Induceret Pluripotente Stem Cell Generation fra Blood Cells Brug Sendai Virus og Centrifugering

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den seneste udvikling af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) viste, at modne somatiske celler kan vende tilbage til en udifferentieret, pluripotent tilstand. Nu er omprogrammering gjort med forskellige typer af voksne somatiske celler: keratinocytter, urin, fibroblaster osv Tidlige eksperimenter blev normalt gøres med dermale fibroblaster. Men dette krævede en invasiv kirurgisk procedure for at opnå fibroblaster fra patienterne. Derfor suspensionsceller, såsom blod og urin celler, blev anset ideel til omprogrammering grund af bekvemmelighed for at opnå de primære celler. Her rapporterer vi en effektiv protokol for iPSC generation fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). Ved udpladning de transducerede PBMC'er serielt til en ny, matrix-coatede plade ved hjælp af centrifugering, kan denne protokol nemt give IPSC kolonier. Denne metode er også for navlestrengen mononukleære navlestrengsblod celler (CBMCs). Denne undersøgelse præsenterer en enkel og effektiv protocol til omprogrammering af PBMC'er og CBMCs.

Introduction

Stamceller har været en af de mest attraktive materialer i klinisk terapi i de sidste mange årtier 1. De attraktive egenskaber af stamceller er pluripotens og evnen til at forny sig selv. I 1981 blev de første embryonale stamceller (EKSF) isoleret fra museembryo 2. Men når teknikken blev anvendt på menneskelige embryoner, det står over for en række etiske spørgsmål.

I 2006, da Dr. Yamanaka og hans team omprogrammeret den første pluripotente celle fra muse somatiske celler, stamceller felt genvundet sin mulighed og interesse blev rekindled 3. Ved at levere flere definerede faktorer, pluripotente stamceller var succesfuldt "fremkaldt" fra voksne somatiske celler, og blev derfor kaldt "inducerede pluripotente stamceller (iPSCs)." I 2007 blev denne teknik anvendes på humane celler 4, hvilket giver celler med de nøjagtige karakteristika økonomiske og sociale råd, men ingen af den etiske debat. Teoretisk iPSCs kan genereres fra enhver celletype opnået fra et individ eller en patient. Patientspecifikke iPSCs stiger som en potentiel værktøj, der kan simulere sygdomsfænotyper og epigenetiske betingelser for den enkelte patient. Brug af genet redigering eller andre metoder, der kan vende den patogene tilstand, kan patient-specifikke iPSCs også anvendes i personaliseret medicin 5. Desuden er iPSCs mindre forbundet med immun afstødning fordi de har samme immun identitet som donor, hvilket gør auto-transplantation mere gennemførlig 6. Derfor har iPSCs blevet den mest lovende platform i sygdom modellering, narkotika screening, og regenererende behandlinger. På baggrund af disse fordele, forbedrede protokoller, der kan give renere og højere udbytter i det mindste beløb af tid fra den mindste celle kilde er konstant under udvikling. En væsentlig overvejelse om at finde den mest effektive protokol til fremtidig anvendelse er den primære celletype. De fleste af de tidlige iPSC generation protocols er optimeret til adhærente celler, da de oprindelige IPSC linjer blev induceret fra hudfibroblaster 4. Men isoleringen og fremstillingen af ​​disse celler er arbejdskrævende. Også, isolering af huden fibroblaster omfatter invasive kirurgiske procedurer, der kan blive en stor mangel for bredere anvendelse.

Derfor til den videre anvendelse af iPSCs, en celle kilde med praktisk erhvervelse er påkrævet. Blod betragtes som en ideel cellekilde, da det opnås ved en temmelig minimalt invasiv procedure 7-9. I denne undersøgelse har vi udviklet en simpel modifikation til protokollen generere hiPSCs fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). Uden den vanskelige ekspansionsprocessen af ​​en specifik celletype, såsom CD34 + celler, blev hele blodlegemer eller PBMC'er serielt udpladet på matrix-coatede plader ved centrifugering efter transduktion med Sendai-virus indeholdende Yamanaka faktorer. Denne fremgangsmåde reducerede den tid der kræves tilfastgørelse af transducerede flydende celler og faldt tabet af omprogrammerede celler, som ikke var i stand til at vedhæfte på egen hånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Statement: Denne undersøgelse protokol blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse det katolske universitet i Korea (KC12TISI0861).

1. Isolering af monocytceller fra Blood

  1. Isolering af monocytiske celler (dag -5)
    1. Opnå mindst 10 ml frisk blod fra en blodprøve i et præparat celle rør (CPT).
    2. Overfør blodet til en ny 50 ml konisk rør og fortynd det med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) ved en 1: 4-forhold.
      BEMÆRK: Et højere forhold mellem fortynding kan anvendes til højere renhed.
    3. Der tilsættes 10 ml densitetsgradient medier til en ny 50 ml konisk rør og omhyggeligt lag det fortyndede blod oven på densitetsgradient medier. Centrifuger ved 750 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) uden centrifugering bremse.
    4. overføre forsigtigt buffy lag til en ny 50 ml konisk rør, tilsættes 30 ml PBS til røret, og vask af cellerne.
    5. Centrifugeres cellerne ved 515 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. </ Li>
    6. Kassér PBS og cellerne resuspenderes i 0,5 ml blod celle medier.
    7. Tæl cellerne og pladen 1 x 10 6 celler pr brønd i en 24-brønds plade. Tilføj PBS til de omgivende brønde for at forhindre fordampning.
    8. Stabiliser cellerne i 5 dage ved 37 ° C i 5% CO2 før transduktion. Tilføj yderligere 0,5 ml frisk blodlegemer medier på dagen 3-4 uden at forstyrre cellerne.

2. Transduktion af Sendai Virus

  1. Transduktion (dag 0)
    1. Indsamle og overføre blodlegemer til et 15 ml konisk rør og tælle dem ved hjælp af et hæmocytometer.
    2. Forbered 3 x 10 5 celler pr transduktion og centrifugere cellerne ved 515 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Supernatanten fjernes ved sugning, og cellerne resuspenderes i 0,5 ml blod celle medier.
    4. Overfør cellerne til en brønd i en ikke-overtrukket 24-brønds plade.
    5. Optø Sendai virus blandingen i is og føje den til suspended celler. Tilføj Sendai virus til de celler baseret på producentens anbefalinger.
    6. Forsegle skiltet med en forseglingsfilm og centrifugere den ved 1.150 xg i 30 minutter ved 30 ° C.
    7. Efter centrifugering inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO2 natten over (O / N).
  2. Celle overførsel til foder-matrix (dag 1)
    1. Den næste dag, frakke en 24-brønds plade med vitronectin. Fortynd vitronectin opløsning i PBS i en endelig 5 ug / ml koncentration. Der tilsættes 1 ml vitronectin til en brønd i en plade med 24 brønde og inkuber det ved stuetemperatur i mindst 1 time. Fjern overtræksopløsningen før brug. Coatede plader kan opbevares i stuetemperatur i 3 dage.
    2. Overføre alle medier indeholdende cellerne og viruset til den coatede brønd.
    3. Indsamle de resterende celler med yderligere 0,5 ml frisk blodlegemer medier og føje den til celleholdige godt.
    4. Centrifugeres pladen ved 1.150 xg i 10 minutter ved 35 ° C.
    5. efter centrifugation, supernatanten fjernes, tilsættes 1 ml iPSC medier og vedligeholde cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
  3. Anden celle overførsel (dag 2)
    1. Coate brøndene i en ny 24-brønds plade med 5 ug / ml vitronectin, som beskrevet i trin 2.2.1. Brug en brønd i pladen for hver transduktion.
    2. Overfør cellesuspensionen fra den første plade til den nyligt overtrukne vitronectin plade.
      BEMÆRK: Hvis der ikke er nødvendigt, kan suspension celler kasseres. Den i trin 2.3 procedure kan gentages 2-3 gange med suspensionen celler. Hvis vil blive gentaget de skridt, høste cellerne.
    3. I mellemtiden tilsættes 1 ml iPSC medier til brønden i den første plade, for vedligeholdelse, og inkuber det ved 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
    4. Oprethold de vedhæftede celler ved 37 ° C og 5% CO2 og udføre en daglig Mediaskift med frisk iPSC medier. Kolonier vil blive vist på dagen 14-21 efter transduktion.
    5. Centrifuge den nyligt overtrukne plade indeholdt suspensionen cellerne ved 1.150 xg og 35 ° C i 10 min.
    6. Efter centrifugering inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2 O / N.
    7. Den næste dag, supernatanten fjernes, og erstatte det med frisk IPSC medier.
      BEMÆRK: Proceduren er nævnt i trin 2.3 kan gentages 2-3 gange med suspensionen celler. Hvis vil blive gentaget trinnene, høste cellerne i supernatanten og gentag trin 2.3.
    8. Bevar de vedhæftede celler med daglige medieændringer indtil 80% sammenflydning er nået.

3. omprogrammeres Cell Vedligeholdelse

  1. Tidlig vedligeholdelse efter 24-brønds plade kultur
    1. 7-10 dage efter transduktion, når cellerne er sammenflydende, udarbejde en vitronectin-coated, 60-mm skål. Fortyndet vitronectin opløsning i PBS i en endelig 5 ug / ml koncentration. Der tilsættes 1 ml vitronectin i skålen og inkuberes det ved stuetemperatur i mindst 1 time.
    2. Vaskceller med PBS, og der tilsættes 1 ml PBS / 1 mM EDTA for at frigøre cellerne.
    3. Inkubere dem ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 min.
    4. Cellerne høstes og centrifugeres dem ved 250 xg og stuetemperatur i 2 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 3 ml frisk IPSC medier.
    5. Plate alle resuspenderede celler på den nyligt overtrukne 60-mm skål.
    6. Tilsæt 10 mM Rho-kinase-inhibitor til cellerne og opretholde dem ved 37 ° C i 5% CO2, indtil cellerne er 80% sammenflydende.
  2. Split til koloni udseende (Subkloning Forberedelse)
    1. Forbered en vitronectin-coated, 100 mm skål, som beskrevet i trin 3.1.2.
    2. Vask cellerne med PBS, og der tilsættes 1 ml af PBS / 1 mM EDTA for at frigøre cellerne.
    3. Inkubere dem ved 37 ° C og 5% CO2 i to minutter.
    4. Cellerne høstes og centrifugeres dem ved 250 xg og stuetemperatur i 2 min.
    5. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og forberede 1 x 10 4 celler pr skål.
    6. Centrifuger cellerne ved 250 xg og stuetemperatur i 2 min.
    7. Resuspender 1 x 10 4 celler i 6 ml iPSC medier, plade dem på det coatede 100-mm-skål, og der tilsættes 10 mM Rho-kinase-inhibitor til medierne.
    8. Inkuber cellerne ved 37 ° C i 5% CO2 i en uge, indtil store kolonier vises.
      BEMÆRK: Fastholde og udbygge kolonierne til subkloning. Subkloning sker normalt på under 5 passager.
  3. Colony plukke hjælp iPSC koloni løsne løsning
    1. En uge før koloni plukning, frø 1 x 10 4 celler i en vitronectin-coated, 100 mm skål, som nævnt i trin 3.2.7.
    2. Forbered en vitronectin-coated, 60 mm skål ved tilsætning af 2 ml vitronectin opløsning og inkubering ved stuetemperatur i mindst 1 time.
    3. Ved at observere gennem et mikroskop (40X eller 100X forstørrelse), markere kolonier med klare grænser ved hjælp af en markør pen. Fjern vitronectin løsning fra den nye plade lavet i trin 3.3.2 og tilsæt 6 mlaf iPSC medier suppleret med 10 mM Rho-kinase.
    4. Fjern dyrkningsmediet fra cellerne og vaskes med 3 ml PBS.
    5. Der tilsættes 1 ml iPSC koloni afmontering opløsning og inkuber dem i 30 s ved stuetemperatur.
    6. Fjern opløsningen fra pladen og inkuber det ved stuetemperatur i yderligere 30 sek.
    7. Ved hjælp af en P200 pipette, tegne 200 pi medier fra pladen og tag de målrettede kolonier ved pipettering. Overfør de spredte kolonier til den nye 100-mm-skål.
    8. Inkuber og opretholde cellerne ved 37 ° C i 5% CO2.
      BEMÆRK: Efter at have opnået en ren iPSC koloni blev cellerne opretholdes, indtil de nåede passage 10. Karakterisering blev udført efter mindst 10 passager. Antistof-fortyndinger og primer information er vist i tabel 1 og 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol præsenterer en enkel metode til at omprogrammere PBMC'er isoleret fra blod. Ved hjælp af en kombination af serielle plating og centrifugering blev iPSCs genereret med succes. Med denne metode kan iPSCs genereres med en lille mængde af hele blodlegemer uden isolering eller udvide en specifik celletype. Vi har med held genereret iPSCs fra kun 1x10 4 celler i en lille cellekultur plade.

Før omprogrammering blev blodceller isoleret ved anvendelse densitetsgradient medier. Blodceller blev transduceret 5 dage efter isolering. Figur 1A illustrerer opbygningen af den omprogrammering metode til suspensionen celler. Efter isolering blev PBMC'er transduceret med Sendai-virus indeholdende Yamanaka faktorer i en ikke-overtrukket brønd. Den næste dag blev suspensionsceller høstet og udpladet på en vitronectin-coatede plade ved hjælp af centrifugering, mens cellerne attgjorde ondt til den ikke-coatede brønd blev bortkastet. De vedhæftede celler, der optrådte på vitronectin-coatede plade blev bevaret og udbygget yderligere. Vedhæftede celler blev opretholdt med daglige medier ændringer ved hjælp iPSC medier. Pletteringsprocessen med centrifugering blev gentaget for de resterende suspensionsceller.

Omprogrammerede iPSCs kunne skelnes ved deres forskellige morfologi flere dage efter transduktion. Men under omprogrammering, det var svært at udvide omprogrammerede celler i en ren form. På den tidlige fase af omprogrammering, de iPSCs var blandet med vedhæftede ikke-omprogrammerede differentierede celler (figur 2A). Pilen i Figur 2A viser IPSC-lignende celletyper i billedet. Før ekspansion, de iPSCs og andre celler var vanskelige at skelne. Derfor blev en ren koloni kun opnås ved kolonien plukkeprocessen. Ved podning af cellerne i en lav densitet, kolonier, der var large nok til plukning blev opnået, som vist i figur 2B. Efter at have isoleret koloni blev celleklumper dissocieres til enkeltceller og dyrket (figur 2C). Pure IPSC kolonier blev set bagefter (figur 2D). Efter de rene iPSCs blev ekspanderet, var kvaliteten af ​​cellerne testet. Celler blev farvet med alkalisk phosphatase for at bekræfte den udifferentierede tilstand iPSCs (figur 3A). Kolonier afledt af isolerede iPSCs alle viste positiv farvning. Pluripotente markører blev bekræftet ved immunfluorescensfarvning, vist i figur 3B. De omprogrammerede celler stærkt udtrykt pluripotente markører såsom SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, og, vigtigst af alt, TRA-1-60. Ekspressionen af pluripotente markører blev bekræftet ved RT-PCR, vist i figur 3C. OCT4 og SOX2 blev påvist som vist i fluorescensdata. Yderligere markører såsom NANOG, DPPA5, TDGF1 var positively udtrykt samt.

For yderligere analyse blev en karyotype analyse udført. Som vist i figur 4A viste de genererede iPSCs en normal kromosomal mønster. At bekræfte sande pluripotens blev cellerne differentieret til ektoderm, mesoderm og endoderm. De genererede iPSCs succes differentieret i alle tre kim lag, set i figur 4B. Da Sendai virus er kendt for sin integration-fri ejendom, er fjernelse af virus-DNA er vist i figur 4C. En ud af tre celler tendens til at have viralt DNA forbliver, selv efter flere passager. Men det integrerede gen var fjernes ved subkloning processer.

Afslutningsvis har vi vist en protokol genererer iPSCs fra flydende PBMC'er. Protokollen viste høj effektivitet og kun kræves en lille mængde blod. De genererede iPSCs havde høj pluripotens og undgået vi ral integration.

Figur 3
Figur 1: Ordning af IPSC generation protokollen fra PBMC'er. En detaljeret diagram af designet protokol baseret på mellemlang type og tidslinje. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 2: Lys-field billede af iPSCs genereret fra PBMC'er. (A) Tidlig morfologi omprogrammerede celler. (B) Billede af en koloni før plukke. (C) celler efter kolonien plukning oprensningsprocessen. (D) Morfologi af en ren koloni. Alle skala søjler indikerer 200 um. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: pluripotens af iPSCs genereret fra PBMC'er. (A) Kolonier farvet med alkalisk phosphatase. (B) Fluorescens billede af de genererede iPSCs. Antistoffet fortyndingsforhold er vist i tabel 1. (C) PCR-analyse af pluripotente markører. Primer oplysninger findes i tabel 2. Alle skala søjler indikerer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

upload / 54650 / 54650fig4.jpg "/>
Figur 4: Yderligere analyse af de genererede iPSCs. (A) Normal karyogram af iPSC. (B) Fluorescens foto af cellerne efter tre kimlag differentiering. (C) PCR-analyse af Sendai virusvektorer. Ikke-transducerede celler blev anvendt som negativ kontrol, og celler høstet en dag efter transduktion blev anvendt som positiv kontrol. Primer oplysninger findes i tabel 2. Alle skala søjler indikerer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

antistof navn Koncentration
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
TRA-1-60 1: 200
Sox2 1: 100
TRA-1-81 1: 100
Klf4 1: 250
Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG (H + L) antistof 1: 400
Alexa Fluor 594 ged anti-kanin IgG (H + L) antistof 1: 400

Tabel 1. Antistof fortyndinger.

Target navn Retning primersekvens Størrelse
OCT3 / 4 Forward ACC FTT GGT GCC GTG AA 190
Bagside GGC TGA ATA CCT TCC CAEn ATA
SOX2 Forward CAG CGC ATG GAC AGT TAC 321
Bagside GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG Forward AAA GGC AAA CAA CCC ACT 270
Bagside GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 Forward GTT CGG CTT FTT GTC CAT 122
Bagside CTG FTT CAC CCT FTT TCA
DPPB5 Forward CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT 215
Bagside AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 Forward TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG 140
Bagside AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA
SeV Forward GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C 181
Bagside ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS Forward ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
Bagside ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4 Forward TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C 410
Bagside AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA

Tabel 2. Primer information.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da embryonale stamceller (EKSF) viste flere mangler, blev behovet for et alternativt værktøj påkrævet. Derfor er udviklingen af ​​inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) ved Yamanaka kom under det internationale søgelys. Det har været næsten et årti siden Yamanaka opdagede at pluripotens kan induceres ved tilsætning af kun fire gener i voksne somatiske celler. Da iPSCs er "fremkaldt" fra modne somatiske celler, kan de undgå etiske spørgsmål, der engang havde været den bekymring vedrørende økonomiske og sociale råd. I modsætning til økonomiske og sociale råd, kan iPSCs genereres fra den enkelte. Derfor kan de anvendes i personlig medicinsk forskning og andre undersøgelser, såsom lægemiddelscreening, sygdomsmodeller eller regenerative lægemidler.

Den første menneske iPSC blev genereret fra dermale fibroblaster i 2007. Forskellige grupper held omprogrammeres denne celletype, men en invasiv kirurgisk procedure var nødvendig for at opnå denne primære celle. Derfor var det ikke tankenl kilde til frembringelse af forskellige sygdomstilstande iPSCs eller designe regenerativ medicin. En alternativ og let opnås celletyper var nødvendige, såsom keratinocytter, urin monocytter og blodceller. Men disse celler er svære at ekspandere, og nogle af disse har en større chance for forurening 10.

I denne undersøgelse, præsenterede vi en protokol, der med succes kan generere iPSCs fra hele blodlegemer, såsom PBMC'er. Uden nogen ekspansionsprocessen af ​​en specifik celletype, denne protokol antyder en forholdsvis enkel metode til at generere iPSCs, selv fra en lille mængde af primære blodceller. Når PBMC'erne blev isoleret fra blodet blev cellerne stabiliseret i blodlegemer medier i 5 dage. Stabiliseringen skridt før transduktion var kritisk i denne protokol. Omprogrammering effektivitet var bedre efter inkubation af cellerne i blodlegemer medier. Dette medie blev anvendt til udvidelse af CD34 + celler. Men når fuldblod celler blev holdt i dette migdia i 5 dage, celletallet var næsten identisk med den første optælling. Anvendelse af hele blodlegemer, det var svært at bekræfte, om de CD34 + celler var blevet udvidet. Alligevel stabilisering trin selv syntes at være vigtige for vellykket omprogrammering.

Efter transduktion, vi serielt udpladet cellerne på en vitronectin-coatede plade ved centrifugering. Oprindeligt de omprogrammerede celler sank til bunden af ​​brønden efter transduktion. Ved at øge af cellerne med mekanisk kraft eller centrifugering, de transducerede celler var i stand til at bindes og opformeres. Da den anvendte protokol hele blodlegemer, halvdelen af ​​den forsøgte forsøg med forskellige prøver resulteret i forskellige typer af morfologier, når udvidet. Derfor isolering af rene IPSC kolonier af koloni plukning var kritisk i denne protokol. Cellerne udvidet fra den isolerede koloni viste alle kendetegn for en ren iPSCs.

Trods andre fordele, iPSCs harflere forhindringer at overvinde. Da flere Yamanaka faktorer er kendte onkogener, er der bekymring for, at iPSCs kan udvikle sig til tumorer in vivo. Derfor er det vigtigt, at omprogrammerede celler har ingen resterende eksogent gen-ekspression ved integration. I de første år efter udviklingen af ​​iPSCs, vira, såsom retrovira og lentivira, blev anvendt til omprogrammering. Den omprogrammering sats var held høj, men disse vira krævede tilfældig integration ind i cellen genom. Af denne grund er der blevet udviklet flere andre metoder. Vira som Sendai-virus er kendt for at transducere celler uden integration, og andre fremgangsmåder, der anvender små molekyler og episomale vektorer er blevet udviklet så godt. I denne undersøgelse, brugte vi Sendai-virus til omprogrammering. Integrationen sats var relativt lav sammenlignet med lentivirus. Vi bekræftede også, at der var nogle resterende virale komponenter i de genererede iPSCs. En ud af tre forsøg resulterede i inteion, selv efter 15-20 passager. Men denne integration var flytbare ved subkloning kolonierne afledt af en enkelt celle. Det er vores erfaring, densiteten for at opnå en sund koloni afledt af en enkelt celle var 1x10 4 celler pr 100-mm-skål. Kolonierne, som resulterede i en perfekt cirkulær form, blev udtaget og ekspanderet til PCR re-bekræftelse af de resterende virale komponenter. Kolonierne afledt af ikke-integrerede celler blev holdt til yderligere anvendelse. Når slettet, cellerne opretholdt den ikke-integrerede tilstand.

I denne undersøgelse, foreslår vi en protokol for blodlegemer omprogrammering. Vi har tilføjet flere trin, såsom seriel plating og centrifugering, for at øge omprogrammering på de flydende celler. Denne metode blev udført med PBMC'er og mononukleære navlestrengsblod celler (CBMCs). Denne protokol blev anvendt til at generere homozygote iPSCs i GMP faciliteter i Sydkorea. Vores gruppe ser frem til fremskyndelse af IPSC omprogrammering proces medvores protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44, (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7, (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2, (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics