Karakterisering av Multi-subenheten Protein Komplekser av menneskelig MXA bruk av ikke-denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nigg, P. E., Pavlovic, J. Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis. J. Vis. Exp. (116), e54683, doi:10.3791/54683 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Den kvaternære struktur av et protein spiller en avgjørende rolle i mange cellulære prosesser. Signalveier, genekspresjon og enzym aktivering / deaktivering alle er avhengige av riktig montering av protein komplekser 1-4. Denne prosessen også kjent som homo- eller hetero-oligomerisering er på grunn av irreversible kovalente eller reversibel elektrofile og hydrofobe protein-protein-interaksjoner. Oligomerisering ikke bare, sprer de forskjellige cellulære prosesser uten å øke genomstørrelse, men gir også en strategi for proteiner for å bygge stabile komplekser som er mer motstandsdyktig mot denaturering og degradering 5. Defekter i oligomerisering har innvirkning på funksjonen av proteiner og kan føre til utvikling av sykdommer. For eksempel, danner enzymet fenylalanin-hydroksylase et tetramert kompleks. Noen mutasjoner innenfor proteinkomplekset kan svekke tetramer formasjonen og føre til sykdommen fenylketonuri 6.

7. Den tilhører superfamily av -strøm lignende store GTPases og har kapasitet til å danne store oligomeric strukturer in vitro 8. Oligomeriseringsprosessen har blitt foreslått for å beskytte MXA fra rask nedbrytning 9,10. Til tross for intens innsats fra mange forskningsgrupper, den molekylære virkningsmekanismen fortsatt i stor grad unnvikende og rollen oligomerisering staten MXA for sin antiviral funksjon er under debatt 9,11,12. I denne forbindelse, Gao og kolleger foreslått en modell der MXA utøver sin antiviral aktivitet ved å samhandle med virus nucleoproteins i form av store ringlignende oligomeric strukturer 11. Men nå nylig, viste vi at MXA dimers utviser antiviral aktivitet og samhandle med nucleoproteins av influensa A virus 12. Based på krystallstrukturen til MXa, Gao og medarbeidere identifisert flere aminosyrerester i grensesnittet regionene som er kritiske for sin oligomerisering in vitro og dens antiviral funksjon 11,13. Derfor, for å belyse hvilken oligomere tilstand av MXa utviser antiviral aktivitet, søkte vi å etablere en enkel protokoll for å raskt bestemme oligmeric tilstanden MXa grensesnitt mutanter uttrykt i humane celler, så vel som endogen MXa uttrykt etter IFNα stimulering.

Selv om det er mange teknikker som ofte brukes for å undersøke samspillet mellom proteiner som split-grønt fluorescerende protein (split-GFP) komplemente assay 14, overflate plasmon resonans 15 og Förster resonans energi overføring (FRET) 16, de gir ikke informasjon om den eksakte støkiometrien av en oligomer proteinkompleks. For undersøkelse av dette aspektet, teknikker såsommulti-vinkel lysspredning (MALS) 17 og analytisk ultracentrifugation 18 er svært nyttig. Vanligvis proteinene analysert ved hjelp av disse metodene er rensede proteiner. Oligomerisering prosesser kan også avhenge av andre cellulære faktorer. Dersom disse faktorene er ukjente, er analysen vanskeligere. I tillegg har noen proteiner er vanskelig å uttrykke i E. coli og å rense. Derfor er disse fremgangsmåter ikke er det optimale valg å analysere proteinet oligomerisering i det cellulære miljø. I tillegg er disse teknikkene krever kostbare instrumenter som ikke er lett tilgjengelig.

Ikke-denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE), størrelseseksklusjons-kromatografi, eller kjemisk tverrbinding, etterfulgt av konvensjonell Natriumdodecylsulfat (SDS) -side er nyttige verktøy for karakteriseringen av dannelsen av oligomerer fra cellelysater 2,19,20. Disse metodene ikke krever spesialisert utstyr og kan lett performed i en standard laboratorium. Vi først evaluert forskjellige kjemiske tverrbindings protokoller som invariantly førte til ikke-spesifikk aggregering og utfelling av MXa. Derfor vi neste testet ikke-denaturerende HOVED protokoller. Som ikke-denaturering PAGE utelukker bruk av SDS, migrering av proteiner avhenger av deres opprinnelige kostnad. Blå-nativ PAGE benytter Coomassie brilliant blue G250 for å laste proteiner med en total negativ ladning, i likhet med SDS, men ikke denaturere proteinet 21. Dessverre, Coomassie brilliant blå bunnfall i nærvær av høye salter og divalente kationer (for eksempel Mg 2+) som ofte inngår i lyseringsbuffer. Avhengig av buffere som brukes, kan det være vanskelig å analysere prøven uten ytterligere optimalisering av trinn som kan ha en effekt på den oligomere proteinkompleks.

Her presenterer vi en enkel protokoll basert på en tidligere publisert metode 22 for å bestemme oligomerisering avmenneskelig MXA protein fra cellelysatene ved hjelp av ikke-denaturering PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne protokollen er basert på tidligere utgitt ikke-denaturering SIDE protokoll 12. I den studien ble oligomere tilstanden i MXA protein vurdert ved hjelp av enten Vero-celler som overuttrykker MXA eller IFN-a-stimulerte A549 celler som uttrykker endogen MXA. Protokollen er beskrevet nedenfor, kan brukes til å analysere den oligomere tilstand av hvilket som helst protein i tillegg til MXa. Imidlertid kan ytterligere optimalisering være nødvendig.

1. Utarbeidelse av cellelvsat for Non-denaturering PAGE

MERK: For å analysere oligomere state of the human MXA protein i enten Vero eller A549 celler, ble 1,0 x 10 6 celler høstet. Avhengig av celletypen eller den mengde av proteinet for å analysere skal celletallet justeres. Det er også viktig å beskytte lysis buffer fra lyseksponering, så snart den lysfølsomme jodacetamid ble tilsatt.

  1. Seed 0,3 x 10 6 A549 eller Vero celler per brønn i6 brønn retter. Holde cellene i 2 ml vekstmedium per brønn (se tabell 1). Inkuber cellene over natten i en cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2).
  2. Høste cellene ved vasking med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og løsne ved tilsetning av 0,5 ml av 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) 1x løsning i ca. 5 minutter ved romtemperatur.
  3. Så snart cellene løsner fra fatet, tilsett 0,5 ml vekstmedium og omhyggelig blande ved å pipettere opp og ned.
  4. Overfør cellene i hver brønn inn i en 2 ml rør og pelletisere dem ved hjelp av en bordsentrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
  5. Fjern forsiktig supernatanten ved å pipettere uten å forstyrre cellepelleten.
  6. Vask cellene med 1 ml iskald PBS ved forsiktig pipettering cellesuspensjonen opp og ned.
  7. Pellet celler i en bordsentrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
  8. Fjern forsiktig supernatanten ved pipettering without løsne cellen pellet.
  9. Resuspender celler i 200 ul iskald lyseringsbuffer (se tabell 1) ved å pipettere opp og ned og lagt på is.
  10. Umiddelbart beskytte lysat fra lys ved å dekke rørene ved hjelp av aluminiumsfolie og inkuberes i 30 min på is.
    MERK: Etter inkubering i 30 minutter på is, er det ikke lenger nødvendig å beskytte lysatet fra lyseksponering, ettersom beskyttelse av de frie tiolgrupper er irreversibel.
  11. Fjerne cellerester ved sentrifugering i en på forhånd avkjølt bordsentrifuge (13 000 xg, 4 ° C, 20 min).
  12. Stabilisere dialyse kolonner i dialysebuffer (tabell 1) i kjølerom ved 4 ° C i 20 minutter under sentrifugeringstrinn. Bruke en kolonne med en molekylvekt cut off på 10.000.
    1. Fest kolonnene til en flåte bøye og sette dem inn i et beger fylt med dialyse buffer. For å sikre forsiktig omrøring, bruke en magnetrører. Ikke berør membranen.
      MERK: Dialyser kolonnene kan kjøpes eller fremstilles fra 1,5 ml rør i henhold til den protokoll som er beskrevet av Fiala og kolleger 19.
  13. Fjern kolonnene fra dialyse buffer og flytebøye. Overfør ryddet lysatene i forberedt dialyse kolonnen ved pipettering uten å berøre membranen. Fest kolonnene til en flåte bøye og sette dem tilbake i begeret fylt med dialyse buffer.
  14. Dialyser lysatet i et beger inneholdende iskald dialysebuffer (tabell 1) i minst 4 timer (eller fortrinnsvis over natten) ved 4 ° C under forsiktig omrøring ved hjelp av en magnetrører. Bruk minst 100 ml dialysebuffer for en 200 ul lysat.
  15. Overfør den dialyseres prøven inn i et 1,5 ml rør. Fjern bunnfall ved sentrifugering i en bordsentrifuge (13 000 xg, 4 ° C, 20 min). For å forhindre dissosiasjon av den oligomere proteinkompleksene fortsette med protokollen (seksjon 2) umiddelbart etter dialyse. Må ikke frysesoppkjørte lysatene.

2. Elektroforese

MERK: Elektroforese ble utført som beskrevet før med noen modifikasjoner 22. I den protokoll som er beskrevet nedenfor, ble ferdigstøpte gradient geler anvendes (4-15% gradient). Alternativt kan gelene fremstilles i laboratoriet. Det er meget viktig å utelukke enhver denaturering middel slik som SDS for å forhindre dissosiering av de oligomere proteinkomplekser. Tidspunkt for elektroforese ble optimalisert for de ulike oligomeric tilstander av den menneskelige MXA protein. Men det kan variere for andre proteiner, avhengig av størrelsen av den oligomere komplisert, så vel som omfanget av separasjon som skal oppnås for å analysere den komplekse. Derfor bør den optimale tiden for elektroforese bestemmes empirisk. For optimal oppløsning av oligomerene som skal analyseres strømmen ikke bør overstige 25 mA.

  1. Montere den ikke-denaturerende PAGE-gel i gelen kammeret. Fyll than indre og ytre kammer med på forhånd avkjølt rennende buffer (tabell 1).
  2. Pre-kjør-gel med på forhånd avkjølt rennende buffer på 25 mA pr gelen i 15 minutter i kaldt rom ved 4 ° C.
  3. Bland 15 ul av det ovenfor fremstilte lysatene med 5 ul av 4x prøvebuffer (tabell 1). Ikke kok prøven.
  4. Last 15 ul prøve og et naturlig protein standard valg på gel. Kjør gelen ved 25 mA i 4 timer i kjølerom ved 4 ° C.
    MERK: semi-kvantitative analyser, et protein kvantifisering protokoll (for eksempel en Bradford proteinanalyse 23) kan utføres for å sikre lasting av like mengder av totalt protein pr kjørefelt.

3. Western Blot

MERK: Beskrevet nedenfor er en protokoll for en våt western blot-system. Enhver blotting-membran kan benyttes. Aktiver polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner i 100% metanol før ekvilibrering i blottings buffer. Semi-dry western blot teknikken kan brukes alternativt, men har til å være optimalisert for store oligomeric komplekser.

  1. Demontere gelen og forsiktig overføre det inn i SDS-buffer (tabell 1).
  2. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur under forsiktig risting.
  3. Forbered 2 svamper, 4 cellulose filter papir ark og en blotting membran per gel. Suge dem i blotting buffer (tabell 1).
  4. Monter sandwich som følger (nedenfra og oppover): 1 svamp, 2 cellulosefilter papirark, membran, gel, 2 cellulosefilter papirark, en svamp.
  5. Sette sandwich inn i den blotting tanken. Sørg for at membranen vender mot plusspolen mens gelen står minuspolen.
  6. Fyll blotting tank med pre-kjølt blotting buffer.
  7. Blot på 90 mA over natten ved 4 ° C i beste protein overføre resultater.
  8. Demonter sandwich og visualisere protein standard ved å inkubere membranen i Ponceau S oppløsningen i 5 minutter ved romtemperatur.
  9. Destain membranen ved forsiktig vask av Ponceau S med avionisert vann til du kan tydelig se band av proteinet standard.
  10. Marker bånd proteinet standard ved hjelp av en penn.
    MERK: Rest Ponceau S kan påvirke immunfarging. For å unngå dette, kan membranen bli avfarget ytterligere ved inkubering i 0,1 M NaOH i 1 min og etterfølgende vasking med deionisert vann.
  11. Blokkere membranen med blokkeringsbuffer (se tabell 1) i minst 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
  12. Visual protein (er) av interesse ved farging ved hjelp av antistoffer rettet mot proteinet som skal analyseres.
    NB: Den menneskelige MXa proteinet ble visualisert ved anvendelse av kanin-polyklonale antistoff som er spesifikt for humant Mx1 fortynnet 1: 1000 i blokkeringsbuffer (tabell 1). Antistoffløsningen ble inkubert over natten ved 4 ° C. Alternativt kan det monoklonale enNTI-MXa antistoff (klon 143) kan brukes (data ikke vist) 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruk av ikke-denaturerende PAGE, analyserte vi den oligomere tilstand av det humane villtype MXa de dimere grensesnitt mutanter MXa (R640A) og MXa (L617D) samt den monomere grensesnitt mutant MXa (M527D) fra cellelysater 12. Celler ble lysert i en buffer inneholdende 1% Octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) og jodacetamid for å sikre protein solubilisering og beskyttelse av frie tiolgrupper (se figur 1). Som beskrevet tidligere, ble salt og små metabolitter fjernet ved dialyse 19. Protein separasjon ble utført av non-denaturering PAGE. For å lette effektiv western blotting ble gelen inkubert i SDS buffer før blotting. De MXa proteinene ble visualisert ved farging ved hjelp av et kanin-polyklonalt antistoff rettet mot MXa. Arbeidsflyten er beskrevet i figur 2.

Å sammenligne oligomere tilstand av endogent humant MXA protein fra IFN-α ; stimulerte A549 celler, transfektert vi Vero-celler (som mangler endogen MXA) med rekombinant hvete, monomere og dimere MXA varianter. Disse rekombinant villtype-varianter monomere og dimere MXa dannet stabile tetramerer monomerer og dimerer, respektivt, når sammenlignet med et nativt protein uten flekker markør (figur 3A). Derfor brukte vi disse rekombinante proteiner for å vurdere tilstanden til oligomere endogent humant MXa protein avledet fra IFN-α stimulerte A549-celler. Figur 3B viser at størrelsen på MXa i lysater av IFN-a-stimulerte A549-celler svarer til en tetramer.

Til sammen beskriver vi en fremgangsmåte for å bestemme den oligomere tilstand av det humane MXa proteinet fra cellelysatet. Vår ikke-denaturering PAGE tilnærmingen kan også brukes til å vurdere den oligomere tilstand av andre oligomeric protein komplekser.

83 / 54683fig1.jpg "/>
Fig. 1: Struktur og reaksjonsskjema av jodacetamid Jodacetamid beskytter irreversibelt tiolgruppen av frie cysteiner ved å danne en tioeterbinding. Denne stabile modifikasjons resultater fra nukleofil substitusjon av jod med svovelatom fra cystein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Arbeidsflyt diagram av ikke-denaturerende PAGE Et systematisk fremstilling av den ikke-denaturerende PAGE tilnærming av cellelysater. I løpet av cellelyse, vaskemidler oppløseliggjøre proteinene og tiolgrupper er beskyttet av jodacetamid til å forhindre proteinaggregering. Dialyse fjerner små metabolitter og salter som kan forstyrre med ikke-denaturering PAGE Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Bestemmelse av den oligomere tilstand av det humane MXa protein ved hjelp av ikke-denaturerende PAGE og Western blotting (A) Rekombinant MXa varianter ectopically uttrykt i Vero celler.. Kompleksene av villtype MXA (tetramer) grensesnitt mutanter MXA (R640A), MXA (L617D) (dimer) og MXA (M527D) vandrer på sine forventede molekylvekt, som bekrefter deres oligomere tilstand. (B) A549-celler ble stimulert med 1000 IU pr ml av IFN-α å indusere ekspresjon MXa. Den endogene MXA shOWS et band som tilsvarer tetramerisk form. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

buffer navn Innhold kommentarer
lyseringsbuffer 20 mM Tris-HCl (pH 7,5),
150 mM NaCl,
5 mM MgCl2,
100 mikrometer iodoacetamide,
50 mM NaF,
1 mM Na 3 VO 4,
1% NP-40,
50 mM β-glycerophosphate,
1 tablett per 50 ml Lysis buffer EDTA gratis, proteasehemmer cocktail
Legg iodacetamide, NaF, Na 3 VO 4, Octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), β-glycerophosphate og protease inhibitor cocktail rett før cellelyse

Iodacetamide er lys-sensitive og ustabil når i løsningen. Forhindre lyseksponering og oppløse rett før bruk.
dialyse buffer 20 mM Tris-HCl (pH 6,8),
10% glycerol,
0,1% CHAPS,
0,5 mM DTT
CHAPS kan raplaced av andre ikke-denaturerende vaskemidler
kjører buffer 25 mM Tris-HCl (pH 8,3),
192 mM glycin,
0,1% CHAPS,
0,5 mM DTT
Ved pH 8,3, er de fleste proteiner negativt ladet. Men for basiske proteiner, en sur pH skal brukes. Ellers vil proteinene kjøres i motsatt retning, og vil gå tapt.

CHAPS kan erstattes av andre ikke-denaturerende detergenter
Sample buffer 310 mM Tris-HCl (pH 6,8),
0,05% bromfenolblått,
50% glycerol
SDS buffer 25 mM Tris-HCl (pH 8,3),
192 mM glycin,
0,1% SDS
blotting buffer 25 mM Tris,
192 mM glycin,
20% Metanol
For svært store komplekser, kan Metanol bli avsatt
Blokkering buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7,4)
150 mM NaCl
0,05% Tween 20
5% Melkepulver
vekstmedium Dulbeccos modifiserte medium
1x Penicillin / streptomycin
2 mM Glutamin
10% føtalt kalveserum

Tabell 1: Buffer oppskrifter som kreves for ikke-denaturering PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en enkel fremgangsmåte som tillater rask bestemmelse av den oligomere tilstand av proteiner uttrykt i pattedyrceller ved ikke-denaturerende PAGE etterfulgt av Western blot-analyse. Den store fordelen med denne tilnærmingen er at den oligomere tilstanden til et gitt protein kan bestemmes fra helcellelysater uten forutgående proteinrensing. Dette kan være viktig for proteiner som oligomerisere eller utøver sin funksjon i forbindelse med hjelpefaktorer. I tillegg er de proteiner er fremdeles i sin opprinnelige tilstand, og hvis ytterligere ekstrahert fra gelen, kan den enzymatiske aktiviteten eller andre proteinfunksjoner bestemmes og korreleres til den oligomere tilstand.

En kritisk del av denne protokollen er valg av vaskemidler under tillagingen. Dette er av særlig viktighet for proteiner forbundet med cellemembraner. MXA ser ut til å være primært assosiert med membraner av glatte endoplasmatiske retikulum 25 19 nærvær av 0,1% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) var nødvendig for å forhindre utfelling av MXa i løpet av gel elektroforese. I tillegg vil CHAPS ikke forstyrrer den enzymatiske aktiviteten til MXa som bestemt med renset rekombinant MXa protein uttrykt i E. coli 12. Det er av stor betydning at vaskemiddel ikke denaturerer proteinene i eller forstyrrer protein-protein interaksjoner under lysis. Ikke-denaturerende detergenter som NP40, Octoxinol 9, digitonin og CHAPS er egnet for oppløseliggjøring. Valget av vaskemiddel og dets konsentrasjon skal bestemmes empirisk. Vaskemiddelet kan også påvirke nedstrøms eksperimenter f.eks for enkelte analyser vaskemiddel trenger å værefjernet som lett oppnås med CHAPS ved dialyse, men ikke med Octoxinol 9 26.

Ettersom den beskrevne metode analyser proteiner fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser, er ingen forutgående rensning av proteinene som kreves. Dette er en fordel ettersom rensing av rekombinante proteiner krever noen ganger bufferoptimaliseringer ved tilsetning av høye salter og andre additiver for å forhindre proteinet fra aggregering eller utfelling. Men kan disse tilsetningsstoffer og den høye saltkonsentrasjoner har en innvirkning på oligomerisering av proteinet som kanskje ikke nødvendigvis likne sin naturlige tilstand. Spesielt i tilfelle av det humane MXa protein, saltkonsentrasjonen og tilstedeværelse av nukleotider spiller en avgjørende rolle i dannelsen av høyere oligomere tilstander 27. I cellelysater, blir proteinene lettere stabilisert seg etter de cellulære stabiliserings faktorene er fortsatt til stede. Derfor er det mulig å analysere protein komplekser under mer celle fysiologiske betingelser (f.eks fysiologiske saltkonsentrasjoner og pH). Denne protokollen bør også være anvendelig for andre proteiner som danner oligomerer, for eksempel for den strukturelt beslektede MXB eller dynamin 8.

Et annet viktig aspekt ved den protokoll er beskyttelse av frie tiolgrupper for å hindre dannelse av kunstige disulfidbroer av cytoplasmatiske proteiner i løpet av lysis (figur 1). Innledende forsøk viste at tilsetning av 1,4-ditiotreitol (DTT) eller β-mercaptethanol er ikke tilstrekkelig til å hindre dannelse av kunstige disulfidbindinger under tillagingen. Begge reduksjonsmidler beskytte tiolgruppen reversibelt fra forming disulfidbroer. Dette reversibel beskyttelse kan ikke være tilstrekkelig til å beskytte alle tiolgrupper permanent. I tilfelle av MXa protein, fører dette til irreversible aggregering av proteinet. Men tilsetning av jodacetamid som irreversibly beskytter de frie tiolgrupper av cysteiner sterkt redusert aggregering av MXa protein Videre jodacetamid behandling av lysatene fremstilt fra MXa uttrykke pattedyrceller ikke hadde noen innflytelse på GTPase aktivitet av immunopresipitert MXa i forhold til MXa fra lysater behandlet med DTT (data ikke vist ).

Andre viktige betraktninger for nøyaktig bestemmelse av antall protomere i en oligomer er valget av polyakrylamidet konsentrasjonsområde, så vel som proteinmolekylvekten referanse. Utvalget av polyakrylamid konsentrasjonen bør først etablert for å tillate maksimal separasjon av bandene på de forventede molekylmasser av oligomerer. Non-denaturering siden ikke inneholder noen SDS. Mangler SDS, ladningen, molekylmasse og formen av proteinet som bestemmer dens elektroforetiske mobilitet. Derfor er avgjørende valget av proteinmolekylvektmarkør den. Ideelt sett ville en molekylær referansevekt være arecombinant renset form av proteinet av interesse med kjente oligomere tilstander. Siden dette er ikke alltid tilgjengelig, bør et ikke-denaturert eller native protein markør anvendes. Siden MXA har vist seg å assosiere med andre cellulære proteiner som UAP56 eller virus nucleoproteins av Thogotovirus, La Crosse virus eller influensavirus 12,28-30, vi også testet ved farging med spesifikke antistoffer om UAP56 eller influensa A nucleoprotein ville samarbeide separat med MXA på de ikke-denaturerende PA geler. Men vi fant ingen bevis for dannelsen av MXA hetero oligomerer. Dette er sannsynligvis på grunn av det faktum at MXa-UAP56 og MXa-nukleoprotein interaksjoner er av lav affinitet 12,24. Dessuten kan den fraksjon av MXa protein assosiere med UAP56 eller virale nukleoproteiner være meget lav og følgelig vanskelig å oppdage ved denne metoden.

Videre er det viktig å ta hensyn til pKa av proteinet som skal analyseres. I den beskrevne ikke-denaturing PAGE-protokoll, blir proteinene separert ved elektroforese ved pH 8,3. De fleste proteinene er negativt ladet ved denne pH. Imidlertid, basiske proteiner som utviser en positiv nettoladning ved pH 8,3, og derfor vil løpe i motsatt retning. Som en konsekvens, er det viktig, for analyse av basiske proteiner for å justere pH av den rennende buffer for å sikre en total negativ ladning av proteinet.

Tatt sammen presenterer vi her en protokoll for rask vurdering av den oligomere tilstand av proteiner uttrykt i pattedyrceller uten nødvendigheten av dens forutgående rensing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml Thermo Fisher Scientific 69570 Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired)
Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, Bio-Rad 456-1083 Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001 use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco Thermo Fisher Scientific 14190-094
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl Invitrogen P/N 57030 load 5 µl/well
A549 cells ATCC ATCC CCL185 Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells ATCC ATCC CCL81 Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody Novus Biologicals H00004599_D01P Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) GE-Healthcare NA934V Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies Thermo Fisher 15400-054
Iodoacetamide   5 g Sigma-Aldrich I-6125 stock  100 mM
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies Thermo Fisher Scientific 41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies Thermo Fisher Scientific 15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies Thermo Fisher Scientific 350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K Thermo Fisher Scientific 10270-106
Cellulose filter paper Bio-Rad 1703965
PVDF blotting  membrane GE-Healthcare 10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Biosolve 0020092391BS
sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich S-7920
NP-40 Calbiochem 492015
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001
Tween 20 Calbiochem 6555204
CHAPS 10% solution Amresco N907
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43819
Glycine Biosolve 0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich 450243
Glycerol Sigma Aldrich G7757
β-Glycerophospate Sigma Aldrich G9422
Milk powder Migros/Switzerland
Methanol Millipore 1.06009
sodium cloride (NaCl) Sigma Aldrich 71380
magnesium chloride (MgCl2) Amresco 288
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma Aldrich L4509
sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S-8045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
  2. Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
  3. Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
  4. Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
  5. Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
  6. Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
  7. Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
  8. Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
  9. Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
  10. Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
  11. Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
  12. Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
  13. Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
  14. Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
  15. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
  16. Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
  17. Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (93), 1-40 (1993).
  18. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
  19. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (2011).
  20. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
  21. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
  22. Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
  23. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  24. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
  25. Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
  26. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
  27. Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
  28. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
  29. Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
  30. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics