Une nouvelle technique de production et d'observation de chimiluminescence en milieu biologique

Bioengineering

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Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

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Abstract

Introduction

Au cours des dernières décennies, les technologies d'imagerie ont révolutionné la façon dont les médecins à diagnostiquer et de surveiller la maladie. Ces techniques d'imagerie, cependant, ont été largement limitée à des systèmes d'imagerie du corps entier, comme la tomographie par émission de positrons (PET), le photon unique par émission de positrons (SPECT), tomographie assistée par ordinateur (CT) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Une attention particulière a été accordée au cancer, et des percées technologiques d'imagerie ont grandement amélioré la façon dont cette maladie est diagnostiquée et traitée. Malgré ces progrès, il y a un endroit où ces technologies d'imagerie ne correspondent tout simplement pas: la salle d'opération. Bien que les techniques d'imagerie du corps entier peut aider à la planification chirurgicale, ils manquent généralement des résolutions spatiales suffisamment élevées pour aider les médecins à déterminer en temps réel si tout le tissu tumoral a été enlevé ou de tissu tumoral résiduel reste caché aux marges chirurgicales 1. Faire en sorte que pas infiltrativemarges tumorales sont laissés est l'un des objectifs chirurgicaux les plus importants, et les chirurgiens doivent marcher un corde raide entre la résection des tissus rigoureux et prudent. Si trop est enlevé, les effets secondaires indésirables pour le patient sont exacerbés; si trop peu est enlevé, les taux de récidive sont augmentés de 2, 3. Par conséquent, il est essentiel de définir des marges tumorales précises, et nous croyons que l'imagerie peropératoire chimioluminescent peut aider à améliorer la précision de l'identification des marges tumorales en aidant les chirurgiens de visualiser les tissus malins qui pourraient autrement ne pas être détectés avec des techniques établies.

Il existe de nombreuses technologies d'imagerie actuellement étudiés pour leur utilité possible que les systèmes d'imagerie peropératoire. Ceux - ci comprennent des sondes ß et γ-émettant un rayonnement 4, la fluorescence optique 5, Raman spectroscopie 6 >, 7 et Cherenkov luminescence 8, 9. À ce jour, cependant, aucune de ces sont établies comme des outils cliniques standard. l'imagerie de fluorescence optique a jusqu'ici avéré être le plus prometteur de ces techniques et est donc le plus exploré. Bien qu'il ait déjà été révélé être un outil précieux pour de nombreuses applications, il ne va pas sans limitations. En effet, son principal inconvénient est la fluorescence de fond généré par le tissu biologique intrinsèquement autofluorescents. Ce signal de fond autofluorescente est un produit de l'excitation du tissu environnant, en plus du fluorophore, par la source de lumière externe nécessaire pour la production d'un signal fluorescent. Du point de vue pratique, cette autofluorescence peut potentiellement conduire à de faibles rapports signal sur bruit, ce qui peut limiter l'utilité de cette technologie dans la salle d'opération.

Le principalavantage de l'imagerie par chimioluminescence sur l'imagerie de fluorescence est qu'aucune lumière d'excitation est nécessaire. Par conséquent, il n'y a pas de fond d'autofluorescence. En imagerie par chimiluminescence, l'énergie d'excitation est générée au lieu chimiquement. Ce procédé ne produit aucun signal de fond non voulue et peut donc entraîner une augmentation des rapports signal sur bruit. Cela pourrait finalement conduire à la détection plus précise et exacte des marges chirurgicales. Assez étonnamment, l'utilité de cette approche comme une technique d'imagerie peropératoire est restée inexplorée 10. En effet, l'exemple le plus proche de cette technique est l'oxydation du luminol par la myéloperoxydase chez les souris 11, 12, 13. imagerie biomédicale chimioluminescente est donc un domaine assez inexploré de la recherche qui pourrait offrir les avantages suivants: (1) autofluorescence minimale résultant en un signal de fond bas avec salutle rapport signal-bruit gher; (2) les longueurs d'onde accordables d'émissions chimioluminescentes allant du visible au proche infrarouge; et (3) complexes chimiluminescents fonctionnalisables qui, lorsqu'il est combiné avec les technologies de liaison et de biomolécules qui existent déjà ciblées, donnent accès à des bibliothèques entières de sondes d'imagerie moléculaire ciblées 14.

Cette étude de validation de principe illustre l'utilité potentielle d'imagerie chimioluminescent dans le milieu biomédical à l'aide d'un agent d'imagerie à base de ruthénium. Les propriétés chimioluminescentes de ce composé sont bien étudiés, des enquêtes datant du milieu des années 1960 15. Lors de l' activation chimique, l'agent produit de la lumière à environ 600 nm 16, ce qui est bien adapté à des fins d'imagerie médicale. L'énergie d'activation est fourni par une réaction d'oxydoréduction qui conduit à un état-excité qui a une durée de vie de 650 ns dans l' eau 17 -folldue par la génération de photons lors du relâchement de cet état excité. Grâce à l'utilisation d'un nébulisateur à distance spécialement conçu, nous avons pu détecter le composé à la fois ex vivo et in vivo. Les résultats des premières expériences sont très prometteurs, ce qui suggère une enquête plus approfondie de cette technologie.

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Protocol

Déclaration éthique: Tous les in vivo des expérimentations animales décrites ont été réalisées selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC).

1. Construction d'un dispositif de nébulisation

  1. Fixer le bois de la partie A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en position verticale dans le centre de la partie B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) à l' aide de deux vis (4 x 25 mm 2). Fixer le bois de la partie C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) au milieu de la partie A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) à l' aide d' une vis, de telle sorte que la partie C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) peuvent encore être déplacés. Voir Figure 1.
  2. Percez deux trous à travers l'extrémité inférieure de la gâchette de la bouteille de pulvérisation d'un mini-pulvérisateur 3 oz plastique (D) et pousser une tige en acier inoxydable (10 cm de "acier 1/16) (E) à travers pour former deux boucles, l'une des deux côté de la gâchette. Enveloppez la partie inférieure de la bouteille de pulvérisation avec du ruban adhésif (F) pour empêcher les attaches de câble de glisser. Fixer la bouteille à bois partie C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) en utilisant les deux attaches de câble en plastique (28 cm) (G) de pulvérisation.
  3. Coupez le moteur 011 d'asservissement (I) et de le reconnecter avec les câbles en vrac de la commande d'asservissement (H). Ensuite, fixez le servo - moteur vers le haut de la partie A du bois (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en utilisant du ruban adhésif.
  4. Fixer un crayon (J) sur le levier de servo-moteur à l'aide du trombone (K). connecter Étroitement les parties les plus externes du crayon pour les boucles de tige en acier à l'aide de fils de torsion en plastique couverte (L) et fixer les extrémités sur le crayon avec du ruban adhésif.
  5. Coupez le connecteur du câble magnétique de l'unité de commande de servo-moteur (M) et le remettre en place le câble de haut-parleur (N). Ensuite, collez l'unité servo de commande du moteur à bois partie B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Couper un câble w1 avec des connecteurs magnétiques en deux et fixer une partie à l'extrémité libre du cuivre scâble peaker (1 m). Connectez le (magnétique) i2 interrupteur à bascule et la puissance de p1 au câble w1 disponible et une batterie de 9V.

2. Sensibilité Détermination de la méthode

  1. Dans un tube de centrifugation de 1,5 mL, préparer des solutions de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans l' eau d'osmose inverse (100 pi) dans des quantités de 260 ug (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 pg (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 pg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), et 3 ng (3,5 pmoles).
  2. Mélanger 100 ul de chaque [Ru (bpy) 3] Cl 2 solution avec 100 ul d'une solution aqueuse de nitrate d' ammonium et de cérium ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) dans l' eau (25 mM) sur une lame de microscope.
  3. Mettre en place l'acquisition dans le lecteur de bioluminescence par l' initialisation du logiciel d'imagerie.
    1. Connectez-vous au profil de l'utilisateur et recherchez le acquipanneau de contrôle d 'opposition. Cliquez sur "Initialiser" et attendre que l'appareil est prêt.
    2. Recherchez "Mode Imaging" et assurez-vous "luminescent" et "Photo" sont vérifiées et que "Fluorescent" est décochée.
    3. Change "temps d'exposition" réglage pour "luminescent" à 20 s. Définissez les paramètres restants pour "luminescent" comme suit: "Binning": Medium; "F / stop": 1; et "Filtre d'émission": Open.
      REMARQUE: Les temps d'exposition pourraient devoir être adaptés en fonction de l'instrumentation et le réglage expérimental utilisé, si différente de la configuration présentée.
    4. Pour "Photo," utiliser les paramètres suivants: "Temps d'exposition": Auto; "Binning": Medium; et "F / stop": 8. Réglez le "Sujet Hauteur" selon l'imagerie target.Look pour le menu «Field of View" déroulante. Le réglage initial est "C" Changer à "B" (14 cm de distance entre le cAmera et le stade de l'échantillon).
  4. Mettre en place le nébulisateur en plaçant une lame de microscope sur une feuille de papier noir sur le plancher de la chambre d'imagerie pour la protéger de l'agent oxydant. Mélanger 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution avec 100 pi d'une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Observer la boîte réticule vert.
    1. Placez le sujet d'imagerie sur le papier de construction noir, de telle sorte que la zone d'intérêt est dans le centre du vert boîte à lumière réticule apparaît sur la scène de l'échantillon. Préparer le nébuliseur en détachant le flacon pulvérisateur en plastique du support en bois. Remplir une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l'eau / éthanol) dans son réservoir en matière plastique et le remettre en place sur le support en bois.
    2. Placez le nébuliseur à l'intérieur du lecteur de bioluminescence et assurez-vous que le cordon d'alimentation est débranché de la corde du nébuliseur. Assurez-vous que l'interrupteur d'alimentationest activée, l'interrupteur à bascule est éteint, et le voyant rouge est allumé Placer le nébuliseur de telle sorte que le débit de pulvérisation est dirigé vers la zone d'intérêt sur le sujet d'imagerie, tout en minimisant l'obstruction de la vue de la caméra vers l'objet d'imagerie par la tête de buse de pulvérisation.
    3. Placez de petits morceaux de papier noir de construction sur tous les points chauds potentiels (par exemple, des marques blanches sur des lames microscopiques ou des sites d'injection) pour les protéger des embruns. La place d'au moins 40 cm de câble à distance du nébuliseur dans la chambre d'imagerie, de telle sorte qu'elle ne gêne pas le sujet d'imagerie, le nébulisateur, ou le verrou de porte magnétique. Fermez la porte du système d'imagerie.
      NOTE: Le réticule va changer la taille sur la base du «Field of View" mise en "image vivante;" assurez-vous que cela est réglé sur "B".
  5. Acquérir une image en lançant la séquence d'imagerie. Cliquez sur "Acquérir" dans le "Panneau de configuration d'acquisition." Sur la première Sequ d'imagerierence, activer la sauvegarde automatique si on le souhaite (recommandé) et choisissez un dossier de données. Ignorer le "Edit Imaging Labels" boîte de dialogue jusqu'à la fin de la séquence.
    REMARQUE: Le logiciel de contrôle affiche les actions de l'instrument, étape par étape en temps réel. Après la préparation de la mesure et le déplacement du stade de l'échantillon à la bonne position, il ouvre l'obturateur de la caméra et compte le temps de mesure. L'ouverture de l'obturateur peut également être entendu par un bruit de clic généré par la machine.
  6. Comme l'ouverture de l'obturateur, pulvériser trois salves d'une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l'eau / éthanol, 0,24 ± 0,04 ml par pulvérisation rafale) en mettant l'interrupteur à bascule à trois reprises pour générer chimioluminescence.
    NOTE: L'étape de l'échantillon se déplace pendant la mesure. Laisser un câble suffisamment (minimum 40 cm) à l'intérieur de l'instrument pour permettre cela. Assurez-vous que la solution à pulvériser par le nébuliseur peut être aspiré par le tube ascendant et qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le tuyau. Avoir plusieurs batterie de rechanges pour le nébuliseur prêt en cas de besoin.

3. Imagerie in vivo Après injection intraveineuse systémique

  1. Dans un microtube de 1,5 ml, la préparation de 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) , solution contenant entre 8 et 33 nmoles de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Préparer une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 dans de l' eau (25 mM) en même temps.
  2. Intraveineusement injecter 100 pi de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans la veine de la queue des souris en bonne santé (n = 5).
  3. Euthanasier les souris 10 minutes après l' injection par l' intermédiaire de CO 2 asphyxie.
    1. Retirer la peau avec une coupe Y du torse, puis retirez l'arc costal dans une forme en U pour exposer le cœur et les poumons. Perfuser les souris en coupant un orifice de sortie dans l'oreillette droite et en injectant 20 ml de PBS à travers une aiguille de calibre 24 dans le ventricule gauche 18. Découpez soigneusement par le ventrela peau et exposer le rein et le foie. Couper longitudinalement à travers les organes pour créer une coupure visible.
  4. Mettre en place l'acquisition comme décrit dans les étapes 2.3-2.6, avec les modifications suivantes.
    1. Après avoir soigneusement lavé le réservoir en plastique nébulisateur, le remplir avec une solution de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 dans de l' eau (25 mM) au lieu de triéthylamine.
      NOTE: Il est important de rincer la buse du nébuliseur après chaque utilisation, car cristallisant (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 peut détruire la buse de pulvérisation après plusieurs utilisations.
  5. Utilisez l'ensemble des échantillons d'animaux ou d' organes pour l' imagerie.
    1. Pour l'imagerie de l'abdomen entier, positionner la carcasse de la souris avec l'abdomen ouvert face à la caméra et la tête pointant vers l'arrière de l'instrument. Centrer l'organe à imager (par exemple, le foie ou les reins) dans le vert boîte à lumière réticule.
    2. Fou individu imagerie d'organes et de quantification, retirez la souris de l'instrument d'imagerie et la broche vers le bas. A partir de la cavité du corps déjà ouvert, exciser les organes internes (par exemple, les reins, le foie, les poumons, les muscles, la rate, le cerveau et le cœur). Couper à travers la peau de la patte arrière pour exciser le tissu musculaire. Ouvrez soigneusement le crâne avec un scalpel pour exciser le cerveau.
      1. Si l'organe d'intérêt est le foie, les reins ou la rate, couper tous les organes dans la moitié longitudinalement, placer chaque organe sur une boîte de Pétri ou un morceau de papier de construction noir.
    3. Suivez la procédure décrite dans les étapes 2.3-2.6 pour établir l'émission relative du traceur chimiluminescent pour les organes simples.

4. Imagerie in vivo des ganglions lymphatiques

  1. Préparer 10 pi d'une solution de PBS contenant 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Préparer une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en water (25 mM) en même temps.
  2. Injecter 10 ul de la solution sous la peau dans la patte arrière de souris en bonne santé (n = 5). Comme témoin négatif, injecter la patte controlatérale avec 10 pi de pur PBS. Sacrifiez les souris via CO 2 asphyxie 15 min après l'injection. Enlever la peau sur les deux pattes arrière pour exposer les canaux lymphatiques jusqu'aux ganglions lymphatiques poplités.
  3. Mettre en place l'acquisition telle que décrite à l'étape 3.4.
  4. Retirer les ganglions lymphatiques poplités des deux pattes arrière, les couper en deux et les pulvériser avec oxydant sur une boîte de Pétri, comme décrit précédemment (étape 3.5.3), aux fins de quantification.

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Representative Results

Le système de nébuliseur décrit dans la section 1 du protocole peut être construit à partir de matériaux facilement disponibles à un faible coût. Il est destiné à être un encart pour la télécommande déclenché par pulvérisation du réducteur / agent oxydant à l' intérieur d' un lecteur de bioluminescence (figure 1). Notre conception permet le fonctionnement en toute sécurité du nébuliseur dans le lecteur de bioluminescence à une distance de 14 cm de la lentille. Pas de buée ou de flou de la lentille a été observée lors de l'opération. Nous avons choisi l'agent chimioluminescent disponible dans le commerce [Ru (bpy) 3] Cl 2 pour le développement de notre méthode basée sur son faible prix, la stabilité en solution aqueuse, le comportement redox bien décrit, et les propriétés chimioluminescentes (Figure 2) 19. Le signal détectable minimale peut être déterminée comme décrit dans la section 2 du protocole par oxydation d' une goutte de [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 pi, 6,9 pmol- 347 nmol dans H 2 O) avec (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 ul, 25 mM) sur une lame de microscope. Ensuite, en utilisant le nébuliseur et la pulvérisation d'une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l'eau / éthanol), le signal chimioluminescent est déclenché. Dans notre cas, le signal détectable minimal a été déterminé à 6,9 pmol / cm 2 (Figure 3). Il est concevable, cependant, que d'optimiser les conditions de réaction, les sensibilités de la caméra, les temps d'obturation, les volumes et les concentrations de réactifs pourraient conduire à des seuils de détection encore plus bas. Ces conditions de réaction peuvent également être utilisés pour explorer et de tester la chimioluminescence de toute combinaison donnée de complexes métalliques, des agents oxydants et réducteurs.

Déplacement des expériences in vivo dans les sections de protocole 3 et 4, les femmes nues souris (consanguine) 5-6 semaines et NU / J souris mâles âgées de 6-8 semaines ont été utilisés. Pour les injections intraveineuses, les montants de8-33 nmoles de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans 100 ul de PBS par souris (n = 5) ont été choisis. Les animaux ont été sacrifiés 10 min après l'injection et la cavité abdominale a été exposé. Les souris ont été placées dans le lecteur de bioluminescence avec le nébulisateur pointant vers le tissu d'intérêt (figure 4). Pour l' imagerie par voie intraveineuse injecté [Ru (bpy) 3] Cl 2, le signal de chimioluminescence a été détectée principalement dans les reins, ce qui suggère fortement l' élimination rénale de la petite molécule hydrophile (figure 5). -Signal-bruit rapports pour les souris injectées avec [Ru (bpy) 3] Cl 2 par rapport à du PBS étaient 27/1 pour le rein et 21/1 pour le foie. Pour le noeud d' imagerie lymphatique, 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl2 dans 10 ul de PBS ont été injectées par voie sous - cutanée dans le coussinet de la patte arrière de souris (n = 5). Les souris ont été sacrifiées 15 après l' injection min par asphyxie au CO2. La peau qui recouvre les deux jambes wa arrière intérieures enlevée pour exposer le muscle, les ganglions lymphatiques et les vaisseaux lymphatiques. Visualisation chimioluminescent ultérieure des ganglions lymphatiques poplités a conduit à l'observation que les ganglions lymphatiques contenant [Ru (bpy) 3] 2+ montrer 10 ± 4,3 fois l' éclat plus élevé que ceux non traités (167,000 p / (s × cm 2 × sr) et 17 000 p / (s cm × 2 × rs), P <0,028) (figure 6).

Figure 1
Figure 1: Photographie du nébuliseur. Parties utilisées: parties de la structure en bois (A, B, C), une bouteille de pulvérisation (D), tige d'acier pliée (E), du ruban adhésif (F), attaches de câble en plastique (G), 011 connecteur servo partie (H), le moteur servo (I), crayon ( J) détenu par trombone déplié (K), les attaches métalliques des plastiques couverts (l) connecteur de fil de w1 (M) et le câble de haut-parleur (N) conduisant à la batterie. Ce chiffre est basé sur la recherche initialement publié en reférence 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Propriétés de [Ru (bpy) 3] 2+. Structure (A) et spectres d' excitation et d'émission (B) de [Ru (bpy) 3] 2+. L'oxydation / réduction cycle catalytique chimioluminescence sur (C). Ce chiffre est basé sur la recherche publiée originalement en référence 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3: seuil de détection de [Ru (bpy) 3] 2+. les intensités de signaux représentatifs à des concentrations différentes de [Ru (bpy) 3] 2+ sur une lame de microscope (A). Imaging quantification du signal avec un seuil de détection (ligne rouge pointillée) et le fond (noir ligne pointillée) (B). Ce chiffre est basé sur la recherche publiée originalement en référence 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: chimiluminescence Imaging. Dessin schématique d'une souris et d' un nébulisateur placé dans le lecteur de bioluminescence (A g>) et schéma (B) du nébuliseur pulvérisation d'une souris. Ce chiffre est basé sur la recherche publiée originalement en référence 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Détection de [Ru (bpy) 3] 2+ après administration systémique. La lumière blanche, chimioluminescence, et la superposition (de gauche à droite). Des images d'une cavité du corps de la souris qui a été injecté avec 33 nmol de [Ru (bpy) 3] 2+ et pulvérisé avec (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Les pointes de flèches blanches vers le rein droit. Ce chiffre est basé sur la recherche publiée originalement en référence 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Détection de [Ru (bpy) 3] 2+ après l' administration sous - dermiques. Poplitée imagerie ganglionnaire montrant la lumière blanche, chimiluminescence et images composites pour les souris injectées avec [Ru (bpy) 3] 2+ ( en haut) et PBS ( en bas) dans les membres postérieurs; 80 nmol dans 10 ul de PBS, imagée 15 min après l' injection (A). La lumière blanche et des images composites pour [Ru (bpy) 3] 2+ ( en haut) et PBS ( en bas) -Traité excisées ganglions lymphatiques poplités (B). Quantification des signaux chimiluminescents pour PBS et [Ru (bpy) 3] 2+ ganglions traités par (C) .La données représente la moyenne ± écart - type. Ce chiffre est basé sur la recherche à l'originepublié inreference 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ici, nous présentons une technologie qui est capable de délimiter le tissu optiquement par l'intermédiaire de l'émission de photons créés par un rapporteur chimioluminescent. Contrairement à d' autres, plus établi, les technologies 4, 5, 6, 7, 8, 9, ce système rapporteur chimioluminescent utilise une sonde d'imagerie qui est non-radioactif et facilite la détection des niveaux de sensibilité très élevée. Peut-être plus important encore, l' imagerie par chimioluminescence ne nécessite pas une source de lumière incidente (comme dans l' imagerie par fluorescence optique) 20, une caractéristique qui minimise autofluorescence et réduit drastiquement les signaux de fond.

Le rapporteur de ruthénium [Ru (bpy) 3] Cl 2 présente in vivo une toxicité tolerable pour des fins d'imagerie (intLD souris raperitoneal 50: 20 mg / kg) 21 est soluble dans l' eau (jusqu'à 8 mM) et est stable dans la circulation sanguine. Les propriétés physico - chimiques du complexe métallique sont bien caractérisés et ont déjà été étudiés pour la thérapie photodynamique du cancer 22, 23. L'agent oxydant (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 a été rapporté que très faible toxicité (LD chez le rat par voie orale 50: 1600 à 3200 mg / kg) 24 et est soluble dans l' eau à des concentrations allant jusqu'à 2,57 M à 20 ° C 25. Dans cet article, une démonstration visuelle ainsi que des conseils à base de texte pour la construction d'un dispositif de nébulisation téléopéré sont présentés. En outre, nous fournissons des protocoles robustes pour réaliser l'imagerie de chimioluminescence dans un dispositif d'imagerie par bioluminescence standard. Nous illustrons l'utilisation de [Ru (bpy) 3] Cl 2 pour les visualizatisur des tissus après deux injections intraveineuses et sous-cutanés chez les souris.

Cependant, comme avec toute autre technologie d'imagerie naissante, il y a place à l'amélioration de nos protocoles. Nous pensons que cette étude de validation de principe pourrait stimuler le développement de multiples applications de chimiluminescence pour les systèmes vivants. Les points suivants pourraient être abordés afin d'améliorer encore la technologie et d'élargir son champ d'application.

Une deuxième génération plus petite des dispositifs de pulvérisation déclenchées à distance permettrait l'échantillon à être plus proche de la caméra, d'où l'amélioration de la résolution spatiale. équipement optique amélioré pourrait encore améliorer les limites de détection de la méthode. Le protocole pourrait également être étendue à l'imagerie des animaux vivants. le contrôle exact du couple (en courant et tension) permettrait un contrôle plus précis du volume de réactif libéré à chaque pulvérisation. Il est important de garder le nébuliseur bien entretenu. Pas de rinçage du nébuliseur peut détruire le jeu de busele. Une nouvelle batterie est cruciale pour la bonne exécution du nébuliseur. Cependant, tous les matériaux utilisés pour le nébuliseur sont peu coûteux et facilement disponibles dans le commerce. Suivant des protocoles de synthèse établis, le [Ru (bpy) 3] 2+ complexe peut être facilement modifié avec divers agents de liaison, y compris 26 des maléimides, les amines 27 et les esters NHS 28, 29. Cela permettrait à la bioconjugaison de petites molécules, des peptides ou des anticorps, et faciliterait donc le ciblage moléculaire spécifique 30, 31, 32, 33. En fin de compte, la livraison de la sonde ciblée pourrait permettre aux chirurgiens d'identifier de petites lésions et de délimiter avec précision les marges chirurgicales dans la salle d'opération avec une très grande spécificité. En outre, l'encapsulation du hautement soluble dans l'eau [Ru (bpy) 3] 2+ dans les nanomatériaux , à la fois ciblées et non ciblées, peut également permettre la visualisation des lésions alors qu'ils sont chirurgicalement enlevés 34, 35, 36. Enfin, la modification de la sphère de la journaliste complexe métallique de coordination et / ou changer le centre de métal de transition lui-même représentent des itinéraires attractifs pour moduler et affiner les longueurs d' onde d'émission dans le visible et les gammes NIR 37, 38.

imagerie peropératoire chimioluminescence a besoin d'un journaliste chimioluminescent et, dans notre cas, un oxydant, qui ne peut être utilisé dans les limites de leur toxicité et leur solubilité. Les membranes de tissus peuvent représenter une barrière pour la diffusion de l'agent d'oxydation dans le tissu, et par conséquent, la génération de signaux. Depuis le journaliste chimioluminescent est seulement de générer un photon par cycle, le signal généré est plutôt faible.La lumière ambiante dans la salle d'opération devra donc être empêché d'entrer dans l'appareil alors que la technique est en cours d'utilisation. Cela pourrait rendre ICI particulièrement intéressant pour le développement d'applications laparoscopiques, où la lumière ambiante est naturellement exclue.

Nous espérons que cette méthode peut se transformer en un outil précieux pour les chirurgiens dans la salle d'opération. L'absence de radioactivité est bénéfique à l'équipe du patient et de fonctionnement semblables et fait moins de précautions de sécurité nécessaires, ce qui pourrait rendre cette technique dans une alternative plus attrayante.

Le bon fonctionnement du nébuliseur et son positionnement jouent un rôle crucial pour l'obtention de bons résultats. les angles et les zones sous-optimales peuvent contribuer à signaler la variance. Le câble de commande doit être mis à travers la porte avec soin, et assez de câble doit rester à l'intérieur du lecteur de bioluminescence de sorte qu'il est pas à l'étroit ou arraché.

En fin de compte, chemiluimagerie minescence est une nouvelle approche extrêmement attrayant pour l'imagerie moléculaire. Il est basé sur une base de la chimie bien établie, emploie des matériaux peu coûteux et facilement disponibles, et évite à la fois le rayonnement et les sources de lumière d'excitation. En conséquence, nous sommes à la fois espoir et confiant qu'à l'avenir, l'imagerie par chemiluminescence pourrait avoir un effet profond sur le traitement chirurgical de la maladie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

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References

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