Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Bioengineering

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Summary

Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme für ein breites Spektrum von Indikationen. Hier beschreiben wir eine einfache , aber leistungsfähige Methode Seide Nanopartikel mit Reverse Engineering Bombyx mori Seide herzustellen. Diese Seide Nanopartikel können leicht mit einem therapeutischen Nutzlast beladen werden und anschließend für Drug-Delivery-Anwendungen untersucht.

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Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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Abstract

Seide ist ein vielversprechender Biopolymer für biomedizinische und pharmazeutische Anwendungen aufgrund ihrer hervorragenden mechanischen Eigenschaften, Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit sowie ihre Fähigkeit zu schützen und anschließend freizugeben seine Nutzlast in Antwort auf ein Trigger. Während Seide kann in verschiedenen Materialformaten formuliert werden, Seide Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme. Daher deckt dieser Artikel die Verfahren für Reverse-Engineering-Seidenkokons eine regenerierte Seiden Lösung zu erhalten, die verwendet werden können, stabile Seide Nanopartikel zu erzeugen. Diese Nanopartikel werden anschließend charakterisiert, Wirkstoff beladen und als potenzielle Anti-Krebs-Arzneimittel-Abgabesystem erforscht. Kurz gesagt, Seide Kokons ersten Rückwärts durch Seide Auflösung von degumming die Kokons, gefolgt entwickelt und reinigen, um eine wässrige Lösung Seide zu erhalten. Als nächstes wird die regenerierte Seiden Lösung Nanopräzipitation zogen Seide Nanopartikel zu erhalten - eine einfache, aber leistungsfähige Methodedass erzeugt einheitliche Nanopartikel. Die Seiden Nanopartikel zeichnen sich dadurch nach ihrer Größe, das Zetapotenzial, die Morphologie und Stabilität in wässrigen Medien, sowie ihre Fähigkeit, ein chemotherapeutisches Nutzlast und töten menschlichen Brustkrebszellen einzuschließen. Insgesamt ergibt die beschriebene Methodik einheitliche Seiden Nanopartikel, die leicht für eine Vielzahl von Anwendungen untersucht werden können, einschließlich ihrer Verwendung als potentielles Nano.

Introduction

Nano-Größe Drug-Delivery-Systeme werden oft verwendet, Wirkstofffreisetzung zu steuern und eine vielfältige Reihe von therapeutischen Nutzlasten zu liefern - zum Beispiel Proteine, Peptide und kleine Molekulargewicht Drogen - Zellen und Gewebe zu zielen. Diese therapeutischen Nutzlasten werden oft in verschiedene makromolekulares Arzneimittelträger eingearbeitet, wie Liposome, wasserlösliche Polymere (einschließlich Dendrimere) und Mikro- und Nanopartikel 1. Nanopartikel ( in der Regel in einem Größenbereich von 1 nm bis 1000 nm) werden als potenzielle Wirkstoffträger weit erforscht, vor allem für Anti - Krebs - Medikamentenabgabe 2. Die erfolgreiche Einführung von Abraxane (120 nm großen Albumin-basierte Nanopartikel mit Paclitaxel beladen) in der klinischen Routine 3 hat das Feld katalysiert, so dass noch viele weitere Nanopartikel für Drug Delivery jetzt betreten klinischen Studien 4. Solide Tumoren zeigen in der Regel schlechte Lymphdrainage und haben undichte Blutgefäße, was bedeutet, dass nanoparticles von bis zu 200 nm passiv zu diesen Tumoren nach intravenöser Verabreichung gezielt werden. Dieses passive Targeting Phänomen ist die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt genannt und wurde erstmals 1986 5 angegeben. Der EPR - Effekt zu einer 50- bis 100-fache Erhöhung der Arzneimittelkonzentrationen im Tumor - Mikroumgebung für eine bestimmte Medikamentendosis führen kann , wenn die Droge Nutzlast ist ein hochmolekulares Wirkstoffträger-Ansatz, anstatt die freie Arzneimittel ohne Träger geliefert. Drug beladene Nanopartikel für Anti - Krebs - Medikamentenabgabe entwickelt haben den Tumor - Mikroumgebung zu erreichen und oft muss eine bestimmte intrazelluläre Kompartiment, in der Regel durch endocytic Aufnahme eingeben, für das Medikament seine gewünschten therapeutischen Effekt 3 zu erzielen. Nanopartikel die für intrazelluläre Arzneimittelabgabe auszunutzen Endozytose als Gateway in die Zelle als auch einen Weg Arzneimittelresistenzmechanismen zu überwinden. Die Wirkstofffreisetzung von Nanopartikeln wird häufig speziell entwickelt, um oCCur in Lysosomen (dh lysosomotropes Arzneimittelabgabe) 6 , wobei der pH - Wert Ansprechverhalten des Nanopartikel - Träger (lysosomalen pH ca. 4,5) als Auslöser für die Wirkstofffreisetzung oder lysosomale Enzyme, die die Nutzlast von dem Träger 7 befreien dienen kann.

Viele unterschiedliche Klassen von Materialien können verwendet werden Nanopartikel zu erzeugen (beispielsweise Metallen und vielen organischen und anorganischen Materialien). Allerdings Biopolymere sind , sich als attraktive Materialien aufgrund ihrer bekannten Biokompatibilität, die biologische Abbaubarkeit und geringe Toxizität 8. Viele Biopolymere werden erforscht, einschließlich Albumin, Alginat, Chitosan und Seide. Von diesen Seide hat sich als vielversprechende Anwärter für die Entwicklung in Systeme 9 Arzneimittelabgabe entstanden. Seiden verschiedener Typen werden durch eine Anzahl von Arthropoden hergestellt, einschließlich Spinnen (zB Nephila clavipes) und Seidenraupen (zB Bombyx mori). Silkworm Seide wird weit mehr exten verwendetlich als Spinnenseide, weil die Seidenraupe ist vollständig domestiziert und seine Seide stellt somit ein reproduzierbares Ausgangsmaterial. Silkworm Seide ist ein Food and Drug Administration (FDA) genehmigt Material für den menschlichen Gebrauch, insbesondere als Nahtmaterial; es verfügt über eine robuste Sicherheitsstandard bei Menschen und bekannt ist , 10 in vivo abzubauen. Der Abbauprofil von Seide kann fein abgestimmt werden von Stunden (niedrige kristalline Seide) zu 12 Monaten oder mehr (hohe kristalline Seide) zu reichen. Seidenabbauprodukte nicht toxisch sind und in dem Körper 10 metabolisiert. Die Seide Struktur verleiht die Fähigkeit , 11 kleine molekulare Verbindungen und hochmolekularen Proteinwirkstoffen zu binden, ist es ein gutes Material für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung zu machen. Protein Medikamente (zB Antikörper) sind anfällig für Denaturierung, Aggregation, proteolytische Spaltung und Clearance durch das Immunsystem. Allerdings Seide stabilisiert therapeutische Proteine ​​aufgrund der Pufferkapazität seiner nanokristallinem WiederRegionen und ihre Fähigkeit , Wassergehalt im Nanobereich 11 anzupassen. Diese einzigartigen Eigenschaften bieten physischen Schutz und reduzieren Nutzlast Mobilität 11 und sind in der Regel nicht mit anderen (Bio-) Polymeren gesehen. Viele Antikrebsarzneimittelabgabesysteme, zum Beispiel Seidenbasis Hydrogelen 12, Folien 13-15 und Nanopartikel 16,17 haben nun diese Funktionen (besprochen in Referenzen 18,19) zu nutzen , entwickelt

Hier Seide Nanopartikel wurden durch Bestimmung ihrer Größe und Ladung über einen längeren Zeitrahmen aus. Doxorubicin, eine klinisch relevante Anti-Krebs-Medikament, wurde als Modell Medikament zur Wirkstoffbeladung und Zytotoxizitätsuntersuchungen in triple negativen menschlichen Brustkrebszellen mit Wirkstoff beladenen Nanopartikel Seide behandelt verwendet.

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Protocol

1. Herstellung eines Reverse-Engineering Silk - Lösung von Bombyx mori Cocoons

HINWEIS: Diese Methode basiert auf Protokolle an anderer Stelle 12,27 beschrieben.

  1. Schneiden 5 g getrocknetes Kokons mit einer Schere in 5 mm x 5 mm große Stücke. Entfernen Sie alle verschmutzte Schichten.
  2. Man wiegt 4,24 g Natriumcarbonat und fügen Sie diese sorgfältig zu 2 l destilliertem Wasser kocht.
    HINWEIS: Dies ergibt eine 0,02 M Natriumcarbonat-Lösung.
  3. Fügen Sie die geschnittenen Kokon Stücke zum Kochen Natriumcarbonatlösung und kochen für 60 min die Seidenfasern zu DEGUM. Rühren Sie die Seide gelegentlich homogene Probenverarbeitung zu gewährleisten.
  4. Entfernen Sie die entschleimt Seide und waschen mit 1 l destilliertem Wasser für 20 min; Wiederholung der Waschstufe mindestens 3 mal.
  5. Entfernen Sie die gewaschener Seide und drücken Sie es gut um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und dann lösen / ziehen die Seide von Hand. Legen Sie die ungebundene Seide in einem Abzug über Nacht trocknen an der Luft. Dies ergibt typischerweise 3,6 g entschleimt silk Fasern.
  6. Am nächsten Tag wiegen 5 g luftgetrocknete entschleimt Seidenfasern und packen die Seide fest in den Boden eines 50 ml-Becher.
  7. Eine frische 9,3 M LiBr-Lösung. Man löst die Seidenfasern in LiBr mit einer 1 g Seide bis 4 ml LiBr-Verhältnis. Decken Sie die Seide LiBr Probe mit Aluminiumfolie Verdunstung verhindern und damit die Seide zu lösen vollständig bei 60 ° C. Dieser Schritt dauert 4 Stunden und wird von gelegentlichem Rühren unterstützt.
  8. Benetzen eine Dialysekassette (Molekulargewicht cut-off von 3.500 Da) in Wasser für 5 min. Injizieren Sie 15 ml der Seide LiBr-Lösung in die 15 ml Dialysekassette und die Verwendung einer Nadel und Spritze Luftblasen zu entfernen.
  9. Dialysieren gegen 1 l destilliertes Wasser und das Wasser wechseln bei 1, 3 und 6 Stunden (dh 3 Änderungen am ersten Tag) und wieder am nächsten Morgen und am Abend (dh 2 Änderungen am zweiten Tag) und wieder am nächsten Morgen (dh 1 Änderung am dritten Tag).
  10. Sammeln Sie die Seide solutiauf von der Dialysekassette und Zentrifuge die Lösung 20 min bei 5 ° C bei 9.500 x g. Gewinnen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Zentrifugierprozesses zweimal.
  11. Bestimmen Sie das Gewicht eines leeren Wiegeschiffchen (W1) und 1 ml der Seiden Lösung. Nehmen Sie das Gewicht wieder (W2) und dann die Probe trocken durch das Wiegeschiffchen bei 60 ºC über Nacht verlassen. Als nächstes wird das gesamte Trockengewicht (W3) (getrocknet Seide und Wiegeschiffchen) bestimmen. Die Konzentration der Seidenlösung (w / v) beträgt:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

2. Herstellung von Seide Nanopartikel aus Reverse-Engineering Silk-Lösung

  1. Fügen eine 5% (w / v) Seiden Lösung tropfenweise zu Aceton während eine> 75% aufrechterhalten (v / v) Acetonlösung. Beispielsweise fügen 9 ml einer 5% (w / v) Seiden Lösung tropfenweise (10 & mgr; l / Drop mit einer Geschwindigkeit von 50 Tropfen / min) auf 34 ml Aceton.
  2. Zentrifugieren der Niederschlag bei 48.000 xg für 2 h bei 4 ° C.
  3. Den Überstand aspirieren und resuspendieren pellet in destilliertem Wasser, indem man zuerst das Pellet mit einem Spatel Verdrängen und dann Zugabe von 20 ml destilliertem Wasser. Verwenden Sie Pipettenspitzen des Pellets aus dem Spachtel zu entfernen. Nach Vortexen für 20 Sekunden durch zwei Beschallungszyklen gefolgt für eine Ultraschallsonde bei 30% Amplitude unter Verwendung von 30 sec, oben das Zentrifugenröhrchen, um die Kapazität mit destilliertem Wasser.
  4. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspension Schritt mindestens zweimal.
  5. Das Pellet in 6 ml destilliertem Wasser, wie bei 4 ° C bis zur Verwendung in 2.3 und speichern beschrieben. Für Zellkulturstudien, Seide Nanopartikel Aktien können Gamma sein 17 bestrahlt.

3. Bestimmung der Silk Nanoparticle Concentration

  1. Zentrifuge Seiden Nanopartikel bei 48.000 xg für 2 h bei 4 ° C.
  2. Sammle alle Nanopartikel in 3 ml destilliertem Wasser, gefolgt von zwei Beschallungszyklen bei 30% Amplitude für 30 sec.
  3. Teilen Sie die 3 ml Lager aus Seide Nanopartikel in 2 ml und 1 ml-Portionen und Transfer in prE-wog 2-ml-Röhrchen. Notieren Sie die Gesamtgewicht der 2 ml Probe. Bewahren Sie die 1 ml Menge bei 4 ° C bis zur Verwendung; Diese 1 ml-Probe wird verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen.
  4. Schnellfrost und dann lyophilisieren die 2 ml Seide Nanopartikel Menge in einem Gefriertrockner über Nacht. Nach Gefriertrocknung, reweigh die 2-ml-Röhrchen und berechnen die Menge an Seide Nanopartikel (mg), die ursprünglich in der 2-ml-Probe war.
  5. Verdünnen Sie die 1 ml Seide Nanopartikel Lager mit destilliertem Wasser zu erzeugen, einen 5-Punkt-Kalibrierungskurve (0,04-7 mg / ml). Stellen Sie sicher, dass die Proben nicht das Absorptionsmaximum überschreiten.
  6. Bestimmen Sie die Absorption jeder Standardverdünnung bei 600 nm. Dies wird am besten mit einem 96-Well-Platte-Setup. Plot der Absorption gegen die Konzentration (mg / ml) für die Standardkurve. Dann verwenden Sie diese Standardkurve routinemäßig die Konzentration von Seide Nanopartikel in Suspensionen zu bestimmen.

4. Herstellung von Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln Silk

  1. Man löst 1,2 mg Doxorubicin HCl in 8 ml destilliertem Wasser.
  2. Machen Sie bis zu 10 ml mit destilliertem Wasser ein Arbeits Bestand von 116 ug / ml zu erhalten (0,2 mmol / ml).
  • Herstellung von Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln Silk
    1. Mix 2 ml von 0,2 & mgr; mol / ml Doxorubicin-Lösung mit 200 & mgr; l von 10, 30 oder 50 mg / ml von Seiden Nanopartikel in einem 2 ml Röhrchen.
    2. Inkubieren Sie die Seide-Doxorubicin Suspension bei Raumtemperatur (25 ° C) über Nacht auf einem Rotationsmischer.
    3. Als nächstes Zentrifuge die Seide-Doxorubicin Suspension bei 194.000 × g für 30 min. Waschen Sie die Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide mit destilliertem Wasser und wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal.
    4. Pool den Überstand und beachten Sie das Gesamtvolumen (in diesem Beispiel verwendet wird, um die Verkapselungswirksamkeit zu bestimmen).
    5. Resuspendieren der Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide in destilliertem Wasser, vor Licht schützen und lagern bei 4 ° C until Einsatz.
  • Bestimmung der Encapsulation Efficiency and Drug Loading
    1. Jeweils 200 & mgr; l des Überstandes aus Schritt 4.2.4 in einer schwarzen Mikrotiterplatte.
    2. Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Mikroplattenlese Doxorubicin-assoziierte Fluoreszenz bei einer festen Photomultiplier Einstellung zu messen.
    3. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 485 nm und die Emissionswellenlänge auf 590 nm und die Fluoreszenzwerte aufzuzeichnen.
    4. Generieren Sie eine Doxorubicin Kalibrierungskurve. Sicherzustellen Messungen sind mit gleichen Instrumenteneinstellungen erfasst (dh mit einer festen Photomultiplier - Einstellung). Unter Verwendung der Kalibrierungskurve, die Berechnung der Doxorubicin-Konzentration in der kombinierten Überstand. Wiederholen Sie diese Messung in drei unabhängigen Experimenten.
    5. Verwenden der Gleichung (1) Einkapselungseffizienz zu bestimmen:
      Gleichung 1
  • 5. Charakterisierung von Silk NanoTeilchen

    1. Beurteilung der Größe und Zeta-Potential von frisch hergestellt und gelagert Silk Nanopartikel.
      1. Store Seiden Nanopartikel in destilliertem Wasser bei 4 ° C und 25 ° C.
      2. Messen Sie die Größe und Zeta-Potential der Seide Nanopartikel an den Tagen 0, 14 und 28 unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS). Stellen Brechungsindizes auf 1,33 für destilliertes Wasser und 1,60 für Protein 17. Berechnen Partikelgrößen mit der Benutzeroberfläche Software.
    2. Morphologische Bewertung der Silk-Nanopartikeln durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
      1. Legen Sie eine Kohlenstoff Haftscheibe auf eine SEM-Stub und befestigen Sie anschließend einen Siliziumwafer.
      2. Verdünnte Seiden Nanopartikel bis zu einer Konzentration von 1 mg / ml. Je 10 ul der Probe auf einen Siliziumwafer, gefrieren die Probe bei -80 ° C und über Nacht lyophilisieren eine Gefriertrocknungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      3. Bestreichen Sie die Probe mit einer Goldschicht von bis zu 20 nm dickmit einem niedrigen Vakuum-Sputter-Beschichtungsvorrichtung.
        HINWEIS: Die Einstellungen des Geräts variieren zwischen den Modellen. Das Modell hier verwendet wird, ist voll automatisiert und arbeitet nur mit der Dicke.
      4. Bildproben mit einem Rasterelektronenmikroskop bei 5 kV und einer 40.000-fachen Vergrößerung.

    6. In - vitro - Zytotoxizität von Kontrolle und-Doxorubicin beladen Silk Nanopartikel

    1. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach Exposition mit Silk Nanopartikel.
      1. Kultur MDA-MB-231-Zellen in RPMI 1640 mit 10% v / v FBS. Platten Zellen auf Gewebskultur - Polystyrol behandelt und bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre inkubiert. alle 2-3 Tage Subkultur Routinemäßig bei 80% Konfluenz.
      2. Platte MDA-MB-231 - Zellen in einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen / cm 2 in 96-Well - Platten. Lassen Sie die Zellen über Nacht zu erholen.
      3. In (i) 0,001 bis 1 & mgr; g frei diffusionsfähig Doxorubicin, (ii) von 0,001 bis 0,5 mg Seide Nanopartikel und 0,1 mg Seide Nanopartikelbeladen mit 0,001 bis 1 & mgr; g Doxorubicin in 96-Well-Platten (Endvolumen 100 ul pro Vertiefung).
      4. Bestimmen , die Lebensfähigkeit der Zellen und die halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC 50) durch Zugabe von (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT von 5 mg / ml in PBS) bei 72 h. Inkubieren 5 Stunden, abtropfen lassen Sie sorgfältig die Vertiefungen mit einer Pipette und die Formazan mit 100 ul Dimethylsulfoxid aufzulösen. die Absorption bei 560 nm messen. diese Messung in drei unabhängigen Experimenten wiederholen.
        HINWEIS: Die Absorptionswerte von unbehandelten Kontrollen dienen als Referenzwert für 100% der Lebensfähigkeit der Zellen.
    2. SEM von Zellen Exposed Silk Nanopartikel.
      1. Seed MDA-MB-231 Zellen auf sterilen Glasdeckgläschen in einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen / cm 2. Lassen Sie die Zellen über Nacht zu erholen. Belichten der Zellen zu den gewünschten Behandlungsbedingungen für 72 Stunden.
      2. Fixieren die Zellen mit 2% v / v Glutaraldehyd in PBS für 30 min, wasche mit digestillt Wasser zweimal, dehydrieren mit einer Ethanol - Serie und kritischen Punkt die Proben trocknen, wie an anderer Stelle 28 ausführlich beschrieben.
      3. Sputter-Beschichtung der Proben mit einer Goldschicht von bis zu 20 nm Dicke mit einem niedrigen Vakuum-Sputter-Beschichtungsvorrichtung.
        HINWEIS: Die Einstellungen des Geräts variieren zwischen den Modellen. Das Modell hier verwendet wird, ist voll automatisiert und arbeitet nur mit der Dicke.
      4. Bild die Proben durch SEM eine Elektronenbeschleunigung von 5 kV und 700-facher Vergrößerung verwendet wird.

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    Representative Results

    Die Daten wurden statistisch als detailliert zuvor 17 analysiert. Die t-Test nach Student wurde für die Probenpaare und Einwegvarianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichs post-hoc-Test für mehrere Proben verwendet. Ein Sternchen bezeichnet eine statistische Signifikanz wie folgt: * P <0,05 und ** p <0,001. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) und die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der unabhängigen Experimenten dargestellt.

    Die regenerierten Seidenlösung wurde hergestellt und anschließend tropfenweise zu Aceton hinzugefügt , um Seide Nanopartikel über Nanopräzipitation (Abbildung 1) zu erzeugen. Dieses Verfahren ergab uniform (Polydispersitätsindex: 0,1), sphärisch, Seide Nanopartikel (106,5 nm ± 1,1) mit einer negativen Oberflächenladung (-49,57 mV ± 0,6) (2 und 3). Silk Nanopartikel stFähigkeit , in Wasser wurde bis zu 28 Tagen beurteilt durch Partikel Größe, Zeta - Potential und die Morphologie (2 und 3) überwacht wird . Über den 28-tägigen Lagerzeit bei entweder 4 ° C oder 25 ° C, keine signifikante Änderung der Partikelgröße, charge (Abbildung 2) oder Morphologie wurde beobachtet (Abbildung 3).

    Doxorubicin wurde als klinisch relevante Chemo Modell Medikament zur Wirkstoffbeladung und in - vitro - Zytotoxizität Studien verwendet. Drei verschiedene Seidennanopartikelkonzentrationen (10, 30 und 50 mg / ml) wurden verwendet, um die Arzneimittelbeladungskapazität der Seiden Nanopartikel zu beurteilen. Die Doxorubicin Einkapselungseffizienz für 10, 30 und 50 mg / ml Seiden Nanopartikel (dh 2, 6 oder 10 mg von Seide und 232 & mgr; g Doxorubicin) betrug 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 und 97 ± 0,2%, bzw. (4A ). Die Teilchengröße und Zeta-Potential von Doxorubicin-loADED Seiden Nanoteilchen (10 mg) wurden zu 10 mg Seide Nanopartikel Kontrollen gemessen und verglichen. Die Partikelgröße nicht geändert hat , nachdem die Arzneimittelbeladung (4B), während das Zeta - Potential von mit Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seiden signifikant von 49,57 ± 0,6 mV bis 43,52 ± 0,37 mV (4C) reduziert wurde.

    Die Fähigkeit von wirkstoffbeladene Seide Nanopartikel Doxorubicin zu liefern und anschließend töten Krebszellen wurde in vitro untersucht. Menschliche Brustkrebs MDA-MB-231-Zellen wurden auf Seide Nanopartikeln ausgesetzt, frei diffusionsfähig Doxorubicin oder Doxorubicin beladenen Seide Nanopartikel. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach einer 72 Stunden Expositionsdauer bestimmt. Die IC 50 -Werte der frei diffusiblen Doxorubicin und Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seiden waren 0,48 & mgr; g / ml und 0,24 & mgr; g / ml jeweils , während die Seide Nanopartikel hatten einen IC 50> 5 mg / ml (5A).Bei äquivalenten Arzneimitteldosen von 0,1 & mgr; g, frei diffusionsfähigen Doxorubicin und Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seiden verursacht signifikante Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen von 83 ± 11 und 65 ± 11%, bzw. (5B). Jedoch frei diffusionsfähig Doxorubicin zeigte eine wesentliche höhere Zytotoxizität als mit Doxorubicin beladenen Seide Nanopartikel. Diese quantitativen Messungen wurden durch qualitative SEM - Bildgebung (Abbildung 5c) bestätigt. Hier Kontrollkulturen zeigte eine hohe Zelldichte und einer vorherrschenden mesenchymalen MDA-MB-231-Phänotyp; Ähnliche Beobachtungen wurden Seide Nanopartikeln ausgesetzt für Kulturen gemacht. Um jedoch zu Doxorubicin ausgesetzt Kulturen zeigten eine deutlich unterschiedliche Zell-Phänotyp. Der äquivalenten Doxorubicin-Dosis, MDA-MB-231-Zellen mit frei diffundierbare Doxorubicin und Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seiden behandelt wurden, zeigten eine wesentliche Verringerung der Zellzahlen. Außerdem hatten viele Zellen eine sehr breite und Morphologie ausgebreitet. Kulturen exposed zu Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seiden zeigte Anzeichen von Nanopartikeln (und deren Aggregate) mit der Plasmamembran (5C) verbunden.

    Abbildung 1
    Abbildung 1: Die wichtigsten Schritte , um einen Reverse Engineering Seide Lösung und Seide Nanopartikel zu erzeugen Zuerst Seidenkokons Reverse Engineering werden durch Schneiden und sie dann degumming für 60 min (dh siedendem) entschleimt Seidenfasern zu ergeben.. Die Fasern werden in 9,3 M LiBr gelöst und dann für 72 Stunden gegen Wasser dialysiert. Eine wässrige 5% w / v Seidenlösung verwendet Seide Nanopartikel zu erzeugen. Die tropfenweise Zugabe von Seide in Aceton führt zu Seide Nanopräzipitation. Silk Nanopartikel werden für die spätere Verwendung gewaschen und zu sammeln. Bitte hier klicken , um eine größere Version davon zu sehenZahl.

    Figur 2
    Abbildung 2:. Größe und Ladung Charakterisierung von Seide Nanopartikel Partikelgröße und Zetapotential von Seide Nanopartikel bei 4 ° C und 25 ° C über 28 Tage. ± SD; Fehlerbalken sind auf dem Grundstück Symbol versteckt , wenn sie nicht sichtbar ist , n = 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 3
    Abbildung 3:. Qualitätsbewertung von Seide Nanopartikel bei 4 ° C gelagert und 25 ° C über 28 Tage Silk Nanopartikel wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie abgebildet (Maßstab = 1 & mgr; m). Please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Charakterisierung von mit Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide (Dox-SNPs) (A) Verkapselungseffizienz von 232 & mgr; g Doxorubicin in Antwort auf verschiedene Mengen von Seiden Nanopartikel (SNPs). 2, 6 und 10 mg Seiden Nanopartikeln. Die Verkapselungseffizienz 10 mg und 5 mg Seiden Nanoteilchen deutlich erhöht, wenn bis 2 mg Seide Nanopartikel verglichen. (B) Partikelgröße und (C) Zeta - Potential von Doxorubicin beladenen Seide Nanopartikel im Vergleich zu Seide Nanopartikel steuern (10 mg Seide Nanopartikel). Statistisch signifikante Unterschiede für die Probenpaare wurden mit dem Student-t-Test bestimmt. Mehrere Proben wurden durch Einweg-ANOVA bewertet, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichs post-hoc-Test; * P & #60; 0,05, ** p <0,001, ± SD; Fehlerbalken werden im Plot-Symbol versteckt , wenn sie nicht sichtbar ist , n = 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 5
    Abbildung 5: In - vitro - Zytotoxizität von Seiden Nanopartikeln und Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide in menschlichen Brustkrebszellen (A) Die Lebensfähigkeit der Zellen von MDA-MB-231 - Zellen nach 72 Stunden Behandlungszyklus mit Seiden Nanopartikel (SNPs) (0,01-5 mg. / ml); Volumen pro Vertiefung wurden 100 ul. (B) Die Lebensfähigkeit der Zellen von MDA-MB-231 - Zellen nach 72 Stunden Behandlungszyklus mit 0,1 mg Seide Nanoteilchen, 0,1 ug frei diffundierbare Doxorubicin (Dox) oder 0,1 mg Seiden Nanoteilchen beladen mit 0,1 & mgr; g Doxorubicin (Dox-SNPs). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als statistisch auf 0,1 ug frei diffundierbare Doxorubicin nach Exposition vermindert und 0,1 mg Seiden Nanopartikel mit 0,1 & mgr; g Doxorubicin geladen, wenn im Vergleich zur Kontrolle. (C) REM - Aufnahmen von MDA-MB-231 - Zellen ausgesetzt (i) Medium (Kontrolle), (ii) 0,1 mg Seiden Nanoteilchen, (iii) 0,1 & mgr; g frei diffundierbare Doxorubicin und (iv) mit Doxorubicin beladenen Seiden Nanopartikeln an Äquivalentdosen (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m). Die statistische Analyse wurde durch eine Strecke mit einem Bonferroni-Mehrfachvergleichs post-hoc-Test gefolgt ANOVA, ns = nicht signifikant, * P <0,05, ** p <0,001, ± SD; Fehlerbalken werden im Plot-Symbol versteckt , wenn sie nicht sichtbar ist , n = 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

    Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung Seide Nanopartikel zu erzeugen, einschließlich Polyvinylalkohol 20 Mischen, Spray 21 Trocknen, Aussalzen 22, Kapillare microdot 23 Druck, überkritischem CO 2 Fällung 24 und Nanopräzipitation 16,25 ( zusammengefasst in Bezug 26). Allerdings Nanopräzipitation aufgrund seiner Gesamt Einfachheit ist die beliebteste Technik für Seide Nanopartikel zu erzeugen. Daher war das Ziel dieser Studie Nanopräzipitation anzuwenden Seide-Reverse Engineering auf Seide-basierten Nanopartikel herzustellen, die für eine Reihe von Anwendungen verwendet werden können, einschließlich lysosomotropes Anti-Krebs-Medikamentenabgabe.

    Im Laufe des letzten Jahrzehnts hat Nanopräzipitation für die Herstellung von Protein-basierten Nanopartikel 29 eine der am häufigsten verwendeten Verfahren werden. Unsere Forschungsgruppe 16,17 und andere 25,26,30,31 haben erfolgreich angewandt diese Techlogie zu Seide; Hier präsentieren wir eine einfache, aber robuste schrittweise Protokoll für die Erzeugung von Seide Nanopartikeln. Aceton Nanopräzipitation ergibt kugelförmige Seidenpartikel, die homogen in der Größe sind und fallen in der Regel im Nanometer-Größenbereich. Aceton wurde als bevorzugte kontinuierliche Phase über Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol und Butanol 16,25 entstanden. Aceton ergibt Nanopartikel , die ein geringeres Maß an Feuchtigkeit haben im Vergleich zu den metastabilen 100-200 nm sphärischen Mizellenstrukturen Größe in nativen und regenerierten Seidenlösungen 32. Allerdings gibt es Spielraum Lösemittelgemische und Variationen in degumming Zeit zu erforschen, um Seide (Nano-) Partikel mit potentiell unterschiedlichen Eigenschaften wie hier beschrieben zu erzeugen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet Aceton als kontinuierliche Phase, die die Herstellung von einheitlich kugelförmigen Nanogröße Seide Partikel (106,5 ± 1,1 nm) erlaubt, die eine negative Oberflächenladung tragen (-49,5777; 0,6 mV) und haben eine dichte Packung der hydrophoben, kristallinen Seidenketten 16,17. Insgesamt erfordert das beschriebene Verfahren wenig Hands-on - Zeit und liefert Seide Nanopartikel aus einem Reverse-Engineering wässrige Seide - Lösung (Abbildung 1). Einige der wichtigsten Merkmale dieses Verfahrens sind die Verwendung von 60 Minuten entschleimt Seide, die entsprechende Tropfengröße (ca. 10 & mgr; l / Drop) und einer maximalen Tropfgeschwindigkeit von 50 Tropfen / min. Die Einhaltung dieser wesentlichen Merkmale ergibt sich eine typische Ausbeute von 14%. Diese Nanopartikel sind robust und wir den Nachweis erbringen, dass sie stabil sind und sich nicht ändern ihre physikalischen Eigenschaften über einen 28 Tage Lagerzeit. Jedoch ist ein potentieller Einschränkung des beschriebenen Verfahrens die Abwesenheit Teilchen über einen breiten Grßenbereich zu erzeugen ( das heißt Partikel von Nanometer - Maßstab zu erzeugen bis Mikrometer , während eine schmale Polydispersitätsindex beibehalten).

    Controlling Partikelgröße, Ladung und Form ist important zur Arzneimittelabgabe, insbesondere dann , wenn 33 soliden Tumoren abzielt. Partikel im Bereich von 100 nm Größenbereich sind, sich als ideale Kandidaten für Tumor-Targeting. Daher sind 100 nm großen Seide Nanopartikel Potential Anwärter als Anti-Krebs-Drug-Delivery-Systeme für feste Tumorbehandlungen. Seiden Nanopartikel haben eine negative Oberflächenladung, die 16 sie leicht beladen mit positiv geladenen Medikamenten durch Ausnutzung der elektrostatischen Wechselwirkung macht. Doch neben Gebühr zusätzliche Arzneimittelmerkmale (zB logD) sind ebenfalls zu beeinflussen Wirkstoffbeladung bekannt und 34 freigeben. In der vorliegenden Studie, Doxorubicin, ein schwach basischen Anti-Krebs-Medikament, wurde als Modell Medikamentenkandidaten ausgewählt. Die Wirkstoffbeladung Studie (Abbildung 4) zeigte , dass die Seide Nanopartikel - Konzentration führte zu einer erhöhten Doxorubicin Verkapselungswirksamkeit zu erhöhen; 10 mg Seide Nanopartikel 232 ug Doxorubicin einzukapseln. Wirkstoffbeladung der Seide napartikel, die wiederum in Folge Seiden Nanoteilchen mit einem deutlich reduzierten Oberflächenladung, die eine direkte experimentelle Nachweis wurde bestätigt, dass das Doxorubicin-silk-Ladungs-Wechselwirkung für diese spezielle Wirkstoffträger Kombination wichtig ist.

    Wir haben bereits nachgewiesen, dass Seide Nanopartikel als lysosomotropes Drug - Delivery - System 16,17 dienen kann. Hier zeigen wir einen Test mit Doxorubicin beladenen Seide Nanopartikel mit der menschlichen Brustkrebs MDA-MB-231-Zelllinie zu behandeln. Diese Zellen stammen aus einer hochinvasiven triple negativem Brustkrebs (ER - / PR - / HER2 -), die nur schwer in der Klinik 35 zu behandeln. Daher wird ein Arzneimittelabgabesystem zugeschnittene Gestaltung dieser Patientenpopulation zu erwarten enorme Vorteile zu ergeben. In Abwesenheit von Arzneimittelbeladung, Seide Nanopartikel beeinflussen nicht die Lebensfähigkeit der Zellen (IC 50 -Werte> 5 mg / ml) (5a, c). Jedoch bei equivalente Dosen war signifikant höher Zytotoxizität mit frei diffundierbare Doxorubicin beobachtet , als mit Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide (Abbildung 5b). Die Unterschiede zwischen den in vitro zelluläre Pharmakokinetik von frei diffusionsfähig und Partikel gebunden Medikament diese Beobachtung erklären. Die frei diffusionsfähig Medikament kann schnell die Plasmamembran durch Diffusion durchqueren, während die Aufnahme der wirkstoffbeladenen Nanopartikel auf Endozytose beruht. Dennoch kann endocytic Aufnahme von Nanopartikeln Wirkstoffretention verbessern und Drogenresistenzmechanismen 3 überwinden. Jedoch ist der wahre Nutzen der Nanopartikel-vermittelten Antikrebsarzneimittelabgabe, dass es die EPR-Effekt ausnutzt passive Tumor-Targeting zu erleichtern und Pharmakokinetik zu verbessern. Daher kann die Verwendung eines Nanopartikels basierte Arzneimittelverabreichungsansatz nur dann vollständig in vivo beurteilt werden. In - vitro - Studien haben Grenzen (dh die Abwesenheit der EPR - Effekt), die die volle charact entgegenmerisation auslösen dieser Arten von Arzneimittelabgabesystemen 7.

    Zusammenfassend ermöglicht die beschriebene Methodik für die einfache Herstellung von sphärischen Seide Nanopartikel einheitliche Größe und Oberflächenladung. Diese Seide Nanopartikel können für ein breites Spektrum von Anwendungen (zB Kosmetika, Vorlagen für die Nanostrukturierung, theranostics, Schmiermittel, Steuer Partikel für Nanotoxizität Studien) verwendet werden, einschließlich deren Verwendung als Anti - Krebs - Drug - Delivery - Plattformen.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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    1. good article

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      Posted by: Anonymous
      August 12, 2017 - 9:49 AM

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