Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den senaste tidens utveckling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) visade att mogna somatiska celler kan återgå till en odifferentierad, pluripotent tillstånd. Nu är omprogrammering göras med olika typer av vuxna somatiska celler: keratinocyter, urin-celler, fibroblaster, etc. Tidiga experiment vanligen med dermala fibroblaster. Detta krävde dock ett invasivt kirurgiskt ingrepp för att erhålla fibroblaster från patienterna. Därför suspensionsceller, såsom blod-och urinceller, ansågs vara idealisk för omprogrammering på grund av bekvämlighet att erhålla de primära cellerna. Här rapporterar vi ett effektivt protokoll för iPSC generationen från perifera mononukleära blodceller (PBMC). Genom att stryka de omvandlade PBMC serie till en ny, matris-belagda plattan med hjälp av centrifugering, kan detta protokoll enkelt ge IPSC kolonier. Denna metod är också tillämplig på navelsträngsblodmononukleära celler (CBMCs). Denna studie presenterar en enkel och effektiv protocol för omprogrammering av PBMC och CBMCs.

Introduction

Stamceller har varit en av de mest attraktiva material i klinisk terapi för de senaste årtiondena 1. De attraktiva egenskaper stamceller är pluripotens och förmågan att själv förnya. 1981 var de första embryonala stamceller (ESCS) isolerad från musembryo 2. Men när tekniken tillämpas på mänskliga embryon, inför den flera etiska frågor.

År 2006, när Dr. Yamanaka och hans team omprogrammeras den första pluripotent cell från mus somatiska celler, stamcellsområdet återfått sin möjlighet och intresse återuppväcktes 3. Genom att leverera flera definierade faktorer, pluripotenta stamceller var framgångsrikt "inducerad" från vuxna somatiska celler, och har således namnet "inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)." År 2007 var denna teknik tillämpas på mänskliga celler 4, vilket ger celler med de exakta egenskaperna hos ESCs men ingen av etisk debatt. Teoretiskt, iPSCs kan genereras från alla celltyper som erhållits från någon individ eller patient. Patientspecifika iPSCs ökar som ett potentiellt verktyg som kan simulera fenotyper sjukdom och epigenetiska förhållandena i varje enskild patient. Med hjälp av genen redigering eller andra metoder som kan vända den patogena tillstånd, kan patientspecifika iPSCs också användas i personlig medicin fem. Dessutom är iPSCs mindre samband med avstötning eftersom de har samma immun identitet som donator, vilket gör auto-transplantation mer genomförbar 6. Därför har iPSCs blivit den mest lovande plattform i sjukdomsmodellering, drug screening, och regenerativ behandlingar. Med tanke på dessa fördelar, förbättrade protokoll som kan ge renare och högre avkastning på kortast tid från den minsta cellkällan är ständigt under utveckling. En viktig fråga att hitta den mest effektiva protokollet för framtida tillämpning är den primära celltyp. De flesta av de tidiga iPSC generationen protocols är optimerade för vidhäftande celler sedan de ursprungliga IPSC linjerna inducerades ur hudfibroblaster 4. Emellertid isolering och beredning av dessa celler är arbetskrävande. Även isolering av hudfibroblaster inkluderar kirurgiska ingrepp som kan bli en stor brist för bredare tillämpning.

Därför för vidare användning av iPSCs är en cellkälla med bekväm förvärv krävs. Blod betraktas som en ideal cellkälla eftersom den erhålls genom en ganska minimalt invasiv procedur 7-9. I denna studie har vi utvecklat en enkel modifiering av protokollet genererar hiPSCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC). Utan den svåra expansionsprocessen av en specifik celltyp, såsom CD34 + celler, hela blodkroppar eller PBMC seriellt ströks ut på matris-belagda plattor genom centrifugering efter transduktion med Sendai-virus innehållande Yamanaka faktorer. Denna metod reduceras den tid som krävs förfastsättning av transducerade flytande celler och minskade förlusten av omprogrammerade celler som inte var i stånd att fästa på egen hand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik: Den här studieprotokoll godkändes av Institutional Review Board av det katolska universitetet i Korea (KC12TISI0861).

1. Isolering av monocytiska celler från blod

  1. Isolering av monocytiska celler (Dag -5)
    1. Erhålla åtminstone 10 ml av färskt blod från en bloddragningen i en beredning cell rör (CPT).
    2. Överföra blodet till en ny 50-ml koniska rör och späd den med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid en 1: 4-förhållande.
      OBS: En högre andel av utspädning kan användas för högre renhet.
    3. Tillsätt 10 ml densitetsgradient media till en ny 50-ml koniska rör och försiktigt skikt det utspädda blodet ovanpå densitetsgradientlösningen media. Centrifugera vid 750 xg under 30 min vid rumstemperatur (RT) utan ett centrifugeringsbroms.
    4. Försiktigt överföra koncentratlagret till en ny 50 ml koniska rör, tillsätt 30 ml PBS till röret, och tvätta cellerna.
    5. Centrifugera cellerna vid 515 xg under 5 min vid RT. </ Li>
    6. Kassera PBS och återsuspendera cellerna i 0,5 ml blod cellmedia.
    7. Räkna celler och plattan 1 x 10 6 celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Lägga PBS till de omgivande brunnarna för att förhindra avdunstning.
    8. Stabilisera cellerna under 5 dagar vid 37 ° C i 5% CO2 före transduktion. Tillsätt ytterligare 0,5 ml av färskt blod cellmedia på dagarna 3-4 utan att störa cellerna.

2. Transduktion av Sendai-virus

  1. Transduktion (Dag 0)
    1. Samla och överföra blodkroppar till en 15-ml koniska rör och räkna dem med hjälp av en hemocytometer.
    2. Förbereda 3 x 10 5 celler per transduktion och centrifugera cellerna vid 515 xg under 5 min vid RT.
    3. Kassera supernatanten genom sugning och återsuspendera cellerna i 0,5 ml blod cellmedia.
    4. Överföra celler till en brunn av en icke-belagd 24-brunnsplatta.
    5. Tina Sendai-virusblandningen i is och lägga till SUspended celler. Lägg Sendai-virus till cellerna baserat på tillverkarens rekommendationer.
    6. Förslut plattan med en tätningsfilm och centrifugera den vid 1150 xg under 30 min vid 30 ° C.
    7. Efter centrifugering, inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 över natten (O / N).
  2. Cell överföring till matarmatris (Day 1)
    1. Nästa dag, belägga en 24-brunnar med vitronektin. Späd vitronektin lösning i PBS under en slutlig 5 ^ g / ml koncentration. Tillsätt 1 ml vitronektin till en brunn i en 24-brunnars platta och inkubera det vid RT under minst 1 timme. Ta bort beläggningslösningen före användning. Belagda plattorna kan lagras i RT under 3 dagar.
    2. Överför alla media som innehåller celler och virus till belagt väl.
    3. Samla de kvarvarande cellerna med ytterligare 0,5 ml av färskt blod cellmedia och lägg till den cellinnehållande väl.
    4. Centrifugera plattan vid 1150 xg under 10 min vid 35 ° C.
    5. efter centrifugation, avlägsna supernatanten, tillsätt 1 ml iPSC medier, och bibehålla cellerna vid 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
  3. Andra cellöverföring (dag 2)
    1. Belägga brunnarna i en ny 24-brunnars platta med 5 | j, g / ml vitronektin, såsom beskrivs i steg 2.2.1. Använda en brunn i plattan för varje transduktion.
    2. Överför cellsuspensionen från den första plattan till den nyligen belagda vitronektin platta.
      OBS: Om det inte behövs, kan suspensionsceller kasseras. Det förfarande som nämns i steg 2,3 kan upprepas 2-3 gånger med upphängningscellerna. Om stegen kommer att upprepas, skörda cellerna.
    3. Under tiden, tillsätt 1 ml iPSC media till brunnen i den första plattan, för underhåll, och inkubera den vid 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
    4. Bibehålla de bifogade cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 och utför en daglig mediaändring med färskt iPSC medier. Kolonier visas på dagarna 14-21 efter transduktion.
    5. Centrifuge den nyligen belagda plattan innehållande upphängningscellerna vid 1150 xg och 35 ° C under 10 min.
    6. Efter centrifugering, inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
    7. Nästa dag, avlägsna supernatanten och ersätta det med färskt IPSC media.
      OBS: det förfarande som nämns i steg 2,3 kan upprepas 2-3 gånger med upphängningscellerna. Om stegen kommer att upprepas, skörda cellerna i supernatanten och upprepa steg 2,3.
    8. Behåll de bifogade cellerna med dagliga medie förändringar tills 80% konfluens uppnåtts.

3. omprogrammeras Cell Underhåll

  1. Tidigt underhåll efter 24-brunnar kultur
    1. 7-10 dagar efter transduktion, när cellerna är konfluenta, förbereda en vitronektin-belagda, 60-mm skål. Späd vitronektin-lösning i PBS under en slutlig 5 ^ g / ml koncentration. Tillsätt 1 ml vitronektin till skålen och inkubera det vid RT under minst 1 timme.
    2. tvättaceller med PBS och tillsätt 1 ml PBS / 1 mM EDTA för att frigöra cellerna.
    3. Inkubera dem vid 37 ° C och 5% CO2 under 2 minuter.
    4. Skörda cellerna och centrifugera dem vid 250 xg och RT i 2 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 3 ml färskt IPSC medier.
    5. Plate alla resuspenderade cellerna på den nyligen belagda 60-mm skål.
    6. Lägg 10 mM RHO kinashämmare till cellerna och bibehålla dem vid 37 ° C i 5% CO2 tills cellerna är 80% konfluenta.
  2. Split för koloniutseende (Subkloning Förberedelser)
    1. Förbered en vitronektin belagd, 100-mm skål, som beskrivs i steg 3.1.2.
    2. Tvätta cellerna med PBS och tillsätt 1 ml PBS / 1 mM EDTA för att lösgöra cellerna.
    3. Inkubera dem vid 37 ° C och 5% CO2 under 2 minuter.
    4. Skörda cellerna och centrifugera dem vid 250 xg och RT i 2 min.
    5. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer och förbereda 1 x 10 4 celler per skål.
    6. Centrifugera cellerna vid 250 xg och RT i 2 min.
    7. Resuspendera 1 x 10 4 celler i 6 ml iPSC media plattan dem på den belagda 100-mm skål och tillsätt 10 mM RHO kinashämmare till media.
    8. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 under en vecka tills stora kolonier visas.
      OBS: Underhåll och utvidga kolonierna för subkloning. Subkloning görs oftast på mindre än 5 passager.
  3. Koloniplockning använder iPSC koloni lösgör lösning
    1. En vecka före koloni plockning, frö 1 x 10 4 celler i en vitronektin belagd, 100-mm skål, som nämnts i steg 3.2.7.
    2. Förbered en vitronektin-belagda, 60-mm skål genom att tillsätta 2 ml av vitronektin lösning och inkubering vid rumstemperatur under åtminstone en timme.
    3. Genom att observera genom ett mikroskop (40X eller 100X förstoring), markera kolonier med tydliga gränser med hjälp av en markeringspenna. Avlägsna vitronektin lösning från den nya plattan i steg 3.3.2 och tillsätt 6 mlIPSC-medium kompletterat med 10 mM RHO kinas.
    4. Avlägsna odlingsmediet från cellerna och tvätta dem med 3 ml PBS.
    5. Tillsätt 1 ml iPSC koloni lösgörlösning och inkubera dem i 30 sek vid RT.
    6. Avlägsna lösningen från plattan och inkubera det vid RT under ytterligare 30 sek.
    7. Med hjälp av en P200 pipett, dra 200 pl av media från plattan och lossa de riktade kolonierna genom pipettering. Överföra de spridda kolonier till den nya 100-mm skål.
    8. Inkubera och bibehålla cellerna vid 37 ° C i 5% CO2.
      OBS: Efter att ha fått en ren iPSC koloni cellerna bibehållas tills de nådde passagen 10. Karakterisering gjordes efter åtminstone 10 passager. Antikropps utspädningar och primer informationen visas i tabellerna 1 och 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll utgör en enkel metod för att omprogrammera PBMC isolerade från blod. Användning av kombinationen av serie plätering och centrifugering gjordes iPSCs framgångsrikt genereras. Med denna metod kunde iPSCs genereras med en liten mängd av helblodceller utan isolering eller utöka en specifik celltyp. Vi genererade framgångsrikt iPSCs från endast 1x10 4 celler i en liten cell odlingsplatta.

Före omprogrammering togs blodceller isolerades med användning av densitetsgradient media. Blodceller transducerades 5 dagar efter isolering. Figur 1A illustrerar systemet för omprogrammeringen metod för suspensionsceller. Efter isolering, var PBMC transducerades med Sendai-virus innehållande Yamanaka faktorer i en icke-belagd brunn. Nästa dag, var upphängningscellerna skördas och stryks ut på ett vitronektin-belagda plattan med användning av centrifugering, medan cellerna ATTvärkte till den icke-belagda väl kastades. De bifogade celler som visades på vitronektin-belagda plattan behölls och utökas ytterligare. Bifogade celler upprätthölls med dagliga medie ändringar med iPSC media. Pläteringsprocessen med centrifugering upprepades för de återstående suspensionsceller.

Omprogrammerade iPSCs kan särskiljas genom deras distinkta morfologi flera dagar efter transduktion. Men under omprogrammering, var det svårt att expandera de omprogrammerade celler i en ren form. I ett tidigt skede av omprogrammering, de iPSCs blandades med bifogade icke-omprogrammerade differentierade celler (Figur 2A). Pilen i figur 2A visar de iPSC-liknande celltyper i bilden. Före expansion, de iPSCs och andra celler var svåra att diskriminera. Därför var en ren koloni endast erhållas genom kolonin plockprocessen. Genom ympning av cellerna i en låg densitet, kolonier som var large nog för att plocka erhölls, såsom visas i figur 2B. Efter isolering kolonin ades de cellklumpar dissocieras till enskilda celler och odlades (Figur 2C). Rena IPSC kolonier sågs efteråt (figur 2D). Efter de rena iPSCs expanderades, var kvaliteten hos cellerna testas. Celler färgades med alkaliskt fosfatas för att bekräfta det odifferentierade tillståndet i iPSCs (figur 3A). Kolonier som härrör från isolerade iPSCs alla visade positiv färgning. Pluripotenta markörer bekräftades genom immunofluorescens-färgning, visas i figur 3B. De omprogrammerade celler kraftigt uttryckt pluripotenta markörer såsom SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4, och, viktigast av allt, TRA-1-60. Expressionen av pluripotenta markörer bekräftades genom RT-PCR, som visas i figur 3C. Oct4 och Sox2 detekterades, såsom visas i fluorescensdata. Ytterligare markörer som NANOG, DPPA5, TDGF1 var positively uttryckt liksom.

För ytterligare analys, var en karyotyp analys göras. Såsom visas i figur 4A, de genererade iPSCs visade ett normalt kromosomalt mönster. För att bekräfta sann pluripotens cellerna differentieras till ektoderm, mesoderm och endoderm. De genererade iPSCs framgångsrikt differentieras till alla tre groddblad, sett i figur 4B. Eftersom Sendai-virus är känd för sin integration fastighet, är avlägsnandet av virus-DNA som visas i figur 4C. En av tre celler tenderade att ha viralt DNA kvarstår, även efter flera passager. Emellertid den integrerade genen var avlägsningsbar genom subkloning processer.

Sammanfattningsvis har vi visat ett protokoll genererar iPSCs från flytande PBMC. Protokollet uppvisade hög effektivitet och krävs endast en liten mängd blod. De genererade iPSCs hade hög pluripotens och undvek vi ral integration.

Figur 3
Figur 1: Schema av IPSC generation protokollet från PBMC. En detaljerat schema över den designade protokollet baserat på mediet typ och tidslinje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 2: Ljus-fältsbild av iPSCs genereras från PBMC. (A) Tidig morfologi omprogrammerade celler. (B) Bild på en koloni innan plocka. (C) celler efter kolonin plockreningsprocessen. (D) Morfologi av en ren koloni. Alla skala staplar indikerar 200 pm. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: pluripotens iPSCs genereras från PBMC. (A) Kolonier färgades med alkaliskt fosfatas. (B) Fluorescens bild av de genererade iPSCs. Utspädningsantikroppsförhållandet visas i tabell 1. (C) PCR-analys av pluripotenta markörer. Primer information ges i tabell 2. Alla skala staplar indikerar 200 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ladda / 54650 / 54650fig4.jpg "/>
Figur 4: Ytterligare analys av de genererade iPSCs. (A) Normal karyogram av IPSC. (B) Fluorescens bild av cellerna efter tre-GRODDBLAD differentiering. (C) PCR-analys av Sendai virala vektorer. Icke-transducerade celler användes som negativ kontroll, och celler skördades en dag efter transduktion användes som positiv kontroll. Primer information ges i tabell 2. Alla skala staplar indikerar 200 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

antikropp Namn Koncentration
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
TRA-1-60 1: 200
Sox2 1: 100
TRA-1-81 1: 100
Klf4 1: 250
Alexa Fluor 488 get-anti-mus-IgG (H + L) -antikropp 1: 400
Alexa Fluor 594 get-anti-kanin-IgG (H + L) -antikropp 1: 400

Tabell 1. Antikropps utspädningar.

Target Namn Riktning primer sekvens Storlek
OCT3 / 4 Framåt ACC CCT GGT GCC GTG AA 190
Omvänd GGC TGA ATA CCT TCC CAEn ATA
Sox2 Framåt CAG CGC ATG GAC AGT TAC 321
Omvänd GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG Framåt AAA GGC AAA CAA CCC ACT 270
Omvänd GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 Framåt GTT CGG CTT CCT GTC CAT 122
Omvänd CTG CCT CAC CCT CCT TCA
DPPB5 Framåt CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT 215
Omvänd AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 Framåt TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG 140
Omvänd AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA
SeV Framåt GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C 181
Omvänd ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS Framåt ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
Omvänd ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4 Framåt TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C 410
Omvänd AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA

Tabell 2. Primer information.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom embryonala stamceller (ESC) visade flera brister, var behovet av ett alternativt verktyg som behövs. Därför är utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) av Yamanaka kom under den internationella rampljuset. Det har varit nästan ett decennium sedan Yamanaka upptäckte att pluripotens kan induceras genom att tillsätta endast fyra gener i vuxna somatiska celler. Eftersom iPSCs är "inducerad" från mogna somatiska celler, kan de kringgå etiska frågor som en gång hade varit en angelägenhet som rör ekonomiska och sociala råd. Till skillnad ESCs kan iPSCs genereras från varje individ. Därför kan de användas i personlig medicinsk forskning och andra studier, såsom läkemedelsscreening, sjukdom modellering, eller regenerativ medicin.

Den första mänskliga iPSC alstrades från dermala fibroblaster 2007. Olika grupper framgångsrikt omprogrammerade denna celltyp, men ett invasivt kirurgiskt ingrepp krävdes för att erhålla denna primärcell. Därför var det inte idénl källa för att generera olika iPSCs sjukdom eller utforma regenerativ medicin. Ett alternativt och enkelt erhållna celltyper behövdes, såsom keratinocyter, urin monocyter och blodceller. Dessa celler är svåra att expandera, och några av dem har en större chans för kontaminering 10.

I denna studie, presenterade vi ett protokoll som framgångsrikt kan generera iPSCs från hela blodkroppar såsom PBMC. Utan någon expansionsprocess av en specifik celltyp, antyder detta protokoll en relativt enkel metod för att generera iPSCs, även från en liten mängd primära blodkroppar. När väl PBMC isolerades från blodet, cellerna stabiliseras i blodcellmedia i 5 dagar. Stabiliseringssteget före transduktion var kritisk i detta protokoll. Omprogrammeringen Effektiviteten var bättre efter inkubering av cellerna i blodcellmedier. Detta medium användes för utbyggnad av CD34 + celler. Men när hela blodceller upprätthölls i detta media under 5 dagar, var cellantalet nästan identisk med den första räkningen. Använda hela blodkroppar, var det svårt att bekräfta om CD34 + cellerna hade utökats. Icke desto mindre, stabiliseringssteget själv verkade vara viktiga för framgångsrik omprogrammering.

Efter transduktion, serie pläterade vi cellerna på en vitronektin-belagda plattan genom centrifugering. Ursprungligen, de omprogrammerade cellerna sjönk till botten av brunnen efter transduktion. Genom att öka cellerna med mekanisk kraft eller centrifugering, de transducerade cellerna kunde fästa och föröka sig. Men eftersom det protokoll som används helblodceller, hälften av de försök till försök med olika prover resulterade i olika typer av morfologier när den expanderas. Därför isolering av rena IPSC kolonier genom koloni plockning var kritisk i detta protokoll. Cellerna expanderade från isolerad koloni visade alla kännetecken på en ren iPSCs.

Trots andra förmåner, iPSCs harflera hinder att övervinna. Eftersom flera Yamanaka faktorer är kända onkogener, det finns oro för att iPSCs kan utvecklas till tumörer in vivo. Därför är det viktigt att de omprogrammerade celler har ingen återstående exogen genexpression genom integrering. Under de första åren efter utveckling av iPSCs, virus, såsom retrovirus och lentivirus, användes för omprogrammering. Omprogrammeringen Hastigheten var framgångsrikt hög, men dessa virus krävs slumpmässig integration i cellgenomet. Av denna anledning har flera andra metoder utvecklats. Virus som Sendai-virus är kända för att transducera cellerna utan integration, och andra metoder som använder små molekyler och episomala vektorer har utvecklats också. I denna studie använde vi Sendai-virus för omprogrammering. Integrationen var relativt låg jämfört med lentivirus. Vi bekräftade också att det inte fanns några kvarvarande virala komponenter i de genererade iPSCs. En av tre försök resulterade i integreion, även efter 15-20 passager. Men denna integration var avlägsnas genom subkloning kolonierna härrör från en enda cell. I vår erfarenhet, densiteten för att erhålla en frisk koloni härstammar från en enda cell var 1x10 4 celler per 100 mm skål. Kolonierna som resulterade i en perfekt cirkulär form plockades och expanderades för PCR åter bekräftelse av de återstående virala komponenter. Kolonierna som härrör från icke-integrerade celler upprätthölls för vidare användning. Raderade cellerna bibehöll icke-integrerade tillstånd.

I denna studie, föreslår vi ett protokoll för blodcell omprogrammering. Vi lagt till flera steg, till exempel seriell plätering och centrifugering, för att öka omprogrammering hastigheten för flytande celler. Denna metod gjordes med PBMC och navelsträngsblod mononukleära celler (CBMCs). Detta protokoll användes för att generera homozygota iPSCs i GMP anläggningar i Sydkorea. Vår grupp ser fram emot accelerationen av omprogrammering processen iPSC användervåra protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44, (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7, (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2, (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics