El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

Bioengineering

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Summary

Se describe un enfoque microquirúrgico para la generación de un bucle arteriovenosa (AV) como un modelo para el análisis de la vascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también es adecuado de manera óptima para la ingeniería vascularizado axialmente y tejidos trasplantables.

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Weigand, A., Beier, J. P., Arkudas, A., Al-Abboodi, M., Polykandriotis, E., Horch, R. E., Boos, A. M. The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (117), e54676, doi:10.3791/54676 (2016).

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Abstract

Introduction

La mayoría de los tejidos y órganos del cuerpo humano dependen de una red de vasos sanguíneos funcionales que suministra nutrientes, intercambia los gases y elimina los productos de desecho. Mal funcionamiento de este sistema debido a los problemas vasculares locales o sistémicos puede conducir a una multitud de enfermedades graves. Por otra parte, en las áreas de investigación, como la ingeniería de tejidos o la medicina regenerativa, una red de vasos sanguíneos funcionales dentro de los tejidos generados artificialmente u órganos trasplantados es indispensable para el éxito de la aplicación clínica.

Durante décadas los investigadores han estado investigando los mecanismos exactos involucrados en la creciente vasculatura para ganar la penetración más profunda en situaciones patológicas con el fin de encontrar nuevas intervenciones terapéuticas y proporcionar una mejor prevención de trastornos vasculares. En el primer paso, los procesos básicos tales como las interacciones célula-célula o el efecto de moléculas sobre las células del sistema vascular son generalmente investigados por vitro en 2D o 3Dexperimentos. modelos 2D tradicionales son fáciles de realizar, están bien establecidos y han contribuido en gran medida a una mejor comprensión de estos procesos. Por primera vez en 1980, Folkman et al. reportado en la siembra de la angiogénesis in vitro de células endoteliales capilares en placas revestidas de gelatina 1. Esto inmediatamente dio lugar a la publicación de una multitud de otros experimentos de angiogénesis 2D en tubo de ensayo de células endoteliales formación 2, ensayo de migración de 3 y el co-cultivo de diferentes tipos de células 4, así como otros. Estos ensayos se siguen utilizando hoy en día y se aceptan como estándar en métodos in vitro.

Sin embargo, esta configuración experimental no siempre es adecuada para el estudio del comportamiento de células in vivo ya que la mayoría tipos de células requieren un entorno 3D para formar estructuras de tejidos fisiológicos relevantes 5. Se pudo demostrar que la arquitectura de la matriz 3D es decisivo para morphogenesi capilars 6 y que las interacciones célula-matriz celular adicional (ECM) y la cultura 3D condiciones regulan factores importantes que intervienen en la angiogénesis tumoral 7. La matriz 3D proporciona entradas mecánicas complejas, pueden unirse a las proteínas efectoras y establecer gradientes de concentración de solutos tejido escala. Por otra parte, se considera necesario con el fin de imitar en morfogenética vivo y pasos de remodelación de tejidos complejos 5. En estos sistemas, tanto la angiogénesis como la vasculogénesis puede ser estudiado. Mientras que la angiogénesis se describe el surgimiento de capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes 8, vasculogénesis se refiere a la formación de novo de vasos sanguíneos a través de células endoteliales o sus progenitores 9,10. La maduración de los vasos se describe en un proceso llamado "arteriogénesis" a través de reclutamiento de células de músculo liso 11. Un angiogénico típico modelo in vitro es el surgimiento de células endoteliales de la monocapa existentes sembró como una monocapa en las superficies de gel, en la superficie de las microesferas incrustadas dentro de un gel o mediante la construcción de esferoides de células endoteliales 12. En los modelos vasculogénicos células endoteliales individuales están atrapados en un gel 3D. Ellos interactúan con las células endoteliales adyacentes para formar estructuras y redes de novo vasculares, típicamente en combinación con células de apoyo 12.

Sin embargo, incluso en 3D compleja en modelos in vitro no pueden imitar en entornos in vivo dado completamente la multitud de célula-célula y célula-ECM Interacciones de 13. Las sustancias con alta actividad in vitro no muestran automáticamente los mismos efectos in vivo y viceversa 14. Para un análisis exhaustivo de la vascularización procesa existe una necesidad urgente de desarrollar in vivo en modelos que simulan mejor la situación en el cuerpo. Una amplia gama de ensayos de angiogénesis in vivo se describen en la literatura, incluyendo elensayo polluelo corioalantoidea membrana (CAM), el modelo de pez cebra, el ensayo de angiogénesis de la córnea, el modelo de saco de aire dorsal, la cámara dorsal del pliegue cutáneo, los modelos de tumores subcutáneos 14. Sin embargo, estos ensayos se asocian a menudo con limitaciones, tales como cambios morfológicos rápidos, problemas en nuevos capilares distintivas de las ya existentes en el ensayo de CAM, o el espacio limitado en el ensayo de angiogénesis de la córnea 15. Además, se utilizan sistemas de no mamíferos (por ejemplo., El modelo de pez cebra 16), que conduce a problemas en los xenotrasplantes 17. En el modelo de tumor subcutáneo, la angiogénesis se origina sólo a partir del propio tumor no puede ser analizada desde el tejido adyacente contribuye en gran medida al proceso de vascularización. Por otra parte, el tejido circundante puede tener un papel decisivo en la formación del microambiente tumoral 18.

No sólo para el estudio de la angiogénesis o vasculogénesis es que hay una fuerte need para una estandarizado y bien caracterizado modelo in vivo, sino también para el estudio de diferentes estrategias de vascularización en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Hoy en día, la generación de órganos artificiales complejos o tejidos es posible tanto in vitro como in vivo. Bioprinting 3D proporciona una técnica de fabricación bajo demanda para la generación de complejo 3D tejidos vivos funcional 19. Además, los biorreactores se pueden utilizar para la generación de tejidos de 20 o incluso el propio cuerpo puede ser utilizado como biorreactor 21. Sin embargo, el principal obstáculo para la aplicación exitosa de los tejidos generados artificialmente es la falta de vascularización dentro de las construcciones de ingeniería. Conexión inmediata a la vasculatura del huésped tras el trasplante es un requisito previo importante para la supervivencia, especialmente en el caso de tejidos u órganos artificiales de gran escala.

Diferentes estrategias in vitro o in vivo en prevascularization eran desadesa- para establecer una microvasculatura funcional en construcciones antes de la implantación 22. La implantación de un andamio con in vitro capilares ingeniería preformadas sobre la piel dorsal de ratones condujo a una rápida anastomosis de la vasculatura ratones dentro de un día 23. En contraste, un co-cultivo de esferoides que consiste en células madre mesenquimatosas humanas y células endoteliales de la vena umbilical humana reunidos en una red prevascular tridimensional desarrolló aún más después de la implantación in vivo. Sin embargo, la anastomosis con la vasculatura huésped se limitó 24. Por encima de todo, en los defectos pobremente vascularizados, como las áreas necróticas o irradiados, esta llamada vascularización extrínseca - el crecimiento interno de los vasos de la zona circundante en el andamio - a menudo falla. Vascularización intrínseca, por el contrario, se basa en un eje vascular como fuente de nuevos capilares que brotan en el armazón 25. Utilizando el enfoque de la vascularización axial, La ingeniería tisular puede ser trasplantado con su eje vasculares y conectado a los vasos locales en el sitio receptor. Inmediatamente después del trasplante, el tejido está adecuadamente soportada por el oxígeno y los nutrientes, lo que crea las condiciones adecuadas para la integración óptima.

Debido a la limitada disponibilidad de modelos para la investigación de la angiogénesis in vivo y en reconocimiento de la creciente importancia de generar tejido vascularizado axialmente, hemos desarrollado el enfoque microquirúrgico de Erol y Spira además para generar un bucle arteriovenosa (AV) en el modelo animal 26. El uso de una cámara de implantación completamente cerrada hace que este método muy adecuado para estudiar la formación de los vasos sanguíneos debajo de "controlado", bien caracterizado en condiciones in vivo (Figura 1). Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también se adapta de forma óptima para la vascularización axial de los andamios de tejido Engininge- propósitos.

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Protocol

El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg (FAU) y el Gobierno de Franconia Media, Alemania, aprobó todos los experimentos. Para los experimentos, las ratas Lewis macho con un peso corporal de 300 - 350 g se utilizaron.

1. El modelo de bucle arteriovenosa en la rata

  1. Procedimiento de implantación (Figura 2)
    1. Para la anestesia utilizar una caja de plástico especial que está conectado a través del tubo al vaporizador de isoflurano y cerrado por una tapa. Encienda el suministro de gas y caudalímetro entre 0,8 - 1,5 l / min.
    2. Coloque la rata en la caja de plástico inducción y sellar la parte superior. Activar el vaporizador de isoflurano al 5%.
    3. Observe cuidadosamente la rata durante la inducción de la anestesia. Después de 3 - 4 min, se anestesió la rata.
    4. Confirmar la anestesia adecuada: la pérdida del reflejo de enderezamiento, la pérdida del reflejo palpebral, reflejo de retirada, reflejo corneal positivo.
    5. Retire la rata de la caja y comprobar supeso para el cálculo de las drogas. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
    6. Administrar medicamentos para el dolor y antibióticos (por ejemplo., 7,5 mg / kg por vía subcutánea enrofloxacina (sc), 12,5 mg / kg de tramadol y 100 mg / kg metamizol tanto por vía intravenosa (iv)). Administrar cristaloides adaptada de peso durante el funcionamiento (por ejemplo., 30 ml / kg sc).
    7. Coloque la rata en su parte posterior en una placa de calentamiento a 37 ° C bajo anestesia con 1 - 2% por inhalación de isoflurano administrado a través de la máscara.
    8. Monitorear la anestesia adecuada y aumentar el nivel de anestesia con isoflurano si es demasiado baja (movimiento de la rata, la respuesta al dolor, el tono de la mandíbula, sin pérdida de los reflejos (véase 1.1.4.), El aumento de la frecuencia cardíaca). Tenga cuidado de no sufrir una sobredosis de isoflurano (pérdida de los reflejos corneales, alta frecuencia cardiaca, disminución de la saturación de oxígeno). Utilice una oximetría de pulso especial para pequeños animales para el control de la saturación de oxígeno (95-100%) y la frecuencia cardíaca (250 a 450 / min) de la rata. Durante los operatide la temperatura del monitor de la rata (36 - 40 ° C) y ajustar la temperatura de la placa de calentamiento si es necesario.
    9. Afeitarse los lados interiores de las patas traseras con una maquinilla de afeitar eléctrica y desinfectar la zona con antisépticos. Difundir las extremidades traseras y fijarlos con cinta adhesiva.
    10. Coloque la rata bajo un microscopio quirúrgico y para abarcar la rata con drapeado estéril. Asegúrese de que todo el procedimiento de operación se realiza en condiciones estériles.
    11. Abra la piel en el medio del muslo izquierdo con una incisión longitudinal desde la rodilla hasta la ingle superior utilizando un bisturí (No. 10).
    12. Cortar el tejido subcutáneo y la fascia en capas de aproximadamente 3 cm de longitud utilizando unas tijeras de disección y microforceps hasta que el haz vascular femoral está expuesto desde la arteria de la pelvis en la ingle a la bifurcación de la arteria femoral en la rodilla.
    13. Separar los vasos y quitar la adventicia con unas tijeras y adventicia microforceps.
    14. Coagular el lado Branchos utilizando la coagulación eléctrica. Cubrir el campo de operación con una compresa húmeda.
    15. Abra la piel en el lado derecho como se describe para el lado izquierdo, 1.1.11 a 1.1.14.
    16. Para la cosecha del injerto venoso, ligar la vena femoral derecha por coagulación eléctrica en los extremos proximal y distal a una distancia de 1 - 1,5 cm.
    17. Retire el injerto venoso con microforceps y lave el injerto venoso con una solución de heparina (50 UI / ml en una solución de cloruro sódico al 0,9%) usando una cánula de irrigación y la transfiere en el muslo izquierdo. Cubrir el campo de operación en el lado derecho con una compresa húmeda.
    18. Ligar la vena femoral en el lado izquierdo de manera proximal en la región inguinal con una abrazadera de microvasos. Coagular la vena femoral distal por coagulación eléctrica, en la rodilla superior antes de ramificación, en una distancia de unos 2 cm.
    19. Para anastomosis conecte el extremo proximal del injerto venoso con el extremo proximal de la vena por anastomosis de extremo a extremo con un Sutur 11-0mi. Utilizar unos 8 suturas interrumpidas. Comience con la colocación de los dos primeros puntos de sutura en las posiciones de las 12 y las 6 horas. Luego, se coloca en 2 a 3 suturas más entre estos puntos en la parte frontal y luego poner 2 a 3 suturas más en la parte de atrás.
    20. Ligar la arteria femoral de la misma manera descrita para la vena femoral (1.1.18.). Asegúrese de que los buques de bucle no estén torcidas. Anastomosan el extremo distal del injerto venoso con el extremo proximal de la arteria como se describe para la vena femoral (pasos 1.1.19.).
    21. Administrar 25 UI de heparina por vía intravenosa. Hacer de nuevo que los vasos de bucle no se tuercen, Retire las abrazaderas y comprobar si hay fugas y la permeabilidad del bucle durante unos 5 minutos.
    22. Papaverina regate (por ejemplo, 4 mg / ml) en los buques a prevenir los espasmos vasculares. Si hay permeabilidad, el bucle se expande y el pulso de la arteria se puede observar.
    23. Rellenar previamente la cámara de implantación con la primera media (aproximadamente 500 l) de la matriz (por ejemplo, </ Em>, un hidrogel o una matriz ósea con o sin células). Incrustar el bucle en la cámara de la implantación.
    24. Llenar la cámara de implantación con el segundo medio de la matriz a un volumen total de 1.000 l. Sellar la cámara con la tapa de la cámara.
    25. Fijar la cámara de implantación en el muslo con un no-absorbible 6-0 sutura. Fijar la tapa de la cámara con un no-absorbible 6-0 sutura. Pare posible sangrado con coagulación eléctrica.
    26. Cierre la piel con suturas absorbibles 4-0. Cubra la herida con el aerosol de aluminio.
    27. Administrar antibióticos y analgésicos (por ejemplo, 7,5 mg / kg sc enrofloxacina, tramadol 12,5 mg / kg per os (PO) (a través de agua potable) durante 3 - 5 días y después en función del comportamiento de la rata).
    28. Girar el vaporizador y deje que la rata para respirar los gases de alimentación hasta que empieza a despertar.
    29. Coloque la rata en una caja con la ayuda térmica y observar con cuidado hasta que esté completamente recuperado.
    30. No deje la ONU rataasistido hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
    31. No regrese a la rata a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
  2. Procedimiento de explantación
    1. Realice la explantación después de un corto tiempo o la implantación de largo plazo (de acuerdo con el diseño del estudio, por favor ver Referencias ejemplos 27-32). Anestesiar la rata de acuerdo con los pasos 1.1.1.-1.1.9.
    2. Abra la piel del abdomen con un escalpelo (No. 10) y mover los intestinos a un lado con una compresa. Exponer la aorta abdominal y la vena cava caudalis utilizando hisopos de algodón.
    3. Canular la aorta abdominal (por ejemplo., Calibre 24 cánula de plástico) y cortar la vena cava caudalis con las tijeras de disección.
    4. Enjuague la aorta abdominal con solución de cloruro sódico al 0,9% que contenía 100 UI / ml de heparina hasta que este líquido es claro. Perfundir la aorta con 30 ml de solución de perfusión (por ejemplo., Agente o contrastar la India enk).
    5. La eutanasia a las ratas mediante la inyección de una dosis letal de embutramida, yoduro de mebezonio, solución de clorhidrato de tetracaína inyectable (0,1-0,2 ml / kg) en anestesia profunda.
    6. Ligar la aorta abdominal y la vena cava caudalis con un no-absorbible 4-0 sutura.
    7. Cierre el área de la herida abierta con 1 - 2 abrazaderas. Almacenar la rata durante 24 horas a 4 ° C (endurecimiento de la solución de perfusión).
    8. Coloque la rata en su parte posterior. Difundir las extremidades traseras y fijarlos con cinta adhesiva.
    9. Abrir la piel por encima de la cámara con una incisión longitudinal con un bisturí (nº 10).
    10. Eliminar el tejido conjuntivo de la cámara y el pedículo de bucle utilizando tijeras de disección y microforceps. Cortar el pedículo de bucle a una distancia de 1 cm de la abertura de la cámara con las tijeras de disección y retire la cámara.
    11. Abra la tapa de la cámara y retirar con cuidado la construcción de la cámara con unas pinzas y fijarlo en solución de formalina tamponada al 4% durante 24 horas a la habitacióntemperatura. Utilizar posteriormente para la construcción 3D de tomografía o incluido en parafina para el análisis histológico de 30 micro-computarizada.

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Representative Results

Ingeniería de tejidos
Para los propósitos de ingeniería de tejido óseo, un número de diferentes sustitutos de hueso se implanta en el intestino de rata de animales modelo de bucle AV 27,28,33,34. Vascularización perfectamente pudo demostrarse por 3D tomografía micro-computarizada (micro-CT) (Figura 3A). La vascularización de una matriz procesada bovina hueso esponjoso (PBCB) fue significativamente mayor en el grupo de bucle en comparación con el grupo sin vascularización. Una red de vasos sanguíneos en constante crecimiento y en maduración se desarrolló dentro de la cámara de la implantación de más de 8 semanas. Entre 4 y 8 semanas, se observó crecimiento continuo del tejido vascularizado hacia el centro de las construcciones, mientras que no se detectó aumento en el grupo no vascularizado 33. Prevascularization de la matriz PBCB durante 6 semanas en el modelo de bucle AV condujo a una supervivencia superior de los osteoblastos inyectados en comparación con los osteoblastos de control. En contraste con los grupos de control, no se detectó expresión de genes específica del hueso en el grupo de bucle AV con osteoblastos implantados 28. Como una matriz adicional, vidrio bioactivo sinterizado junto con gel de fibrina se implantó en los bucles de AV de las ratas. Después de 3 semanas, una densa red de vasos de neoformación ha desarrollado demostrado por micro-CT y la histología 27.

La cámara de implantación se modificó a fin de acelerar la vascularización andamio. Mediante el uso de una cámara de titanio perforada, vascularización intrínseca fue apoyada por los vasos extrínsecos desde el tejido circundante. A tan solo 2 semanas después de la implantación de una hidroxiapatita β-fosfato tricálcico (β-TCP / HA) / matriz de fibrina, el 83% de los buques estaban conectados al bucle de AV con aumento continuo en el tiempo y alcanzó el 97% de conexión después de 8 semanas 34. Con la implantación de células madre mesenquimales derivadas de médula 5 x 10 6 óseas (MSC) y la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), un aumento significativo en la formación ósea en comparación con las BMP-2 o MSC grupos por sí sola podría ser inducidos. A las 6 y 12 semanas, la matriz de fibrina se degradó completamente y reemplazado por tejido conectivo muy vascularizado en todos los grupos (Figura 3B 6 semanas de la implantación). Hubo una disminución significativa en el número recipiente en el grupo de BMP-2 / MSC entre 6 y 12 semanas y después de 12 semanas en los otros grupos. Esto era probablemente debido a la maduración de la red vascular o la disposición compacta de las estructuras óseas que conducen a una formación de la red vascular limitada 32.

Además de hueso, otros tejidos tales como músculo o hígado también se pueden diseñar en el modelo de bucle de AV.

Para la ingeniería de tejido muscular vascularizado axialmente, los experimentos con mioblastos primarios en una matriz de fibrina bucle de AV se llevaron a cabo. Después de un prevascultiempo arization de 2 semanas para 2, 4 y 8 semanas, 1 x 10 6 mioblastos se trasplantaron en la cámara de bucle AV. mioblastos transplantados podrían vuelve a detectar incluso después de 8 semanas usando etiquetado éster de diacetato de carboxifluoresceína succinimidil (CFDA). Las células mantienen su fenotipo miogénico dentro de la matriz de fibrina y la expresión de los marcadores específicos de músculo MEF-2 y desmina fue positiva después de 4 semanas. Sin embargo, la expresión del gen marcador miogénica fue negativo después de 8 semanas, que era probablemente debido a la ausencia de estímulos myogenic y rápida absorción de la matriz de fibrina 35. Para aumentar la estimulación miogénica, una nueva modificación del bucle AV rata se ha desarrollado utilizando la vena epigástrica en lugar de la vena safena con el fin de lograr un posicionamiento más proximal de la cámara de aislamiento. Por lo tanto, la incorporación adicional del nervio motor del obturador se vio facilitada geométricamente. Mediante el uso de esta modificación bucle AV, que se conoce como el bucle EPI, podríamos demostrar myogenic differentiation de mioblastos co-implantado y el MSC 36.

Para la ingeniería de tejido hepático se trasplantaron 4 x 10 6 PKH-26 células de hígado fetal marcados dentro de una matriz de fibrina en el modelo de bucle AV rata durante 2 semanas. En el grupo de control, se implantaron matrices sin un bucle de AV y matrices libres de células. capilares funcionales surgieron de los vasos de bucle AV y se observó muy vascularizado neo-tejido dentro de la cámara después de 14 días de la implantación, como se muestra por la tinción de CD31 y el etiquetado de tinta India. No hubo diferencias entre el grupo de bucle libre de células y de hepatocitos AV. El bucle de AV vascularizado la matriz de fibrina densa y células fetales viables pudo detectarse después de la explantación por positiva PKH-26 tinción y citoqueratina 18 inmunohistología hígado específico de la célula (CK-18), principalmente en la proximidad del eje vascular mayor. los niveles de mRNA de CK-18 fueron elevados en el grupo de células de bucle AV. Por el contrario, no CK-18 expression puede ser detectada en construcciones sin un bucle o células 37.

Los estudios de la angiogénesis
El bucle de AV consiste en tres segmentos: la vena, el injerto arterial y el segmento de interposición de injerto venoso (IVG) (Figura 1). evaluación tridimensional del sistema vascular demostró que los vasos recién formados originados tanto desde el venosa y la porción arterial, así como de la interponate venosa. Se observó un gran número de vasos de neoformación de la interrupción voluntaria del embarazo 33. Con in vivo MRA, la microscopía electrónica de barrido de moldes de corrosión y la histología inmune, se observó la aparición de la angiogénesis en una matriz de fibrina entre el día 10 y 14. Por encima de todo, la venosa y segmentos IVG dieron lugar a muchos capilares y vasos más grandes. Una reducción gradual en el calibre luminal como un signo de la arterialización de la IVG debido al aumento de la presión endovascular y wa esfuerzo cortantes detectado desde el día 7 de 38. En otros estudios, se pudo confirmar que la brotación vascular tiene lugar principalmente en el injerto no-arterial 39.

El análisis exacto de los procesos de angiogénesis y la estimulación y la inhibición de la formación de vasos sanguíneos puede ser visualizado en la cámara AV bucle de implantación. Los factores de crecimiento vascular endotelial factor de crecimiento A (VEGFA) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) indujeron una densidad vascular más alta absoluta y relativa y la resorción más rápida de la matriz de fibrina en comparación con el grupo de control sin factor de crecimiento 31. Además, la remodelación de los fenómenos y la maduración de la red vascular dentro de la cámara de aislamiento se visualizaron en un período de implantación de 8 semanas. En AV se identificaron cámaras de bucle procesos de interconexión intercapilar y la angiogénesis intussusceptive, así como el posible crecimiento linfático inmunohistológicamente como parámetros de nela maduración medades 39. Mediante la aplicación de la PHD (dominio prolil hidroxilasa) DMOG inhibidor (dimethyloxallyl glicina) sistémicamente en ratas, se pudo demostrar que la concentración del factor alfa inducible por hipoxia (HIF-α) se correlaciona con la creciente vascularización en el bucle de AV y es una estímulo para la excrecencia de recipiente 40.

Figura 1
Figura 1:. Esquema de un bucle AV en el modelo de rata El bucle AV consiste en tres segmentos: la vena (V), el injerto arterial (A) y el segmento de interposición de injerto venoso (IVG). El bucle de AV puede ser embebido en una cámara cerrada de implantación (C) para la inducción de la vascularización intrínseca. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ge = "1"> Figura 2
Figura 2: Operación AV Loop en la rata (A):.. La localización del haz femoral en el lado interior de las extremidades traseras de la rata (B / C): Preparación del haz vascular femoral en la izquierda y derecha de la ingle de La rata. Los vasos se separan (D), el injerto de vena de interposición se extrae de la parte derecha (E) y anastomosa con la vena femoral (F) y la arteria femoral del lado izquierdo en un bucle AV (G, flecha indica las anastomosis). Los vasos de bucle son transferidos a la cámara de implantación prellenado con una matriz (H) y después de llenado completo (I) se cierra la tapa (J). A = arteria femoral, V = vena femoral, N = nervio femoral, IVG = injerto venoso de interposición. La barra de escala 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Visualización de la vascularización en el modelo de bucle Rat AV (A):. Micro-CT después de la perfusión con un agente de contraste (amarillo vasos perfundidos) (B):. Hematoxilina-eosina tinción de un sustituto óseo β-TCP / HA con MSC implanta en el AV modelo de bucle de ratas durante 6 semanas. Los vasos de bucle AV son perfundidos con tinta china (color negro). La barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Desde hace más de una década, se ha utilizado con éxito el asa arteriovenosa (AV) para propósitos de ingeniería tisular y la angiogénesis estudiar in vivo en el modelo animal pequeño. Hemos podido demostrar que este modelo de microcirugía se adapta muy bien para la ingeniería de tejidos diferentes y que también se puede utilizar para los estudios de la angiogénesis o antiangiogénico.

Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
Tejidos u órganos de ingeniería requieren una red de vasos sanguíneos funcionales para suministrar los nutrientes y el oxígeno que necesitan para su supervivencia y el éxito de la integración después del trasplante en el sitio del defecto 41. Una serie de estrategias diferentes prevascularization se han desarrollado en las últimas décadas, que pueden diferenciarse según in vitro frente a los enfoques in vivo e intrínsecas vs extrínseca.

Los andamios pueden ser Fabricated con estructuras y se sembró con células vasculares tales como las células endoteliales o células progenitoras in vitro 42 de forma tubular. Por otro lado, para prevascularization in vivo, andamios se implantan en una zona altamente vascularizado tal como el tejido subcutáneo o muscular 21. Después, estas construcciones extrínsecamente vascularizados se pueden trasplantar en el sitio del defecto. Sin embargo, el inconveniente de estos enfoques es la falta de conexión de microcirugía con los vasos del receptor después del trasplante. Particularmente en el caso de las construcciones a gran escala, la conexión inmediata a la vasculatura huésped es esencial para el suministro inmediato de la ingeniería tisular 43. La solución obvia y más prometedora a este problema radica en la generación de un tejido vascularizado intrínsecamente u órgano por un eje vascular, tales como el modelo de bucle AV.

Además de utilizar el método de bucle de AV como se describe anteriormente, la vascularización axial puede alpor lo que es inducida por el uso de haces de AV en lugar de 44 o sólo un depósito, tales como la arteria epigástrica 45. Sin embargo, en varias publicaciones el modelo de bucle AV resultó ser superior con respecto a grado de vascularización y la cantidad de formación de tejido de novo. Tanaka et al. Compara ambos enfoques metodológicos y la formación de tejido significativamente más alta observada y un mayor grado de capilares en desarrollo en el bucle en comparación con el grupo de lotes 46. Dong et al. también llevó a cabo un estudio utilizando el bucle de AV o haz AV enfoques para ingeniería de tejido óseo en un modelo de conejo, que también mostraron significativamente mayor densidad vascular en el bucle en comparación con el grupo de lotes 47. Hemos sido capaces de confirmar estos resultados, así como mostrar en un estudio anterior que el modelo de bucle AV tiene una mayor capacidad para la angiogénesis 48.

A lo mejor de nuestro conocimiento, no existe un modelo comparable para el análisisvascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Por lo tanto, el modelo de bucle AV representa una poderosa herramienta para evaluar cómo los diferentes tipos de células o factores de crecimiento contribuyen a la red recipiente de formación o de vascularización procesos en diferentes tejidos y sin perturbaciones de las estructuras circundantes, como la invasión de las células o factores de crecimiento.

Limitaciones de la Técnica
Sin embargo, un reto importante del modelo propuesto es la alta complejidad de la cirugía. Por un lado, el tratamiento de defectos utilizando el modelo de bucle AV requiere un procedimiento de dos etapas - prevascularization del andamio y el trasplante en el sitio del defecto. Esto significa que el paciente tiene que someterse a dos cirugías. Además, las habilidades de microcirugía son un requisito previo necesario para el éxito de los vasos submilimétricas anastomosing 49. Por lo tanto, el haz AV a veces se considera más útil para la aplicación clínica ya que yot también ofrece prometedor, aunque menos, el potencial para la angiogénesis y la generación de tejido en comparación con el bucle de AV 46. Sin embargo, esta operación se puede aprender paso a paso, incluso por los no-quirúrgica, utilizando tubos de calibre de silicio pequeñas para la formación en el comienzo y después los vasos de los animales muertos (por ejemplo, las piernas de pollo) antes de realizar la operación de bucle de AV en una animal vivo. Por el contrario, más practicados micro-cirujanos pueden realizar esta operación con sólo un corto tiempo de entrenamiento.

Los pasos críticos dentro del Protocolo
En general, debido al pequeño calibre de los vasos existe el riesgo de formación de trombos y el cierre de los vasos de bucle. Sin embargo, en el modelo de rata de 80% -100% de los bucles, en promedio, la patente utilizando sólo de corta duración anticoagulación con heparina después de la cirugía 28,30,31,34,38,39.

Por otra parte, debido a la alta complejidad de la cirugía que tomará un par de horas (dependiendo de tque la experiencia del cirujano). Es esencial para verificar la anestesia adecuada de los animales durante toda la operación y para abastecer adecuadamente infusión para mantener una presión arterial adecuada. Durante el período postoperatorio es de gran importancia para controlar la salud de los animales varias veces, para administrar analgésicos / antibióticos y para comprobar la herida de la operación. Dado que en la mayoría de los casos se lleva a cabo la implantación de una cámara aislada, es posible que la infección en el interior de la cámara se produce sin darse cuenta. Por lo tanto, es muy importante para mantener la esterilidad durante toda la operación y la administración de antibióticos cuidadosamente se debe hacer durante un período de 3 - 5 días.

Modificaciones del Protocolo
La cámara se puede ajustar individualmente el tamaño y la forma del defecto. Por otra parte, también las membranas se pueden utilizar para encerrar el bucle AV interpretada por Manasseri et al. 50. Además, el andamio, suppcélulas lemented y factores de crecimiento pueden ser elegidos de acuerdo con los diferentes tipos de tejidos. Recientemente, Miomas et al. Génicas combinado enfoques terapéuticos con éxito con el modelo de bucle de AV y podría inducir la mejora de la formación de vasos mediante transducción con VEGF165 51. Recientemente, se ajustó el modelo de bucle AV rata a efectos de ingeniería de tejido muscular. En lugar de los vasos femorales, se utilizaron la vena y la arteria epigástrica safena, lo que permitió la implantación del nervio obturador en el andamio axialmente vascularizado para inervación motora ( "EPI modelo de bucle") 36. Además de la implantación de un nervio motriz, la neurotization de tejido óseo por ingeniería construcciones con los nervios sensoriales se informa de que es beneficioso para mejorar la osteogénesis y mejor reparación de defectos óseos 52. El bucle AV induce una mínima morbilidad del sitio donante y se puede crear en varios sitios del cuerpo 52. Sería posible utilizar vasos superficiales en otros sitios deel cuerpo para la generación del bucle de AV o incluso utilizar otros animales como el conejo o el modelo de ratón.

Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
Recientemente, nuestro grupo de trabajo implanta una línea bien caracterizado murino embrionario de células progenitoras endoteliales (EPC) (T17b) que expresa la proteína-1 (GBP-1) de unión a guanilato - un marcador y intracelular inhibidor de las funciones de células endoteliales tales como la proliferación, la migración y invasión - en el modelo de bucle AV rata. La capacidad antiangiogénica de diferenciado GBP-1-EPC se pudo demostrar por una reducción significativa de la densidad de vasos sanguíneos en las construcciones de bucle AV. Con respecto a la aplicación clínica, la proinflamatoria antiangiogénico GTPasa GBP-1 podría abrir nuevas vías de terapias antiangiogénicas, por ejemplo., Para el cáncer u otras enfermedades 53. Basado en este estudio, es concebible que el modelo de bucle de AV se puede utilizar para establecer una patológicavascularización de la red para su posterior análisis y posible modulación. Por ejemplo, este modelo proporciona una oportunidad óptima para obtener una mejor comprensión de la angiogénesis tumoral, sus factores de influencia y la función exacta de las diferentes células implicadas en la formación de red de vasos del tumor, tales como las CPE, las células tumorales y las células madre 54. Modelos in vivo de cáncer a menudo se llevan a cabo en ratones modificados genéticamente para simular los procesos y características de crecimiento de diferentes tipos de cáncer humano y han demostrado ser excelentes para el desarrollo de medicamentos y ensayos preclínicos 55. Además, existen modelos de xenoinjerto para el trasplante de tumores en animales experimentales tales como ratones inmunocomprometidos 56. Un enfoque más clínico relacionado implica el trasplante de tumor del paciente, conocida como "modelos de ratón personalizadas" o "modelos de xenoinjertos de tumores derivados del paciente" 57. Sin embargo, estos modelos no son prácticos para el estudio de la inflinfluencia de una fuente celular o factor de crecimiento solo sin efectos del tejido circundante.

El modelo de bucle AV hace que sea posible el uso de métodos de ingeniería de tejidos para estudiar la biología del tumor. Esto se define como la "ingeniería tumor" por Ghajar et al. y consiste en "la construcción de modelos de cultivo complejos que recapitular los aspectos del microambiente del tumor in vivo para estudiar la dinámica del desarrollo del tumor, la progresión y la terapia en múltiples escalas" 58. Un entorno de tumor se puede construir dentro de la cámara de implantación aislado, lo que permite un análisis preciso de las interacciones célula-célula, la angiogénesis, la modulación, la mejora y la inhibición. Además, el modelo de bucle AV puede resultar beneficioso para el desarrollo o la validación de terapias relativo a la interrupción de la neoangiogénesis o la inhibición del crecimiento tumoral.

El uso de este enfoque para la inducción de la vascularización, es posible engineetejidos r en un tamaño clínicamente relevantes. En otros estudios, hemos sido capaces de generar tejido óseo vascularizado axial para el trasplante con un importante volumen de aproximadamente 15 cm³ en un tiempo relativamente corto de 12 semanas 59,60. Con el fin de traducir estos resultados a la práctica clínica, un estudio de prueba de principio utilizando el modelo de defecto tibia se llevará a cabo en un futuro próximo antes para su aplicación en seres humanos. Como primer paso, hemos podido demostrar con éxito en ingeniería de tejido óseo in situ en un gran defecto volumen en un escenario clínico con estabilidad a largo plazo 61. La aplicación del modelo de bucle AV descrito hace que sea posible proporcionar una terapia adaptada a las necesidades del paciente individual. En base a los resultados de la idea del cuerpo humano en sí sirve como un biorreactor que viven todavía representa una gran promesa para el futuro.

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Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a las siguientes instituciones por apoyar nuestra investigación bucle AV: Staedtler Stiftung, el Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Oficina de Género y Diversidad, la Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander Universidad de Erlangen-Nürnberg (FAU), Fundación AO, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Fundación Hans Georg Geis, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Alemania, y el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica, Irak. Nos gustaría dar las gracias a Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Kohn y Ilse Arnold-Herberth por su excelente apoyo técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride Berlin-Chemie AG 34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6 Ethicon EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910 Ethicon V392H
6-0 Prolene / polypropylene Ethicon 8695H
aluminium spray Pharma Partner Vertriebs-GmbH 1020
antiseptics  BODE Chemie GmbH 
Catheter  B Braun Meslungen AG 4251612-02
contrast agent Flowtech  MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution  Intervet International GmbH
encre de chine intense Indian ink Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin Bayer AG
eye ointment Bayer AG
Formalin 4% Carl Roth GmbH & Co. KG P087.4
Heparin Ratiopharm GmbH
isoflurane  Abbott Laboratories 6055482
Lewis rat, male Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium  Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal Grünenthal GmbH

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