비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nigg, P. E., Pavlovic, J. Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis. J. Vis. Exp. (116), e54683, doi:10.3791/54683 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

단백질의 구조는 많은 급 세포 과정에서 중요한 역할을한다. 신호 전달 경로, 유전자 발현, 효소의 활성화 / 비활성화는 모두 단백질 복합체 1-4의 적절한 조립에 의존한다. 또한, 단일 - 또는 헤테로 올리고머라고도이 프로세스는 공유 비가역 또는 가역 정전 소수성 단백질 - 단백질 상호 작용에 기인한다. 올리고머는 게놈 크기를 증가시키지 않고 상이한 세포 과정을 다양 화하지만, 단백질 변성, 열화 (5)을 향해 더 내성 안정한 착물을 구축에도 전략을 제공 아닙니다. 올리고머에 결함이 단백질의 기능에 영향을 미치는 질병의 개발로 이어질 수있다. 예를 들어, 효소 페닐알라닌 수산화이 량체 복합체를 형성한다. 단백질 단지 내 일부 돌연변이는 사량 형성을 약화시키고 질병 페닐 케톤뇨증 (6)으로 이어질 수 있습니다.

7을 유도 된 인터페론 (IFN)입니다. 그것은 dynamin 같은 대형 GTP 아제의 슈퍼 패밀리에 속한다 체외 8 큰 올리고머 구조를 형성 할 수있는 능력을 갖는다. 올리고머는 급속한 저하 9,10에서 MXA을 보호하기 위해 제안되었다. 많은 연구 그룹에 의해 집중적 노력에도 불구하고, 액션의 분자 메커니즘은 크게 어려운 유지 및 바이러스 기능 MXA의 올리고머 화 상태의 역할은 논쟁 9,11,12 중이다. 이와 관련하여, 가오와 동료 MXA 큰 링형 올리고머 구조 (11)의 형태 nucleoproteins 바이러스와의 상호 작용에 의해 항 바이러스 활성을 발휘하는 모델을 제안 하였다. 그러나,보다 최근에는 MXA 이량 체는 항 바이러스 활성을 나타내는 인플루엔자 바이러스 (12)의 핵 단백질과 상호 작용하는 것을 보여 주었다. 비MXA의 결정 구조에 ased 가오 동료는 시험 관내에서의 올리고머 및 바이러스 11,13 기능에 중요한 인터페이스 영역의 몇 아미노산 잔기를 확인 하였다. 따라서, 항 바이러스 활성을 나타낸다 MXA의 올리고머있는 상태 규명하기 위해, 우리는 급속 내인성 MXA는 IFNα 자극 후 발현뿐만 아니라 인간 세포에서 발현 MXA 인터페이스 돌연변이 oligmeric 상태를 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설정하기 위해 노력했다.

일반적으로 이러한 분할 녹색 형광 단백질과 같은 단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용되는 많은 방법이 있지만 (분할-GFP) 상보성 분석 (14), 표면 플라스 몬 공명 (15) 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) (16)들은 제공하지 올리고머 단백질 복합체의 정확한 화학 양론의 정보를 제공합니다. 이 특정 측면의 조사, 기술 등멀티 앵글 광 산란 (MALS) 17 및 분석 초 원심 (18)는 매우 유용합니다. 일반적으로 이러한 방법을 사용하여 분석 한 단백질은 정제 된 단백질이다. 올리고머 화 공정은 또한 다른 세포 인자에 의존 할 수있다. 이러한 요인을 알 수있는 경우, 분석은 더욱 곤란하다. 또한, 일부 단백질은 E.에서 표현하기 어려운 대장균 및 정화. 따라서,이 방법은 세포 환경에서 단백질 올리고머를 분석 할 수있는 최적의 선택되지 않습니다. 또한, 이러한 기술은 용이하게 사용할 수있는 고가의 장비를 필요로한다.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE), 크기 배제 크로마토 그래피 또는 종래의 도데 실 황산나트륨 (SDS) -page 뒤에 화학적 가교 세포 용 해물 2,19,20에서 올리고머 형성의 특성을위한 유용한 도구이다. 이러한 방법은 전문 장비가 필요하지 않습니다 쉽게 체육 될 수 있습니다표준 실험실에서 rformed. 우리는 처음에 가변되지 않은 특정 집계와 MXA의 침전되었다 다양한 화학 가교 프로토콜을 평가 하였다. 따라서, 우리는 다음 비 변성 PAGE 프로토콜을 테스트했다. 비 - 변성 PAGE는 SDS의 사용을 배제 같이, 단백질의 이동은 그 나라의 전하에 의존한다. 블루 기본 페이지는 SDS 유사한 전반적인 음전하와 단백질을로드 쿠마 빛나는 푸른 G250을 사용하지만 단백질 (21) 변성하지 않습니다. 불행하게도, 높은 염 종종 용해 버퍼에 포함되는 가의 양이온 (예를 들어 Mg를 2+)의 존재 브릴리언트 블루 침전물을 쿠마. 사용 된 버퍼에 따라, 올리고머 단백질 복합체에 영향을 미칠 수있는 단계를 더 최적화없이 샘플을 분석하기 어려울 수있다.

여기에서 우리는의 올리고머를 결정하기 이전에 발행 된 방법 (22)에 기초한 간단한 프로토콜을 제시비 - 변성 PAGE를 사용하여 세포 용 해물로부터 유도 된 인간 MXA 단백질.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

주 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 비 - 변성 PAGE 프로토콜 (12)에 기초한다. 이 연구에서, MXA 단백질 올리고머 상태 내인성 MXA 표현 MXA 과발현 베로 세포 또는 IFN-α 자극 A549 세포를 사용하여 평가 하였다. 후술되는 프로토콜 MXA 이외에 어떤 단백질 올리고머 상태를 분석하는데 사용될 수있다. 그러나, 더 최적화가 필요할 수 있습니다.

비 변성 페이지에 대한 세포 용 해물 1. 준비

주 : 하나 또는 베로 A549 세포에서 인간 MXA 단백질 올리고머 상태를 분석하기 위해, 1.0 × 106 세포를 수확 하였다. 세포 유형 또는 분석하는 단백질 풍부에 따라, 세포 수를 조정해야한다. 이는 곧 감광 요오도 아세트 아미드를 첨가 한, 노광에서 용해 완충액을 보호하는 것이 중요하다.

  1. 잘 당 종자 0.3 × 10 6 A549 또는 베로 세포에서6 잘 요리한다. 웰 당 2 ml의 성장 배지에서 세포를 유지하고 (표 1 참조). 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2).
  2. 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖로 세척하여 세포를 수확하고, 0.5 ml의 0.25 % 트립신 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 실온에서 약 5 분 동안 1X 용액을 첨가하여 분리.
  3. 즉시 세포가 접시에서 분리로, 0.5 ml의 성장 매체를 추가하고 조심스럽게 피펫 팅 아래로 섞는다.
  4. 잘 한 2 ML 튜브에 각각의 세포를 전송하고 테이블 톱 원심 분리기 (5,000 XG, 4 ° C, 5 분)를 사용하여 펠렛.
  5. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 피펫으로 상층 액을 제거합니다.
  6. 심하게 상하 세포 현탁액을 피펫 팅에 의해 1 ml의 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다.
  7. 테이블 위에 원심 분리기에서 펠렛 세포 (5,000 XG, 4 ° C, 5 분).
  8. 조심스럽게 위스콘신 피펫 팅하여 상층 액을 제거세포 펠렛을 분리 사전 통 보없이.
  9. 로 pipetting 아래 얼음에 넣어 200 ㎕의 빙냉 용해 완충액 (표 1 참조)에 재현 탁 된 세포.
  10. 즉시 주석 호일을 사용하여 얼음에 30 분 동안 품어 튜브를 덮어 빛 해물를 보호합니다.
    참고 : 무료 티올 그룹의 보호를 되돌릴 수 있기 때문에 얼음에 30 분 동안 배양 한 후에는 더 이상 빛에 노출에서 해물을 보호하기 위해 필수적이다.
  11. 미리 냉장 테이블 탑 원심 분리기 (13,000 XG, 4 ° C, 20 분)에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
  12. 원심 분리 단계에서 20 분 동안 4 ℃에서 냉각 실의 투석 완충액 (표 1)에서 투석 열 평형. 10,000 잘라 분자량 열을 사용합니다.
    1. 플로트 부표에 열을 연결하고 투석 버퍼 가득 비커에 넣어. 부드러운 교반을 보장하기 위해, 자석 교반기를 사용합니다. 멤브레인을 만지지 마십시오.
      참고 : Dialys열은 구입 또는 FIALA 및 동료 (19)에 의해 기술 된 프로토콜에 따라 1.5 ml의 튜브로부터 제조 될 수있다.
  13. 투석 버퍼와 플로트 부표에서 열을 제거합니다. 멤브레인을 건드리지 않고 피펫 팅에 의해 제조 된 투석 열로 삭제 해물을 전송합니다. 플로트 부표에 열을 연결하고 투석 버퍼로 가득 비커에 다시 넣어.
  14. 신중 자기 교반기를 사용하여 교반하면서 4 ℃에서 적어도 4 시간 (바람직 밤새) 미국 빙냉 투석 완충액 (표 1)을 함유하는 비이커에 해물을 투석. 200 μl의 용 해물 적어도 100 ㎖ 투석 버퍼를 사용합니다.
  15. 1.5 ML 튜브로 투석 샘플을 전송합니다. 테이블 탑 원심 분리기 (13,000 XG, 4 ° C, 20 분)에서 원심 분리하여 침전물을 제거합니다. 단지 바로 투석 후 프로토콜 (섹션 2) 계속 올리고머 단백질의 분해를 방지합니다. 냉동하지 마십시오준비된 해물.

2. 전기 영동

참고 : 일부 수정 (22) 전술 한 바와 같이 전기 영동을 실시 하였다. 후술 프로토콜, 프리 캐스트 구배 겔 (4 % -15 % 구배)을 사용 하였다. 대안 적으로, 겔은 실험실에서 제조 될 수있다. 이는 SDS는 올리고머 단백질 복합체의 해리를 방지하는 등의 임의의 변성제를 배제하는 것은 매우 중요하다. 전기 영동시 인간 MXA 단백질의 상이한 올리고머 상태에 대해 최적화되었다. 그러나, 올리고머 복합체의 크기뿐만 아니라 복잡한 분석을 달성 할 것으로 예상되는 분리의 범위에 따라, 다른 단백질에 대해 변할 수있다. 따라서, 전기의 최적 시간은 경험적으로 결정되어야한다. 올리고머의 최적 해상도를 분석하기 위해서는 전류가 25mA를 초과 할 수 없습니다.

  1. 겔 챔버 내의 비 - 변성 PAGE 겔을 조립한다. t 채우기미리 냉각 주행 완충액 (표 1)와 그 내부 및 외부 챔버.
  2. 4 ℃에서 추운 방에서 15 분 동안 젤 당 25mA에서 미리 냉장 실행 버퍼 젤을 미리 실행합니다.
  3. 4X 샘플 버퍼 5 μl를 (표 1)를 상기 제조 된 용 해물 15 μL를 혼합한다. 샘플을 끓여하지 마십시오.
  4. 15 샘플의 μL 겔에 선택의 천연 단백질 표준을 넣습니다. 4 ℃에서 추운 방에서 4 시간 동안 25mA에서 젤을 실행합니다.
    주 : 반 정량 분석을 위해, 단백질 정량화 프로토콜 (예를 Bradford 단백질 분석 23) 레인 당 총 단백질의 동일한 양의 부하를 보장하기 위해 수행 될 수있다.

3. 서양 얼룩

참고 : 아래 설명은 젖은 웨스턴 블롯 시스템의 프로토콜입니다. 상관 블 롯팅 막을 사용할 수있다. 버피 블 롯팅으로 평형화 전에 100 % 메탄올, 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 활성화FER. 반 건조 웨스턴 블랏 기술은 대안 적으로 사용될 수 있지만, 큰 올리고머 성 복합체에 대해 최적화되어야한다.

  1. 젤을 분해 조심스럽게 SDS 버퍼 (표 1)로 전송합니다.
  2. 부드럽게 진탕하면서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
  3. 이 스폰지 4 셀룰로오스 필터 종이 시트 당 겔 블롯 막을 제조. 버퍼 (표 1) 모래 바닥에서 그들을 만끽 해보세요.
  4. 한 스폰지,이 셀룰로스 여과지 시트, 막, 겔,이 셀룰로오스 필터 종이 시트 일 스폰지 (상하로)를 다음과 같이 샌드위치를 ​​조립한다.
  5. 블로 팅 탱크에 샌드위치를 ​​넣습니다. 젤은 마이너스 극에 직면하면서 막 플러스 극에 직면 해 있는지 확인합니다.
  6. 사전 냉장 블로 팅 버퍼로 블로 팅 탱크를 채우십시오.
  7. 최고의 단백질 전송 결과를 4 ℃에서 하룻밤 90mA에서시킨다.
  8. 샌드위치를 ​​분해 Ponc의 막을 배양함으로써 단백질 표준을 시각화실온에서 5 분 동안 오 S 용액.
  9. 명확 단백질 표준의 밴드를 볼 수있을 때까지 조심스럽게 탈 이온수 폰소 s를 세정 막 Destain.
  10. 펜을 사용하여 단백질 표준의 밴드를 표시한다.
    참고 : 잔류 폰소 s는 면역 염색을 방해 할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 상기 멤브레인은 탈 이온수로 1 분 이후의 세정에 0.1 M NaOH로 인큐베이션하여 상기 탈색 될 수있다.
  11. 버퍼 블로킹 멤브레인을 차단하고 실온에서 적어도 1 시간 또는 밤새 39 ° C에 대해 (표 1 참조).
  12. 분석하고자하는 단백질에 대한 항체를 이용한 면역 염색으로 관심 단백질 (들)을 가시화.
    주 : 완충액 (표 1)은 블록 1000 : 인간 MXA 단백질이 인간 MX1 특정 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 시각화 하였다 (1) 희석 하였다. 항체 용액을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 대안 적으로, 단일 클론NTI-MXA 항체 (클론 143) (24) (데이터는 도시하지 않음)이 사용될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

비 - 변성 PAGE를 사용하여, 우리는 인간 야생형 MXA, 다이머 인터페이스 돌연변이의 MXA (R640A)와 MXA (L617D)뿐만 아니라, 세포 용 해물 (12)로부터의 단량체 인터페이스 돌연변이 MXA (M527D)의 올리고머 상태를 분석했다. 세포를 1 % octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) 및 요오도 아세트 아미드는 단백질의 가용화 및 유리 티올 기의 보호를 보장하기를 함유하는 완충액에 용해시켰다 (도 1 참조). 앞서 설명한 바와 같이, 소금, 작은 대사 산물은 투석 (19)에 의해 제거 하였다. 단백질 분리는 비 변성 PAGE에 의해 행했다. 효율적인 웨스턴 블로 팅을 용이하게하기 위해, 겔 블롯 전에 SDS 완충액 하였다. MXA 단백질은 MXA 향한 토끼 폴리 클로 날 항체를 이용한 면역 염색으로 가시화 하였다. 워크 플로는 그림 2에 설명되어 있습니다.

IFN-α에서 내인성 MXA 인간 단백질의 올리고머 상태를 비교할 ; 자극 된 A549 세포, 우리는 재조합 야생형 모노머와 다이머 MXA 변종 (내인성 MXA 결여) 베로 세포를 형질. 흠 천연 단백질 마커 (도 3a)에 비해 이들 재조합 야생형 모노머와 다이머 MXA 각각 안정 사량, 단량체 및 이량 체를 형성 변이체. 따라서 IFN-α 유래의 내생 인간 MXA 단백질 올리고머 상태 A549 세포를 자극.도 3b는 IFN-α 자극 A549 세포의 용 해물에서 MXA의 크기 량체에 해당하는 것을 알 평가할 이들 재조합 단백질을 사용 하였다.

종합하면, 우리는 세포 용 해물로부터 인간 MXA 단백질 올리고머 상태를 결정하는 방법을 설명한다. 우리의 비 - 변성 PAGE 접근법은 다른 올리고머 단백질 복합체의 올리고머 상태를 평가하기 위해 사용될 수있다.

83 / 54683fig1.jpg "/>
그림 1 :. 요오도 아세트 아미드의 구조와 반응 방식은 요오도 아세트 아미드는 비가 역적 티오 에테르 결합을 형성하여 무료 cysteins의 티올 그룹을 보호합니다. 시스테인에서 황 원자와 요오드의 친 핵성 치환에서이 안정 수정 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 비 - 변성 PAGE의 흐름 다이어그램 세포 용 해물의 비 - 변성 PAGE 방식의 체계적인 표현. 세포 용해 동안 세제는 단백질의 가용화 및 티올 그룹은 단백질 응집을 방지 요오도 아세트 아미드에 의해 보호된다. 투석은 비 - 변성 PAGE 방해 할 수있는 작은 대사 염을 제거 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3 : 비 - 변성 PAGE 및 웨스턴 블랏을 이용하여 인간 단백질 MXA 올리고머 상태의 결정 (A)는 재조합 MXA ectopically 베로 세포에서 발현 변이체.. 야생형 MXA (테트라) 인터페이스 돌연변이의 MXA의 복합체 (R640A)는, MXA (L617D) (이량 체)와 MXA (M527D)는 자신의 올리고머 상태를 확인하고, 자신의 예상 분자량에 이동한다. (B) A549 세포 (MXA)의 발현을 유도 IFN-α 1 ㎖ 당 1,000 IU로 자극 하였다. 내생 MXA 쉬OWS 테트라 머 양식에 해당하는 밴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

버퍼 이름 함유량 댓글
용해 완충액 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5)
150 mM의 NaCl을,
5 밀리미터의 MgCl 2,
100 μM의 요오도 아세트 아미드,
50 mM의 불화 나트륨,
1 ㎜ 나 3 VO 4,
1 % NP-40,
50 MM의 β-글리세로,
1 태블릿 50 EDTA ml의 용해 버퍼 무료, 프로테아제 억제제 칵테일 당
iodacetamide, 불화 나트륨, 나 3 VO 4, octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), β-글리세 및 단백질 분해 효소 inhibi 추가세포 용해 전에 토르 칵테일 바로

Iodacetamide는 빛에 민감한 때 용액에서 불안정하다. 빛에 노출되지 않도록하고, 사용하기 전에 권리를 녹인다.
투석 버퍼 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 6.8)
10 % 글리세롤,
0.1 % CHAPS,
0.5 mM의 DTT
CHAPS 다른 비 - 변성 계면 활성제에 의해 수 raplaced
실행 버퍼 25 mM 트리스 - 염산 (PH 8.3),
192 mM의 글리신,
0.1 % CHAPS,
0.5 mM의 DTT
pH가 8.3에서 대부분의 단백질은 부정적으로 청구됩니다. 그러나, 염기성 단백질, 산성 pH는 사용되어야한다. 그렇지 않으면, 단백질은 반대 방향으로 실행되고 손실됩니다.

CHAPS 다른 비 - 변성 계면 활성제로 대체 될 수있다
샘플 버퍼 310 mM 트리스 - 염산 (pH6.8),
0.05 % 브로 모 페놀 블루,
50 % 글리세롤
SDS 버퍼 25 mM 트리스 - 염산 (PH 8.3),
192 mM의 글리신,
0.1 % SDS
블로 팅 버퍼 25 mM 트리스,
192 mM의 글리신,
20 % 메탄올
매우 큰 단지를 들어, 메탄올 ommitted 할 수있다
버퍼를 차단 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.4)
150 mM의 NaCl을
0.05 % 트윈 20
5 % 분유
성장 배지 둘 베코의 변형 매체
1X 페니실린 / 스트렙토 마이신
2 mM의 글루타민
10 % 태아 송아지 혈청

표 1 : 비 변성 PAGE에 필요한 버퍼 조리법.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기에서 우리는 웨스턴 블롯 분석 한 다음 비 변성 PAGE에 의해 포유 동물 세포에서 발현 된 단백질의 올리고머 상태의 빠른 결정을 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 중요한 이점은 주어진 단백질의 올리고머 상태 전에 단백질 정제없이 전체 세포 용 해물로부터 결정될 수 있다는 것이다. 이 올리고머 또는 보조 요인과 관련하여 그 기능을 발휘 단백질 중요 할 수있다. 또한, 단백질은 천연 상태로되어 있고, 상기 겔로부터 추출하는 경우, 효소 활성 또는 다른 단백질의 기능을 결정 올리고머 상태로 상관 될 수있다.

이 프로토콜의 중요한 측면은 샘플 준비하는 동안 세제의 선택입니다. 이것은 세포막과 관련된 단백질 특히 중요하다. MXA 주로 평활 소포체 (25)의 막과 연관되는 것으로 보인다 19 바와 같이 버퍼 교환 및 투석에 의해 용 해물의 저분자 불순물을 제거한 후, 0.1 % (3)의 존재 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 술포 네이트 (CHAPS) 겔 중에 MXA의 침전을 방지하기 위해 필요했다 전기. E. 표현 MXA 정제 된 재조합 단백질과 결정된 또한, CHAPS는 MXA의 효소 활성을 방해하지 대장균 12. 이 세정제는 단백질의 변성 또는 분해시 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하지 않는 매우 중요하다. 이러한 NP40, Octoxinol 9 같은 비 변성 세제, 디기 토닌과 CHAPS는 가용화에 적합하다. 세제 및 농도의 선택은 경험적으로 결정되어야한다. 세제는 세제 있어야 특정 분석에 대한 실험 하류에 영향을 미칠 수제거 쉽게 투석에 의해 CHAPS 달성,하지만 Octoxinol 9 (26)된다.

전술 한 방법은, 비 - 변성 조건하에 세포 용 해물로부터 유래 된 단백질을 분석하기 때문에, 종래에는 단백질 정제는 필요하지 않다. 재조합 단백질의 정제는 종종 응집 침전에서 단백질을 방지하기 위해 높은 염 및 다른 첨가제의 첨가에 의해 완충 최적화를 요구하기 때문에 이점이있다. 그러나 이러한 첨가제 및 높은 소금 농도는 반드시 자연 상태와 유사하지 않을 수 있습니다 단백질의 올리고머에 영향을 미칠 수 있습니다. 특히 인간 MXA 단백질의 경우에는, 염 농도 및 뉴클레오티드의 존재는 더 높은 올리고머 상태 (27)의 형성에 중요한 역할을한다. 셀룰러 안정화 요소가 여전히 존재하기 때문에 세포 용 해물에서의 단백질이 더욱 쉽게 안정된다. 그러므로 PR을 분석 할 수있다더 많은 세포 생리 학적 조건에서 otein 단지 (예를 들어 생리 소금 농도, pH를). 다른 단백질은 구조적으로 관련 MXB 또는 dynamin 8 예를 들어, 올리고머를 형성하기 위해이 프로토콜은 또한 적용되어야한다.

프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 용해 (도 1) 중 세포질 단백질의 인공 디설파이드 브릿지의 형성을 방지하기 위해 유리 티올 기의 보호이다. 초기 실험은 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT) 또는 β-mercaptethanol 첨가 샘플 제조 동안 인공 이황화 결합의 형성을 방지하기에 충분하지 않은 것으로 나타났다. 두 환원제 디설파이드 브릿지를 형성하는 가역적 티올기를 보호한다. 이 가역적 보호가 영구적으로 모든 티올 그룹을 보호하기에 충분하지 않을 수 있습니다. MXA 단백질의 경우, 이는 단백질의 비가역적인 응집을 이끈다. 그러나, 요오도 아세트 아미드를 첨가 irrevers 그DTT로 처리 해물로부터 MXA에 비해 ibly 시스테인 크게 감소 더욱이 MXA 단백질의 응집, MXA 포유류 발현 세포로부터 제조 해물의 요오도 아세트 아미드 치료 면역 MXA의는 GTPase 활성에 영향이 없었다의 자유 티올기를 보호 (데이터 미도 ).

올리고머의 protomers 수의 정확한 결정을 위해 다른 중요한 고려 사항은 폴리 아크릴 아마이드 농도 범위의 선택뿐만 아니라, 단백질의 분자량을 참조한다. 폴리 아크릴 아미드의 농도 범위는 제 올리고머의 예상 분자 질량에서의 주파수 대역의 최대 분리를 허용하도록 설정되어야한다. 비 변성 PAGE는 SDS가 포함되어 있지 않습니다. , SDS 전하, 분자량 및 단백질의 형상을 결여하면 그 전기 영동 이동성을 결정한다. 따라서, 단백질 분자량 마커의 선택은 매우 중요하다. 이상적으로는, 분자량 참조 AR 것알려진 올리고머 상태와 관심의 단백질의 ecombinant 정제 형태. 이것이 항상 가능하지 않기 때문에, 비 변성 또는 천연 단백질 마커를 사용한다. MXA는 UAP56 또는 Thogotovirus의 바이러스 nucleoproteins 같은 다른 세포 단백질과 연결하는 것으로되어 있기 때문에, 라크로스 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 12,28-30, 우리는 또한-별도의 공동 것이라고 핵 단백질을 UAP56 여부를 특정 항체를 사용하거나 인플루엔자 면역 염색에 의해 테스트 비 변성 PA 젤에 MXA와. 그러나 우리는 MXA의 헤테로 올리고머의 형성에 대한 증거를 찾을 수 없습니다. 이것은 아마도 MXA-UAP56 및 MXA - 핵 단백질 상호 작용이 낮은 친 화성 (12, 24)의 사실이다. 또한, UAP56 또는 바이러스 nucleoproteins와 관련 MXA 단백질의 비율이 방법에 의해 감지하기가 매우 낮은 때문에 어려울 수 있습니다.

또한, 고려 단백질의 pKa가 분석되도록하는 것이 중요하다. 설명 비 denat에서uring 페이지 프로토콜은, 단백질은 pH가 8.3에서 전기 영동에 의해 분리된다. 대부분의 단백질은 음이 pH에서 청구됩니다. 그러나 기본 단백질은 pH가 8.3에서 순 전하를 나타내고, 따라서 반대 방향으로 실행됩니다. 염기성 단백질의 분석은 단백질의 전체 음전하를 위해 주행 완충액의 pH를 조정하기 위해 그 결과, 이것은 중요하다.

종합하면, 우리는 사전 정제없이 여기 포유 동물 세포에서 발현 된 단백질의 올리고머 상태의 신속한 평가를위한 프로토콜을 제시한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml Thermo Fisher Scientific 69570 Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired)
Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, Bio-Rad 456-1083 Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001 use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco Thermo Fisher Scientific 14190-094
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl Invitrogen P/N 57030 load 5 µl/well
A549 cells ATCC ATCC CCL185 Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells ATCC ATCC CCL81 Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody Novus Biologicals H00004599_D01P Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) GE-Healthcare NA934V Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies Thermo Fisher 15400-054
Iodoacetamide   5 g Sigma-Aldrich I-6125 stock  100 mM
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies Thermo Fisher Scientific 41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies Thermo Fisher Scientific 15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies Thermo Fisher Scientific 350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K Thermo Fisher Scientific 10270-106
Cellulose filter paper Bio-Rad 1703965
PVDF blotting  membrane GE-Healthcare 10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Biosolve 0020092391BS
sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich S-7920
NP-40 Calbiochem 492015
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001
Tween 20 Calbiochem 6555204
CHAPS 10% solution Amresco N907
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43819
Glycine Biosolve 0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich 450243
Glycerol Sigma Aldrich G7757
β-Glycerophospate Sigma Aldrich G9422
Milk powder Migros/Switzerland
Methanol Millipore 1.06009
sodium cloride (NaCl) Sigma Aldrich 71380
magnesium chloride (MgCl2) Amresco 288
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma Aldrich L4509
sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S-8045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
  2. Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
  3. Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
  4. Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
  5. Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
  6. Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
  7. Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
  8. Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
  9. Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
  10. Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
  11. Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
  12. Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
  13. Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
  14. Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
  15. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
  16. Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
  17. Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (93), 1-40 (1993).
  18. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
  19. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (2011).
  20. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
  21. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
  22. Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
  23. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  24. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
  25. Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
  26. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
  27. Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
  28. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
  29. Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
  30. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics