En ny teknik til generering og Observing Kemiluminescens i en biologisk indstilling

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

I de seneste årtier har imaging teknologier revolutioneret den måde, at læger diagnosticere og overvåge sygdommen. Disse billeddannende teknologier har imidlertid stort set været begrænset til hele kroppen billeddannende systemer, såsom positronemissionstomografi (PET), enkelt foton-tomografi (SPECT), computertomografi (CT), og magnetisk resonans billeddannelse (MRI). Særlig opmærksomhed er blevet betalt til kræft, og teknologiske imaging gennembrud har forbedret den måde, at denne sygdom diagnosticeres og behandles. På trods af disse fremskridt, der er ét sted, hvor disse billeddiagnostiske teknologier bare ikke passer: operationsstuen. Mens hele kroppen billeddannelsesteknikker kan hjælpe med kirurgisk planlægning, de typisk mangler geografiske opløsninger høje nok til at hjælpe læger afgøre i realtid om alle tumorvævet er blevet fjernet og resterende tumorvæv forbliver skjult på de kirurgiske margener 1. At sikre, at der ikke infiltrativtumor margener bag er en af ​​de vigtigste kirurgiske mål, og kirurger skal gå en stram-tov mellem streng og forsigtig væv resektion. Hvis for meget er fjernet, er uønskede bivirkninger for patienten forværret; hvis for lidt er fjernet, er tilbagefald steget 2, 3. Det er derfor afgørende at afgrænse nøjagtige tumor marginer, og vi mener, at kemiluminescens intraoperativ billeddannelse kan bidrage til at forbedre nøjagtigheden af ​​identifikation af tumor marginer ved at hjælpe kirurger at visualisere ondartet væv, der ellers kunne forblive uopdaget med etablerede teknikker.

Der er mange imaging teknologier i øjeblikket undersøgt for deres mulige anvendelighed som intraoperative billeddannelse. Disse omfatter p- og γ-stråling-emitterende prober 4, optisk fluorescens 5, Raman spektroskopi 6 >, 7, og Cherenkov luminescens 8, 9. Til dato, men ingen af ​​disse er blevet etableret som standard kliniske værktøjer. Optisk fluorescensafbildning har hidtil vist sig at være den mest lovende af disse teknikker og er derfor den mest udforsket. Mens det allerede har vist sig at være et værdifuldt redskab for mange anvendelser er det ikke uden begrænsninger. Faktisk principalt ulempe er baggrunden fluorescens genereres af sagens natur autofluorescerende biologisk væv. Denne baggrund autofluorescerende signal er et produkt af excitation af det omgivende væv, ud over fluoroforen, som den eksterne lyskilde nødvendig til frembringelse af et fluorescerende signal. Fra et praktisk synspunkt, kan dette autofluorescens potentielt føre til lave signal-til-støj-forhold, der kan begrænse nytten af ​​denne teknologi på operationsstuen.

den væsentligstefordel af kemiluminescens billeddannelse løbet fluorescensafbildning er, at ingen excitationslyset er nødvendig. Som følge heraf er der ingen baggrund autofluorescens. I kemiluminescens billeddannelse, er excitationsenergien stedet genereres kemisk. Denne proces producerer ingen utilsigtet baggrundssignal og kan derfor resultere i højere signal-til-støj-forhold. Dette kan i sidste ende resultere i mere præcise og nøjagtige detektion af kirurgiske margener. Noget overraskende har nytten af denne tilgang som en intraoperativ billeddannelse teknik forblevet uudforskede 10. Faktisk tættest eksempel på denne teknik er oxidationen af luminol ved myeloperoxidase i mus 11, 12, 13. Kemiluminescens biomedicinsk billeddannelse er derfor et temmelig uudforsket område af forskning, der kunne tilbyde følgende fordele: (1) minimal autofluorescens resulterer i en lav baggrund signal med hiGher signal-til-støj-forhold; (2) afstemmelige bølgelængder på kemiluminescerende emissioner lige fra det synlige til det nær-infrarøde; og (3) funktionaliserbare kemiluminescerende komplekser, der, når de kombineres med linker teknologier og målrettede biomolekyler, der allerede eksisterer, giver adgang til hele biblioteker af målrettede molekylære billeddannelse sonder 14.

Denne proof-of-principle undersøgelse illustrerer potentialet nytte af kemiluminescerende billeddannelse i det biomedicinske indstilling med en ruthenium-baserede imaging agent. De kemiluminescerende egenskaber for denne forbindelse er godt undersøgt, med undersøgelser går tilbage til midten af 1960'erne 15. Ved kemisk aktivering midlet frembringer lys ved omkring 600 nm 16, som er velegnet til medicinske billeddannelsesformål. Aktiveringsenergien leveres af en redoxreaktion, der fører til en exciteret tilstand-som har en levetid på 650 ns i vand 17 -follskyldte ved at danne fotoner ved lempelse af denne ophidset tilstand. Gennem brug af en specialdesignet fjernbetjening forstøver, var vi i stand til at påvise forbindelsen både ex vivo og in vivo. Resultaterne af indledende forsøg er meget lovende, tyder yderligere undersøgelse af denne teknologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: Alle de in vivo dyreforsøg beskrevne blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1. Konstruktion af en forstøvningsanordningen

  1. Vedhæfte træ del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm3) oprejst i centrum af del B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) med to skruer (4 x 25 mm 2). Vedhæfte træ del C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) til midten af del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm3) ved hjælp af en skrue, således at del C (11 x 2,5 x 1,8 cm3) stadig kan flyttes. Se figur 1.
  2. Bor to huller gennem den nedre spids af flasken spray udløser af en plast 3 ounce mini sprøjte (D) og skubbe en rustfri stålstang (10 cm 1/16 "stål) (E) gennem at danne to løkker, en på hver side af udløseren. Wrap den nederste del af sprayflaske med gaffatape (F) for at forhindre stripsene glider af. Fastgør sprayflaske til træ del C (11 x 2,5 x 1,8 cm3) under anvendelse af de to plastik kabelbindere (28 cm) (G).
  3. Skær 011 servomotor (I) og tilslut den med de løse kabler af servo kontrol (H). Derefter lægger servomotoren til toppen af træ del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm3) under anvendelse af tape.
  4. Vedhæft en blyant (J) til servomotor håndtaget ved hjælp af papirclips (K). Tæt forbinde de yderste dele af blyant til stålstang sløjfer ved hjælp af plast dækket twist ledninger (L), og fastgør enderne på blyanten med gaffatape.
  5. Skær servo motorstyring magnetiske kabelstik (M) og sæt den til højttalerkablet (N). Derefter tape servo motorstyring til træ del B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Skær en w1 kabel med magnetiske stik i halve og vedhæfte den ene del til den løse ende af kobber sfrekvensfremhæveren kabel (1 m). Tilslut (magnetisk) i2 vippekontakt og p1 strøm til rådighed w1 kabel og et 9V batteri.

2. Følsomhed Bestemmelse af metode

  1. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, fremstille opløsninger af [Ru (bpy) 3] Cl2 i omvendt osmose vand (100 pi) i mængder på 260 ug (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 ug (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 ug (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), og 3 ng (3,5 pmol).
  2. Bland 100 pi af hver [Ru (bpy) 3] Cl2-opløsning med 100 pi af en vandig opløsning af ammonium- cerium nitrat ((NH4) 2 Ce (NO3) 6) i vand (25 mM) på et objektglas.
  3. Opsæt købet i bioluminescens læseren ved initialisering af imaging software.
    1. Log ind på brugerprofilen og se efter acquisition kontrolpanel. Klik på "Initialiser" og vent, indtil instrumentet er klar.
    2. Kig efter "Imaging Mode" og at "Selvlysende" og "Photograph" er markeret, og at "Fluorescent" er markeret.
    3. Ændre "Exposure Time" indstillingen for "Selvlysende" til 20 s. Sæt de resterende indstillinger for "Selvlysende" som følger: "Binning": Middel; "F / stop": 1; og "Emission Filter": Open.
      BEMÆRK: De eksponeringstider skal muligvis tilpasses den instrumentering og eksperimenterende indstilling benyttes, hvis forskellig fra den præsenterede setup.
    4. For "Photograph" bruge følgende indstillinger: "Exposure Time": Auto; "Binning": Medium; og "F / stop": 8. Juster "Subject Højde" ifølge billeddannelse target.Look til "Field of View" dropdown menu. Den oprindelige indstilling er "C." Skift til "B" (14 cm afstand mellem cAmera og prøve etape).
  4. Opsætning af forstøveren ved at placere en mikroskoppræparatet på et ark sort bygning papir på gulvet i afbildningskammeret at beskytte den mod oxidationsmidlet. Bland en 100 μLdroplet af [Ru (bpy) 3] Cl2-opløsning med 100 pi af en vandig opløsning af (NH4) 2 Ce (NO3) 6. Observer den grønne boks trådkors.
    1. Placer imaging genstand på den sorte bygning papir, således at arealet af interesse er i centrum af den grønne lyskassen trådkors vises på prøven scenen. Forbered forstøveren ved at fjerne plastik sprayflaske fra træ støtte. Fyld en opløsning af triethylamin (1: 3 i vand / ethanol) i sin plast reservoir og sæt det til træ støtte.
    2. Placer forstøver inde i bioluminescens læseren og sørg for, at ledningen er afbrudt fra forstøver ledningen. Sørg for, at afbryderener tændt, vippekontakt er slukket, og den røde LED lyser Placer forstøver, således at spray flow peger mod feltet af renter på den billeddannende emnet, samtidig minimere udsigten obstruktion fra kameraet mod imaging emner, som spray dyse hoved.
    3. Placer små, sorte stykker byggeri papir end eventuelle hot spots (f.eks, hvide mærker på mikroskopiske dias eller injektionssteder) for at beskytte dem mod spray. Sted mindst 40 cm af forstøveren fjernbetjeningskabel inde afbildningskammeret, således at det ikke interfererer med den billeddannende emne, forstøveren, eller den magnetiske dørlåsen. Luk billeddannende system døren.
      BEMÆRK: trådkors ændrer størrelse baseret på "Field of View" indstillingen i "Living billede;" sikre, at dette er sat til "B".
  5. Hente et billede ved at indlede den billeddannende sekvens. Klik på "Acquire" i "Acquisition Kontrolpanel". På den første imaging sequidelse, aktivere gemme automatisk, hvis det ønskes (anbefales), og vælg en data mappe. Ignorer "Rediger Imaging Labels" dialog indtil udgangen af ​​sekvensen.
    BEMÆRK: Styringen software viser instrumentets handlinger trin-for-trin i realtid. Efter klargøring af måling og bevæge prøven fase til den rigtige position, åbner kameraets lukker og tæller målingen tid. Lukkeren åbning kan også høres af en kliklyd genereret af maskinen.
  6. Som lukkeren åbnes, spray tre byger af en opløsning af triethylamin (1: 3 i vand / ethanol, 0,24 ± 0,04 ml pr spray burst) ved at skifte vippeafbryderen tre gange for at generere kemiluminescens.
    BEMÆRK: Prøven fase vil bevæge sig under målingen. Lad nok (minimum 40 cm) kabel inde i instrumentet for at tillade dette. Kontroller, at opløsningen, der skal sprøjtes af forstøveren kan stræbte af stigrøret, og at der ikke er nogen luftbobler i røret. Har flere reservedele batteries for forstøveren klar i tilfælde nødvendig.

3. I Vivo Imaging efter systemisk intravenøs injektion

  1. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, fremstilling af 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS) opløsning, der indeholder mellem 8 og 33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl2. Fremstille en vandig opløsning af (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i vand (25 mM) på samme tid.
  2. Intravenøst injicere 100 pi [Ru (bpy) 3] Cl2 i halevenen af sunde mus (n = 5).
  3. Aflive musene 10 min efter injektion via CO2-kvælning.
    1. Fjerne huden med en Y-snit fra torsoen, fjern derefter ribben bue i en U-form for at blotlægge hjertet og lungerne. Perfundere musene ved at skære et udløb i det højre forkammer og indsprøjtning af 20 ml PBS gennem en 24 gauge nål i den venstre ventrikel 18. Skær forsigtigt gennem mavenhuden og eksponere nyrerne og leveren. Skær langs gennem organerne til at skabe en synlig snit.
  4. Opsæt købet som beskrevet i trin 2,3-2,6, med følgende ændringer.
    1. Efter grundig vask af forstøveren plast reservoir, fylde den med en opløsning af (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i vand (25 mM) i stedet for triethylamin.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at grundigt skylle forstøver dysen efter hver brug, da krystallisere (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kan ødelægge spray dyse efter flere anvendelser.
  5. Brug hele dyret eller organprøver til billeddannelse.
    1. For hele underlivet billedbehandling, skal du placere musen slagtekroppen med det åbne abdomen vender kameraet og hovedet peger på bagsiden af ​​instrumentet. Centrer orglet skal afbildes (f.eks, lever eller nyre) i grønt lys boksen trådkors.
    2. Feller individuel orgel billedbehandling og kvantificering, fjerne musen fra imaging instrument og pin det ned. Startende fra den allerede åbnede legemshule, udskære de indre organer (f.eks nyre, lever, lunge, muskel, milt, hjerne og hjerte). Skær gennem bagbenet huden at udskære muskelvæv. Åbn forsigtigt kraniet med en skalpel for at udskære hjernen.
      1. Hvis orglet af interesse er lever, nyre eller milt, skære alle organer i halve på langs, læg hvert organ på en petriskål eller et stykke sort bygning papir.
    3. Følg proceduren beskrevet i trin 2,3-2,6 for at etablere den relative udledning af kemiluminescerende sporstof for enlige organer.

4. I Vivo Imaging af lymfeknuder

  1. Forbered 10 pi af en PBS-opløsning indeholdende 80 nmol [Ru (bpy) 3] Cl2. Fremstille en vandig opløsning af (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i water (25 mM) på samme tid.
  2. Der injiceres 10 pi af opløsningen subdermalt i bagpoten af ​​sunde mus (n = 5). Som en negativ kontrol, injicere den kontralaterale pote med 10 pi af ren PBS. Sacrifice musene via CO2-kvælning 15 min efter injektionen. Fjern skindet på begge bagben til at blotlægge lymfeknuder kanaler op til de popliteale lymfeknuder.
  3. Opsæt købet som beskrevet i trin 3.4.
  4. Fjern de popliteale lymfeknuder fra begge bagben, skær dem i halve, og sprøjte dem med oxidant på en petriskål, som beskrevet før (trin 3.5.3), med henblik på kvantificering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forstøveren Systemet beskrevet i protokol sektion 1 kan konstrueres ud fra let tilgængelige materialer til en lav pris. Det er hensigten at være en indsat for remote-udløst sprøjtning af det reducerende / oxiderende middel inde i en bioluminescerende læser (figur 1). Vores design giver mulighed for en sikker drift af forstøveren i bioluminescens læseren på en 14 cm afstand fra linsen. Ingen dug eller sløring af linsen blev observeret under operationen. Vi valgte den kommercielt tilgængelige kemiluminescerende middel [Ru (bpy) 3] Cl 2 til udvikling af vores metode baseret på dens lave pris, stabilitet i vandig opløsning, velbeskrevet redox adfærd, og kemiluminescerende egenskaber (figur 2) 19. Den minimale detekterbare signal kan bestemmes som beskrevet i protokol sektion 2 ved oxidation en dråbe [Ru (bpy) 3] Cl2 (100 pi, 6,9 pmol- 347 nmol i H2O) med (NH4) 2 Ce (NO3) 6 (100 pi, 25 mM) på et objektglas. Derefter, ved hjælp af forstøveren og sprøjtning på en opløsning af triethylamin (1: 3 i vand / ethanol), er det kemiluminescerende signal udløses. I vores tilfælde blev den minimale detekterbare signal bestemt til at være 6,9 pmol / cm2 (figur 3). Det er tænkeligt, dog, at optimerede reaktionsbetingelser, kamera følsomheder, lukkertid gange, mængder, og reagenskoncentrationer kan føre til tærskler endnu lavere afsløring. Disse reaktionsbetingelser kan også anvendes til at udforske og teste den kemiluminescens af enhver given kombination af metalkomplekser, oxidationsmidler og reduktionsmidler.

Flytning til in vivo eksperimenter i protokol §§ 3 og 4, kvindelige nude (udavlede) mus 5-6 uger gamle og NU / J hanmus 6-8 uger gamle, blev anvendt. Til intravenøse injektioner er mængder af8-33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 i 100 pi PBS pr mus (n = 5) blev valgt. Dyrene blev aflivet 10 min efter injektion, og bughulen blev blotlagt. Musene blev anbragt i bioluminescerende læseren med forstøveren peger mod vævet af interesse (Figur 4). Til billeddannelse med intravenøst injiceret [Ru (bpy) 3] Cl 2 blev kemiluminescenssignalet detekteret overvejende i nyrerne, hvilket kraftigt antyder renal eliminering af den hydrofile lille molekyle (figur 5). Signal-til-støj-forhold for mus injiceret med [Ru (bpy) 3] Cl2 versus PBS var 27/1 for nyrerne og 21/1 for leveren. For lymfeknude-billeddannelse, 80 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 i 10 pi PBS blev injiceret subdermalt i det bagben pude af mus (n = 5). Mus blev aflivet 15 min efter injektion af CO2 kvælning. Huden dækker både den indre hind ben was fjernet for at blotlægge muskel, lymfeknuder, og lymfekar. Efterfølgende kemiluminescerende visualisering af knæhaselymfeknuder ført til den observation, at lymfeknuder indeholdende [Ru (bpy) 3] 2+ vise en 10 ± 4,3 gange højere udstråling end ubehandlede dem (167.000 s / (s x cm2 x sr) og 17.000 p / (s x cm2 x sr); P <0,028) (figur 6).

figur 1
Figur 1: Fotografi af forstøveren. Dele anvendes: træstruktur dele (A, B, C), sprayflaske (D), bøjet stålstang (E), gaffatape (F), plast kabelbindere (G), 011 servo stik del (H), servomotor (I), blyant ( J) indehaves af bøjet papirclips (K), plast dækket wire twist bånd (L) w1 wire stik (M) og højttaler kabel (N), der fører til batteriet. Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i refrence 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Egenskaber af [Ru (bpy) 3] 2+. Struktur (A) og excitations- og emissionsspektre (B) af [Ru (bpy) 3] 2+. Den oxidation / reduktion baseret kemiluminescens katalytiske cyklus (C). Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i henvisning 19. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 3: Detektion Threshold af [Ru (bpy) 3] 2+. Repræsentative intensiteter signal ved forskellige koncentrationer af [Ru (bpy) 3] 2+ på et mikroskopobjektglas (A). Imaging signal kvantificering med detekteringstærskel (rød stiplet linie) og baggrund (sort stiplet linje) (B). Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i henvisning 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Kemiluminescens Imaging. Skematisk tegning af en mus og en forstøver anbragt i bioluminescens læseren (A g>) og skematisk tegning (B) af forstøveren sprøjtning på en mus. Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i henvisning 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Detektion af [Ru (bpy) 3] 2+ efter systemisk administration. Hvidt lys, kemiluminescens, og overlay (fra venstre til højre). Billeder af en mus legemshulrum, der blev injiceret med 33 nmol [Ru (bpy) 3] 2+ og sprøjtet med (NH4) 2 Ce (NO3) 6. De hvide pil peger mod højre nyre. Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i henvisning 19.ftp_upload / 54.694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Påvisning af [Ru (bpy) 3] 2+ efter subdermal Administration. Popliteale lymfeknude-billeddannelse viser hvidt lys, kemiluminescens og sammensatte billeder for mus injiceret med [Ru (bpy) 3] 2+ (øverst) og PBS (nederst) i bagbenene; 80 nmol i 10 pi PBS, afbildes 15 min efter injektion (A). Hvidt lys og sammensatte billeder for [Ru (bpy) 3] 2+ (øverst) og PBS (nederst) -behandlede udskåret popliteale lymfeknuder (B). Kvantificering af kemiluminescerende signaler for PBS og [Ru (bpy) 3] 2+ -behandlede lymfeknuder (C) .Den data repræsenterer middelværdien ± SD. Dette tal er baseret på forskning, der oprindeligtoffentliggjort inreference 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi præsenteret en teknologi, der er i stand til optisk afgrænse væv via emission af fotoner skabt af et kemiluminescerende reporter. I modsætning til andre, mere etablerede, teknologier 4, 5, 6, 7, 8, 9, dette kemiluminescerende reporter system benytter et billeddannende probe, som er ikke-radioaktiv og letter detektion ved meget høje følsomhedsniveauer. Måske endnu vigtigere, er kemiluminiscens imaging kræver ikke en hændelse lyskilde (som i optisk fluorescens billeddannelse) 20, et træk, der minimerer autofluorescens og drastisk reducerer baggrundssignaler.

Ruthenium reporter [Ru (bpy) 3] Cl 2 har en in vivo toksicitet tåleligt for imaging formål (intraperitoneal mus LD 50: 20 mg / kg) 21, er vandopløselig (op til 8 mM), og er stabile i blodbanen. De fysisk-kemiske egenskaber af metalkomplekset er velkarakteriserede og er allerede blevet undersøgt for fotodynamisk terapi af cancer 22, 23. Oxidationsmidlet (NH4) 2 Ce (NO3) 6 er blevet rapporteret at have meget lav toksicitet (oral rotte LD 50: 1600-3200 mg / kg) 24 og er opløselig i vand ved koncentrationer på op til 2,57 M ved 20 ° C 25. I denne artikel er en visuel demonstration samt tekstbaseret vejledning til opførelse af en fjernbetjent betjente forstøvningsanordningen præsenteret. Derudover giver vi robuste protokoller til at udføre chemiluminescens billeddannelse i en standard bioluminescens imaging enhed. Vi illustrerer anvendelsen af [Ru (bpy) 3] Cl 2 for de visualizatipå af væv efter både intravenøs og subdermale injektioner i mus.

Men som med alle andre spirende billedteknologi, der er plads til forbedring af vores protokoller. Vi mener, at dette proof-of-principle studie kunne anspore udviklingen af ​​flere chemiluminescens ansøgninger om levende systemer. Følgende punkter kan rettes til yderligere at forbedre teknologien og udvide dens anvendelsesområde.

En mindre anden generation af eksternt udløst sprøjtning enheder ville tillade prøven at være tættere på kameraet, dermed forbedre rumlig opløsning. Forbedret optisk udstyr kan yderligere forbedre påvisningsgrænserne for fremgangsmåden. Protokollen kan også udvides til at afbilde levende dyr. Præcis styring af drejningsmomentet (ved strøm og spænding) tillader en mere præcis styring af mængden af ​​reagens frigives med hver spray. Det er vigtigt at holde forstøveren velholdte. Ikke skylle forstøveren kan ødelægge nozzle. En frisk batteri er afgørende for korrekt udførelse af forstøveren. Men alle de, der anvendes til forstøveren materialer er billige og let kommercielt tilgængelige. Efter etablerede syntetiske protokoller, den [Ru (bpy) 3] 2+ komplekset kan nemt modificeres med forskellige linkere, herunder maleimider 26, aminer 27, og NHS-estere 28, 29. Dette vil sætte bioconjugation til små molekyler, peptider eller antistoffer, og vil derfor lette specifik molekylær targeting 30, 31, 32, 33. I sidste ende kunne målrettet sonde levering muligt kirurger til at identificere små læsioner og præcist at afgrænse kirurgiske margener på operationsstuen med meget høj specificitet. Også, indkapslingen af den yderst vandopløseligt [Ru (bpy) 3] 2+ i nanomaterialer-både målrettet og ikke-målrettede-kan også give mulighed for visualisering af læsioner, mens de bliver fjernet kirurgisk 34, 35, 36. Endelig modificering koordineringen sfære af metallet komplekse reporter og / eller ændre overgangen metal centret selv repræsenterer attraktive ruter til at modulere og finjustere emissionsbølgelængder inden for det synlige og NIR spænder 37, 38.

Intraoperativ chemiluminescens imaging har brug for en kemiluminescerende reporter, og i vores tilfælde, en oxidant, som kun kan anvendes inden for rammerne af deres toksicitet og opløselighed. Vævsmembraner kan udgøre en barriere for diffusion af oxidant ind i vævet, og dermed signalet generation. Da den kemiluminescerende reporter kun genererer en foton per cyklus, det genererede signal er ret svag.Det omgivende lys på operationsstuen skal derfor forhindres i at komme ind i kameraet, mens teknikken er i brug. Dette kan gøre ICI særligt interessant for udviklingen af ​​laparoskopiske anvendelser, hvor det omgivende lys er naturligt udelukket.

Vi håber, at denne metode kan blive til et værdifuldt værktøj for kirurger i operationsstuen. Fraværet af radioaktivitet er til gavn for patienten og drift hold ens og gør færre sikkerhedsforanstaltninger er nødvendige, potentielt gør denne teknik til et mere attraktivt alternativ.

Den velfungerende forstøveren og dens placering spiller en afgørende rolle for at opnå gode resultater. Suboptimale vinkler og områder kan bidrage til at signalere varians. Styringen kablet skal sættes gennem døren med omhu, og nok kabel skal forblive inde i bioluminescens læseren, så det ikke er trængsel eller revet af.

I sidste ende, chemiluminescence imaging er en yderst attraktiv ny tilgang til molekylær billeddannelse. Den er baseret på et fundament af veletableret kemi, beskæftiger billige og let tilgængelige materialer, og skyr både stråling og excitation lyskilder. Som et resultat, vi er begge håb og tillid til, at i fremtiden, kunne kemiluminescens billeddannelse have en dybtgående indvirkning på den kirurgiske behandling af sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics