Een nieuwe techniek voor het genereren en Observing Chemiluminescence in een biologische instelling

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

In de afgelopen decennia hebben beeldtechnologieën van de manier waarop artsen diagnosticeren en monitoren van de ziekte van een revolutie. Deze beeldvormende technieken zijn echter grotendeels beperkt tot gehele lichaam systemen, zoals positron emissie tomografie (PET), enkelvoudige foton-emissie-computertomografie (SPECT), computertomografie (CT) en magnetische resonantie imaging (MRI) is. Bijzondere aandacht is besteed aan kanker, en technologische doorbraken imaging zijn sterk verbeterd de manier waarop deze ziekte wordt gediagnosticeerd en behandeld. Ondanks deze vooruitgang, er is een plek waar deze beeldvormende technieken gewoon niet passen: de operatiekamer. Terwijl het gehele lichaam technieken helpen bij chirurgische planning, ze meestal onvoldoende ruimtelijke resolutie hoog genoeg om artsen te helpen bepalen realtime of alle tumorweefsel is verwijderd of resttumorweefsel verborgen blijft aan de snijvlakken 1. Ervoor zorgen dat er geen infiltratievetumor marges zijn achtergelaten is een van de belangrijkste chirurgische doelen, en chirurgen moeten een strakke-koord tussen strenge en voorzichtige weefsel resectie te lopen. Als er te veel wordt verwijderd, worden ongewenste bijwerkingen voor de patiënt vergroot; als er te weinig wordt verwijderd, worden recidief steeg met 2, 3. Daarom is het cruciaal om nauwkeurige tumorgrenzen bakenen, en wij geloven dat chemiluminescente intra-operatieve beeldvorming kan bijdragen tot de nauwkeurigheid van de identificatie van tumor marges te verbeteren door te helpen chirurgen kwaadaardig weefsel dat anders onopgemerkt bestaande technieken kunnen blijven visualiseren.

Er zijn vele imaging technologieën momenteel onderzocht voor hun mogelijke bruikbaarheid als intra-operatieve imaging systemen. Deze omvatten β- en γ-straling-emitterende probes 4, 5 optische fluorescentie, Raman spectroscopie 6 >, 7 en Cherenkov luminescentie 8, 9. Tot dusver is geen van deze zijn vestigen standaard klinische instrumenten. Optische fluorescentiebeeldvorming dusver bewezen als de meest veelbelovende van deze technieken en is dus het meest onderzocht. Hoewel reeds aangetoond dat het een waardevol instrument voor vele toepassingen, is niet zonder beperkingen. Sterker nog, zijn belangrijkste nadeel is de achtergrond fluorescentie gegenereerd door inherent Autofluorescente biologisch weefsel. Deze achtergrond autofluorescente signaal is een product van de excitatie van het omringende weefsel, naast de fluorofoor door de externe lichtbron nodig voor het genereren van een fluorescerend signaal. Vanuit praktisch oogpunt kan deze autofluorescentie mogelijk leiden tot lage signaal-ruisverhoudingen, die het nut van deze technologie in de operatiekamer kan beperken.

de voornaamstevoordeel van chemiluminescentie imaging via fluorescentiebeeldvorming is dat er geen excitatie licht nodig is. Daardoor is er geen achtergrond autofluorescentie. In chemiluminescentie beeldvorming wordt de excitatie-energie plaats chemisch gegenereerd. Deze werkwijze geeft geen ongewenste achtergrondsignaal en kan daarom leiden tot hogere signaal-ruisverhoudingen. Dit kan uiteindelijk leiden tot nauwkeuriger en nauwkeurige detectie van snijvlakken. Enigszins verrassend is het nut van deze aanpak als een intra-operatieve beeldvormende techniek onontgonnen 10 gebleven. Inderdaad, het dichtst voorbeeld van deze techniek is de oxidatie van luminol door myeloperoxidase in muizen 11, 12, 13. Chemiluminescente biomedische beeldvorming is daarmee tamelijk onontgonnen onderzoeksgebied dat de volgende voordelen kunnen bieden: (1) minimale autofluorescentie resulteert in een lage achtergrondsignaal met higher signal-to-noise ratio's; (2) afstembare golflengten van chemiluminescente emissie variëren van het zichtbare naar het nabije-infrarood; en (3) functionalizable chemoluminescente complexen die in combinatie met linker technologieën en gerichte biomoleculen reeds bestaande, toegang tot volledige bibliotheken van gerichte moleculaire beeldvorming sondes 14.

Deze proof-of-principle studie toont het potentieel nut van chemiluminescent beeldvorming in de biomedische omgeving met behulp van een ruthenium-based imaging middel. De chemiluminescente eigenschappen van deze verbinding zijn goed bestudeerd, met onderzoeken die teruggaat tot het midden van de jaren 1960 15. Bij chemische activatie agens produceert het licht bij ongeveer 600 nm 16, die goed geschikt is voor medische beeldvorming doeleinden. De activeringsenergie wordt geleverd door een redoxreactie die leidt tot een aangeslagen toestand-die een levensduur van 650 ns in water 17 heeft -follverschuldigd door het genereren van fotonen op relaxatie van deze aangeslagen toestand. Door het gebruik van een speciaal ontworpen remote vernevelaar, waren we in staat om de verbinding zowel ex vivo en in vivo te detecteren. De resultaten van initiële experimenten zijn veelbelovend, suggereert verder onderzoek van deze technologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek statement: Alle in vivo dierexperimenten beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurd protocol en in het kader van de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Bouw van een vernevelen Device

  1. Bevestig hout deel A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) rechtop in het midden van deel B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) met twee schroeven (4 x 25 mm 2). Attach hout deel C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) naar het midden van deel A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) via een schroef, zodanig dat een deel C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) nog verschuifbaar. Zie figuur 1.
  2. Boor twee gaten door de onderste punt van de trekker verstuiver van een kunststof 3 oz mini spuit (D) en druk op een roestvrij stalen staaf (10 cm 1/16 "steel) (E) tot twee lussen, een aan elke vorm zijde van de trekker. Wikkel het onderste deel van de verstuiver met tape (F) aan de kabelbinders afglijden te voorkomen. Bevestig de spray fles om hout deel C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) met behulp van de twee plastic kabelbinders (28 cm) (G).
  3. Snijd de 011 servomotor (I) en sluit deze met de losse kabels van de servo controle (H). Maak dan de servomotor naar de top van hout deel A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) met behulp van duct tape.
  4. Bevestig een potlood (J) aan de servomotor hendel met de paperclip (K). Nauw sluit de buitenste delen van het potlood om de stalen staaf lussen met behulp van plastic bedekt twist draden (L) en zet de uiteinden van het potlood met duct tape.
  5. Snijd de servomotor besturing magnetische connector (M) en sluit hem aan de luidsprekerkabel (N). Dan tape de servomotor controle-eenheid om hout deel B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Snijd een w1 kabel met magnetische connectors doormidden en bevestig het ene deel naar het losse uiteinde van de koperen sPeaker kabel (1 m). Sluit de (magnetische) i2 tuimelschakelaar en p1 macht om de beschikbare w1-kabel en een 9V batterij.

2. Gevoeligheid Bepaling van de methode

  1. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, worden de oplossingen van [Ru (bpy) 3] Cl 2 in omgekeerde osmose water (100 ui) in hoeveelheden van 260 pg (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 ug (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 ug (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6.9 pmol), en 3 ng (3,5 pmol).
  2. Meng 100 pi van elk [Ru (bpy) 3] Cl2-oplossing met 100 ul van een waterige oplossing van ammonium cerium nitraat ((NH4) 2 Ce (NO 3) 6) in water (25 mM) op een microscoopglaasje.
  3. Stel de acquisitie in de bioluminescentie lezer door het initialiseren van de imaging software.
    1. Meld u aan bij het gebruikersprofiel en kijk voor de acquiling bedieningspaneel. Klik op "initialiseren" en wacht tot het apparaat klaar is.
    2. Kijk voor "Imaging Mode" en zorg ervoor dat "Lichtende" en "Foto" worden gecontroleerd en dat "Fluorescent" is aangevinkt.
    3. Change "Exposure Time" instelling voor "Lichtend" tot 20 s. Stel de overige instellingen voor "Lichtende" als volgt: "Binning": Medium; "F / stop": 1; en "Emission Filter": Open.
      NB: De belichtingstijden mogelijk moeten worden aangepast aan de instrumentatie en experimentele setting gebruikt, indien verschillend van de gepresenteerde setup.
    4. Voor "Foto", gebruikt u de volgende instellingen: "Exposure Time": Auto; "Binning": Medium; en "F / stop": 8. Pas de "Subject Hoogte", aldus beeldvorming target.Look voor de "Field of View" dropdown menu. De oorspronkelijke instelling is "C." Veranderen in "B" (14 cm afstand tussen de cAmera en sample fase).
  4. Stel de vernevelaar door een microscopisch preparaat op een vel zwart papier constructie op de bodem van de imaging kamer te beschermen tegen het oxidatiemiddel. Meng 100 μLdroplet van [Ru (bpy) 3] Cl 2-oplossing met 100 ul van een waterige oplossing van (NH4) 2 Ce (NO 3) 6. Neem de groene doos draadkruis.
    1. Plaats de beeldvorming onderworpen aan de zwarte bouw document, zodat het interessegebied is in het midden van de groene lichtbak draadkruis op het monstertafel. Bereid de vernevelaar door het losmaken van de plastic spuitfles van de houten steun. Vul een oplossing van triethylamine (1: 3 water / ethanol) in de plastic reservoir en sluit deze de houten steun.
    2. Plaats de vernevelaar in de bioluminescentie lezer en zorg ervoor dat het netsnoer is losgekoppeld van de vernevelaar snoer. Zorg ervoor dat de stroomschakelaaris op, de schakelaar uit is, en de rode LED brandt Plaats de vernevelaar zodanig dat de spray stroom gericht is naar het gebied van de rente op de beeldvorming onderwerp, terwijl het minimaliseren van het uitzicht obstructie van de camera naar de beeldvorming onderwerp door de sproeikop hoofd.
    3. Plaats de kleine, zwarte stukken van de bouw papier over eventuele hot spots (bv, witte vlekken op microscopische dia's of injectieplaatsen) om ze te beschermen tegen spray. Plaats ten minste 40 cm van de vernevelaar afstandsbedieningskabel in de beeldvorming kamer, zodat het niet interfereert met de beeldvorming onderworpen, de vernevelaar of de magnetische deurgrendel. Sluit het afbeeldingssysteem deur.
      LET OP: De crosshair de grootte veranderen op basis van het "Field of View" instelling in "Living Image;" Zorg ervoor dat deze is ingesteld op "B".
  5. Verwerven van een beeld door de inleiding van de imaging volgorde. Klik op 'Acquire "in het" Acquisition Control Panel. " Op de eerste imaging lovertlingen, in te schakelen automatisch opslaan indien gewenst (aanbevolen) en kies een data-map. Negeer de "Edit Imaging Labels" dialoog tot het einde van de reeks.
    NB: De besturingssoftware geeft de acties van het instrument stap-voor-stap in real time. Na bereiding van de meting en het verplaatsen van de monstertafel op de juiste positie, opent de sluiter van de camera en telt de meettijd. De sluiter opening kan ook worden gehoord door een klikgeluid gegenereerd door de machine.
  6. Als de sluiter opent, spuit drie uitbarstingen van een oplossing van triethylamine (1: 3 water / ethanol, 0,24 ± 0,04 ml per spuit burst) door het schakelen van de schakelaar driemaal chemiluminescentie genereren.
    NB: De sample fase zal bewegen tijdens de meting. Laat voldoende (minimaal 40 cm) kabel in het instrument om dit mogelijk te maken. Controleer of de oplossing te versproeien door de vernevelaar kan worden nagestreefd door de stijgbuis en dat er geen luchtbellen in de buis. Hebben verschillende reserve batteries de vernevelaar voor het geval dat nodig is.

3. In vivo beeldvorming Na Systemische injectie in de ader

  1. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, bereiden 100 ui met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing die tussen 8 en 33 nmol van [Ru (bpy) 3] Cl2. Bereid een waterige oplossing van (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) tegelijkertijd.
  2. Intraveneus 100 ui [Ru (bpy) 3] Cl 2 in de staartader van gezonde muizen (n = 5).
  3. Euthanaseren de muizen 10 minuten na de injectie via CO 2 stikken.
    1. Verwijder de huid met een Y-gesneden uit de romp en verwijder de ribbenboog in een U-vorm naar het hart en de longen bloot te leggen. Perfuseren de muizen door het snijden van een uitgang in het rechter atrium en het injecteren van 20 ml PBS door een 24 gauge naald in de linker ventrikel 18. Knip voorzichtig door de buikhuid en bloot de nieren en de lever. Snijd in de lengte door de organen om een ​​zichtbare cut te maken.
  4. Stel het verwerven zoals beschreven in stappen 2.3-2.6, met de volgende wijzigingen.
    1. Na grondig wassen van de vernevelaar kunststof reservoir, vullen met een oplossing van (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) in plaats van triethylamine.
      NB: Het is belangrijk om grondig te spoelen de vernevelaar mondstuk na elk gebruik, omdat het kristalliseren (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kan de spuitmond te vernietigen na een aantal toepassingen.
  5. Gebruik het gehele dier of orgaanmonsters voor beeldvorming.
    1. Voor de hele buik imaging, plaatst u de muis karkas met de open buik geconfronteerd met de camera en het hoofd wijzend naar de achterkant van het instrument. Centreer het orgel af te beelden (bv, lever of nier) in het groene lichtbak crosshair.
    2. Fof individuele orgel beeldvorming en kwantificatie, verwijder de muis van de beeldvorming instrument en speld het naar beneden. Uitgaande van de reeds geopende lichaamsholte te snijden de inwendige organen (bijvoorbeeld nier, lever, longen, spieren, milt, hersenen en hart). Snijd door de achterpoot huid om spierweefsel accijnzen. Open voorzichtig de schedel met een scalpel aan de hersenen te snijden.
      1. Indien het orgaan van belang is lever, nier en milt, snijd alle organen in de helft in de lengte, leg elk orgaan op een petrischaal of een stuk van zwarte bouw papier.
    3. Volg de procedure in stappen 2.3-2.6 om de relatieve emissie van de chemiluminescente tracer voor enige organen vast beschreven.

4. In vivo beeldvorming van de lymfeklieren

  1. Bereid 10 pi van een PBS-oplossing die 80 nmol [Ru (bpy) 3] Cl2. Bereid een waterige oplossing van (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) tegelijkertijd.
  2. Injecteer 10 pi van de oplossing subdermaal in de achterpoot van gezonde muizen (n = 5). Als negatieve controle, injecteer de contralaterale poot met 10 pi zuivere PBS. Offer de muizen via CO 2 stikken 15 minuten na de injectie. Verwijder het vel op beide achterpoten aan de lymfe kanalen bloot aan de popliteale lymfeknopen.
  3. Stel het verwerven zoals beschreven in stap 3.4.
  4. Verwijder de popliteale lymfeknopen uit beide achterpoten, halveer ze en te spuiten met oxidatiemiddel op een petrischaal, zoals eerder beschreven (stap 3.5.3), ten behoeve van kwantificering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De vernevelaar systeem in dienst Protocol 1 omschreven kan worden opgebouwd uit gemakkelijk verkrijgbare materialen tegen een lage kostprijs. Het is bedoeld om een inzet op afstand getriggerde sproeien van het reducerende / oxiderende stof in een bioluminescente reader (figuur 1). Ons ontwerp zorgt voor een veilig gebruik van de vernevelaar in de bioluminescentie lezer op 14 cm afstand van de lens. Geen beslaan of vervaging van de lens werd waargenomen tijdens de operatie. Wij selecteerden de handel verkrijgbare chemiluminescent agens [Ru (bpy) 3] Cl 2 voor de ontwikkeling van de methode op basis van zijn lage prijs, stabiliteit in waterige oplossing goed beschreven redoxgedrag en chemiluminescente eigenschappen (figuur 2) 19. De minimale detecteerbare signaal kan worden bepaald zoals beschreven in paragraaf 2 protocol door oxidatie van één druppel [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 pl, 6,9 pmol- 347 nmol in H 2 O) met (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 pl, 25 mM) op een microscoopglaasje. Dan, met de vernevelaar en opspuiten van een oplossing van triethylamine (1: 3 water / ethanol), het chemiluminescente signaal wordt geactiveerd. In ons geval werd de minimale detecteerbare signaal bepaald 6,9 pmol / cm 2 (figuur 3) zijn. Denkbaar is echter dat de reactie omstandigheden, camera gevoeligheden, sluitertijden, volumes geoptimaliseerd en reagens concentraties zou kunnen leiden tot nog lagere detectie drempels. Deze reactieomstandigheden kunnen ook worden gebruikt voor het onderzoeken en testen van de chemiluminescentie van elke bepaalde combinatie van metaalcomplexen, oxidatiemiddelen en reductiemiddelen.

Verhuizen naar de in vivo-experimenten in protocol secties 3 en 4, vrouwelijk naakt (outbred) muizen 5-6 weken oud en NU / J mannelijke muizen 6-8 weken oud werden gebruikt. Voor intraveneuze injecties, hoeveelheden8-33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 in 100 pi PBS per muis (n = 5) werden gekozen. De dieren werden opgeofferd 10 min na injectie, en de buikholte werd blootgesteld. De muizen werden in de bioluminescent lezer geplaatst met de vernevelaar richting van het weefsel van belang (figuur 4). Voor beeldvorming met intraveneus geïnjecteerd [Ru (bpy) 3] Cl 2, het chemiluminescente signaal werd voornamelijk gedetecteerd in de nieren, wat sterk suggereert renale eliminatie van het hydrofiele kleine molecuul (Figuur 5). Signaal-ruisverhouding voor muizen geïnjecteerd met [Ru (bpy) 3] Cl 2 versus PBS werden 27/1 voor de nieren en 21/1 voor de lever. Voor lymfeklieren imaging, 80 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 in 10 ul PBS werden subdermaal geïnjecteerd in de achterste voetzool van muizen (n = 5). Muizen werden opgeofferd 15 minuten na de injectie van CO 2 stikken. De huid die zowel de innerlijke achterpoten was verwijderd om de spier, lymfeknopen en lymfevaten bloot. Daaropvolgende chemiluminescente visualisatie van de popliteale lymfeknopen leidde tot de waarneming dat knopen die lymfe [Ru (bpy) 3] 2+ tonen een 10 ± 4,3-voudig hoger dan onbehandelde straling (167.000 p / (s x cm 2 × sr) en 17.000 p / (s x cm 2 x sr); P <0,028) (figuur 6).

Figuur 1
Figuur 1: Foto van de vernevelaar. Delen die worden gebruikt: Houten structuurdelen (A, B, C), spuitfles (D), gebogen stalen staaf (E), duct tape (F), plastic kabelbinders (G), 011 servo connector deel (H), servomotor (I), potlood ( J) in het bezit van gebogen paperclip (K), plastic beklede draad twistties (L) w1 kroonsteentje (M) en de luidsprekerkabel (N) die leidt tot de batterij. Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in reference 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Eigenschappen van [Ru (bpy) 3] 2+. Structuur (A) en excitatie- en emissiespectra (B) van [Ru (bpy) 3] 2+. De oxidatie / reductie-chemiluminescentie katalytische cyclus (C). Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in referentie 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 3: Detectie drempel van [Ru (bpy) 3] 2+. Representatieve signaal intensiteiten in verschillende concentraties [Ru (bpy) 3] 2+ op een microscoopglaasje (A). Imaging signaal kwantificering met detectiegrens (rode stippellijn) en achtergrond (zwarte stippellijn) (B). Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in referentie 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Imaging chemiluminescentie. Schematische tekening van een muis en een verstuiver gepositioneerd in de bioluminescentie lezer (A g>) en schematische tekening (B) van de vernevelaar spuiten op een muis. Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in referentie 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Detectie van [Ru (bpy) 3] 2+ na systemische toediening. Wit licht, chemiluminescentie, en overlay (van links naar rechts). Beelden van een muis lichaamsholte die werd geïnjecteerd met 33 nmol [Ru (bpy) 3] 2+ en bespoten met (NH4) 2 Ce (NO 3) 6. De witte pijl wijst naar de rechter nier. Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in referentie 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Detectie van [Ru (bpy) 3] 2+ na Subdermale Administration. Popliteale lymfeknoop beeldvorming geeft wit licht, chemiluminescentie en composite's van muizen geïnjecteerd met [Ru (bpy) 3] 2+ (boven) en PBS (onder) in de achterpoten; 80 nmol in 10 pi PBS, afgebeeld 15 min na injectie (A). Wit licht en samengestelde beelden van [Ru (bpy) 3] 2+ (boven) en PBS (onderste) behandeld uitgesneden popliteale lymfeknopen (B). Kwantificering van chemiluminescente signalen voor PBS en [Ru (bpy) 3] 2+ behandelde lymfklieren (C) .De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD. Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijkgepubliceerd inreference 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier hebben wij voorgesteld een technologie die in staat is optisch afbakenen weefsel via de emissie van fotonen door een chemiluminescente reporter is. In tegenstelling tot andere, meer gevestigde technologieën 4, 5, 6, 7, 8, 9, chemiluminescente reporter dit systeem gebruik van een beeldvormende sonde die niet-radioactieve en maakt detectie bij zeer hoge gevoeligheidsniveaus. Misschien nog belangrijker is, chemiluminescentie imaging niet een incident lichtbron (zoals in optische fluorescentie beeldvorming) 20, een eigenschap die autofluorescentie minimaliseert en drastisch vermindert achtergrondgeluiden signalen nodig.

Het ruthenium reporter [Ru (bpy) 3] Cl 2 heeft een in vivo toxiciteit aanvaardbaar voor de beeldvorming doeleinden (intraperitoneal muis LD 50: 20 mg / kg) 21, wateroplosbaar (tot 8 mM), en is stabiel in de bloedstroom. De fysicochemische eigenschappen van het metaalcomplex zijn goed gekarakteriseerd en zijn reeds onderzocht voor de fotodynamische therapie van kanker 22, 23. Het oxidatiemiddel (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 is beschreven dat zeer lage toxiciteit (oraal rat LD 50: 1600-3200 mg / kg) 24 en oplosbaar is in water bij concentraties tot 2,57 M in 20 ° C 25. In dit artikel, een visuele demonstratie en tekst gebaseerde richtlijnen voor de constructie van een op afstand bediende vernevelende inrichting worden gepresenteerd. Daarnaast bieden we robuuste protocollen voor het uitvoeren van chemiluminescentie beeldvorming in een standaard bioluminescentie imaging apparaat. We illustreren het gebruik van [Ru (bpy) 3] Cl 2 voor visualizatiop weefsels na zowel intraveneuze en onderhuidse injecties in muizen.

Zoals bij andere opkomende beeldvormingstechnologie is er ruimte voor verbetering van onze protocollen. We geloven dat deze proof-of-principle studie van de ontwikkeling van multiple chemiluminescentie toepassingen kunnen aansporen om levende systemen. De volgende punten zouden kunnen worden aangepakt om de technologie verder te verbeteren en het toepassingsgebied ervan uit te breiden.

Een kleinere tweede generatie van op afstand geactiveerd lakinstallaties zou het monster op dichter bij de camera dus verbetering van de ruimtelijke resolutie. Verbeterde optische apparatuur kunnen verdere verbetering van de detectielimieten van de methode. Het protocol kan ook worden uitgebreid tot levende dieren beeldvorming. Nauwkeurige regeling van het draaimoment (van stroom en spanning) een meer nauwkeurige regeling van de hoeveelheid reagens vrijgegeven bij elke spuit toe. Het is belangrijk om de vernevelaar goed onderhouden houden. Niet spoelen vernevelaar kan Nozz vernietigenle. Een nieuwe batterij is cruciaal voor de goede uitvoering van de vernevelaar. Echter, alle voor de vernevelaar materialen zijn goedkoop en gemakkelijk commercieel verkrijgbaar. Na gangbare synthetische protocollen, de [Ru (bpy) 3] 2+ complex kan gemakkelijk worden gemodificeerd met verschillende linkers, zoals maleïmiden 26, aminen 27 en NHS esters 28, 29. Dit zou bioconjugatie toelaten om kleine moleculen, peptiden of antilichamen, en aldus vergemakkelijkt specifieke moleculaire targeting 30, 31, 32, 33. Uiteindelijk kan gerichte afgifte probe chirurgen in staat om kleine laesies en nauwkeurig af te bakenen snijvlakken in de operatiekamer met een zeer hoge specificiteit. Ook het inkapselen van de zeer wateroplosbare [Ru (bpy) 3] 2+ in nanomaterialen, zowel gerichte en ongerichte-kan ook zorgen voor de visualisatie van laesies terwijl ze worden chirurgisch verwijderd 34, 35, 36. Tot slot, het wijzigen van de coördinatie bol van het metaal complex reporter en / of het wijzigen van het overgangsmetaal centrum zelf vertegenwoordigen aantrekkelijke routes naar de emissie golflengtes moduleren en fine-tunen in het zichtbare en NIR varieert 37, 38.

Intraoperatieve chemiluminescentie imaging heeft een chemiluminescente reporter en, in ons geval een oxidant die binnen de grenzen van hun toxiciteit en oplosbaarheid kan worden gebruikt. Weefselmembranen kan een barrière voor diffusie van het oxidatiemiddel in het weefsel vormen, en dus de signaalopwekking. Aangezien de chemiluminescente reporter enige genereert één foton per cyclus, het gegenereerde signaal nogal zwak.Het omgevingslicht in de operatiekamer zal dus moeten worden voorkomen dat het invoeren van de camera, terwijl de techniek in gebruik is. Dit kan ICI bijzonder interessant voor de ontwikkeling van laparoscopische toepassingen, waarbij omgevingslicht nature uitgesloten maken.

Wij hopen dat deze methode kan veranderen in een waardevol instrument voor chirurgen in de operatiekamer. Aangezien radioactiviteit gunstig voor de patiënt en operatieteam elkaar en maakt minder veiligheidsmaatregelen nodig, bezitten waardoor deze techniek in een aantrekkelijk alternatief.

De goede werking van de vernevelaar en de positionering spelen een cruciale rol voor het verkrijgen van goede resultaten. Suboptimale hoeken en gebieden kunnen bijdragen aan variantie signaleren. De stuurkabel moet door de deur worden met zorg en voldoende kabel binnenin de bioluminescentie lezer te blijven, zodat het niet krap of afgescheurd.

Uiteindelijk chemiluminescence beeldvorming is een zeer aantrekkelijke nieuwe benadering van moleculaire beeldvorming. Het is gebaseerd op een fundament van gerenommeerde chemie, maakt gebruik van goedkope en gemakkelijk beschikbare materialen, en schuwt zowel straling en excitatie lichtbronnen. Dientengevolge we beiden hopen en vertrouwen dat in de toekomst zou chemiluminescentie imaging een diepgaand effect op de chirurgische behandeling van ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics