Uma nova técnica para gerar e Observing Quimioluminescência em um ambiente Biológica

Bioengineering

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Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

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Abstract

Introduction

Nas últimas décadas, as tecnologias de imagem têm revolucionado a maneira que os médicos diagnosticar e monitorar a doença. Estas tecnologias de imagem, no entanto, foram em grande parte limitada a sistemas de imagem de corpo inteiro, como a tomografia por emissão de positrões (PET), photon emissão única tomografia computadorizada (SPECT), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (MRI). Particular atenção tem sido dada ao câncer, e os avanços tecnológicos de imagem melhoraram muito a maneira que esta doença é diagnosticada e tratada. Apesar destes avanços, há um lugar onde essas tecnologias de imagem simplesmente não se encaixam: a sala de cirurgia. Enquanto técnicas de imagem de corpo inteiro pode ajudar no planejamento cirúrgico, que normalmente não têm resoluções espaciais altas o suficiente para ajudar os médicos a determinar em tempo real se todo o tecido do tumor foi removido ou tecido tumoral residual permanece escondido nas margens cirúrgicas 1. Certificar-se de que nenhum infiltrativamargens do tumor são deixados para trás é um dos objetivos cirúrgicos mais importantes, e os cirurgiões devem andar uma corda bamba entre rigorosos e cautelosos ressecção de tecido. Se demasiado for removido, os efeitos colaterais indesejáveis ​​para o paciente são exacerbados; se muito pouco é removido, as taxas de recorrência são aumentados 2, 3. Portanto, é fundamental para delinear as margens tumorais precisos, e acreditamos que a imagem intra-operatória quimioluminescente pode ajudar a melhorar a precisão da identificação de margens do tumor, ajudando cirurgiões a visualizar tecido maligno que poderiam passar despercebido com técnicas estabelecidas.

Existem muitas tecnologias de imagem atualmente sendo investigado por sua possível utilidade como sistemas de imagem intra-operatórias. Estes incluem sondas p- e-γ-radiação que emite 4, fluorescência óptica 5, espectroscopia Raman 6 >, 7 e Cherenkov luminescência 8, 9. Até à data, no entanto, nenhum deles se estabeleceram como ferramentas clínicas padrão. imagem de fluorescência óptica tem até agora provado ser o mais promissor destes técnicas e é portanto a mais explorada. Enquanto que foi já demonstrado ser uma ferramenta valiosa para muitas aplicações, não é sem os seus limites. Na verdade, sua principal desvantagem é a fluorescência de fundo gerado pelo tecido biológico inerentemente autofluorescente. Este sinal de fundo autofluorescente é um produto da excitação do tecido circundante, para além do fluoróforo, pela fonte de luz externa necessária para a geração de um sinal fluorescente. De uma perspectiva prática, este autofluorescência pode potencialmente levar a baixas taxas de sinal-ruído, que podem limitar a utilidade desta tecnologia na sala de cirurgia.

O diretor da escolavantagem de imagiologia quimiluminescência sobre imagens de fluorescência é que nenhuma luz de excitação é necessário. Como resultado, não há autofluorescência fundo. Em imagiologia de quimioluminescência, a energia de excitação é em vez disso gerado quimicamente. Este processo produz nenhum sinal de fundo não intencional e, portanto, pode resultar em rácios mais elevados de sinal-para-ruído. Isto poderia finalmente resultar na detecção mais precisa e exata das margens cirúrgicas. Surpreendentemente, a utilidade desta abordagem como uma técnica de imagem intra-operatória tem permanecido inexplorados 10. Na verdade, o mais próximo de exemplo desta técnica é a oxidação do luminol pela enzima mieloperoxidase em ratinhos 11, 12, 13. imagiologia biomédica quimioluminescente é, portanto, uma área bastante inexplorada da pesquisa que poderia oferecer as seguintes vantagens: (1) autofluorescência mínima resultando em um baixo sinal de fundo com oirácios Gher sinal-ruído; (2) comprimentos de onda sintonizável de emissões quimioluminescentes que vão desde o visível ao infravermelho próximo; e (3) complexos quimioluminescentes functionalizable que, quando combinado com as tecnologias vinculador e biomoléculas que já existem direcionados, dão acesso a bibliotecas inteiras de sondas de imagem molecular alvo 14.

Este estudo de prova de princípio ilustra a utilidade potencial da imagem quimioluminescente na configuração biomédica utilizando um agente de imagiologia à base de ruténio. As propriedades quimiluminescentes deste composto são bem estudadas, com investigações que datam de meados da década de 1960 15. Após a activação química, o agente produz luz em torno de 600 nm, 16, que é bem adequado para fins de imagiologia médica. A energia de activação é fornecida através de uma reacção redox, que conduz a um estado que animado tem uma duração de 650 ns na água 17 -folldevidos pela geração de fótons em cima relaxamento deste estado animado. Através da utilização de um nebulizador remoto especialmente concebido, fomos capazes de detectar o composto tanto ex vivo e in vivo. Os resultados dos experimentos iniciais são muito promissores, sugerindo uma investigação mais aprofundada desta tecnologia.

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Protocol

Declaração de ética: Todos os experimentos in vivo em animais descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Cuidado Institucional Animal e Comitê de Uso (IACUC).

1. Construção de um dispositivo de nebulização

  1. Anexar madeira parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) na vertical no centro da parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) com dois parafusos (4 x 25 mm 2). Anexar madeira parte C (11 × 2,5 × 1,8 centímetros 3) para o meio da parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3), utilizando um parafuso, de tal modo que a parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) pode ainda ser movido. Veja a Figura 1.
  2. Broca dois furos através da ponta inferior do gatilho garrafa de pulverização de um mini-pulverizador 3 oz plástico (D) e empurrar uma barra de aço inoxidável (10 cm de "aço 16/1) (E) por meio para formar duas alças, uma em cada lado do gatilho. Enrole a parte inferior do frasco de spray com fita adesiva (F) para evitar que os laços de cabo de deslizar fora. Fixe o frasco de spray para madeira parte C (11 x 2,5 x 1,8 centímetros 3) usando as duas braçadeiras de plástico (28 cm) (G).
  3. Cortar o motor 011 servo (I) e reconecte-o com os cabos soltos do controle servo (H). Em seguida, conecte o servo motor para o topo da madeira a parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 centímetros 3) usando fita adesiva.
  4. Anexar um lápis (J) para a alavanca servo motor usando o clipe de papel (K). Firmemente conectar as partes periféricas da lápis para os loops haste de aço que utilizam fios de torção de plástico coberta (L) e prenda as extremidades do lápis com fita adesiva.
  5. Cortar conector do cabo magnético da unidade de controle do servo motor (M) e recolocá-la ao cabo de altifalante (N). Em seguida, cole a unidade de controle servo motor para a madeira parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm3). Cortar um cabo W1 com conectores magnéticos na metade e anexar uma parte para a ponta solta do cobre scabo Peaker (1 m). Ligue o interruptor basculante (magnética) i2 e poder p1 ao cabo W1 disponível e uma bateria de 9V.

2. Sensibilidade Determinação do Método

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar soluções de [Ru (bpy) 3] Cl 2 em água de osmose inversa (100 uL) em quantidades de 260 mg (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 ug (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 ug (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmoles), 5 ng (6,9 pmol), e 3 ng (3,5 pmol).
  2. Misturar 100 mL de cada [Ru (bpy) 3] Cl 2 solução com 100 mL de uma solução aquosa de nitrato de cério e amónio ((NH4) 2 Ce (NO3) 6) em água (25 mM) numa lâmina de microscópio.
  3. Configurar a aquisição no leitor bioluminescência por inicializar o software de imagem.
    1. Entrar no perfil do usuário e olhar para o acquipainel de controle sição. Clique em "Iniciar" e aguarde até que o instrumento está pronto.
    2. Olhe para o "Modo de imagem" e certifique-se "luminescentes" e "Fotografia" são verificados e que "Fluorescent" está desmarcada.
    3. Change "Tempo de Exposição" configuração para "luminescentes" a 20 s. Defina as configurações restantes para "luminescentes" da seguinte forma: "Binning": Médio; "F / stop": 1; e "filtro de emissão": Open.
      NOTA: Os tempos de exposição pode ter de ser adaptadas de acordo com a instrumentação e configuração experimental utilizado, se for diferente da configuração apresentada.
    4. Para "Photograph", use as seguintes definições: "tempo de exposição": Auto; "Binning": Médio; e "F / stop": 8. Ajuste o "Assunto Altura" de acordo com a imagem latente target.Look para o menu suspenso "campo de visão". A definição inicial é "C." Mudar para "B" (14 cm de distância entre a camera e estágio da amostra).
  4. Defina-se o nebulizador por colocação de uma lâmina de microscópio sobre uma folha de papel de construção preto no chão da câmara de imagem para protegê-lo contra o agente oxidante. Misturar 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution com 100 mL de uma solução aquosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6. Observar o quadro de mira verde.
    1. Colocar o objecto de imagem no papel de construção preto, de tal modo que a área de interesse está no centro da cruz caixa de luz verde exibido na fase de amostra. Prepare o nebulizador, retirando o frasco de spray de plástico do suporte de madeira. Encha uma solução de trietilamina (1: 3 em água / etanol) em seu reservatório de plástico e recolocá-la para o suporte de madeira.
    2. Coloque o nebulizador no interior do leitor de bioluminescência e certifique-se de que o cabo de alimentação está desconectado do cabo de nebulizador. Certifique-se de que o interruptor de alimentaçãoestá ligado, o interruptor basculante está desligado e o LED vermelho está aceso Colocar o nebulizador de modo a que o fluxo de pulverização é apontada para a área de interesse na imagem objecto, enquanto minimiza a obstrução da vista a partir da câmara em direcção ao objecto de imagem pela cabeça de bico de pulverização.
    3. Coloque pequenos pedaços, preto de papel de construção mais de quaisquer potenciais pontos quentes (por exemplo, marcas brancas em lâminas microscópicas ou locais de injecção), para protegê-los de spray. Coloque pelo menos 40 cm do cabo remoto nebulizador dentro da câmara de imagem, de modo a que não interfira com o objecto de imagem, o nebulizador, ou o fecho da porta magnética. Feche a porta do sistema de imagem.
      NOTA: A mira irá alterar o tamanho com base no "campo de visão" em "Imagem Viver"; certificar-se de que este está definido para "B".
  5. Adquirir uma imagem, iniciando a sequência de imagens. Clique em "Adquirir" no "Painel de Controle Aquisição". No primeiro sequ imagiologiacia, permitir a gravação automática se desejado (recomendado) e escolha uma pasta de dados. Ignore o "Editar etiquetas de imagem" de diálogo até que o fim da sequência.
    NOTA: O software de controle exibe as ações do instrumento passo-a-passo em tempo real. Depois de preparar a medição e movendo-se a fase de amostra para a posição direita, que abre o obturador da câmara e conta o tempo de medição. A abertura do obturador também pode ser ouvido por um som de clique gerado pela máquina.
  6. À medida que o obturador se abre, spray três explosões de uma solução de trietilamina (1: 3 em água / etanol, 0,24 ± 0,04 mL por pulverização) de ruptura pela comutação do interruptor de alavanca de três vezes para gerar quimioluminescência.
    NOTA: O estágio da amostra irá mover durante a medição. Deixe cabo suficiente (mínimo 40 cm) dentro do instrumento para permitir isso. Certifique-se de que a solução a ser pulverizada pelo nebulizador pode ser aspirado pelo tubo ascendente e que não existem bolhas de ar no tubo. Ter vários batterie de reposiçãos para o nebulizador pronto no caso necessário.

3. In vivo de imagens Após Systemic injeção intravenosa

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), contendo entre 8 e 33 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Prepara-se uma solução aquosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 em água (25 mM), ao mesmo tempo.
  2. Injectar por via intravenosa de 100 ul de [Ru (bpy) 3] Cl 2 na veia da cauda de ratinhos saudáveis (n = 5).
  3. Eutanásia dos ratinhos 10 minutos após a injecção através de asfixia com CO 2.
    1. Retire a pele com um Y-cut do torso, em seguida, retire o arco costal em forma de U para expor o coração e os pulmões. Perfundir dos ratinhos por corte de uma tomada no átrio direito e injectando 20 ml de PBS através de uma agulha de calibre 24 para o ventrículo esquerdo 18. Cuidadosamente cortar a barrigapele e expor o rim e fígado. Cortar longitudinalmente através dos órgãos para criar um corte visível.
  4. Defina-se a aquisição tal como descrito nos passos 2,3-2,6, com as seguintes alterações.
    1. Depois de lavar cuidadosamente o reservatório de plástico nebulizador, enchê-lo com uma solução de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 em água (25 mM) em vez de trietilamina.
      NOTA: É importante para enxaguar bem o bico nebulizador após cada utilização, uma vez que a cristalização de (NH4) 2 Ce (NO3) 6, podem destruir o bico de pulverização depois de vários usos.
  5. Use toda a amostras de animais ou de órgãos para a imagem latente.
    1. Para geração de imagens abdômen inteiro, posicione a carcaça do rato com o abdômen aberto virado para a câmera e a cabeça apontando para a parte de trás do instrumento. Centralize o órgão a ser trabalhada (por exemplo, fígado ou rins) na mira caixa de luz verde.
    2. Fou indivíduo imagens de órgãos e quantificação, remova o rato do instrumento de imagem e fixá-lo. A partir da cavidade do corpo já aberto, excisar os órgãos internos (por exemplo, rim, fígado, pulmão, músculo, baço, cérebro e coração). Corte através da pele perna para excisar o tecido muscular. abra cuidadosamente o crânio com um bisturi para extirpar o cérebro.
      1. Se o órgão de interesse é o fígado, rim e baço, cortar todos os órgãos em metade longitudinalmente, coloque cada órgão em uma placa de Petri ou um pedaço de papel de construção preto.
    3. Seguir o processo descrito nas etapas 2,3-2,6 para estabelecer a emissão relativa do marcador quimioluminescente para órgãos individuais.

4. In vivo de imagens de linfonodos

  1. Preparar 10 ml de uma solução de PBS contendo 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Prepara-se uma solução aquosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 em WATer (25 mM), ao mesmo tempo.
  2. Injectam-se 10 ul da solução subcutaneamente na pata traseira de ratinhos saudáveis ​​(n = 5). Como um controlo negativo, injectar a pata contralateral com 10 ul de PBS puro. Sacrifício dos ratinhos através de asfixia com CO 2 15 minutos após a injecção. Remover a pele em ambas as patas traseiras para expor os canais linfáticos-se para os nódulos linfáticos poplíteos.
  3. Defina-se a aquisição tal como descrito na etapa 3.4.
  4. Remover os gânglios linfáticos poplíteos de ambas as patas traseiras, cortá-los ao meio, e pulverizá-los com oxidante em uma placa de Petri, tal como descrito antes (passo 3.5.3), com o objectivo de quantificação.

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Representative Results

O sistema de nebulizador descrito na secção protocolo 1 pode ser construído a partir de materiais facilmente disponíveis, a um baixo custo. Destina-se a ser uma aposta para remoto disparado pulverização do agente de redução / oxidação dentro de um leitor bioluminescente (Figura 1). Nosso projeto permite a operação segura do nebulizador dentro do leitor bioluminescência em um 14 cm de distância da lente. Não se observou qualquer embaciamento ou desfocagem da lente durante a operação. Foi selecionado o agente quimioluminescente comercialmente disponível [Ru (bpy) 3] Cl 2 para o desenvolvimento do nosso método com base no seu baixo preço, a estabilidade em solução aquosa, o comportamento redox bem descrito, e propriedades quimioluminescentes (Figura 2) 19. O sinal detectável mínima pode ser determinada como descrito na secção de protocolo 2 por oxidação de uma gota de [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 uL, 6,9 pmol- 347 nmol em H2O) com (NH4) 2 Ce (NO3) 6 (100 ul, 25 mM) numa lâmina de microscópio. Em seguida, utilizando o nebulizador e pulverização sobre uma solução de trietilamina (1: 3 em água / etanol), o sinal quimioluminescente é disparado. No nosso caso, o sinal detectável mínima foi determinada como sendo de 6,9 pmol / cm 2 (Figura 3). É concebível, porém, que otimizado condições de reação, sensibilidades câmera, tempos de obturador, volumes e concentrações de reagentes pode levar a limiares de detecção ainda mais baixos. Estas condições reaccionais podem também ser usados ​​para explorar e testar a quimioluminescência de qualquer dada combinação de complexos de metais, agentes oxidantes e redutores.

Movendo-se para os experimentos in vivo em seções de protocolo 3 e 4, nuas (outbred) ratos 5-6 semanas de idade e ratos do sexo masculino NU / J 6-8 semanas de idade foram utilizados. Para injeções intravenosas, quantidades de8-33 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2 em 100 ul de PBS por ratinho (n = 5) foram escolhidos. Os animais foram sacrificados 10 minutos após a injecção, e a cavidade abdominal foi exposta. Os murganhos foram colocados no leitor bioluminescente com o nebulizador que aponta para o tecido de interesse (Figura 4). Para imagiologia com intravenosamente injectados [Ru (bpy) 3] Cl 2, o sinal quimioluminescente foi detectado predominantemente nos rins, sugerindo fortemente a eliminação renal da molécula pequena hidrofílico (Figura 5). Relações sinal-ruído para ratinhos injectados com [RU (bpy) 3] Cl 2 versus PBS foram 27/1 para o rim e para o fígado 21/1. Para imagem de linfonodo, 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2 em 10 uL de PBS foram injectadas subcutaneamente na almofada da pata traseira de ratos (n = 5). Os ratinhos foram sacrificados 15 minutos após a injecção por asfixia com CO2. A pele que cobre tanto o interior pés traseiros was removidas para expor o músculo, nódulos linfáticos e vasos linfáticos. Quimioluminescente visualização subsequente dos gânglios linfáticos poplíteos conduziu à observação de que os nódulos linfáticos contendo [Ru (bpy) 3] 2+ mostram uma 10 ± 4,3 vezes maior brilho do que as não tratadas (P 167000 / (s × 2 × cm SR) e 17.000 p / (s × 2 × cm SR); P <0,028) (Figura 6).

figura 1
Figura 1: Fotografia do nebulizador. Partes usadas: peças de estrutura de madeira (A, B, C), frasco de spray (D), haste de aço dobrado (E), fita adesiva (F), abraçadeiras de plástico (G), 011 conector servo parte (H), o servo motor (I), lápis ( J), realizada por bent clipe de papel (K), de plástico coberto de arame de torção laços (L) conector de fio w1 (M) e o cabo de alto-falante (N), levando à bateria. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente em refrefe- 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Propriedades de [Ru (bpy) 3] 2+. Estrutura (A) e de excitação e os espectros de emissão (B) de [Ru (bpy) 3] 2+. A oxidação / redução catalítica baseado ciclo quimioluminescente (C). Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente na referência 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3: limiar de detecção de [Ru (bpy) 3] 2+. intensidades de sinal representativos a diferentes concentrações de [Ru (bpy) 3] 2+ numa lâmina de microscópio (A). Quantificação de sinal de imagem com limiar de detecção (linha pontilhada vermelha) e do fundo (linha pontilhada preto) (B). Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente na referência 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Quimioluminescência Imaging. Desenho esquemático de um mouse e um nebulizador posicionado no leitor de bioluminescência (A g>) e desenho esquemático (B) do nebulizador pulverização em um mouse. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente na referência 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Detecção de [Ru (bpy) 3] 2+ após administração sistémica. A luz branca, quimiluminescência e sobreposição (a partir da esquerda para a direita). Imagens de uma cavidade do corpo do rato que foi injectado com 33 nmol de [Ru (bpy) 3] 2+ e pulverizadas com (NH4) 2 Ce (NO3) 6. A seta aponta brancas para a rim direito. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente na referência 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Detecção de [Ru (bpy) 3] 2+ após administração subdérmica. Imaging linfonodo poplíteo mostrando brancos leves, quimiluminescência, e imagens compostas para os ratos injectados com [Ru (bpy) 3] 2+ (topo) e PBS (parte inferior) nos membros posteriores; 80 nmol em 10 ul de PBS, fotografada 15 min após a injecção (A). A luz branca e imagens compostas de [Ru (bpy) 3] 2+ (topo) e PBS (parte inferior) tenha sido tratada com extirpado gânglios linfáticos poplíteos (B). A quantificação de sinais quimioluminescentes para PBS e [Ru (bpy) 3] 2+ gânglios linfáticos tenha sido tratada com (C) .O dados representa a média ± DP. Este valor é baseado em pesquisa originalpublicada inreference 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, nós apresentamos uma tecnologia que é capaz de delinear opticamente tecido através da emissão de fotões criada por um repórter quimioluminescente. Em contraste com a outra, mais estabelecido, as tecnologias de 4, 5, 6, 7, 8, 9, este sistema repórter quimioluminescente emprega uma sonda de imagem que é não-radioativo e facilita a detecção em níveis muito elevados de sensibilidade. Talvez ainda mais importante, a imagiologia de quimioluminescência não requer uma fonte de luz incidente (como em imagem de fluorescência óptica) 20, uma característica que minimize a autofluorescência e reduz drasticamente os sinais espontâneos.

O repórter ruténio [Ru (bpy) 3] Cl 2 tem uma in vivo toxicidade tolerável para fins de imagiologia (intraperitoneal rato LD 50: 20 mg / kg) 21, é solúvel em água (até 8 mm), e é estável na corrente sanguínea. As propriedades físico-químicas do complexo de metal são bem caracterizadas e já foram investigados para a terapia fotodinâmica de câncer 22, 23. O agente oxidante (NH4) 2 Ce (NO3) 6 foi reportado ter uma toxicidade muito baixa (LD Oral Rato 50: 1600-3200 mg / kg) 24 e é solúvel em água a concentrações de até 2,57 M a 20 ° C 25. Neste artigo, uma demonstração visual, bem como a orientação à base de texto para a construção de um dispositivo de nebulização remotamente operado são apresentados. Além disso, nós fornecemos protocolos robustos para a realização de imagiologia quimiluminescência em um dispositivo de imagem de bioluminescência padrão. Nós ilustram o uso de [Ru (bpy) 3] Cl 2 para os visualizatiem ambos dos tecidos após injecções intravenosas e subcutâneos em ratinhos.

No entanto, como com qualquer outra tecnologia de imagem nascente, não há espaço para melhorias dos nossos protocolos. Acreditamos que este estudo prova-de-princípio pode estimular o desenvolvimento de várias aplicações de quimiluminescência para sistemas vivos. Os seguintes pontos podem ser tratadas para melhorar ainda mais a tecnologia e expandir o seu alcance.

Uma segunda geração menor de dispositivos de pulverização remotamente desencadeada permitiria que a amostra a ser mais perto da câmera, melhorando assim a resolução espacial. equipamento óptico melhorada pode melhorar ainda mais os limites de detecção do método. O protocolo também pode ser estendido para imagiologia animais vivos. controlo exacto do binário (por corrente e tensão) permitiria que um controlo mais exacto do volume de reagente libertado com cada spray. É importante manter o nebulizador bem conservados. Não enxaguar o nebulizador pode destruir o Nozzle. Uma bateria nova é crucial para o bom desempenho do nebulizador. No entanto, todos os materiais utilizados para o nebulizador são baratos e prontamente disponíveis comercialmente. Seguindo protocolos sintéticos estabelecidos, o [Ru (bpy) 3] 2+ complexo pode ser facilmente modificado com vários ligantes, incluindo maleimidas 26, aminas 27, e ésteres de NHS 28, 29. Isto permitiria bioconjugação a pequenas moléculas, peptídeos ou anticorpos, e, assim, facilitar molecular específica de segmentação 30, 31, 32, 33. Em última análise, a entrega sonda alvo poderia permitir aos cirurgiões para identificar pequenas lesões e delinear com precisão margens cirúrgicas na sala de cirurgia com alta especificidade. Além disso, o encapsulamento da altamente solúvel em água [Ru (bpy) 3] 2+ em nanomateriais, tanto alvejado e irrelevantes-pode também permitir a visualização de lesões, enquanto eles estão sendo removidos cirurgicamente 34, 35, 36. Finalmente, modificando a esfera de coordenação do repórter complexo de metal e / ou mudando o centro de metal da transição em si representam rotas atraentes para modular e afinar os comprimentos de onda de emissão dentro do visível e NIR varia 37, 38.

imagiologia de quimioluminescência precisa intra-operatória de um repórter quimioluminescente e, no nosso caso, um oxidante, o que só pode ser utilizado dentro dos limites da sua toxicidade e solubilidade. membranas de tecido podem representar um obstáculo para a difusão do oxidante para o tecido, e, por conseguinte, a geração de sinal. Desde o repórter quimioluminescente só é gerar um fóton por ciclo, o sinal gerado é bastante fraca.A luz ambiente na sala de cirurgia, portanto, têm de ser impedidos de entrar na câmera, enquanto a técnica está em uso. Isto pode tornar a ICI particularmente interessante para o desenvolvimento de aplicações laparoscópicas, onde a luz ambiente é naturalmente excluídos.

Esperamos que esse método pode se transformar em uma ferramenta valiosa para os cirurgiões na sala de operações. A ausência de radioactividade é benéfico para a equipe paciente e operacional iguais e faz menos precauções de segurança necessárias, potencialmente tornando esta técnica em uma alternativa mais atraente.

O bom funcionamento do nebulizador e seu posicionamento desempenham um papel crucial para a obtenção de bons resultados. ângulos sub-óptimos e áreas pode contribuir para sinalizar variância. O cabo de controle deve ser colocado através da porta com cuidado, e cabo suficiente tem que permanecer no interior do leitor de bioluminescência para que ele não é apertado ou arrancada.

Em última análise, chemiluimaging minescence é uma nova abordagem extremamente atraente para imagiologia molecular. Ele baseia-se numa base de química bem estabelecida, emprega materiais baratos e facilmente disponíveis, e evita, tanto fontes de luz de excitação e radiação. Como resultado, ambos estamos esperançosos e confiantes de que, no futuro, a imagem latente de quimiluminescência poderia ter um efeito profundo sobre o tratamento cirúrgico da doença.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

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References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

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