 ° C i 5% CO2 over natten (O / N).
  2. Celle overføring til materen matrise (dag 1)
    1. Den neste dagen, strøk en 24-brønns plate med vitronectin. Fortynn vitronektin løsning i PBS til en endelig 5 ug / ml konsentrasjon. Tilsett 1 ml av vitronektin til en brønn i en 24-brønners plate og inkuber det ved romtemperatur i minst 1 time. Fjerne beleggoppløsningen før bruk. Belagte plater kan lagres i RT i 3 dager.
    2. Overføre alle media inneholdende celler og virus i den belagte brønnen.
    3. Samle de gjenværende cellene med ytterligere 0,5 ml friskt blod celle media og legge det til celleholdige godt.
    4. Sentrifuger plate ved 1150 xg i 10 min ved 35 ° C.
    5. etter ørerifugation, fjern supernatanten, tilsett 1 ml IPSC media, og opprettholde cellene ved 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
  3. Andre celle overføring (Dag 2)
    1. Belegge brønnene i en ny 24-brønners plate med 5 ug / ml vitronectin, som beskrevet i trinn 2.2.1. Bruke en brønn på platen for hver transduksjon.
    2. Overfør cellesuspensjonen fra den første plate til den nylig belagte vitronektin plate.
      MERK: Hvis ikke det er nødvendig, kan suspensjonsceller kastes. Fremgangsmåten beskrevet i trinn 2.3 kan bli gjentatt 2-3 ganger med suspensjonsceller. Hvis trinnene vil bli gjentatt, høste celler.
    3. I mellomtiden, tilsett 1 ml IPSC media til brønnen av den første plate, for vedlikehold, og inkuber det ved 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
    4. Opprettholde de festede celler ved 37 ° C og 5% CO2 og utføre en daglig mediaendring med frisk IPSC media. Kolonier vises på dager 14-21 etter transduksjon.
    5. sentrifugee den nylig belagte plate inneholdende suspensjons cellene ved 1150 xg og 35 ° C i 10 minutter.
    6. Etter sentrifugering, inkubere cellene ved 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
    7. Den neste dag, fjern supernatanten og erstatte den med ferske IPSC media.
      MERK: Prosedyren er nevnt i punkt 2.3 kan gjentas 2-3 ganger med suspensjonsceller. Hvis fremgangsmåten blir gjentatt, høste cellene i supernatanten og gjenta trinn 2.3.
    8. Opprettholde vedlagte celler med daglige medie endringer før 80% konfluens er nådd.

3. omprogrammeret Cell Vedlikehold

  1. Tidlig vedlikehold etter at 24-brønners platekultur
    1. 7-10 dager etter transduksjon, når cellene er konfluent, utarbeide en vitronectin-belagt, 60-mm parabolen. Fortynn vitronektin løsning i PBS i en slutt 5 ug / ml konsentrasjon. Tilsett 1 ml av vitronektin til fatet og inkubere den ved romtemperatur i minst 1 time.
    2. Vaskceller med PBS og tilsett 1 ml PBS / 1 mM EDTA for å løsne cellene.
    3. Inkubere dem ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 min.
    4. Høste celler og sentrifuger dem ved 250 xg og RT i 2 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 3 ml frisk IPSC media.
    5. Plate alle resuspendert celler på den nylig belagt 60-mm parabolen.
    6. Tilsett 10 mM RHO-kinase-inhibitor til cellene og holde dem ved 37 ° C i 5% CO2 inntil cellene er 80% konfluent.
  2. Split for koloni utseende (Subkloning Forberedelse)
    1. Forbered en vitronectin-belagt, 100-mm fatet, som beskrevet i trinn 3.1.2.
    2. Vask cellene med PBS og tilsett 1 ml PBS / 1 mM EDTA for å løsne cellene.
    3. Inkubere dem ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 min.
    4. Høste celler og sentrifuger dem ved 250 xg og RT i 2 min.
    5. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og forberede 1 x 10 4 celler per parabolen.
    6. Sentrifuger cellene ved 250 xg og RT i 2 min.
    7. Resuspender 1 x 10 4 celler i 6 ml IPSC media, plate dem på den belagte 100-mm fatet, og tilsett 10 mM RHO kinase inhibitor til media.
    8. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2 i en uke til store kolonier til syne.
      MERK: Opprettholde og utvide koloniene for subkloning. Subkloning er vanligvis gjort på under 5 passasjer.
  3. Colony plukke bruker IPSC koloni løsne løsning
    1. En uke før koloni plukking, frø 1 x 10 4 celler i en vitronectin-belagt, 100-mm fatet, som nevnt i punkt 3.2.7.
    2. Forbered en vitronectin belagt, 60-mm fatet ved å tilsette 2 ml vitronectin løsning og inkubasjon ved romtemperatur i minst en time.
    3. Ved å observere gjennom et mikroskop (40X eller 100X forstørrelse), merker kolonier med klare grenser ved hjelp av en tusj. Fjern vitronectin løsning fra den nye plate laget i trinn 3.3.2 og legge til 6 mlav IPSC media supplert med 10 mM RHO kinase.
    4. Fjerne dyrkningsmediet fra cellene og vask dem med 3 ml PBS.
    5. Tilsett 1 ml IPSC koloni demontere løsning og inkuber dem i 30 s ved RT.
    6. Fjerne løsningen fra platen og inkuber det ved RT i ytterligere 30 sek.
    7. Ved hjelp av en P200 pipette, trekke 200 ul media fra platen og ta målrettede kolonier ved pipettering. Overfør de spredte kolonier i den nye 100-mm fatet.
    8. Inkuber og opprettholde cellene ved 37 ° C i 5% CO2.
      MERK: Etter å ha fått en ren IPSC koloni ble cellene opprettholdes inntil de nådde passasje 10. Karakterisering ble gjort etter at minst 10 passasjer. Antistoff-fortynninger og primer informasjon er vist i tabellene 1 og 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen gir en enkel metode for å omprogrammere PBMC isolert fra blod. Ved hjelp av en kombinasjon av serie plating og sentrifugering ble iPSCs vellykket generert. Med denne metoden kan iPSCs bli generert med en liten mengde av fullblodceller uten å isolere eller utvidelse av en bestemt celletype. Vi har med hell generert iPSCs fra bare 1x10 4-celler i en liten cellekulturplate.

Før omprogrammering, ble blodceller isolert ved hjelp av tetthetsgradient media. Blodcellene ble transdusert 5 dager etter isolering. Figur 1A illustrerer ordningen med omprogrammering metode for suspensjonsceller. Etter isolering ble PBMC transdusert med Sendai-virus inneholdende Yamanaka faktorer i en ikke-belagte brønnen. Den neste dag, suspensjonsceller ble høstet og sådd ut på en vitronektin-belagte plate ved hjelp av sentrifugering, mens cellene attverket til den ikke-belagte brønn ble kastet. Vedlagte celler som dukket opp på vitronectin-belagt plate ble beholdt og utvidet ytterligere. Vedlagte celler ble opprettholdt med daglige medie endringer med IPSC medier. Pletterings Prosessen med sentrifugering ble gjentatt for de gjenværende suspensjonsceller.

Omprogrammeres iPSCs kan være preget av sine distinkte morfologi flere dager etter transduksjon. Men under omprogrammering, det var vanskelig å utvide omprogrammeres celler i en ren form. På et tidlig stadium av omprogrammering, de iPSCs ble blandet med vedlagte ikke-omprogrammeres differensierte celler (figur 2A). Pilen i figur 2A viser IPSC-lignende celletyper i bildet. Før utvidelse, de iPSCs og andre celler var vanskelig å diskriminere. Derfor er en ren koloni ble bare oppnådd ved hjelp av kolonien plukkeprosessen. Ved utsåing av cellene i en lav tetthet, kolonier som var large nok for å plukke ble erholdt, som vist i figur 2B. Etter isolering av kolonien, ble celleklumper dissosiert til enkeltceller og dyrket (figur 2C). Pure IPSC kolonier ble sett etterpå (figur 2D). Etter de rene iPSCs ble ekspandert, ble kvaliteten av cellene testet. Cellene ble farget med alkalisk fosfatase å bekrefte udifferensiert tilstand av iPSCs (figur 3A). Kolonier som stammer fra isolerte iPSCs alle viste positiv farging. Pluripotente markører ble bekreftet ved immunofluorescens farging, vist i figur 3B. De omprogrammeres celler sterkt uttrykt pluripotente markører som SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, og, viktigst, TRA-1-60. Ekspresjon av pluripotent markører ble bekreftet ved RT-PCR, er vist i figur 3C. OCT4 og SOX2 ble påvist, som vist i fluorescens dataene. Andre markører som Nanog, DPPA5, TDGF1 var positivEly uttrykt i tillegg.

For ytterligere analyse, ble en karyotype analyse gjort. Som vist i figur 4A, de genererte iPSCs viste en normal kromosomal mønster. For å bekrefte sant pluripotency, ble cellene differensiert i ektoderm, mesoderm og endoderm. De genererte iPSCs hell differensiert i alle tre bakterie lag, sett i figur 4B. Siden Sendai-virus er kjent for sin integrasjon lokaler, er fjerning av virus-DNA er vist i figur 4C. En av tre celler som hadde tendens til å ha viral DNA forblir, selv etter flere passeringer. Men det integrerte genet var fjernbar ved subkloning prosesser.

Avslutningsvis har vi vist en protokoll generere iPSCs fra flytende PBMC. Protokollen viste høy effektivitet og kreves bare en liten mengde av blod. De genererte iPSCs hadde høy pluripotency og unngikk vi ral integrasjon.

Figur 3
Figur 1: Skjema for IPSC generasjon protokollen fra PBMC. Et detaljert diagram av den utformet protokoll basert på mediet typen og tidslinjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 2: Bright-feltet bilde av iPSCs generert fra PBMC. (A) Tidlig morfologi omprogrammeres celler. (B) Bilde av en koloni før plukke. (C) celler etter kolonien plukkerenseprosessen. (D) Morfologi av en ren koloni. Alle skala barer indikerer 200 mikrometer. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: pluripotency av iPSCs generert fra PBMC. (A) Colonies farget med alkalisk fosfatase. (B) Fluorescens bilde av de genererte iPSCs. Antistoffet fortynningsforholdet er vist i tabell 1. (C) PCR-analyse av pluripotent markører. Primer informasjon er gitt i tabell 2. Alle skala barer indikerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

laste opp / 54650 / 54650fig4.jpg "/>
Figur 4: videre analyse av genererte iPSCs. (A) Normal karyogram av IPSC. (B) Fluorescens bilde av cellene etter tre-lags bakterie differensiering. (C) PCR-analyse av Sendai virale vektorer. Ikke-transduserte celler ble anvendt som negativ kontroll, og cellene høstet en dag etter transduksjon ble anvendt som positiv kontroll. Primer informasjon er gitt i tabell 2. Alle skala barer indikerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

antistoff Name Konsentrasjon
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
TRA-1-60 1: 200
Sox2 1: 100
TRA-1-81 1: 100
Klf4 1: 250
Alexa Fluor 488 geit-anti-mus IgG (H + L) antistoff 1: 400
Alexa Fluor 594 geit-anti-kanin IgG (H + L) antistoff 1: 400

Tabell 1. Antistoff fortynninger.

Target Name Retning primer Sequence Størrelse
OCT3 / 4 Framover ACC CCT GGT GCC GTG AA 190
Omvendt GGC TGA ATA CCT TCC CAEn ATA
SOX2 Framover CAG CGC ATG GAC AGT TAC 321
Omvendt GGA GTG GGA GGA AGA GGT
Nanog Framover AAA GGC AAA CAA CCC ACT 270
Omvendt GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 Framover GTT CGG CTT CCT GTC CAT 122
Omvendt CTG CCT CAC CCT CCT TCA
DPPB5 Framover CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT 215
Omvendt AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 Framover TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG 140
Omvendt AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA
SeV Framover GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C 181
Omvendt ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS Framover ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
Omvendt ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4 Framover TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C 410
Omvendt AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA

Tabell 2. Primer informasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden embryonale stamceller (ESCS) viste flere mangler, ble det behov for et alternativt verktøy er nødvendig. Derfor er utviklingen av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) av Yamanaka kom under det internasjonale søkelyset. Det har vært nesten et tiår siden Yamanaka oppdaget at pluripotency kan induseres ved å legge til bare fire gener inn voksne somatiske celler. Siden iPSCs er "indusert" fra modne somatiske celler, kan de unngå etiske problemstillinger som en gang hadde vært bekymring knyttet til ESCs. I motsetning til ESCs kan iPSCs bli generert fra hver enkelt. Derfor kan de anvendes i tilpasset medisinsk forskning og andre studier, som legemiddelscreening, sykdom modellering, eller regenerative medisiner.

Den første menneskelige IPSC ble generert fra dermale fibroblaster i 2007. Ulike grupper hell omprogrammeres denne celletype, men en invasiv kirurgisk prosedyre var nødvendig for å oppnå dette primære celle. Det var derfor ikke den idél kilde for å generere ulike sykdoms iPSCs eller designe regenerativ medisin. En alternativ og enkelt oppnådde celletyper ble nødvendig, slik som keratinocytter, urin monocytter og blodceller. Men disse cellene er vanskelig å utvide, og noen av dem har en høyere sjanse for forurensning 10.

I denne studien presenterte vi en protokoll som kan lykkes generere iPSCs fra fullblodceller som PBMC. Uten noen ekspansjonsprosess med en spesifikk celletype, tyder dette på protokollen en forholdsvis enkel metode for å generere iPSCs, selv fra en liten mengde av primære blodceller. Når PBMC ble isolert fra blodet ble cellene stabilisert i blodcellemateriale i 5 dager. Stabiliseringstrinnet før transduksjon var avgjørende i denne protokollen. Den omprogrammering effektivitet var bedre etter inkubering av cellene i blodceller media. Dette medium ble anvendt for utvidelse av CD34 + celler. Men da hele blodceller ble opprettholdt i dette megdia i 5 dager, celletallet var nesten identisk med den første teller. Ved hjelp av fullblodceller, var det vanskelig å få bekreftet om CD34 + celler som var blitt utvidet. Ikke desto mindre, stabiliseringstrinnet seg så ut til å være viktig for vellykket omprogrammering.

Etter transduksjon, vi serielt platet cellene på en vitronectin-belagt plate ved sentrifugering. Opprinnelig, omprogrammeres cellene sank til bunnen av brønnen etter transduksjon. Ved å forsterke cellene med mekanisk kraft eller sentrifugering, de omsatte cellene var i stand til å feste og sprer. Imidlertid, siden den protokollen som brukes fullblodceller, halvparten av de forsøk forsøk med forskjellige prøver resulterte i forskjellige typer av morfologi når den er utvidet. Derfor isolering av rene IPSC kolonier ved koloni plukking var avgjørende i denne protokollen. Cellene utvidet fra isolert koloni viste alle egenskapene til en ren iPSCs.

Til tross for andre ytelser, iPSCs haflere hindringer å overvinne. Siden flere Yamanaka faktorer er kjent onkogener, det er bekymringer som iPSCs kan utvikle seg til tumorer in vivo. Derfor er det viktig at omprogrammeres cellene ikke har noen gjenværende eksogent gen-ekspresjon ved integrasjon. I de første årene etter at utviklingen av iPSCs, virus, for eksempel retrovirus og lentiviruses, ble brukt for omprogrammering. Den omprogrammering hastigheten var vellykket høy, men disse virusene nødvendig tilfeldig integrering inn i cellen genomet. Av denne grunn har flere andre metoder blitt utviklet. Virus som Sendai-virus er kjent for å transdusere cellene uten integrasjon, og andre metoder ved hjelp av små molekyler og episomale vektorer har blitt utviklet i tillegg. I denne studien brukte vi Sendai-virus for omprogrammering. Integrasjonen hastigheten var relativt lav i forhold til lentiviruses. Vi bekreftet også at det var noen gjenværende virale komponenter i de genererte iPSCs. En av tre forsøk resulterte i integration, selv etter 15-20 passasjer. Men denne integreringen var fjernbar ved subkloning av koloniene avledet fra en enkelt celle. I vår erfaring, tettheten for å få en sunn koloni stammer fra en enkelt celle var 1x10 4 celler per 100-mm fatet. Koloniene som resulterte i en perfekt sirkulær form ble plukket og ekspandert for PCR gjen bekreftelse av de gjenværende virale komponenter. Koloniene som stammer fra ikke-integrerte celler ble opprettholdt i ytterligere bruk. Etter slettingen cellene opprettholdt den ikke-integrert tilstand.

I denne studien foreslår vi en protokoll for blodceller omprogrammering. Vi har lagt flere trinn, slik som serieplettering og sentrifugering, for å øke den hastighet omprogrammering av de flytende cellene. Denne metoden ble gjort med PBMC og ledningen blod mononukleære celler (CBMCs). Denne protokollen ble brukt til å generere homozygote iPSCs i GMP fasiliteter i Sør-Korea. Vår gruppe ser frem til akselerasjon av IPSC omprogrammering prosessen ved hjelpvår protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44, (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7, (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2, (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics