Preparación y
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Published 11/23/2016
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Biochemistry

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Summary

Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

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Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., et al. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

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Abstract

perfiles de proteínas basado en las actividades (ABPP) es un método para la identificación de una enzima de interés en un proteoma complejo mediante el uso de una sonda química que se dirige a los sitios activos de la enzima. Una etiqueta de reportero introducido en la sonda permite la detección de la enzima marcada por el análisis en gel de fluorescencia, transferencia de proteínas, la microscopía de fluorescencia, o la espectrometría de cromatografía de masa líquida. Aquí, se describe la preparación y uso de la ARN14686 compuesto, una sonda basada en la actividad de química (CC-ABP) que reconoce selectivamente la enzima N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA). Naaa es una hidrolasa cisteína que promueve la inflamación mediante la desactivación de los agonistas alfa endógenos receptor activado por el proliferador de peroxisomas-(PPAR), tales como palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA). NAAA se sintetiza como una proenzima inactiva de longitud completa, que se activa por autoproteolisis en el pH ácido del lisosoma. Los estudios de localización have muestra que NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B. Proporcionamos ejemplos de cómo ARN14686 se puede utilizar para detectar y cuantificar NAAA activo ex vivo en los tejidos de roedores por transferencia de proteínas y microscopía de fluorescencia.

Introduction

Comúnmente utilizado métodos para investigar los patrones de expresión, interacciones y funciones de las proteínas, incluyendo las plataformas de cromatografía de espectrometría de masas para el análisis de líquidos escopeta 1,2, levadura de dos híbridos de métodos 3,4, y en ensayos in vitro, están limitadas en cuanto a que son no se puede evaluar la actividad de las proteínas en su estado nativo. basados ​​en la actividad de proteína de perfiles (ABPP) se puede utilizar para llenar este vacío. En este enfoque, las sondas de molécula pequeña capaz de unirse covalentemente al sitio activo de una enzima de interés se conjugan con un grupo indicador que permite la detección de blancos. El uso de la química clic (CC), el reportero puede ser integrado en la sonda o puede ser introducido después del acoplamiento de destino se ha producido 5,6. El último procedimiento requiere el uso de sondas que contienen grupos químicos apropiados, tales como un alquino o azida de terminal, que puede ser modificado con un número de reactivos de reportero a través de reacciones bio-ortogonal such como el Cu (I) catalizada Huisgen [3 + 2] cicloadición 7-9 o Staudinger ligadura 10,11.

Recientemente, hemos revelado el ARN14686 compuesto como la primera ABP para la detección in vitro y in vivo de la hidrolasa cisteína, NAAA 12 en. NAAA cataliza la desactivación hidrolítica de FAEs saturados y monoinsaturados, incluyendo oleoiletanolamida (OEA) y palmitoiletanolamida (PEA), que son agonistas endógenos de la anti-inflamatoria receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B 14,16, lo que sugiere un papel en la regulación de la respuesta inmune innata. La enzima se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso en una forma inactiva y se activa en los compartimientos ácidos de la célula por un mecanismo autoproteolítica 17. La escisión autoproteolítica genera una nueva cisteína-terminal de N (C131 en ratones y ratas, C126 en los seres humanos), que es el nucleófilo responsable de FAE hidrólisis 18,19. La inhibición farmacológica de la actividad naaa altera el equilibrio de síntesis / degradación de la FAE en favor de un aumento de los niveles celulares de FAE 16,20,21. Varios derivados de β-lactona y β-lactámicos se ha demostrado que inhiben la actividad de NAAA con alta potencia y selectividad 16,22-26. Estos inhibidores actúan a través de S acilación de la cisteína catalítica 16,27,28.

El ARN14686 compuesto fue diseñado sobre la base de la estructura química de la, inhibidor de la β-lactama NAAA serina derivados sistémicamente activo, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) 16. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal para la posterior conjugación CC con una etiqueta de reportero azida-cojinete. Hemos elegido para diseñar un SPA de dos pasos para MiniMally alterar la estructura del andamio original, manteniendo así la afinidad de la sonda para NAAA. Además, evitando la introducción de etiquetas voluminosos, una sonda de este tipo podría ser más adecuado para el tratamiento in vivo de un directo ABP. ARN14686 inhibe NAAA con alta potencia (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) mediante la formación de un aducto covalente con la cisteína catalítica de la enzima 12. Experimentos en ratas vivas mostraron que la sonda es selectiva en la captura de NAAA expresa en pulmones. Ceramidasa ácida, otra amidasa cisteína que comparte 33-34% de identidad con NAAA, también fue identificado como un objetivo de baja afinidad utilizando las altas concentraciones de sonda (10 micras de vitro, 10 mg / ml por vía intravenosa, iv) 12. También hemos utilizado ARN14686 para estudiar la presencia de NAAA activo en tejidos de rata inflamadas después de la administración de adyuvante completo de Freund (CFA) 29.

A continuación, se describe un protocolo para los preparatien de ARN14686 (Figura 1) y su aplicación a la investigación de la activación NAAA ex vivo. Como ejemplo, se describe un procedimiento experimental para visualizar NAAA en patas de rata después de la administración CFA. En este experimento, las proteínas se extrajeron a partir de tejido de la pata después de la inyección iv de la sonda, y el proteoma marcado-ABP es sometido a CC con biotina-azida. muestras biotiniladas se enriquecen usando perlas de estreptavidina, y se llevan a cabo transferencias de proteínas. En otra aplicación, se describe la localización de NAAA activo por microscopía de fluorescencia en los pulmones del ratón de los ratones tratados con la sonda. En este caso, el tejido se seccionó y las secciones se someten a CC para la adición de rodamina. Un esquema de flujo de trabajo se ilustra en la Figura 2.

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Protocol

Precaución: Todas las reacciones de química deben llevarse a cabo en una campana ventilada y con el uso de una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras. Las reacciones se deben también llevaron a cabo en un ambiente de nitrógeno.

declaración ética: Nuestros procedimientos con animales se llevan a cabo de conformidad con la normativa italiana sobre la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (DM 116192), y los reglamentos de la Comunidad Económica Europea (DO L 358/1 de la CE 12/18/1986 ).

NOTA: Síntesis de [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amonio se describe para los rendimientos a gran escala (50 g de N CBZ-L-serina), pero se pueden escalar fácilmente hacia abajo.

1. Síntesis

NOTA: Véase la Figura 1 para el esquema de reacción de síntesis.

  1. Preparación de 2-piridilo carbonato undec-10-inilo y undec-10-inil 2-oxopiridina 1-carboxilato de metilo
    1. En un matraz de 50 ml de fondo redondo, se disuelven 350 mg de undec-10-in-1-ol en 3,5 ml de diclorometano seco.
    2. A la solución en 1.1.1, añadir 25 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 530 mg de 2-dipyridylcarbonate (DPC). Se agita la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 16 horas.
    3. Añadir 20 ml de diclorometano.
    4. Transferir la mezcla en un embudo de separación. Añadir 15 ml de agua, agitar, y permitir que las dos fases se separen.
    5. Abrir la llave de paso, recoger la fase orgánica (inferior), y luego cerrar la llave de paso. Añadir 15 ml de una solución saturada de NaHCO3. Agitar la ampolla de decantación y dejar que las dos fases separadas. Repita este paso dos veces más.
    6. Se seca la capa orgánica con Na 2 SO 4, se filtra a través de algodón en un matraz de fondo redondo (tara primero), y se evapora a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
    7. Pesar el matraz y obtener 600 mg de aceite que es una mezcla de 2-piridilo carbonato undec-10-inilo y undec-10-inil 2-oxopiridina 1-carboxilato de etilo en una proporción de 1,7: 1.
      1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) componente principal δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2.18 a 2.11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) componente menor δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6.30 hasta 6.25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2.18 a 2.11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. Utilice el aceite sin ninguna separación o purificación adicional.
  2. Preparación de [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amonio
    1. Preparación de bencil N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxoethil] carbamato.
      1. En un matraz de fondo redondo de 4-L, se disuelven 141,5 g de p anisidina en 1,5 L de tetrahidrofurano y 0,5 l de diclorometano.
      2. Se enfría la solución a 0 ° C en un baño de hielo.
      3. Añadir 50,0 g de N CBZ-L-serina y 43,9 g de N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida clorhidrato de N '.
      4. Se agita la mezcla con una barra magnética a 0 ° C durante 30 min.
      5. Se elimina la solución del baño de hielo y se agita con una barra magnética a temperatura ambiente durante 16 horas.
      6. Se evaporan los disolventes a presión reducida (evaporador rotatorio).
      7. Añadir 400 ml de 1: 1 de ciclohexano / acetato de etilo, se agita con una espátula, y se decanta.
      8. Repita el paso 1.2.1.7 dos veces más.
      9. Se disuelve el residuo gomoso en 500 ml de acetato de etilo y se lava con 400 ml de solución 0,1 M de HCl (10 veces), con 400 ml de solución saturada de NaHCO3 (2 veces), y con 400 ml de salmuera.
      10. Se seca la capa orgánica conNa 2 SO 4, se filtra la solución a través de algodón en un matraz de fondo redondo (tara primero), y se evapora a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
      11. Pesar el matraz y obtener 61,4 g de un sólido blanco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6)? = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4.24 a 4.15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Preparación de bencil N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxo-azetidin-3-il] carbamato.
      1. Disolver 58,6 g de N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxo-etil] carbamato de 1,6 L de N, N-dimetilformamida.
      2. Se enfría la solución a 0 ° C con un baño de hielo.
      3. Añadir 50,6 g de 1,1-sulfonyldiimidazole y se agita con una barra magnética durante 30 minutos.
      4. Se enfría la solucióna -20 ° C con un baño de hielo / NaCl y añadir 10,2 g de hidruro de sodio (60% en aceite mineral) en porciones.
      5. Se agita la mezcla a -20 ° C durante 1 hora, y luego se apaga con 2 ml de metanol y 1 l de agua.
      6. Vacío a filtrar el precipitado, se lava con 200 ml de agua, y secar a vacío.
      7. Obtener 42,2 g de un sólido blanco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Preparación de bencil N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato.
      1. Suspender 9,0 g de bencil N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato en 500 ml de acetonitrilo y 400 ml de agua.
      2. Se enfría la solución a 0 ° C en un baño de hielo.
      3. Añadir 45,4 g de Ceric nitrato de amonio en porciones durante 45 min y se agita con una barra magnética a 0 ° C durante 15 minutos.
      4. Añadir 500 ml de solución saturada de NaHCO3 con cautela, y luego añadir 500 ml de acetato de etilo.
      5. Filtrar el precipitado y lavar con 200 ml de acetato de etilo.
      6. Se separa la solución bifásica y se lava la capa acuosa con 200 ml de acetato de etilo (3 veces).
      7. Se seca la capa orgánica con Na 2 SO 4, añadir 5 g de carbón activado, filtro a través de una capa de sílice de diatomeas, y se evapora a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
      8. Añadir éter dietílico y se agita con una espátula.
      9. Filtrar el sólido y obtener 4,85 g de un sólido de color blanquecino.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
      Preparación de [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -amonio de etilo.
      1. Disolver 0,93 ml de ácido acético en 245 ml de acetato de etilo. Marcar esto como "solución de atrapar."
      2. Disolver 3,28 g de bencil- N - [(R) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato en 298 ml de etanol.
      3. Añadir 14,1 ml de ciclohexadieno y 3,27 g de 10% de paladio sobre carbono.
      4. Se agita la suspensión a temperatura ambiente durante 12 horas y después se filtra a través de un lecho corto de tierra de diatomeas. Verter el líquido de elución directamente en la solución de captura.
      5. Se evapora el disolvente a presión reducida (evaporador rotatorio), manteniendo la temperatura por debajo de 35 ° C.
      6. Se tritura el sólido obtenido con tetrahidrofurano y obtener 1,72 g de un sólido blanco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6)? = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Preparación de undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de
    1. En un matraz de 10 ml de fondo redondo, se disuelven 60 mg de [(3 S) -2-oxoazetidin 3 il--] acetato de amonio en 2 ml de diclorometano seco.
    2. Se enfría la solución a 0 ° C en un baño de hielo y se añaden 81 l de N, N-diisopropiletilamina gota a gota.
    3. Disolver 350 mg de la mezcla en bruto que contiene undec-10-inil 2-oxopiridina 1-carboxilato de etilo en 2 ml de diclorometano seco, añadir a la solución, y se agita a TA durante 15 h. Se evapora el disolvente a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
    4. Se purifica mediante cromatografía en columna (gel de sílice) usando un aparato de cromatografía en columna automatizada:
      1. Absorber la muestra sobre gel de sílice, equilibrar la columna con ciclohexano, y la carga de la muestra en el cartucho.
      2. Eluir con ciclohexano / acetato de etilo de 100: 0 a 0: 100 y recoger los picos en tubos de ensayo.
      3. Se evapora el disolvente de las fracciones correspondientes al compuesto a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio) y obtener 40 mg de un sólido blanco.

2. Preparación de los reactivos CC

  1. Preparación de 5 mM de la solución de moléculas Tag-azida
    1. Disolver 1,5 mg de azida-PEG3-Fluor 545 en 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Hacer alícuotas de 0,5 ml en tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C.
    2. Disolver 1,1 mg de azida-PEG3-biotina en 0,5 ml de DMSO. Hacer alícuotas de 0,5 ml en tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C.
  2. Preparación de 50 mM solución madre de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)
    1. Disolver 14,3 mg de TCEP en 1 ml de agua, y hacerlo de nuevo cada vez.
  3. Preparación de la solución 50 mM de CuSO 4 · 5H 2 O
    1. En un vial de vidrio, se disuelven 12.48 Mg de CuSO 4 · 5H 2 O en 1 ml de agua. Almacenar a temperatura ambiente hasta por un mes.
  4. Preparación de 83,5 mM de solución de Tris [(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA)
    1. En un vial de vidrio, se disuelven 8,85 mg de TBTA en 200 l de DMSO. Almacenar a temperatura ambiente hasta por un mes.
  5. Preparación de Trabajo 1,7 mM Solución de TBTA (inmediatamente antes del uso)
    1. Añadir 20 l de TBTA 83,5 mM a un vial de vidrio y se diluye con 180 ml de DMSO.
    2. Añadir 800 l de terc-butanol y vórtice.

3. Análisis de Expresión naaa en el tejido de la pata de las ratas tratadas con CFA

NOTA: El uso ratas Sprague-Dawley, con un peso de 175-200 g, y llevar a cabo todos los procedimientos de conformidad con las directrices para el uso ético de los animales. Casa ratas en jaulas ventiladas en un ciclo de luz de 12 horas / oscuridad y darles acceso libre a comida y agua. Para el protocolo de CFUn tratamiento, consulte el artículo publicado por Bonezzi et al. 29 Utilizar animales 7 días después de la administración de CFA.

  1. La administración intravenosa de ARN14686
    1. Disolver ARN14686 en vehículo (15% de PEG y 15% de solución salina de Tween). Calcular la concentración de la solución en función del peso de la rata (dosis 3 mg / kg, volumen de inyección 5 ml / kg).
    2. Proceder con inyecciones iv de cada tres ingenuo y tres ratas tratadas con CFA. Coloque cada rata en un dispositivo de sujeción de plástico apropiado. A continuación, coloque la cola de rata en agua caliente durante 2-4 minutos para permitir la vasodilatación, e inyectar el compuesto IV a través de la vena de la cola.
    3. Inyectar iv tres ratas (ingenuo y CFA tratos) con el único vehículo.
  2. Colección de la pata y la disección
    1. Sacrificar las ratas por inhalación de CO2 4 horas después de la administración de la sonda o del vehículo y recoger sus patas cortándolos 0,5 cm por encima de la articulación de la rodilla utilizando un bisturí.
    2. Retirar con cuidado la piel mediante la disección de tijera asistida y diseccionar los tejidos blandos mediante el raspado de ellos desde el hueso. Desechar los huesos y recoger los tejidos blandos de las patas. muestras de congelamiento rápido en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
  3. La pata de Homogeneización y preparación de proteínas lisosomales
    NOTA: Evite el uso de detergentes y tampones que contienen aminas, ya que pueden inhibir la reacción de CC.
    1. Combinar el tejido pata de 3 ratas (obtenido como se describe en la sección 3.2.1) y homogeneizar en 4 ml de 320 mM de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y un cóctel inhibidor de la proteasa (ver Material / Reactivo Tabla); utilizar un instrumento de dispersión de alto rendimiento (ver Material / reactivo de la tabla).
    2. Centrifugar el homogeneizado de tejido durante 20 minutos a 1000 xga 4 ° C; guardar el sobrenadante.
    3. Añadir 2 ml de sacarosa 320 mM en PBS y el cóctel inhibidor de la proteasa para el sedimento de tejido yhomogeneizar una vez más.
    4. Centrifugar durante 20 min a 1000 xg a 4 ° C, y añadir el sobrenadante a la de la etapa 3.3.2.
    5. Centrifugar los sobrenadantes recogidos durante 30 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
    6. Pesar el sedimento y se resuspende en dos volúmenes de PBS (es decir, 200 l por cada 100 mg de pellets). Transferir a un tubo de 1,5 ml de recogida y congelar a -80 ° C durante 1 hora.
    7. Descongelar las muestras y congelar de nuevo durante 1 hora a -80 ° C.
    8. Repetir el ciclo de congelación / descongelación dos veces más.
      NOTA: Este paso está diseñado para solubilizar la proteína. Congelar durante la noche si es necesario.
    9. Centrifugar durante 1 hora a 100.000 xg a 4 ° C. Recoger el sobrenadante, que contiene las proteínas lisosómicas solubles, y desechar el sedimento. Almacenar a -80 ° C o proceder inmediatamente con la cuantificación de proteínas.
    10. Cuantificar el contenido de proteína utilizando un ensayo de proteína BCA 30 kit comercial (ver Material / Tabla de reactivos
    11. Almacenar las muestras a -80 ° C hasta su uso.
  4. CC con azida-PEG3-biotina
    NOTA: El protocolo de CC y el enriquecimiento de perlas de estreptavidina (pasos 3.4-3.6) están ligeramente modificada del protocolo publicado por Speers y Cravatt 31.
    1. Preparar 500 l (1 mg / ml, en PBS) de las proteínas lisosómicas de las ratas tratadas con vehículo y probe--(ratas ingenuas y tratados con CFA).
    2. muestras preaclarado con 40 l de una suspensión al 50% de agarosa estreptavidina (lavado tres veces con 1 ml de PBS antes de su uso) durante 1 hora a 4 ° C. Se centrifuga durante 4 minutos a 1.000 xg a 4 ° C y tomar el sobrenadante.
    3. Añadir 11,3 l de una solución madre 5 mM de azida-PEG3-biotina y agitar.
    4. Añadir 11,3 l de una madre 50 mM recién preparada de TCEP y agitar.
    5. De premezcla 34 l de una solución de trabajo recién preparada de TBTA 1,7 mM con 11,3 l de una mM CuSO4 50 2 O stock.
    6. Añadir 45,3 ml de una solución premezclada TBTA / CuSO 4 · 5H 2 O y vórtice.
    7. Incubar la reacción a 25 ° C durante 2 horas (un tiempo de incubación más largo no afecta a la reacción). Observar la precipitación de proteínas en este paso. Mezclar después de la primera hora de incubación.
  5. La eliminación del exceso de reactivos CC
    1. Centrifugar las muestras durante 4 minutos a 6500 xga 4 ° C y se elimina el sobrenadante.
    2. Añadir 750 l de metanol frío y se vuelve a suspender por tratamiento con ultrasonidos (5 segundos con un aparato de ultrasonidos de sonda).
    3. Centrifugar las muestras durante 4 minutos a 6500 xga 4 ° C y separar el sobrenadante usando una jeringa y la aguja.
    4. Repita el paso 3.5.2 dos veces (no se requiere tratamiento con ultrasonidos).
    5. Después del último lavado, añadir 325 l de dodecilsulfato de sodio (SDS) 2,5% en PBS al sedimento y se somete a ultrasonidos 3 veces de proteína durante 5 s.
    6. Calentar las muestras durante 5 minutos a 65 ° C y sonicar unaganancia.
    7. Centrifugar durante 5 min a 6500 xg a TA y guardar el sobrenadante.
    8. Añadir 1,4 ml de PBS para diluir la concentración de SDS al 0,5%. Almacenar a -20 ° C o continuar con el enriquecimiento de estreptavidina.
  6. Enriquecimiento estreptavidina
    1. Con PBS, llevar el volumen de las muestras obtenidas en el paso 3.5.8 a 4.2 ml. Añadir 40 l de una suspensión al 50% de agarosa estreptavidina usando una punta de corte de extremo (lavado tres veces con 1 ml de PBS antes de su uso).
    2. Incubar durante 2 horas a RT con la rotación y centrifugar durante 2 minutos a 1400 x g.
    3. Eliminar el sobrenadante sin secar los granos de sedimento y se utilizan sobrenadante residual para transferir las cuentas a un 1 ml girar la columna (ver Material / reactivo de la tabla).
    4. Lavar por gravedad con 3x 1 ml de SDS al 1% (en PBS), 3x 1 ml de 6 M urea (en PBS), y 4x 1 ml de PBS.
    5. Uso 2x 500 l de PBS para transferir las perlas a un tubo de 1,5 ml y se centrifuga durante 2 min a 1400 xg a TA. Se aspira suavemente el sobrenadante con una jeringuilla y una aguja.
    6. Eluir las proteínas unidos a la resina mediante la adición de 25 l de tampón de elución (urea 6 M, 2 M tiourea, 2% SDS, y biotina 6 mM, todos en PBS) durante 15 min a TA seguido por 15 min a 95 ° C 32.
  7. proteína Blot
    1. Añadir 5 l de tampón de 6x Laemmli (para 9 ml: 0,5 ml de 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml de 20% SDS, 5 mg de azul de bromofenol, 3 ml de glicerol, y H 2 O hasta 9 ml) y añadir 5% β-mercaptoetanol inmediatamente antes del uso. Centrifugar brevemente las muestras a 2000 xg para sedimentar la resina y carga de 25 l del sobrenadante obtenido en un gel de poliacrilamida al 4-12%.
    2. Realizar electroforesis en gel y transferencia de proteínas en una membrana de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante 33.
    3. Saturar la membrana de transferencia durante 1 hora con 10 ml de un tampón de bloqueo (ver Material / Reactivo Tabla) que contiene 0,1% de Tween-20.Evitar el uso de la leche, ya que puede aumentar el fondo.
    4. Se lava la membrana con 10 ml de 0,05% de Tween-20 en PBS y añadir 10 l de estreptavidina fluorescente (ver Material / Reactivo Tabla) disuelto en 10 ml de tampón de bloqueo más 0.1% de Tween-20 durante 1 hora a RT.
    5. Lavar 4 veces con 0,05% de Tween-20 en PBS y una vez con PBS solo (10 min cada uno).
    6. Utilizar un escáner de imágenes (ver Material / reactivo de la tabla). Encienda el instrumento y el ordenador conectado. Espere hasta que esté listo.
    7. Iniciar el programa de adquisición y seleccionar el modo de fluorescencia. Seleccione el área de la membrana y elegir la carpeta de destino para los archivos guardados.
    8. Ajuste los siguientes parámetros de adquisición: 680 nm de longitud de excitación, filtro de BPFR700, 1.000 V tubo fotomultiplicador (PMT) valor (canal 2), y 25 micras de tamaño de píxel. Adquirir la imagen.

4. La localización de naaa catalíticamente activo en los pulmones del ratón por fluorescencia Microsdupdo

NOTA: El uso de sexo masculino ratones de 8 a 10 semanas de edad y llevar a cabo todos los procedimientos de conformidad con las directrices para el uso ético de los animales. Los ratones domésticos en jaulas ventiladas en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad y darles acceso libre a comida y agua.

  1. La administración intravenosa de ARN14686 en ratones
    1. Disolver ARN14686 en vehículo: solución salina 15% de PEG y 15% de Tween-20. Calcular la concentración de la solución de acuerdo al peso del ratón (dosis de 3 mg / kg, volumen de inyección 5 ml / kg).
    2. Proceder a la inyección iv de 3 ratones. Coloque cada ratón en un dispositivo de sujeción de plástico apropiado. A continuación, coloque el ratón de cola en agua caliente durante 2-4 minutos para permitir la vasodilatación e inyectar el compuesto IV a través de la vena de la cola.
    3. Inyectar 3 iv ratones con sólo el vehículo.
  2. Colección de pulmón y la rebanada Preparación
    Advertencia: Manipular con cuidado paraformaldehído en una campana de humos, y use guantes!
    1. Anestesiar a los ratones con Chlohidrato de RAL (400 mg / kg). Confirmar la anestesia con una pizca dedo del pie. Realizar una perfusión transcardial como sigue:
      1. Superficialmente cortar la piel ventral con las tijeras y exponer las superficies de la membrana peritoneal y torácica.
      2. Superficialmente cortar la membrana peritoneal con tijeras, justo por debajo del apéndice xifoides, y exponer el diafragma y los órganos viscerales. Tenga cuidado de no lacerar cualquier vasculatura significativa.
      3. Abra la cavidad torácica por el diafragma de corte desde un aspecto lateral a la otra.
      4. Insertar la aguja 25 G conectada a la bomba de jeringa automatizada e infundir 20 ml de solución salina al 0,9%, seguido de 60 ml de 4% PFA en tampón fosfato (0,1 M, pH 7,4).
    2. Una vez que la perfusión se ha completado, tire del corazón con unas pinzas y diseccionar cuidadosamente hacia fuera. Agarre la tráquea con unas pinzas y cortar completamente a través de él con unas tijeras. Tire suavemente de la tráquea hacia arriba y retire los pulmones de la caja torácica. Diseccionar el tejido deseparar el pulmón derecho desde la izquierda.
    3. Postfix el tejido en paraformaldehído al 4% durante 1 hr, congelar las muestras en frío de 2-metilbutano, y los almacena a -80 ° C.
    4. Recoger 40 micras secciones usando un criostato, montarlos inmediatamente en portaobjetos (uno de cada cinco), y procesarlos para inmunohistoquímica, como se detalla a continuación.
  3. Las rebanadas de tejido permeabilización y el bloqueo de
    1. Lavar con PBS (2 x durante 5 min) y permeabilizar con 0,1% Triton X-100 PBS durante 15 min a TA.
    2. Lavar con PBS (2 x durante 5 min) y bloquear con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 30 min a TA.
    3. Lavar con PBS (2 x durante 5 min) y proceder con CC.
  4. CC con azida-PEG3-Fluor 545 en cortes de tejido
    1. Se prepara una solución mezclando los reactivos CC preparados como se describe en la sección 2. Para 1 ml de solución, añadir: 2 l de azida-PEG3-Fluor 545 (5 mM), 20 l de TCEP (recién preparada stoc 50 mMk), 58,8 l de TBTA (recién preparada solución de trabajo de 1,7 mM), 20 l de CuSO 4 · 5H 2 O (50 mM stock) y 900 l de PBS.
    2. Añadir alrededor de 400 l de mezcla de CC a los cortes de tejido, que fueron preparados de acuerdo con el apartado 4.2. Prestar atención a que el volumen de la mezcla elegida CC es suficiente para cubrir las rebanadas. Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente protegido de la luz.
    3. Lavar con PBS (1 x para 5 min), metanol frío (1x para 5 min), una solución de EDTA 1% de Tween-20 y 0,5 mM en PBS (3 veces durante 2 min) y PBS (1 x para 5 min).
    4. Aire seco, añadir una gota de medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI (ver Material / reactivo de la tabla), cerrar con cubreobjetos (evitando la formación de burbujas), y sellar con el pulimento. Almacenar a 4 ° C hasta su análisis.
  5. Adquisición de imágen
    1. Utilizar un microscopio confocal equipado con 546 nm y 450 nm láseres de excitación (ver Material Tabla / Reactivo) siguientela guía del usuario.
    2. Seleccionar un lente objetivo de 60X con NA = 1,40, asegurándose de vista previa de la diapositiva a través de los oculares y de centrarse en un área de interés.
    3. Determinar los parámetros de adquisición de acuerdo con las características de la muestra y de equipos.

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Representative Results

ARN14686 fue diseñado basado en el andamio de la ARN726 inhibidor naaa. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal (Figura 1). La etiqueta de alquino se introdujo con el fin de permitir el uso de un procedimiento de marcaje de dos pasos para añadir un fluoróforo o una molécula de biotina por medio de CC. Esta característica hace que ARN14686 una herramienta muy versátil para sondear NAAA in vitro e in vivo.

A continuación, se muestran dos aplicaciones de ARN14686, que son representativos del potencial de esta molécula. La figura 2 es un esquema del procedimiento experimental se informó aquí. Después de la administración iv de la sonda, dos diferentes métodos de detección pueden ser utilizados: i) análisis de la expresión NAAA activa mediante transferencia de la proteína y ii) análisis de la expresión activa NAAA y localización dentro de las células por fluorescence microscopía.

El primer resultado representativo fue publicado recientemente por nuestro grupo 29. Se analizó la expresión NAAA en un modelo de rata de inflamación de la pata inducida por CFA. La sonda (3 mg / kg) o vehículo se inyectaron iv en ratas ingenuas y CFA tratados. Las ratas se sacrificaron 4 horas más tarde. CC se realizó en extractos enriquecidos lisosomales para introducir una etiqueta de biotina en las proteínas sonda marcada. proteínas biotiniladas fueron los siguientes enriquecieron usando perlas de estreptavidina. Las proteínas eluidas se analizaron mediante transferencia de proteínas, que muestra que los niveles de NAAA activo se incrementaron notablemente en las patas de ratas tratadas con CFA en relación con los de las ratas de control (Figura 3). La ventaja del análisis de transferencia de proteínas es que permite un examen detallado del proteoma sonda reactiva, que se separa por electroforesis en gel. Este enfoque también permite la presentación de posibles sonda fuera de los objetivos. Un control sin sonda debe estar almaneras incluyen con el fin de excluir las proteínas biotiniladas endógenos, que constituyen el fondo experimental. La punta de flecha en la Figura 3 indica tales proteínas fondo, que a su vez se pueden utilizar como un control de referencia de carga.

En un segundo experimento no publicado (Figura 4), se utilizó para sondear ARN14686 NAAA para la detección ex vivo por microscopía de fluorescencia. Se administró a ratones en ARN14686 3 mg / kg (iv) y los sacrificamos 2 hr después del tratamiento por perfusión transcardial. Se recogieron los pulmones, después se fijaron, y se congelaron en frío de 2 metylbutane. La reacción CC para la adición fluoróforo se realizó directamente en cortes de tejido de 40 m de espesor, recogidas con un criostato. El análisis por microscopía de fluorescencia mostró la presencia de NAAA catalíticamente activo en estructuras vesiculares difusas que pertenece a los macrófagos alveolares. En comparación con el uso de un anticuerpo específico de la proteína, sólo la unaSe observa enzima ctivo.

Figura 1

Figura 1:. Esquema de reacción de síntesis de ARN14686 undec-10-in-2-ol fue activado por dipyridylcarbonate (DPC) en presencia de catalizador 4-dimetilaminopiridina (DMAP), para producir un carbonato mixto. A continuación, esta carbonato se hizo reaccionar con la lactama amino para obtener la molécula diana ARN14686. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Esquema de flujo de trabajo de la estrategia general que se muestra en el presente trabajo La sonda se inyecta en animales (ratas o ratones) y dirigir la expresión se analiza dos siguientes procedimiento experimental diferentes: i) El proteoma marcado se extrae y la biotina se añade por CC. Después de una fase de enriquecimiento de las proteínas biotiniladas sobre perlas de estreptavidina, destinos de la sonda se analizaron mediante transferencia de proteínas. ii) cortes de tejido se preparan y un fluoróforo se añade por CC. Sonda de localización objetivo es analizado por microscopía de fluorescencia. Esta cifra se ha adaptado de Bonezzi et al. 29 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Análisis de la activación NAAA en las patas de ratas tratadas con CFA El análisis de proteínas blot de las proteínas estreptavidina enriquecido de ratas ingenuas (carriles 1 y 2) ratas o inyectados con CFA 7 días después de la inyección (carriles 3 y 4). Las ratas recibieron inyecciones iv de vehículo o ARN14686 (3 mg / kg). La membrana de transferenciase sondeó con una estreptavidina fluorescente. La flecha indica la banda naaa; la punta de flecha indica una banda que contiene biotina de aproximadamente 90 kDa, que muestran que una cantidad similar de proteína se cargó en cada carril. Esta cifra ha sido modificado a partir de Bonezzi et al. 29 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Ex vivo de detección de la sonda se informó marcado NAAA en pulmones de ratón por microscopía de fluorescencia imágenes representativas de secciones de pulmón de vehículo- (A) o ratones ARN14686-inyectado (B) después de CC con azida-PEG3-Fluor 545.. Se detectó una señal positiva (glóbulos rojos) en ratones ARN14686 inyectado, mientras que no se detectó señal en vehículo ratones administrados. Un detalle de un macrófago alveolar positivo azida-PEG3-Fluor 545 se muestra en la C a mayor aumento. Los núcleos fueron marcados con DAPI (azul). Barra de escala = 50 micras de A y 10 micras de C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La actividad enzimática se finamente regulada a diferentes niveles, incluyendo la transcripción de ARN, síntesis de proteínas, la translocación de proteínas, modificación después de la traducción, y la interacción proteína-proteína. A menudo, la expresión de la enzima sola no tiene en cuenta para su actividad. ABPP fue desarrollado para estudiar la actividad de las proteínas en su estado nativo. Se requieren dos características: una sonda química que se une covalentemente al sitio activo de una enzima de interés y una etiqueta de reportero para detectar la enzima sonda marcada.

diseño de la sonda y la síntesis son puntos críticos del procedimiento. La sonda debe tener una afinidad y selectividad adecuadas para su objetivo. Por otra parte, la presencia de una etiqueta de reportero no debe afectar objetivo de compromiso. Este problema se supera en gran medida por el diseño de un ABP de dos etapas, en el que se introduce la etiqueta de reportero después de que el objetivo ha sido capturado. Sondas libre de la etiqueta son especialmente adecuados para los estudios in vivo, en el que la actividad de proteínaspuede ser evaluado en una célula viva o un organismo, con la alteración externa mínima. La sonda ARN14686 naaa fue diseñado para cumplir con los requisitos descritos anteriormente. El β-lactámicos ojiva reactiva fue elegido sobre la base de los resultados anteriores obtenidos con la clase β-lactámicos de inhibidores NAAA 16,26. Estos compuestos inhiben NAAA de una manera potente y selectivo mediante la unión covalente a la cisteína catalítica de la enzima. Además, los compuestos demostraron ser sistémicamente activo 16. Introdujimos una cadena alifática saturada C9, teniendo en cuenta el aumento de la afinidad de NAAA para cadenas alifáticas largas. Se añadió una alquino terminal para permitir el etiquetado de dos pasos.

Otro paso crítico es la selección de la dosis y el tiempo para la administración in vivo. Esto depende de la estabilidad de la sonda en el plasma, su afinidad de destino, y su selectividad. La dosis correcta se debe seleccionar para permitir la captura del objetivo, evitando el compromiso de possible fuera de los objetivos. Se encontró que 3 mg / kg iv ARN14686 era óptima para capturar selectivamente naaa. Las dosis más altas dieron como resultado la captura de la amidasa cisteína homóloga, ceramidasa ácida. Con respecto a la duración del tratamiento, al analizar órganos bien perfundidos, como los pulmones, un corto tiempo (2 hr) puede ser suficiente para permitir la sonda para reaccionar con el objetivo. Para las patas, sin embargo, nos hemos visto obligados a duplicar el tiempo de reacción.

Un posible problema en el análisis por transferencia de objetivo de proteínas es debido a la presencia de las proteínas biotiniladas de forma natural. Estos serán, inevitablemente, ser identificados, junto con sonda objetivos específicos. Se encontró que la introducción de un paso preclearing con perlas de estreptavidina antes de realizar CC aumenta en gran medida la calidad de nuestros resultados. Por otra parte, la presencia de proteínas biotiniladas nativas podría ser utilizado para controlar los posibles artefactos de carga. Por último, con respecto a los estudios de localización por microscopía de fluorescencia, es muy importante ser consciente de probe selectividad, ya que, a diferencia de manchas de proteínas, microscopia de fluorescencia no permite la distinción del objetivo de sobre-objetivos. Los estudios preliminares de selectividad deben llevarse a cabo para evaluar la viabilidad y para establecer las condiciones experimentales óptimas.

Limitaciones de la técnica descrita se refieren principalmente a la necesidad de evitar condiciones experimentales que pueden afectar a la reacción de CC, tales como el uso de detergentes y tampones que contienen amina. Estos aspectos deben tenerse en cuenta a la hora de preparar un lisado celular o un homogeneizado de tejido. Por otra parte, cuando se requiere una fase de enriquecimiento estreptavidina, la cantidad de material de partida constituye otro problema, porque este procedimiento sólo es aplicable cuando el contenido de proteínas no es menor de 250 mg. Este límite se establece debido a problemas técnicos, como los volúmenes de trabajo, la recuperación de proteínas, después de la precipitación inducida por CC, y la cantidad de resina estreptavidina para ser utilizado.

Previously, la actividad NAAA podría ser solamente evaluó mediante la realización de ensayos de actividad, que requieren el uso de un tampón de activación para la activación in vitro de la enzima y para la solubilización sustrato 14. Este enfoque proporciona información acerca de la expresión total de naaa, no se trata de la presencia de naaa activo. Otra posibilidad es medir los niveles tisulares de la PEA y la OEA, pero este método sólo representa una forma indirecta de evaluar la actividad naaa 34,35. Además, los niveles de FAE pueden ser influenciados por otros factores tales como la biosíntesis. La sonda ARN14686 química es la primera ABP para naaa. El protocolo descrito aquí ilustra un procedimiento sencillo para la captura y visualización de la forma activa de NAAA, tanto in vitro como in vivo. Todas las manipulaciones de la muestra son posteriores a las reacciones de sonda-diana, dando así una información fiable sobre el estado in vivo de la enzima. Por otra parte, el uso de ARN14686 en microscopía de fluorescencia representa una herramienta única to localizar naaa activo. anticuerpos disponibles, que reconocen la subunidad catalítica naaa, no discriminan entre los de larga duración proenzima naaa y la enzima activa.

A partir de el protocolo descrito aquí, la expresión y la activación NAAA pueden ser analizados en diferentes líneas celulares y modelos animales de inflamación. estudios de co-localización se pueden realizar para caracterizar mejor el papel de NAAA en condiciones fisiológicas y patológicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2 Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

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References

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