Новый метод для генерации и наблюдения хемилюминесценции в биологическом Окружение

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

В последние десятилетия технологии обработки изображений коренным образом, что врачи диагностику и мониторинг заболевания. Эти технологии обработки изображений, однако, были в значительной степени ограничены целыми системами визуализации тела, таких как позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонной-эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ). Особое внимание было уделено раку, и технологические прорывы визуализации значительно улучшили способ, которым это заболевание диагностируется и лечится. Несмотря на эти успехи, есть одно место, где эти технологии визуализации просто не подходят: операционный зал. В то время как методы визуализации всего тела может помочь в планировании хирургического, они , как правило , не имеют пространственного разрешения достаточно высоко , чтобы помочь врачам определить , в режиме реального времени , все ли ткань опухоли была удалена или остаточная опухолевая ткань остается скрытой в хирургических краев 1. Убедившись, что нет инфильтративныйОпухолевые поля остались позади является одним из наиболее важных хирургических целей, и хирурги должны пройти канату между строгой и осторожной резекции ткани. Если слишком много снимается, нежелательные побочные эффекты для пациента усугубляются; если слишком мало снимается, уровень рецидивов увеличивается 2, 3. Поэтому крайне важно, чтобы очертить точные опухолевые поля, и мы считаем, что Хемилюминесцентный интраоперационной визуализации может помочь повысить точность идентификации краев опухоли, помогая хирургам визуализировать злокачественные ткани, которые могли бы остаться незамеченными с установленными методами.

Есть много технологий визуализации в настоящее время изучается на предмет их возможного полезности в качестве интраоперационных систем визуализации. К ним относятся бета- и γ-излучения , излучающий зонды 4, оптическую флуоресценцию 5, спектроскопии комбинационного рассеяния света 6 >, 7, и Черенкова люминесценции 8, 9. На сегодняшний день, однако, ни один из них не укоренились в качестве стандартных клинических инструментов. Оптическая флуоресцентных изображений до сих пор оказались наиболее перспективным из этих методов, и, следовательно, является наиболее изученным. В то время как уже было показано, что является ценным инструментом для многих приложений, это не без его ограничений. В самом деле, его основным недостатком является фоновой флуоресценции генерируется по своей сути autofluorescent биологической ткани. Этот сигнал фона autofluorescent является продуктом возбуждения окружающих тканей, в дополнение к флуорофора, внешним источником света, необходимого для генерации флуоресцентного сигнала. С практической точки зрения, это аутофлуоресценция потенциально может привести к низким отношением сигнал-шум коэффициентов, которые могут ограничить полезность этой технологии в операционной комнате.

ГлавныйПреимущество хемилюминесцентного визуализации над флуоресцентных изображений является то, что никакого света возбуждения не требуется. В результате, нет никакого фона аутофлуоресценция. В визуализации хемилюминесценции, энергия возбуждения генерируется вместо химически. Этот процесс не приводит к непреднамеренному фоновый сигнал, и, следовательно, может привести к более высоким соотношением сигнал-шум. Это в конечном счете может привести к более точной и точного обнаружения хирургического края. Несколько удивительно, полезность такого подхода в качестве интраоперационной метода визуализации остается неисследованным 10. В самом деле, ближайший пример для этого метода является окисление люминола по миелопероксидазы у мышей 11, 12, 13. Поэтому Хемилюминесцентный биомедицинской визуализации является довольно неизученной областью исследований, которые могли бы предложить следующие преимущества: (1) минимальное аутофлуоресценция что приводит к низкой фонового сигнала с приветGher сигнала к шуму; (2) перестраиваемые длины волн хемилюминесцентные выбросов в диапазоне от видимого до ближнего инфракрасного диапазона; и (3) модифицируемыми хемилюминесцентные комплексы , которые, в сочетании с компоновщика технологий и целевых биомолекул , которые уже существуют, предоставляют доступ к целым библиотекам целевых молекулярных зондов 14 изображений.

Это исследование проверка и подтверждение принципа действия иллюстрирует потенциальную полезность хемилюминесцентной визуализации в биомедицинской установке с использованием рутений на основе изображений агента. Хемилюминесцентный свойства этого соединения хорошо изучены, с исследованиями , начиная с середины 1960-х годов 15. После химической активации, агент производит свет на длине волны 600 нм около 16, который хорошо подходит для целей медицинской визуализации. Энергия активации обеспечивается окислительно - восстановительной реакции , которая приводит в возбужденное состояние-который имеет срок службы 650 нс в воде 17 -follпричитающиеся генерации фотонов при релаксации этого возбужденного состояния. Благодаря использованию специально разработанного дистанционного небулайзер, мы смогли обнаружить соединение , как экс виво и ин виво. Результаты первых экспериментов являются весьма перспективными, предполагая дальнейшее исследование этой технологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике: Все эксперименты на животных в естественных условиях , описанных были выполнены в соответствии с утвержденным протоколом и в соответствии с этическими принципами в Memorial Sloan Kettering Cancer Center (ММС) Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).

1. Построение распыляющего устройства

  1. Приложить дерево часть А (12,5 х 2,5 х 1,8 см 3) вертикально в центре части В (12,7 х 10,7 х 1,8 см 3) с помощью двух винтов (4 х 25 мм 2). Приложить дерево часть C (11 × 2,5 × 1,8 см 3) до середины , часть А (12,5 х 2,5 х 1,8 см 3) , используя один винт, таким образом, что часть С (11 х 2,5 х 1,8 см 3) по- прежнему могут быть перемещены. Смотри рисунок 1.
  2. Просверлите два отверстия через нижний кончик спускового крючка спрей бутылку пластиковую 3 унции мини-распылитель (D) и нажать стальной стержень из нержавеющей стали (10 см "стали 1/16) (Е) с помощью, чтобы сформировать две петли, по одному на каждой сторона триггера. Заверните нижнюю часть пульверизатор с клейкой лентой (F), чтобы предотвратить кабельные стяжки от соскальзывания. Присоединить распылитель к деревянной части С (11 х 2,5 х 1,8 см 3) с помощью двух пластиковых стяжек (28 см) (G).
  3. Отрежьте 011 серводвигателя (I) и подключите его с рыхлыми кабелями управления сервоприводом (H). Затем прикрепите серводвигателя к верхней части деревянной части А (12,5 х 2,5 х 1,8 см 3) с помощью клейкой ленты.
  4. Приложите карандаш (J) к рычагу серводвигателя, используя скрепку (K). Плотно соединить крайние части карандаша петель стальной стержень с использованием пластиковых покрыты перекрученные провода (L) и закрепите концы на карандаш с клейкой лентой.
  5. Отрезанные магнитный разъем кабеля блок управления серводвигателя (M) и приклеить ее к диктору кабель (N). Затем лента блок серво управления двигателем с деревянной части В (12,7 х 10,7 х 1,8 см 3). Вырезать w1 кабель с магнитными соединителями пополам и приложите одну часть к свободному концу меди сКабель акустическая (1 м). Подключите (магнитный) i2 тумблер и P1 мощности к имеющейся w1 кабеля и 9В батареи.

2. Чувствительность Определение метода

  1. В 1,5 мл микроцентрифужных трубки, готовят растворы [Ru (BPY) 3] Cl 2 в обратноосмотической воде (100 мкл) в количестве 260 мкг (347 нмоль), 52 мкг (69 нмоль), 26 мкг (34 нмоль) , 5 мкг (6,9 нмоль), 3 мкг (3,5 нмоль), 520 нг (694 пмоль), 260 нг (347 пмоль), 52 нг (69 пмоль), 26 нг (34 пмоль), 5 нг (6,9 пмоль), и 3 нг (3,5 пмоль).
  2. Смешайте 100 мкл каждого [Ru (BPY) 3] Cl 2 , раствор с 100 мкл водного раствора нитрата церия аммония ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) в воде (25 мМ) на предметное стекло микроскопа.
  3. Настройка приобретения у читателя биолюминесценции путем инициализации программного обеспечения визуализации.
    1. Войти в профиле пользователя и искать АквиПанель управления ложение. Нажмите на кнопку "Initialize" и ждать, пока прибор не будет готов.
    2. Посмотрите на "изображений Mode" и убедитесь, что "люминесцентный" и "Фотография" проверяются и что "Fluorescent" снят.
    3. Изменение "Время экспозиции" настройки для "люминесцентного" до 20 с. Установите остальные настройки "люминесцентного" следующим образом: "Биннинг": Средняя; "F / стоп": 1; и "эмиссионный фильтр": Open.
      Примечание: Время экспозиции может потребоваться быть адаптирована в соответствии с приборами и экспериментальной установке, используемой, если она отличается от представленной настройки.
    4. Для "Photograph" используйте следующие настройки: «Время выдержки»: Авто; "Биннинг": Средняя; и "F / стоп": 8. Отрегулируйте "Subject Высота" в соответствии с изображениями target.Look для выпадающего меню "поле зрения". Первоначальная настройка "С" Изменение к "B" (14 см расстояние между CAmera и стадия образца).
  4. Настройка небулайзер путем размещения микроскопический слайд на листе черной бумаги строительства на полу камеры формирования изображений , чтобы защитить его от окисляющего агента. Смешайте 100 μLdroplet из [Ru (BPY) 3] Cl 2 -решением с 100 мкл водного раствора (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Обратите внимание на перекрестие зеленый ящик.
    1. Поместите объект изображения на черной плотной бумаги, таким образом, что сфера интересов находится в центре зеленого светового короба перекрестие отображается на стадии образца. Подготовьте ингалятор, отсоединив пластиковую бутылку спрей от деревянной подставке. Наполните раствор триэтиламина (1: 3 в смеси вода / этанол) в пластиковый резервуар и прикрепить ее к деревянной подставке.
    2. Поместите распылитель внутри читателя биолюминесценции и убедитесь, что шнур питания отключен от небулайзера шнура. Убедитесь в том, что выключатель питаниявключен, тумблер выключен, а красный светодиод горит Поместите распылитель так, что поток распыления направлен в сторону области, представляющей интерес по этому вопросу формирования изображения, при этом сводя к минимуму препятствие вид с камеры на объект съемки изображения с помощью головки распылителя.
    3. Поместите маленькие, черные кусочки цветной бумаги над любым потенциальным горячих точек (например, белые пятна на микроскопических слайдах или местах инъекций) , чтобы оградить их от брызг. Место по крайней мере, 40 см небулайзера кабель дистанционного управления внутри камеры формирования изображения, таким образом, что он не мешает с предметом визуализации, распылителем или магнитного дверного замка. Закройте дверцу системы формирования изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: перекрестие изменится размер основанный на "поле зрения" настройки в "живой образ"; убедитесь, что этот параметр установлен на "B".
  5. Приобретать изображение, инициируя последовательность изображений. Нажмите кнопку "Приобретать" в "Панель управления Acquisition». На первом sequ изображенияENCE, включить автосохранение при желании (рекомендуется) и выбрать папку данных. Не обращайте внимания на "Edit" визуализации этикетки диалог до конца последовательности.
    Примечание: Программное обеспечение управления отображает действия прибора шаг за шагом в режиме реального времени. После подготовки измерения и перемещения образца в стадию нужное положение, он открывает затвор камеры и подсчитывает измерения времени. Открытие затвора также может быть услышан звук щелчка, порожденного машиной.
  6. При открывании затвора, распылить три пачки раствора триэтиламина (1: 3 в воде / этаноле, 0,24 ± 0,04 мл на спрей пакетной передачи данных) путем переключения тумблера три раза, чтобы сгенерировать хемилюминесценции.
    Примечание: Этап образца будет двигаться во время измерения. Оставьте достаточно (минимум 40 см) кабель внутри прибора, чтобы позволить этому. Убедитесь, что раствор для распыления с помощью распылителя может быть стремилось по восходящей трубы и что нет пузырьков воздуха в трубе. Есть несколько запасных BATTERIEs для ингалятора готового в случае необходимости.

3. В визуализации in vivo после внутривенной инъекции Системной

  1. В 1,5 мл пробирку микроцентрифужных, готовят 100 мкл фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) , содержащего от 8 до 33 нмоль [Ru (BPY) 3] Cl 2. Готовят водный раствор (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 в воде (25 мМ) , в то же время.
  2. Внутривенно вводят по 100 мкл [Ru (BPY) 3] Cl 2 в хвостовую вену здоровых мышей (п = 5).
  3. Эвтаназии мышей через 10 минут после инъекции через СО 2 удушья.
    1. Снимите кожу с Y-среза от туловища, а затем удалить реберной дуги в U-образную форму, чтобы обнажить сердце и легкие. Заливать мышей резанием выпускное отверстие в правом предсердии и инъекционного 20 мл PBS через 24 иглы калибра в левый желудочек 18. Аккуратно вырежьте через животкожу и обнажить почек и печени. Разрезанные продольно через органы, чтобы создать видимый срез.
  4. Настройка приобретения , как описано в пунктах 2,3-2,6, со следующими изменениями.
    1. После тщательной промывки небулайзера пластиковый резервуар, залейте его раствором (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 в воде (25 мМ) вместо триэтиламина.
      Примечание: Важно тщательно промыть небулайзер сопло после каждого использования, так как кристаллизацию (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 может разрушить форсунку после нескольких применений.
  5. Используйте целого животного или органа образцы для работы с изображениями.
    1. Для всей брюшной полости изображения, поместите тушку мыши с открытым животом перед камерой и головой, указывая на задней панели прибора. Сосредоточьте орган для включения в образ (например, печень или почки) в зеленой светлой коробки перекрестия.
    2. Fили индивидуальные изображения органов и количественное определение, удалить мышь из инструмента визуализации и пин-код его вниз. Начиная с уже открыли полости тела, акцизные внутренние органы (например, почек, печени, легких, мышц, селезенка, головной мозг, и сердце). Разрезать задней кожи ног акцизным мышечной ткани. Осторожно откройте череп с скальпелем иссечь мозг.
      1. Если орган интерес печень, почки или селезенка, вырезаны все органы в половине продольно, поместите каждый орган на чашку Петри или кусок черного строительной бумаги.
    3. Выполните процедуру, описанную в пунктах 2,3-2,6 установить относительную эмиссию хемилюминесцентной трассера для отдельных органов.

4. В Vivo изображений лимфоузлов

  1. Готовят 10 мкл раствора PBS , содержащего 80 нмоль [Ru (бипиридин) 3] Cl 2. Готовят водный раствор (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 в промтер (25 мМ), в то же время.
  2. Вводят 10 мкл раствора подкожно в заднюю лапу здоровых мышей (п = 5). В качестве отрицательного контроля, вводят контралатеральной лапу с 10 мкл чистого PBS. Жертвоприношение мышей с помощью СО 2 удушья через 15 мин после инъекции. Удалить кожу на обеих задних ног, чтобы выставить лимфатические каналы до подколенных лимфатических узлов.
  3. Настройка приобретения, как описано в шаге 3.4.
  4. Удалить подколенных лимфатических узлов с обеих задних ног, разрезать их пополам, и распылить их с окислителем на чашку Петри, как описано ранее (этап 3.5.3), с целью количественной оценки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Система небулайзер описано в разделе 1 протокола могут быть изготовлены из легко доступных материалов по низкой цене. Он предназначен , чтобы быть врезке для дистанционного запускаемых распыления восстанавливающего / окислителем внутри биолюминесцентном читателя (рисунок 1). Наша конструкция позволяет для безопасной эксплуатации распылителя в пределах читателя биолюминесценции на расстоянии 14 см от объектива. Не наблюдалось запотевание или размывание объектива во время операции. Мы выбрали коммерчески доступный хемилюминесцентного агента [Ru (BPY) 3] Cl 2 , для развития нашего метода , основанного на его низкой цены, стабильность в водном растворе, хорошо описанного поведения окислительно - восстановительного и хемилюминесцентные свойств (рисунок 2) 19. Минимальный детектируемый сигнал может быть определен , как описано в разделе 2 протокола путем окисления одной капли [Ru (бипиридин) 3] Cl 2 (100 мкл, 6,9 pmol- 347 нмоль в H 2 O) с (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 мкл, 25 мМ) на предметное стекло микроскопа. Затем, с помощью распылителя и распылять на раствор триэтиламина (1: 3 в воде / этаноле), хемилюминесцентный сигнал тревоги. В нашем случае, минимальный регистрируемый сигнал был определен как 6,9 пмоль / см 2 (рисунок 3). Вполне возможно, однако, что оптимизированные условия реакции, камеры, чувствительность времени срабатывания затвора, объемы и концентрации реагентов могут привести к еще более низких порогов обнаружения. Эти условия реакции могут быть также использованы для изучения и тестирования на хемилюминесценции любой данной комбинации металлических комплексов, окислителей и восстановителей.

Были использованы Двигаясь к опытам в естественных условиях в разделах протокола 3 и 4, обнаженные женские (беспородных) мышей 5-6 недель старых и NU / J мышей - самцов в возрасте 6-8 недель. Для внутривенных инъекций, составляет от8-33 нмоль [Ru (бипиридин) 3] Cl 2 в 100 мкл PBS на мышь (n = 5) были выбраны. Животных забивали 10 мин после инъекции, и брюшную полость подвергается. Мышей помещали в биолюминесцентном читателя с распылителем , указывающую на интересующую ткань (рис 4). Для получения изображений с внутривенно инъецировали [Ru (BPY) 3] Cl 2, хемилюминесцентный сигнал был обнаружен преимущественно в почках, сильно предполагая почек ликвидации гидрофильного малой молекулы (рисунок 5). Отношение сигнал-шум отношения для мышей , которым инъецировали [Ru (BPY) 3] Cl 2 в сравнении с PBS были 27/1 для почек и 21/1 для печени. Для визуализации лимфатических узлов, 80 нмоль [Ru (бипиридин) 3] Cl 2 в 10 мкл PBS вводили подкожно в заднюю подушечку лапы мышей (п = 5). Мыши были умерщвлены через 15 мин после инъекции с помощью СО 2 удушья. Кожа, покрывающая как внутренние задние ноги ваы удалены, чтобы подвергать мышцы, лимфатические узлы и лимфатические сосуды. Последующее хемилюминесцентный визуализация подколенных лимфатических узлов привело к наблюдению , что лимфатические узлы , содержащие [Ru (бипиридин) 3] 2+ показывают 10 ± 4,3 раза выше , чем необработанные сиянием них (167000 р / (с · см 2 × ср) и 17000 р / (s × см 2 × стер); P <0,028) (рисунок 6).

Рисунок 1
Рисунок 1: Фотография небулайзер. Используемые части: Деревянные Структурные компоненты (A, B, C), распылитель (D), согнуты стальной стержень (E), клейкая лента (F), пластиковые кабельные стяжки (G), 011 разъем серво часть (H), серводвигатель (I), карандаш ( J) удерживается согнуты скрепкой (K), с пластиковым покрытием проволочную перевязку (L) разъем w1 провод (M) и акустический кабель (N), что приводит к батарее. Эта цифра основана на исследовании первоначально опубликовано в ссылкеразностную 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Свойства [Ru (BPY) 3] 2+. Структура (А) и возбуждения и спектры излучения (В) [Ru (бипиридин) 3] 2+. Окисления / восстановления на основе хемилюминесцентного каталитического цикла (С). Эта цифра основана на исследованиях , первоначально опубликованной в ссылке 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 3: Обнаружение Порог [Ru (BPY) 3] 2+. Типичные интенсивности сигналов при различных концентрациях [Ru (бипиридин) 3] 2+ на предметное стекло микроскопа (A). Количественное сигнал обработки изображений с порога обнаружения (красная пунктирная линия) и фона (черный пунктир) (B). Эта цифра основана на исследованиях , первоначально опубликованной в ссылке 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Хемилюминесценция изображений. Схематическое изображение мыши и небулайзер , расположенной в считывателе биолюминесценции г>) и схематическое изображение (В) распылител опрыскивание мыши. Эта цифра основана на исследованиях , первоначально опубликованной в ссылке 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Обнаружение [Ru (BPY) 3] 2+ после системного введения. Белый свет, хемилюминесценции и наложение (слева направо). Изображения полости тела мыши, посеянный с 33 нмоль [Ru (BPY) 3] 2+ и опрыскивают (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Белые стрелка указывает в направлении правой почки. Эта цифра основана на исследованиях , первоначально опубликованной в ссылке 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Обнаружение [Ru (BPY) 3] 2+ после подкожных администрации. Подколенный лимфатический узел формирования изображения , показывая белый свет, хемилюминесценции и композитных изображений для мышей , которым инъецировали [Ru (бипиридин) 3] 2+ (вверху) и PBS (нижняя) в задних конечностей; 80 нмоль в 10 мкл PBS, 15 мин отображены после инъекции (A). Белый свет и композитные изображения для [Ru (BPY) 3] 2+ (вверху) и PBS (внизу) -обработанной вырезают подколенные лимфатические узлы (B). Количественное хемилюминесцентные сигналов для PBS и [Ru (BPY) 3] 2+ -обработанной лимфатических узлов (C) .The данные представляют собой среднее ± SD. Эта цифра основана на исследовании первоначальноопубликовано inreference 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представили технологию, которая способна оптически очерчивания ткани с помощью излучения фотонов, созданных хемилюминесцентного репортером. В отличие от других, более установлено, технологии 4, 5, 6, 7, 8, 9, эта система Хемилюминесцентный репортер использует тестовое формирования изображения, которое нерадиоактивных и облегчает обнаружение на очень высоких уровнях чувствительности. Возможно , что еще более важно, ХЛ визуализация не требует источника падающего света (как в оптическом флуоресцентных изображений) 20, черта , которая сводит к минимуму аутофлюоресценция и резко сокращает фоновые сигналы.

Рутений репортер [Ru (BPY) 3] Cl 2 имеет в естественных условиях токсичность терпимым для целей визуализации (INTraperitoneal ЛД мышь 50: 20 мг / кг) 21, растворяется в воде (до 8 мм), и является стабильным в крови. Физико - химические свойства металлического комплекса являются хорошо охарактеризованных и уже были изучены для фотодинамической терапии рака 22, 23. Окислитель (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 Сообщалось , что имеют очень низкую токсичность (оральное LD крысиный 50: 1600-3200 мг / кг) 24 и растворим в воде при концентрациях до 2,57 м при 20 25 ° C. В этой статье, визуальная демонстрация, а также на основе текста руководства для строительства дистанционно управляемых распыляющего устройства представлены. Кроме того, мы обеспечиваем надежные протоколы для выполнения визуализации хемилюминесценции в стандартном устройстве биолюминесценции визуализации. Проиллюстрируем использование [Ru (BPY) 3] Cl 2 для visualizatiна тканей после того, как внутривенных и подкожных инъекций у мышей.

Тем не менее, как и с любой другой зарождающейся технологии визуализации, есть место для совершенствования наших протоколов. Мы считаем, что это доказательство правильности принципа исследования можно было бы стимулировать развитие нескольких приложений ХЛ для живых систем. Следующие пункты могут быть решены для дальнейшего совершенствования технологии и расширения сферы его применения.

Меньшее второе поколение дистанционно запускаемых распылительных устройств позволило бы образец, чтобы быть ближе к камере, следовательно, улучшение пространственного разрешения. Улучшенное оптическое оборудование может дополнительно улучшить пределы обнаружения метода. Протокол также может быть распространен на получение изображений живых животных. Точное управление моментом (по току и напряжению) позволило бы более точный контроль объема реагента выпущен с каждым распылителем. Важно, чтобы держать ингалятор в хорошем состоянии. Не промывая небулайзер может уничтожить nozzле. Свежий аккумулятор имеет решающее значение для надлежащего исполнения ингалятора. Тем не менее, все материалы, используемые для небулайзера недороги и легко доступны коммерчески. После установленных синтетических протоколов, то [Ru (BPY) 3] 2+ может быть легко модифицирована с различными линкерами, в том числе малеинимидов 26, аминов 27 и НСЗ эфиров 28, 29. Это позволило бы биоконъюгации для малых молекул, пептидов, или антитела, и, таким образом , способствовать конкретным молекулярным нацеливание 30, 31, 32, 33. В конечном счете, направленной доставки зонд может позволить хирургам идентифицировать мелкие повреждения и точно разграничить хирургического края в операционной комнате с очень высокой специфичностью. Кроме того , инкапсуляция хорошо растворимого в воде [Ru (BPY) 3] 2+ в наноматериалах-как целевые и нецелевой-может также позволить для визуализации поражений во время их удалены хирургическим путем 34, 35, 36. И, наконец, изменение координационной сферы комплекса репортер металла и / или изменение переходный металл сам центр представляют собой привлекательные маршруты для модуляции и тонкой настройки длины волн излучения в видимой и ближней ИК диапазонах 37, 38.

Интраоперационное хемилюминесценции потребность в обработке изображений хемилюминесцентный репортер и, в нашем случае, окислитель, который может быть использован только в пределах их токсичности и растворимости. Тканевые мембраны могут представлять собой барьер для диффузии окислителя в ткани, и, следовательно, генерацию сигнала. Так как хемилюминесцентный репортер только генерировать один фотон за один цикл, сгенерированный сигнал достаточно слабый.Таким образом, окружающий свет в операционной комнате должны быть предотвращены от входа в камеру в то время как метод используется. Это может оказать ICI особенно интересным для развития лапароскопических приложений, где окружающий свет естественным образом исключены.

Мы надеемся, что этот метод может превратиться в ценный инструмент для хирургов в операционной комнате. Отсутствие радиоактивности является благоприятным для пациента и операционной команды, так и делает меньше меры безопасности необходимо, потенциально рендеринга эту технику в более привлекательной альтернативой.

Плавная работа небулайзер и его позиционирование играют решающую роль для получения хороших результатов. Субоптимальный углы и области могут внести свой вклад в сигнал дисперсии. Кабель управления должен быть пропущена через дверь с осторожностью, и достаточно кабель должен оставаться внутри читателя биолюминесценции так, чтобы она не стесненными или оторван.

В конечном счете, chemiluнесценции визуализация является чрезвычайно привлекательным новый подход к молекулярной визуализации. Он основан на фундаменте устоявшихся химии, использует недорогие и легко доступные материалы, и сторонится как излучение и источники света возбуждения. В результате, мы оба надеемся и уверены, что в будущем, ХЛ визуализация может оказать глубокое воздействие на хирургическое лечение заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics