網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

Immunology and Infection

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Summary

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。

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Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

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Abstract

Introduction

この方法の全体的な目標を正確に評価し、 生体内ミクログリア食作用定量化することです。ミクログリアは、中枢神経系(CNS)の組織常在性マクロファージです。彼らは、組織恒常性の維持を確実にするために様々な機能を実行します。これらは、免疫監視機構、神経栄養因子の分泌と、極めて重要で、貪食1が含まれます。ミクログリアの貪食は、無関係なシナプス(シナプス剪定)の食作用およびアポトーシスニューロン2-4の除去などの脳や網膜の開発中に、いくつかの重要なイベント、内のキーです。また、損傷を受けたまたはアポトーシスニューロンのミクログリア食作用、細胞の破片、および侵入微生物が成人期5を介して中枢神経系の恒常性を維持するために必須であることが示されています。最後に、ミクログリア食作用は、アルツハイマー病、年齢関連を含むいくつかの神経変性疾患の病因に関与しています不良または不十分な貪食能は、アミロイドβ(Aβ)斑とドルーゼン、それぞれ6,7のビルドアップに寄与し得ることが示唆されている黄斑変性症、。

ミクログリア機能はしっかり特に、腫瘍増殖因子β、または細胞 - 細胞相互作用などの可溶性因子によって、それらの微小環境によって調節されます。ミクログリアは、排他的にそれぞれの受容体CD200RとCX3CR1を表現しながら、ニューロンは恒常的に、このようなCD200およびCX3CL1などのいくつかの細胞表面リガンドを発現します。これらの受容体は、それらの細胞内部分に、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ(のITIM)を含有します。これらの受容体は、神経炎症に寄与することができる、ミクログリアの過剰刺激を防止するために重要である阻害剤。したがって、通常の生理学的条件下で、ニューロンとミクログリアの間の細胞間相互作用は、休止状態にミクログリアを保ちます。組織損傷の間、ただし、ニューロンは、EXPをダウンレギュレートすることができこれらのリガンドのression、ミクログリアの活性化に対する阻害効果を除去します。 (食作用を含む)ミクログリアの機能は、このようにしっかりとその微小環境8に連結されています。それにもかかわらず、現在までに、生理的な文脈で、または完全にそのCNS微小環境を複製する方法で、ミクログリアの貪食作用を研究するための標準化アッセイはありません。

いくつかのアッセイは、初代ミクログリアまたはミクログリア細胞株は、標的細胞( 例えば 、アポトーシスのニューロン)または蛍光標識されたビーズで培養し、インビトロでミクログリアの食作用活性を測定するために開発されてきました。標的取り込みはその後、蛍光イメージング顕微鏡を用いて評価またはサイトメトリー9-12フローです。これらのアッセイは、薬理学的または遺伝的操作が有益ながら、完全に生体内環境での複合体を複製するために失敗し、ミクログリア食作用に影響を与えることができるかのテストを可能にします。ミクログリア食作用を調べるための間接的な方法in vivoで報告されている。これらは、食作用に関与すると考えられ、分子の染色によって達成されている( 例えば、CD68)、( 例えば 、妥協ニューロンまたはシナプス要素)食作用のためにミクログリアとターゲットの物理的な近接性を評価する、または食作用の免疫組織化学的検出によって、ミクログリア細胞内標的( 例えば、Aβ)13-17。二つの研究は、 生体内でミクログリアの貪食作用を評価するために、より直接的なアプローチを使用してきました。ヒューズらは、頭蓋内経路18を介して配信ビーズのミクログリアの取り込みを測定するためのイメージング技術を使用しています。シエラらは、定量的に複雑なイメージング技術4を用いてアポトーシス細胞のミクログリア食作用を評価するための洗練された方法を開発しました。しかしながら、これらの方法は、組織標本、セクショニング、画像化、および分析のための複雑なプロトコルを含みます。我々は以前外感光体の食作用を評価するためにフローサイトメトリー分析を使用しています文化19における網膜色素上皮(RPE)細胞による小胞体セグメント。ここでは、急速にin vivoでのミクログリアの貪食作用の定量的尺度として網膜ミクログリアにより、蛍光標識された粒子の取り込みを評価するためのプロトコルについて説明します。

蛍光標識された粒子の(1)硝子体内の配信、(2)収穫と網膜組織の準備、および(3)流量:私たちはここで説明するプロトコルは、信頼性が高く、定量的な3つの重要なステップですぐ下に6時間で網膜ミクログリア食作用の測定を可能にしますサイトメトリー分析。我々が開発した方法は網膜におけるミクログリア食作用を評価するための堅牢な方法であり、正常に種々の化合物または遺伝子操作は、生理学的設定でこのキーミクログリアの機能を変化させる方法をテストするために使用することができます。 CNSの専門分野として、網膜ミクログリア機能20を研究するため簡単にアクセスできるモデル系です。この方法は、トンで開発されたが彼の目、我々はそれがミクログリアの貪食機能を調査するすべての神経科学者のために役立つことができると信じています。

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Protocol

全ての動物は、スクリップス研究所によって確立された倫理ガイドラインに従って処理しました。

注射用材料の調製

  1. 33 G針と注射器を滅菌:C.ο115で分解し、オートクレーブ滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に上昇することによって、注射用の針を準備します。
  2. 10分 - 5室温で蛍光標識された粒子を解凍します。 Ca 2+ / Mgの2+との無菌PBS中に50mg / mlの溶液に再構成することによって、注射用粒子溶液を準備します。
    注:食作用アッセイのために検証された真菌由来のAF488標識粒子は、このプロトコル21-23で使用されています。最適な取り込みのために、新鮮な、すぐに注射の前に粒子を作製。
    注2:粒子濃度は、それぞれの特定の実験のために最適化することができます。

ビーズ溶液の2硝子体内注射

注:2つのPeopleは、注入を行う人は、マウスを保持し、他の人がロードされた注射器を通過し、プランジャーを押している間は、眼球に焦点を維持できるように、注入を実行するために必要とされます。

  1. 20μL/体重10gの用量では100mg / mlのケタミンおよび10mg / mlのキシラジンの腹腔内注射により齧歯類をAnaesthetize。注射の前に、麻酔のレベルを評価するためにつま先のピンチを使用します。
    注:イソフルランは、骨髄細胞の機能に重大な影響を与え、したがって、このアッセイを通して、その使用は24,25を避けるべきです。
  2. 0.5μlに蛍光標識した粒子溶液と負荷針。
  3. 手術用顕微鏡( 図1A-B)の下で横にマウスを置きます。マウスのより良い位置決め用軟質材料、 例えば、ゲルパックを使用します。目はまだ開いていないである、若いマウスの場合は、そっとfissuを作成することにより、O 45細かい角度を付け鉗子の助けを借りて、まぶたを開きますまぶたが最終的に開きます。そこからスリットに沿って再。
    1. 眼球がソケットから少し持ち上がるように角度をつけO 45細かい鉗子の助けを借りて、慎重に、まぶたの周りに圧力をかけます。ちょうど耳の上とその顎によって2本の指で頭を押さえ、静かにソケットから少し目を維持するためにまぶたに並列に皮膚を伸ばします。喉( 図1B)に近すぎる把握しないように注意してください。
  4. 眼球を穿刺するために、(角膜と強膜接続)角膜輪部での注射器の針を挿入します。これは、着色されたマウスでは灰色の円として表示されます。硝子体液の小容積を追放し、その後注入するために、わずかに針を撤回。注射を行う人はそっと片手でマウスや他の針を保持する必要があります。二人はゆっくりプランジャーを押す必要があります。
  5. ゆっくりと注射器を後退させます。適用目の保湿は、水和目を維持するためにドロップされます。</李>
  6. 齧歯類は、熱パッドの上にケージに回復し、動物を監視するために続けましょう。子犬を扱う場合、それは呼吸と自発的な移動が可能されるまで、他のアラート動物とのケージに動物を返しません。大人で作業している場合、それは胸骨横臥を回復するまで、他のアラート動物とのケージにげっ歯類を返しません。

網膜組織の3収穫

注:蛍光標識された粒子を注射していない目から網膜組織は、フローサイトメトリー分析のためのコントロールとして収集する必要があります。アッセイは、単一の網膜を使用して行うことができますが、最高のパフォーマンスを得るために、2網膜を一緒にプールする必要があります。

  1. 蛍光標識された粒子の硝子体内注射後の網膜組織3時間を収集します。
    注:粒子溶液の注射後の時間は、各特定の実験のために最適化することができるが、我々は、3時間の注入後、粒子の取り込みは、O最も層を通して見ることができることを見出しました網膜( 図1C-D)は、f。
  2. 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
  3. 優しく眼球をproptoseする罰金45 O傾斜した鉗子の助けを借りて、まぶたを押圧することにより、眼球を収集します。眼球とプルの後ろに鉗子を置きます。
  4. 解剖顕微鏡下で網膜を解剖。 Ca 2+ / Mgの2+と少量のPBSを含むペトリ皿に眼球を転送します。ペトリ皿の乾燥した場所では、超微細鉗子の先端で角膜輪部に眼球を穿孔。
  5. O 45細かい角度を付け鉗子の助けを借りて、眼球を持ち、角膜輪部の円周の約半分が切断されるまで、角膜輪部の周りにカットする春のはさみを使用しています。
  6. 罰金45 O傾斜してピンセットで眼球を持ち、PBSに眼球をもたらします。罰金45 O角度を付け鉗子の第二の対と離れて角膜と強膜を引き裂きます。レンズや網膜は私が出てきますntact。
  7. レンズや網膜を分離します。網膜を収集およびCa 2+ / Mgの2+を含むPBSの2ミリリットルを含む5.4ミリリットルポリスチレン試験管に移します。

4.単一細胞懸濁液を準備

  1. 製造元の指示にマイナーな修正を加えた神経組織解離キットを使用して、単一細胞懸濁液を準備します。簡単に言えば、ピペッティングP1000ピペットで振とうせずに37°Cの時に酵素消化を行うことにより、粉砕物網膜。

フローサイトメトリー解析のための5染色単一細胞懸濁液

  1. 染色緩衝液200μl中に細胞を再懸濁し(0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.09%アジ化ナトリウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水)とU底96ウェルプレートに移します。 130×gで5分間遠心分離します。
    注:アジ化ナトリウムは、人間や環境に有害です。適切な個人保護具aを使用しますndは、地域の条例に従って廃棄物を捨てます。
  2. 上清を廃棄し、シンクの上にプレートを反転。 Fc受容体は、ウェルあたりの抗マウスCD16 / CD32抗体5μgの/ mlを含む染色緩衝液25μl中に再懸濁細胞をブロックします。室温で5分間インキュベートします。
  3. 抗マウスLy6C-APC-Cy7を0.5μgの/ mlの、抗マウスLy6G-PE-Cy7ののを0.5μg/ mlの抗マウスのCD11b-AF6502.5μgの/ mlを含有する染色用緩衝液25μlのを追加します。暗所で室温で15分間インキュベートします。
  4. 130×gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、プレートを反転。染色緩衝液200μl中に細胞を再懸濁することにより洗浄します。
  5. 130×gで5分間遠心分離します。ヨウ化プロピジウム(PI)の0.5μg/ mlを含む染色緩衝液200μlで再懸濁。 1.2ミリリットルマイクロチューブに移します。
  6. の前の200μlのPIとプールの0.5μg/ mlを含む染色緩衝液の追加を100μlでウェルを洗浄1.2ミリリットルマイクロチューブ。染色された細胞を300μlの全容積が得られます。

6.フローサイトメトリー分析

  1. 従来の3つのレーザ(紫、青、赤のレーザー)を使用して、PE、PerCPを-Cy5.5を、BV510、と非常に明るい蛍光AF488-粒子からの重要な波及によるPI染料を避けます。それは(代わりにPerCPを-のCy5.5チャネルのmCherryをチャネルに)PE標識抗体とPIを可能にするように( 図2)を使用するように、このアッセイを最適化するために、第四(黄色)のレーザーを使用してください。
    注:黄色のレーザーが利用できない場合、別のチャンネルで死細胞排除染料を使用しています。
  2. PI陰性細胞(PI-)上のゲートは、死細胞( 図2B)を除外します。
  3. 、のCD11b陽性細胞(のCD11b +)の上にゲートを死細胞を除いた後、これはすべての骨髄細胞( 図2C)が含まれます。
  4. / Ly6G - -除外するためのCD11b +集団 、Ly6C上のゲート内好中球(のCD11b + / Ly6G +)および単球(のCD11b + / Ly6C +; 図2D)。ミクログリア( - / Ly6G -ここでのCD11b + / Ly6Cとして定義されて簡単にするため)にゲーティングした後、2明確な集団が表示されるはずです。負の1と蛍光標識された粒子のための肯定的な1。食細胞は、粒子を取り、したがって、AF488 +( 図2E)であることになります。
    注:Ly6C正またはLy6G陽性の集団は、この染色手法を使用して、粒子の取り込みを測定するために分析することができます。貪食のCD11b +細胞の割合は、食細胞ミクログリアの割合( 図2F)とよく相関します。これは食細胞、好中球や単球、ならびにミクログリアが含まれますにもかかわらず、フローサイトメトリーの経験のない研究者のために、単独でのCD11b染色で簡単な分析を行うことができます。こののCD11b + / Ly6C内- / Ly6G - </ SUP>人口、マーカーF4 / 80とCX3CR1で染色することによって判断されるように、これらの細胞は> 99%のミクログリアです。これらのマーカーが追加されますが、私たちの手の中に必要とされないことができます。

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Representative Results

ここでは、この方法は、以下の貪食能の化合物および/または遺伝子操作の効果を試験するために適合させることができる 図2)を迅速かつ確実に、フローサイトメトリー分析を用いて、生理学的設定において食網膜ミクログリアの数を定量化する方法を記載しますミクログリア( 図3A、3B)。 ( - 20日生後10)又は成体マウス( 図3C)、また、若いに使用することができます。リポ多糖(LPS)の様々な用量を腹腔内投与しました。 24時間LPSチャレンジ後、ここに説明されたプロトコルは、網膜ミクログリア食作用機能( 図3A)を評価しました。 LPSの1.42ミリグラム/ kgの用量は、26予想されるように、ビヒクル対照( 図3B)と比較食ミクログリアの割合の統計的に有意な増加を誘導しました。


網膜層に蛍光標識された粒子を示す硝子体内注射の設定と代表網膜節 :図1。 (A)ゲルパックが解剖顕微鏡の下に配置されている。(B)硝子体内注射のための目を配置するために示したように、げっ歯類が開催される。(C)注射の3時間後に蛍光標識された粒子が最も網膜層全体で見ることができます。(D 、E)CX3CR1 GFP / GFPマウス及び赤色蛍光体で標識された粒子は、小膠細胞による粒子の取り込みを可視化するために使用しました。深く(D)におけるミクログリアおよび表在性(E)層は、粒子を取ります。スケールバー- 。20ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: ゲーティング戦略貪食ミクログリアを選択する (A)のp10マウスからの網膜組織からの単一細胞懸濁液が分析される(B)死細胞(PI +)を除外した後、(C)のCD11b +細胞が選択されている(D)。。。のみミクログリアを選択、のCD11b +好中球(Ly6G +)および単球(Ly6C +)が除外されている。(E)貪食ミクログリアがアップし、蛍光標識された粒子をとっているだろう。(F)貪食のCD11b +細胞の数は、ミクログリアの場合と同様です(のCD11b + Ly6G - Ly6C - )。 n = 9、3つの独立した実験からプール。エラーバーは平均値±SEMを表します。目標確認= "_空白"> この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: ミクログリア貪食能は、LPSチャレンジ後の仔と成体マウスで評価することができる (A)ヤングマウス(P10)24時間貪食作用を評価する前に、様々な用量で腹腔内LPSでチャレンジした(B)の挑戦1.42ミリグラムと/。。ビヒクル対照(P = 0.0021)と比較した場合kgの貪食網膜ミクログリアの有意に増加した割合をもたらした。(C)このプロトコルは、同様仔と成体マウスにおける網膜ミクログリア食作用を測定するために使用することができます。 LPSでチャレンジしていない若い(P10)マウス(P = 0.019)と比較して成体マウスにおける貪食ミクログリアの有意に小さい割合があります。 n = 9 -12、3から4にプールされました独立した実験;エラーバーは平均±SEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

この方法では3つの重要なステップがあります:蛍光標識された粒子の(1)硝子体内注射; (2)収穫および網膜組織の調製。 (3)フローサイトメトリー分析。私たちは、研究者は、我々がここで紹介する方法を実行する前に硝子体内注射を練習することをお勧めします。アルビノマウス( 例えば 、BALB / c)および着色した溶液( 例えば、蛍光標識された粒子)が針と注入した溶液を簡単に可視化するために使用することができます。硝子体内注射は挑戦的であり、正しく行われていない場合はバイアスされ、変数の結果につながります。貧しい注入技術に関連した共通の問題は、レンズおよび/または出血や炎症を引き起こすことがあり、網膜の損傷の穿孔です。眼への外傷のリスクを最小限に抑えるために、齧歯類は、最小限の頭の動きと安定した位置にあるべきです。眼球に浸透するには、注射器は、ゆっくりとしませ挿入打撃を避けるために、あまりにも遠くにプッシュする必要がありますレンズ。別の一般的な合併症は、眼の外に注入された材料の逆流です。これを避けるために、プランジャーをゆっくりと押し下げされるべきであり、注射後に、眼球は眼窩の中に後退させるために許されるべきであると注射器をゆっくりと後退させる必要があります。最高の硝子体内注射は、低レベルでミクログリアを活性化しますが、未治療群と処置群との間に明確な違いを測定することができます。適切な対照( 例えば、非チャレンジマウス)は、ベースライン食作用レベルを確立するために、各実験において使用されていることが必須です。練習を必要とするこの方法の別の態様は、網膜の解剖あります。標本全体で同等の単一細胞調製物を確実にするために、網膜組織は、迅速かつ最小限の可能な組織破壊で収集されなければなりません。収集を容易にします - PBS中で解剖の最後のステップを実行する(3.7 3.4を参照)。最後に、サイトメトリー正しく流れのための網膜組織を準備することが重要です。活性化ミクログリアは、Fcをアップレギュレート抗体のFc部分に結合する受容体、したがって、非特異的には7を発生することがあります。 Fcブロックは、非特異的な染色を防ぐために行われなければなりません。適切なフルオロフォアおよびセットアップ補償の選択はまた、27重要です。

私たちは日常的にこれらの実験のために10〜20生後日齢のマウスを使用します。しかしながら、このプロトコルはまた、成体マウス( 図3C)におけるミクログリア食細胞機能を評価するために使用することができます。すべての約5%(成人より- (すべてのCD11b +細胞の50%、約40)注目すべきことに、起因する硝子体血管系の存在のために、外因性の骨髄細胞(Ly6C +またはLy6G +)の集団は、若いマウスでより顕著ですCD11b +細胞)。研究者は、彼らの実験のために最も適切な年齢を決定する必要があります。ここで紹介するプロトコルは、網膜中の貪食ミクログリアのレベルの堅牢な検出を可能にします。しかし、我々はその3 4生物学的にお勧めアルは、各実験に用いることが複製し、その少なくとも3つの独立した実験が行われます。このプロトコルで使用される粒子は、食作用アッセイ21-23ために検証されてきたが、具体的な食細胞マーカーを有する粒子のさらなる検証が必要な場合には、免疫組織化学共局在化を実行することができます。

この方法の一つの潜在的な制限は、粒子へのミクログリアの差動アクセスです。通常の網膜では、ミクログリアは2層、より深い外網状層、および硝子体7に近いより表面の内網状層、内に存在します。刺激を受けると、または老化の間に、ミクログリアは、すべての網膜層全体に移行することができます。この方法では、蛍光標識された粒子は、硝子体に注入されます。注射の3時間後に、これは網膜全体、特に硝子体の表面に沿って粒子の蓄積につながります。研究者はさらにconcentratiを最適化することができます粒子または彼らの実験のために、注射後の時間の上。硝子体に近い近接するミクログリアが粒子に簡単にアクセスを有する可能性があります。それにもかかわらず、我々は粒子が網膜全体に広がり、おそらく限られたビーズのアクセス( 図1C-E)に、すべての層にわたってではなく、網膜色素上皮(RPE)細胞でミクログリアによって取り込まれることを示しています。我々は(年齢とともに蓄積することができる)、網膜下ミクログリアは、粒子へのアクセスを得るかどうかを判断するためには至っていません。これは、研究者にとって重要である場合、このプロトコルは、粒子の注意深い網膜下注射後に実行することができます。もう一つの重要な考慮事項は、CNSの他の領域における網膜ミクログリアとミクログリアの間に本質的に異なる挙動があるかもしれないことです。よく、特定の脳領域の疾患に対して異なる感受性を有することが知られています。例えば、パーキンソン病では、黒質中のニューロンは、主にALZにいる間、影響を受けていますheimer病は、海馬ニューロンは、主に28に影響与えています。特定の疾患の病理を研究する際にこのように、脳の領域が重要な因子である可能性が高いです。ここに記載のものと同様のプロトコルは、網膜と脳のミクログリアの間の食細胞応答における潜在的な差異を探るために頭蓋内注射した後に行うことができました。網膜は、血液網膜関門20の存在を含む脳の他の領域と多くの共通点を持っています。網膜ミクログリアと脳のミクログリアは同じ卵黄嚢の前駆細胞に由来し、形態および細胞表面マーカー発現7,29に関して非常に似て表示されます。さらに、いくつかの脳疾患( 例えば、アルツハイマー病、脳卒中、及び多発性硬化症)は、網膜20にも影響を与えていることを示す、眼の症状を有しています。研究者は潜在的な地域差を認識しておく必要がありますが、我々はこれがために有益なモデルであると考えていますすべてのミクログリアの研究、およびミクログリア食作用を研究するすべての神経科学者は、このプロトコルを使用することができることを示唆しています。

眼は、このアッセイを実行する明確な利点は、複数の技術が網膜に多様な神経性ストレスを誘導するために開発されており、及びストレス応答をin vivoでモニターし、標準化されたプロトコル30を用いて定量することができることです。神経因性ストレスを誘導した後、ここに記載のアッセイを行うことにより、研究者は、重症度が異なる侮辱の広いスペクトルにわたってミクログリアの機能を解析することができます。仕分けフローサイトメトリー技術と組み合わせたときに最後に、このプロトコルは、それが貪食ミクログリア( 例えば 、定量PCR、細胞培養、プロテオミクス)の深さの分析を可能にすることができる免疫組織化学を上回る利点があります。

粒子の取り込みは、以前の両方において、インビトロおよびインビボ系において 、食細胞機能を測定するために使用されています。ラ粒子の関与頭蓋内注射、脳組織、凍結切片、免疫染色、イメージングおよびポストイメージング分析18の収穫および凍結tter。ここで紹介するプロトコルは、網膜ミクログリアの貪食機能のはるかに速い定量を可能にします。これは、高感度のミクログリアは、生理的な文脈での食細胞機能の評価を可能にする、その微小環境から削除されませんin vitro系よりも利点があります。具体的には、他の細胞型(神経細胞における遺伝子の、 例えば 、遺伝子アブレーション)の欠陥がミクログリアの貪食機能にどのように影響するかのテストを有効にする必要があります。それはまた、食細胞集団の、迅速定量、および正確な検出を可能にする、フローサイトメトリーを使用するin vivoアッセイにおいて以前に勝る利点を有します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

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References

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