स्व-प्रतिरक्षात्मकता खिलाफ स्टेम सेल व्युत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं के विकास

Immunology and Infection

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Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

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Abstract

स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों प्रतिरक्षात्मक आत्म सहिष्णुता की कमी के कारण उत्पन्न होती हैं। विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) immunologic आत्म सहिष्णुता की महत्वपूर्ण मध्यस्थों हैं। , चूहों और इंसानों में परिपक्व सीडी 4+ टी सेल उप-जनसंख्या के 10% के बारे में 1 के साथ - - Tregs के बारे में 5 प्रतिनिधित्व करते हैं उन Tregs परिधीय रक्त में घूम के 2%। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) कार्यात्मक Tregs है, जो एक संभावित स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों की सेल आधारित चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है में भेदभाव किया जा सकता है। यहाँ, हम IPSCs से प्रतिजन (एजी) विशिष्ट Tregs (यानी, IPSC-Tregs) विकसित करने के लिए एक तरीका मौजूद है। विधि IPSCs में प्रतिलेखन कारक Foxp3 और एक एजी विशेष टी सेल रिसेप्टर (TCR) को शामिल करने और फिर OP9 stromal कोशिकाओं पायदान व्यक्त पर फर्क पर आधारित है डेल्टा-तरह (डीएल) 1 और DL4 ligands। इन विट्रो भेदभाव के बाद, IPSC-Tregs सीडी 4, सीडी 8, CD3, CD25, Foxp3, और एजी- विशिष्ट TCR व्यक्त करने और एजी उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं।इस पद्धति को सफलतापूर्वक एक murine मॉडल में स्व-प्रतिरक्षित गठिया के सेल आधारित चिकित्सा करने के लिए लागू किया गया है। एजी प्रेरित गठिया (एआईए) -bearing चूहों में इन एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs के दत्तक हस्तांतरण संयुक्त सूजन को कम करने और सूजन और हड्डी हानि को रोकने के लिए की क्षमता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों पेनसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज चिकित्सा पशु की देखभाल समिति की (IACUC प्रोटोकॉल # 45470) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं और आकलन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन के दिशा-निर्देशों के अनुपालन में आयोजित की जाती हैं।

1. स्टेम सेल संस्कृति

  1. 10 0.1% जिलेटिन की कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (इनक्यूबेटर) में क्रम में कोट करने के लिए प्लेट मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी पकवान सेते हैं।
  2. पकवान और थाली 3 एक्स 10 6 से जिलेटिन हटाये किरणित SNL76 / 7 कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस (इनक्यूबेटर) में एक दिन के लिए सेते हैं 10% DMEM मीडिया (10% FBS और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) का उपयोग।
  3. प्लेट और SNL76 / 7 सेल फीडर परत IPSC मीडिया का उपयोग करने पर संस्कृति thawed IPSCs से मीडिया निकालें (DMEM 15% भ्रूण बछड़ा सीरम, 0.1 mmol / एल गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 1 mmol / एल एल glutamine युक्त मीडिया, और 0.1 mmol / एल β-mercaptoethanol) 9। माउस आईपीएस MEF एनजी-20D -17 सेल लीजो Oct3 / 4, Sox2, Klf4, और सी Myc के रेट्रो वायरल अभिकर्मक द्वारा माउस भ्रूण fibroblasts से प्रेरित किया गया था, पूर्वोत्तर, डॉ शिन्या यामानाका (इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल साइंसेज फ्रंटियर के लिए क्योटो विश्वविद्यालय, क्योटो, जापान) से प्राप्त हुई थी।
  4. ताजा मीडिया के साथ 3 दिन मीडिया को बदलें और माइक्रोस्कोप के नीचे IPSC कालोनियों का निरीक्षण।
    नोट: इन कालोनियों छोटे, चमकदार समूहों या एक स्पष्ट एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे GFP अभिव्यक्ति दिखा सीमांकन के साथ गोल कोशिकाओं रहे हैं।

2. एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs की इन विट्रो भेदभाव में

  1. निर्माणों उत्पन्न MiDR-TCRα -2 ए-TCRβ -2 ए-Foxp3 का निर्माण करने के लिए MiDR प्लाज्मिड 10 आत्म-cleaving पेप्टाइड 2A के साथ जोड़ा में उप-क्लोनिंग OT-द्वितीय TCR जीन और Foxp3 द्वारा रेट्रोवायरल पारगमन में इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. पैकेजिंग सेल लाइन के रूप में बेनी ई कोशिकाओं का उपयोग IPSCs की रेट्रोवायरल पारगमन 9 प्रदर्शन करना।
  3. 0 दिन, बीज OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं एकजिसमें 20% एफसीएस और 2.2 जी / एल सोडियम बाइकार्बोनेट। प्रति प्लेट 10 सेमी पकवान 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं ओपी -9 मीडिया (α सदस्य मीडिया का उपयोग करके 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी की टा न्यूनतम घनत्व।
  4. आइए बी कोशिकाओं ओपी -9 मीडिया में - 3 दिन, जब OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं 80-90% मिला हुआ हो, मीडिया को हटाने और 0.5 बीज - OP9-DL1-DL4 पर 1 x 10 5 IPSCs।
    नोट: यह OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं पर IPSCs के सह-संस्कृति को स्थापित करता है और भेदभाव 9 0 दिन माना जाता है।
  5. 5 दिन पर, आकांक्षा से 10 सेमी पकवान से मीडिया को दूर 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, और पीबीएस aspirate। 0.25% trypsin के 4 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। IPSC मीडिया का एक और 8 मिलीलीटर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को जोड़ने, उन्हें फिर से निलंबित, और।
    1. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और IPSC मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एक ताजा 10 सेमी पकवान पर इन फिर से निलंबित कोशिकाओं को सेतेऔर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में लौटने।
      नोट: OP9-DL1-DL4 आइए फीडर कोशिकाओं को हटाने और मीडिया में चल फर्क IPSCs रहते हैं। आगे सह संस्कृति के लिए 90% confluency - बनाए रखें OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं लगातार हासिल करने के लिए 80।
    2. 30 मिनट के बाद, चल कोशिकाओं को इकट्ठा एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से उन्हें फिल्टर, और एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती।
  6. बीज 5 एक्स 10 IPSCs के 5 नए सिरे से 80 - OP9 मीडिया में OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं का 90% मिला हुआ। 5 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में mFlt-3L साथ मीडिया अनुपूरक।
  7. 8 दिन, पकवान अपने आप में एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने से मीडिया के साथ प्लेट धोने से आंशिक रूप से भेदभाव कर IPSCs इकट्ठा। डिश में ओपी -9 मीडिया का एक और 5 मिलीलीटर का प्रयोग धीरे सावधान, सशक्त pipetting द्वारा अर्द्ध पक्षपाती कोशिकाओं को धोने के लिए इतनी के रूप में डिश के तल पर OP9 monolayer तोड़ने के लिए नहीं। पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ धोने दोहराएँ सभी अर्द्ध विज्ञापन फसल के लिएHerent कोशिकाओं का फर्क।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर दोनों washes, सेंट्रीफ्यूज का मिश्रण है, OP9 mFlt-3L (5 एनजी / एमएल) और मिल-7 (1 एनजी / एमएल) युक्त मीडिया के 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित, और एक 70 के माध्यम से फिल्टर माइक्रोन सेल झरनी।
  8. 6 अच्छी तरह से संस्कृति 80 युक्त थाली में कोशिकाओं स्थानांतरण - 90% मिला हुआ OP9-DL1-DL4 आइए कोशिकाओं बी, 1.1 चरण में के रूप में। स्थानांतरण कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में एक 10 सेमी पकवान से काटा।
  9. 10 दिन, mFlt-3L (5 एनजी / एमएल) और मिल-7 (1 एनजी / एमएल) के साथ पूरक ताजा OP9 मीडिया के लिए कोशिकाओं से मीडिया के परिवर्तन आधा। इस चरण को दोहराएँ हर दो दिन।
  10. हर 4-6 दिनों के विकास पर निर्भर करता है, फिर से बीज OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं की एक परत के साथ ताजा प्लेटों पर फर्क IPSCs, 1.1 चरण में वर्णित है।

3. इन विट्रो Treg भेदभाव और परिपक्वता का मूल्यांकन

  1. फर्क IPSCs के morphological परिवर्तन।
    1. मोnitor OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं के साथ IPSCs के सह संस्कृति एक पारंपरिक brightfield माइक्रोस्कोप (20X) के तहत जीवित कोशिकाओं को देख कर हर रोज। 5 दिन तक, इस तरह चपटा कोशिकाओं के रूप में mesoderm तरह विशेषताओं, साथ कालोनियों का निरीक्षण। 8 दिन तक, कोशिकाओं के छोटे, गोल समूहों, जो फर्क कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते निरीक्षण करते हैं।
    2. Trypan नीले अपवर्जन विधि का प्रयोग संख्या और जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत का पता लगाने के लिए कोशिकाओं की गिनती करने के लिए। hemocytometer पर चार ग्रिडों के भीतर कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के रूप में सेल व्यवहार्यता की गणना। यदि कोशिकाओं trypan नीले रंग ले, उन्हें मृत या अलाभकारी पर विचार करें। संस्कृति से काटा जीवित कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड।
  2. IPSCs फर्क के प्रवाह cytometry विश्लेषण।
    1. दिन 5, 7, 11, 15, 19, 21, और सह-संस्कृति के 28, चरण 25 में के रूप में 0.25% trypsin के साथ कोशिकाओं को हटा दें।
    2. विभिन्न fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ सतह धुंधला करने से पहले, incubatई एफसी अवरोधक 2.4G2 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस (अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोग्राम / एमएल) में पतला के 100 μl के साथ 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं कोशिका की सतह पर एफसी रिसेप्टर के लिए एंटीबॉडी के बंधन को रोकने के लिए।
    3. दिन 5, 7, 11, 15, 19, 21, और 28 पर, 1 x 10 6 कोशिकाओं के प्रवाह के लिए cytometry विभिन्न fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ CD3, TCRβ, सीडी 4, सीडी 8, CD25 सहित कोशिका की सतह मार्कर, पता लगाने के लिए उपयोग करते हैं, और CTLA4।
    4. एफसी ब्लॉक के बाद, कोशिकाओं पीबीएस के 10 मिलीग्राम और दाग के साथ विभिन्न fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धो लें, और फिर प्रवाह cytometer 15-रंग के साथ प्रवाह cytometric विश्लेषण करते हैं। पीबीएस के 100 μl में पतला 10 6 कोशिकाओं प्रति एंटीबॉडी की 0.200 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें।
    5. 28 दिन पर, 11 प्रवाह cytometry और सीडी 4 + सीडी 8 + सीडी 4 और सीडी 8 fluorochrome संयुग्मित धुंधला का उपयोग कोशिकाओं पर गेट से कोशिकाओं का विश्लेषण; TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण-4, और Foxp3 (चित्रा 1)। Foxp3 धुंधला के लिए, कोशिकाओं को ठीक करने और उन्हें permealize और फिर एंटीबॉडी धुंधला 11 प्रदर्शन करते हैं।
  3. IPSCs के इन विट्रो प्रतिजन उत्तेजना में।
    1. सह संस्कृति अस्थायी कोशिकाओं को इकट्ठा करके संस्कृतियों से, फसल IPSC-Tregs के 28 दिन। (2.5 कदम के रूप में) 0.25% trypsin के साथ कोशिकाओं के बाकी Trypsinize और IPSC मीडिया के 8 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। कमरे के तापमान पर 400 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित मीडिया aspirate, और फिर से।
      1. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नया 10 सेमी डिश में फिर से निलंबित कोशिकाओं को सेते हैं और अस्थायी कोशिकाओं को इकट्ठा। ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली 11 में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया के 200 μl में 5 माइक्रोन के ovalbumin पेप्टाइड के साथ चूहों (ओवीए 323-339) - / - C57BL / 6 Rag1 की spleens से 3 एक्स 10 6 splenocytes सेते हैं।
    3. ओवीए 323-339 साथ Tregs मिक्स एक 1 पर splenocytes: 4 अनुपात (0.75 x 10 6 Tregs उपयोग करें)। 40 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पिछले 4 घंटे में, संस्कृति (वास्तविक एकाग्रता 1,000x, 1x संस्कृति मीडिया में पतला) में पतला Brefeldin ए के 4 μl जोड़ें।
    4. (2.5 कदम के रूप में) 0.25% trypsin के साथ हार्वेस्ट कोशिकाओं, 10% NaN 3 और 0.5 एम EDTA समाधान (FACS बफर), ब्लॉक से धो लें पतला (अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोग्राम / एमएल) एफसी अवरोधक 2.4G2, और दाग के 100 μl के साथ सतह मार्कर, सीडी 4, सीडी 8, TCRVα2, और TCRVβ5 कदम 3.2.3-3.2.4 में के रूप में लिए।
    5. पीबीएस में एक 4% paraformaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और कोशिका की सतह धुंधला के बाद 1x permeabilization बफर के 100 μl के साथ permeabilize। सावधानी! Paraformaldehyde, allergenic कैंसर, और विषैला होता है।
    6. fluorochrome संयुग्मित TGF-β और आईएल -10 अंधेरे में 20 मिनट के लिए के साथ कोशिकाओं दाग। एंटीबॉडी की 0.200 माइक्रोग्राम / 10 6 कोशिकाओं का प्रयोग dilutपीबीएस के 100 μl में एड। 15-रंग प्रवाह cytometer (चित्रा 2) के साथ TGF-β और आईएल -10 के intracellular उत्पादन का पता लगाने।
    7. कोशिकाओं ठंड FACS बफर प्रवाह cytometric विश्लेषण करने से पहले 11 के साथ तीन बार धोएं।
  4. एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs की विवो हठ में।
    1. OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं पर सह संस्कृति के 8 दिनों के बाद, हस्तांतरण IPSC व्युत्पन्न पूर्व Tregs (Thy1.2) एक के माध्यम से कदम तेरा 1.1 congenic चूहों में 3.3.1 (4-6 सप्ताह वर्ष) के रूप में संज्ञाहरण के बिना पूंछ नस में इंजेक्शन। पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करने से पहले 5 मिनट के लिए एक अवरक्त दीपक का उपयोग नस पूंछ चौड़ा करना। पूंछ नस फैलाव के बाद, एक restrainer में माउस और adoptively हस्तांतरण 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्शन लगाने के द्वारा पीबीएस के 200 μl में resuspended जगह है।
    2. छह हफ्ते Treg हस्तांतरण के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 asphyxiation द्वारा चूहों euthanize। सुनिश्चित करें कि Miसीई साँस नहीं ले रहे हैं। पेरिटोनियम कैंची और संदंश का उपयोग की बाहरी त्वचा को काटने और धीरे आंतरिक त्वचा पेरिटोनियल गुहा की परत बेनकाब करने के लिए इसे खींच वापस द्वारा पेरिटोनियल गुहा खोलें। तिल्ली और इंजेक्शन तेरा 1.1 congenic चूहों के परिधीय लिम्फ नोड्स अलग।
    3. यांत्रिक तोड़ने का उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन उपज के लिए तिल्ली और लिम्फ नोड्स से कोशिकाओं को ले लीजिए। लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए एसीके lysis बफर के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। लीजिए और ठंड FACS बफर के 10 मिलीलीटर के साथ शेष splenocytes या लिम्फोसाइट धो लें।
    4. धोने के बाद, पतला fluorochrome संयुग्मित विरोधी तेरा 1.2 एंटीबॉडी के 100 μl के साथ कदम 3.2.2 और दाग के रूप में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एफसी अवरोधक 2.4G2 के साथ कोशिकाओं का इलाज।
    5. FACS बफर के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और प्रवाह के लिए cytometric विश्लेषण 11 आगे बढ़ें।

4. विवो परिपक्वता में और स्व-प्रतिरक्षित गठिया का दमन

  • 2.1 कदम के रूप में निर्माणों उत्पन्न करता है।
  • 2.2 कदम के रूप में रेट्रोवायरल पारगमन 9 प्रदर्शन करना।
  • विवो भेदभाव और चूहों में गठिया प्रेरण में।
    1. अंतर OT-द्वितीय TCR / Foxp3-transduced IPSCs (ओटी द्वितीय Foxp3 / IPSCs), साइटोकिन्स mFlt-3L की उपस्थिति में OP9-DL1-DL4 आइए stromal कोशिकाओं पर Foxp3-transduced IPSCs, और DsRed transduced IPSCs और 2.6 - लाख 7 8 दिनों के लिए कदम 2.1 में वर्णित है।
    2. Trypisinize 10 सेमी की थाली और से कोशिकाओं के सभी तीन प्रकार के ताजा मीडिया के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक 10 सेमी की थाली से कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एक ताजा 10 सेमी की थाली के लिए कोशिकाओं जोड़ें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में लौटने। 30 मिनट के बाद, अस्थायी कोशिकाओं को इकट्ठा।
    3. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती सेल समूहों को हटाने और एक hemocytometer का उपयोग गिनती करने के लिए। ठंड पीबीएस में 1.5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को समायोजित करें और यदि आवश्यक हो तो फिर फिल्टर। चूहों में दत्तक सेल हस्तांतरण जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें। 3.4.1 में वर्णित के रूप में पूंछ नस के माध्यम से 6 सप्ताह पुरानी महिला C57BL / 6 चूहों - 4 के तीन अलग-अलग समूहों में (3 एक्स 10 6 कोशिकाओं) सेल निलंबन के 200 μl इंजेक्षन
    4. सेल हस्तांतरण के बाद 10 दिन, साथ 100 MBSA की माइक्रोग्राम 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके पूंछ के आधार पर Freund की पूरी सहायक में emulsified चूहों इंजेक्षन।
    5. 17 दिन, एक isoflurane vaporizer (IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार) का प्रयोग चूहों anesthetize। प्रेरण के लिए 5% isoflurane और 1 - - रखरखाव के लिए 2% 4 का उपयोग। 20 माइक्रोग्राम MBSA का इंट्रा-जोड़ इंजेक्शन द्वारा गठिया सही संयुक्त घुटने में 10 μl पीबीएस में बाएं घुटने संयुक्त 20 माइक्रोग्राम MBSA और 100 माइक्रोग्राम प्रति पूरी ओवीए में और के 10 μl पीबीएस में प्रेरित। खाद्य और एक gelpack बिस्तर फर्श पर रखा जा सकता है के बाद गठिया विकसित की है। चूहे euthanized किया जाएगा: शारीरिक स्थिति स्कोर 2/5 या मरणासन्न, गंभीर दुर्बलता और / या लगातार लेटना (एक 24 घंटे की अवधि) के (BCS), और गंभीरता 4. स्कोर में4, पर्विल और गंभीर सूजन टखने, पैर और अंक, या अंग की ankyloses धरना।
  • OT-द्वितीय TCR / Foxp3-transduced IPSCs की विशेषता।
    1. Unfixed लाइव DsRed + GFP + कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (20X) का प्रयोग करें।
    2. दोनों पश्चिमी धब्बा द्वारा जीन एकीकरण और अभिव्यक्ति की जांच करने और 11 प्रवाह cytometry।
  • Treg विकास और परिपक्वता।
    1. सप्ताह 2, 4, 6 और सेल हस्तांतरण के बाद, चूहों euthanize। पहले चरण में सीओ 2 का 2 एल - इच्छामृत्यु के लिए, प्रत्येक पिंजरे में उपयोग 1। 5 एल / मिनट - एक बार पशु चेतना खो दिया है, के लिए 4 सीओ 2 के प्रवाह की दर में वृद्धि। सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों euthanize। तिल्ली अलग करने और पेरिटोनियम कैंची और संदंश का उपयोग की बाहरी त्वचा को काटने और धीरे आंतरिक त्वचा पेरिटोनियल गुहा की परत बेनकाब करने के लिए इसे खींच वापस द्वारा लिम्फ नोड्स नाली।
    2. एकल कक्ष निलंबन च लीजिएROM यांत्रिक टूटने से प्लीहा और लिम्फ नोड्स एक सेल झरनी और 1% IPSC मीडिया में एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग। 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर मीडिया वाले शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र। लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए एसीके lysis बफर के 5 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित। पुनः सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर। सेल गोली पुनः निलंबित और ठंड FACS बफर के साथ शेष splenocytes या लिम्फोसाइट धो लें। 3.4.4 चरणों का पालन करें - 3.4.5 और प्रवाह के लिए cytometric विश्लेषण आगे बढ़ें।
  • Intracellular धुंधला हो जाना।
    1. दिन 50 के बाद चुनौती पर, तिल्ली अलग और 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ द्वारा euthanization के बाद चूहों के लिम्फ नोड्स नाली (कदम 4.5.1 के रूप में)।
    2. एक सेल झरनी और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग यांत्रिक टूटने से प्लीहा और लिम्फ नोड्स से एकल कक्ष निलंबन लीजिए। लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए एसीके lysis बफर के 5 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर splenocytes सेते हैं। लीजिए और शेष रों धोनेplenocytes या ठंड FACS बफर के साथ लिम्फोसाइट। सतह मार्कर सीडी 4, सीडी 8, CD25, और TCRVβ5 साथ 3.2.4, लेकिन दाग - कदम 3.2.3 का पालन करें।
    3. 3.3.7 और जीने सीडी 4 + CD25 + कोशिकाओं पर intracellular साइटोकाइन उत्पादन (TGF-β और आईएल -10) IPSC व्युत्पन्न Tregs की और गेट का विश्लेषण - में 3.3.5 में वर्णित के रूप में intracellular धुंधला के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए आगे बढ़ें।
  • घुटनों में एजी-विशिष्ट Tregs की घुसपैठ और गठिया के दमन।
    1. दिन पर 7 - कदम (4.3.6 4.3) - के बाद 14 के बाद गठिया प्रेरण, चूहों सीओ द्वारा (IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार) 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था के बाद euthanize। एक बिजली क्लिपर के साथ घुटनों से बालों को हटाने और शल्य प्रक्रिया द्वारा घुटनों आबकारी।
    2. कुंद अंत कैंची से हिंद पैर में एक चीरा द्वारा पैर से त्वचा निकालें और टखने को जांघ के पार और नीचे त्वचा में कटौती। धीरे पैर और पैर की मांसपेशी को बेनकाब करने पर त्वचा छील। हटानापैर से पेशी ध्यान से संयुक्त घुटने को नुकसान पहुँचाए बिना।
      1. सिर्फ श्रोणि / कूल्हे ऊपर हिंद पैर कट और तेज विदारक कैंची का उपयोग टिबिअ काटा।
    3. 48 घंटे के लिए 4% formalin में घुटनों को ठीक करें। 2.5 एम फार्मिक एसिड का उपयोग करके घुटनों decalcify; 3 मिनट के लिए xylene में तीन बार कुल्ला, 100% इथेनॉल में दो बार कुल्ला, 95% इथेनॉल में दो बार कुल्ला, 2 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में दो बार कुल्ला, और 1 मिमी EDTA में decalcify। 20 मिनट के लिए एक उप-उबलते तापमान (90 डिग्री सेल्सियस) पर समझो।
    4. 30 मिनट के लिए तय ऊतक शांत। 4 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ यह कुल्ला और यह आयल में एम्बेड। इथेनॉल स्नान की एक श्रृंखला के माध्यम से ऊतकों निर्जलीकरण पानी विस्थापित, और फिर उन्हें मोम के साथ घुसपैठ करने के लिए। फिर मोम ब्लॉकों में घुसपैठ के ऊतकों एम्बेड। धुंधला के लिए दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर सेक्शनिंग प्रदर्शन करना। एक रपट microtome के साथ 4 माइक्रोन वर्गों तैयार करें।
    5. deparaffi के मानक प्रक्रियाओं के बाद वर्गों पर immunofluorescent धुंधला प्रदर्शन करनाnization और पुनर्जलीकरण xylene और इथेनॉल 12 का उपयोग कर।
    6. एजी पुनर्प्राप्ति के बाद 3 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में स्लाइड डुबो कर अंतर्जात peroxidase गतिविधि को ब्लॉक। गैर विशिष्ट 3% BSA में 60 मिनट के लिए एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर पीबीएस में बाइंडिंग के लिए ब्लॉक स्लाइड।
    7. अवरुद्ध समाधान में 100: 1 पतला fluorochrome संयुग्मित TCRVβ5 एंटीबॉडी के 200 μl के साथ दाग वर्गों। एक 75 में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं - 100% humidified कक्ष, और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 5 बार धो लें।
    8. एक antifade DAPI युक्त अभिकर्मक के साथ परमाणु धुंधला के लिए स्लाइड Counterstain। निश्चित है कि पूरे coverslip कवर किया जाता है बना रही coverslip को पतला DAPI धुंधला समाधान (1x पीबीएस में 300 एनएम) के लगभग 300 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड्स स्टोर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के तहत विश्लेषण तक।
  • गठिया दमन परख
    1. एक डायल गेज कैलीपर का उपयोग कर एक आधारभूत स्थापित करने से गठिया शामिल होने से पहले चूहों के दोनों घुटनों में सूजन उपाय।
    2. गठिया प्रेरण और Treg हस्तांतरण के लिए - कदम (4.3.6 4.3) का पालन करें। एक डायल गेज कैलीपर के बाद Treg हस्तांतरण के साथ माउस घुटनों उपाय।
    3. (1 दिन पर घुटने व्यास - 0 दिन पर घुटने व्यास) प्रतिशत की वृद्धि = / 0 दिन पर घुटने व्यास: घुटने व्यास में प्रतिशत वृद्धि की गणना।
  • ऊतक विज्ञान द्वारा संयुक्त विनाश और घुटनों में सूजन सेल घुसपैठ का मापन (चित्रा 4)।
    1. दिन 7 के बाद गठिया प्रेरण पर, चूहों के रूप में पहले से वर्णित euthanize और शल्य प्रक्रिया द्वारा घुटनों आबकारी। 4.7.2 - कदम 4.7.1 देखें।
    2. 4% formalin में घुटनों फिक्स, EDTA में decalcify, और आयल में एम्बेड। कदम 4.7.3 देखें
    3. दोनों घुटनों निकालें, 10% formalin में ठीक है, और Formical -4 में कड़ा हो जाना। 4 माइक्रोन पर आयल, अनुभाग में ऊतकों एम्बेड करते हैं, और hematoxyl साथ दागऔर eosin (एच एंड ई) या (कदम 4.7.7 के रूप में) सैफरैनीन हे धुंधला हो जाना और एक माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं।
    4. एक अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली के साथ हड्डी कटाव का मूल्यांकन करने के लिए एच एंड ई धुंधला प्रयोग (0: कोई अपरदन, 4: बढ़ाया अपरदन और हड्डी के विनाश)। प्रोटेयोग्लाईकैन्स के नुकसान का मूल्यांकन करने और एक अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली के साथ स्कोर करने के लिए प्रयोग करें सैफरैनीन हे धुंधला (0: प्रोटेयोग्लाईकैन्स का कोई नुकसान नहीं है, 3: प्रोटेयोग्लाईकैन्स के लिए धुंधला का पूरा नुकसान)।
      1. स्कोर करने के लिए एच एंड ई दाग स्लाइड पर भड़काऊ सेल घुसपैठ एक अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली का प्रयोग करें (: कोई सेल घुसपैठ, 4: 0 सेल घुसपैठ abounded)। एक अंधे ढंग से दोनों घुटनों का परीक्षण करके स्कोर का मूल्यांकन।
  • उच्च संकल्प सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (सूक्ष्म सीटी) प्रणाली के साथ घुटनों में हड्डी हानि के 5. मापन

    1. दिन 10 के बाद गठिया प्रेरण पर, 2% isoflurane के साथ चूहों चतनाशून्य और इमेजिंग के लिए तैयार करते हैं।
    2. स्थिति micचैम्बर में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ घुटनों के साथ ई।
    3. चूहों के घुटनों के आसपास की हड्डी वास्तुकला के vivo इमेजिंग में प्राप्त करने के लिए एक उच्च संकल्प सूक्ष्म सीटी प्रणाली का प्रयोग करें।
    4. 55 केवी पर 10.5 माइक्रोन voxel आकार, 145 μA 200 मिसे एकीकरण के समय, 211 छवियों: एक 2.2 मिमी लंबाई के साथ सूक्ष्म सीटी स्कैन, निम्नलिखित मानकों के साथ माउस घुटने के जोड़ों सहित प्रदर्शन करना।
    5. आयात सूक्ष्म सीटी आगे इमेज प्रोसेसिंग (मात्रा प्रतिपादन और परिवर्तन) (चित्रा 5) के बाद छवियों और कब्जा ललाट विमान छवियों।

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    Representative Results

    यहाँ दिखाया गया है 28 दिन पर, एजी-विशिष्ट Tregs काफी CD3 और एजी- विशिष्ट TCR, दो टी सेल मार्कर व्यक्त किया। CD3 + TCRVβ5 + आबादी सीडी 4 व्यक्त किया। CD3 + TCRVβ5 + CD4 + कोशिकाओं को भी CD25, CD127, और CTLA -4 व्यक्त की है, जो आम तौर पर स्वाभाविक रूप से टी regs (nTregs) से होने वाली में और टी कोशिकाओं ectopically Foxp3 को व्यक्त करने में ऊंचा स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं के अधिकांश। IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं में Foxp3 अभिव्यक्ति के रूप में प्रवाह cytometry (चित्रा 1) द्वारा विश्लेषण intracellular धुंधला द्वारा पता लगाया, पायदान ligand के साथ इन विट्रो उत्तेजना में जाने के बाद भी लंबे समय तक बनी रही। इसके अलावा, एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs, ऐसे TGF-β और आईएल 10 के रूप में दमनकारी साइटोकिन्स, उत्पादित जब एजी-स्पंदित splenocytes (चित्रा 2) के साथ इन विट्रो में प्रेरित किया है, यह दर्शाता IPSC-Tregs संभावित दमनकारी गतिविधियों के लिए किया था। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का पता चला ओवीए इलाज पीबीएस इलाज घुटनों से है कि अधिक Foxp3 + कोशिकाओं में उपस्थित थे; वहाँ कोई Foxp3 + DsRed + वेक्टर transduced IPSCs प्राप्त चूहों में घुटनों में मौजूदा कोशिकाओं थे। बहुत से अधिक सीडी 4 + Foxp3 + TCRVβ5 + (चित्रा 3) IPSCs प्राप्त चूहों के घुटनों MiDR-Foxp3 से MiDR-TCR-Foxp3 साथ ट्रांसड्यूस में प्रस्तुत कोशिकाओं। इन टिप्पणियों का सुझाव है कि एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs प्राप्तकर्ता चूहों में दत्तक हस्तांतरण के बाद एआईए घुटने की ओर पलायन। स्थानांतरित कर IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं में काफी सूजन घुटने में सूजन जब ओवीए उपस्थित थे कमी आई है, लेकिन नियंत्रण घुटने कि केवल murine मॉडल में MBSA साथ इंजेक्ट किया गया था (चित्रा 4) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा; सेल हस्तांतरण घुटने उच्च संकल्प सूक्ष्म सीटी प्रणाली (चित्रा 5) द्वारा कल्पना में कम हड्डी हानि।

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    चित्रा 1:। एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs के भेदभाव Murine IPSCs एक निर्माण के साथ ट्रांसड्यूस गया: MiDR-TCRα -2 ए-TCRβ -2 ए-Foxp3 युक्त ओवीए विशिष्ट TCR और Foxp3 के जीन। जीन-transduced कोशिकाओं (DsRed +) mFlt3L और मिल-7 की उपस्थिति में OP9-DL1-DL4 आइए बी कोशिकाओं पर सह-सुसंस्कृत थे। (ए) टी की आकृति विज्ञान दिवस 0, 7, 14 और पर सेल भेदभाव regs 22. दिन 28. CD3 पर IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए (बी) के प्रवाह cytometric विश्लेषण + TCRVβ5 + कोशिकाओं, CD25, CD127, CTLA- के साथ संकेत (आर 1) के रूप में gated और सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया 4, और Foxp3 के रूप में सीडी 4 + सीडी 8 gated कोशिकाओं के लिए दिखाया - कोशिकाओं (R2)। (अंधेरे लाइनों; छायांकित क्षेत्रों निर्धारण नियंत्रण संकेत मिलता है) एक larg देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की एर संस्करण।

    चित्र 2
    चित्रा 2: मैं n इन विट्रो विभेदित एजी-विशिष्ट Tregs के कार्यात्मक विश्लेषण Murine IPSC-Tregs splenocytes से प्रेरित थे।; और ओवीए 323-339 पेप्टाइड के साथ स्पंदित (APCs टी regs / APCs = 1 4)। Intracellular साइटोकाइन उत्पादन (TGF-β और आईएल -10) cytometry पर लाइव सीडी 4 + CD25 + कोशिकाओं gating के बाद प्रवाह से विश्लेषण किया गया था। (अंधेरे लाइनों; छायांकित क्षेत्रों निर्धारण नियंत्रण संकेत मिलता है) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: एकजी-विशिष्ट IPSC-Tregs घुसपैठ घुटने के जोड़ों में। एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs adoptively C57BL / 6 चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया। फौरन गठिया प्रेरण (दिन 7 - 14) के बाद, घुटनों हटा दिया है और immunohistology लिए दाग रहे थे (पैमाने सलाखों: 20 माइक्रोन)। ओवीए विशिष्ट IPSC-Tregs प्राप्त चूहे घुटनों में TCRVβ5 + कोशिकाओं की बड़ी संख्या है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: AG-विशिष्ट IPSC-Tregs के दत्तक हस्तांतरण चूहे में एआईए ameliorates Murine IPSCs रेट्रोवायरल निर्माण MiDR, MiDR-Foxp3, या MiDR-TCR-Foxp3 और थे OP9-DL1 पर सह सुसंस्कृत / DL4 / साथ transduced थे। आइए बी कोशिकाओं। एक 7 दिन, जीन-transduced कोशिकाओं (3 × 10 6 / माउस) थेdoptively है कि दो सप्ताह सेल हस्तांतरण के बाद एआईए के साथ प्रेरित किया गया महिला C57BL / 6 चूहों में स्थानांतरित कर दिया। अगले दिन गठिया प्रेरण पर, गठिया गंभीरता घुटने व्यास की माप द्वारा नजर रखी थी। (एसी) घुटने के व्यास में प्रतिशत वृद्धि हुई है। घुटने के व्यास में वृद्धि दिन 0. गठिया स्कोर पर इंजेक्शन से पहले प्रत्येक माउस के लिए preinjection घुटने व्यास के आधार पर एक अंधा ढंग से दोनों घुटनों का परीक्षण करके मूल्यांकन किया गया था गणना की गई; प्रत्येक घुटने के स्कोर सौंपा गया था (0: कोई दिखाई सूजन या मलिनकिरण, 1: के साथ या बिना मलिनकिरण सूजन दिखाई दे; 2: मध्यम मलिनकिरण के साथ सूजन, 3: मलिनकिरण के साथ गंभीर सूजन)। प्रत्येक समूह में, पांच चूहों का इस्तेमाल किया गया है, और डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। डेटा (डी) मतलब पाँच चूहों से दोनों घुटनों के लिए 7 दिन स्कोरिंग ± एसडी मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।। डेटा ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एसडी से मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ** पी <0.01, *** पी <0.001, दो तरह एनोवा)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5:। एजी-विशिष्ट ओवीए इंजेक्शन घुटने को IPSC-Tregs विस्थापित और अस्थि नुकसान को कम IPSC-Tregs adoptively C57BL / 6 चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया। 21 दिनों के बाद गठिया प्रेरण के भीतर, चूहों anaesthetized थे और माउस घुटनों के आसपास की हड्डी वास्तुकला सूक्ष्म सीटी प्रणाली से ली गई। प्राप्त चूहे OT-द्वितीय TCR / Foxp3 जीन-transduced murine IPSC-Tregs हड्डी हानि के महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शनी के रूप में वेक्टर transduced IPSCs प्राप्त चूहों पर नियंत्रण की तुलना में। (ए) स्कैन एक 2.2 मिमी लंबाई के साथ प्रदर्शन किया गया, और छवियों के बाद कब्जा कर लिया गया आगे इमेज प्रोसेसिंग (मात्रा प्रतिपादन और परिवर्तन;स्केल सलाखों:। 1 मिमी) (बी) के संयुक्त घुटने के आसपास की हड्डी मात्रा सूक्ष्म सीटी छवियों के तीन आयामी पुनर्निर्माण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, और ब्याज की मात्रा के अंदर हड्डी मात्रा गणना की गई (पैमाने सलाखों:। 1 मिमी) के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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    Discussion

    इस प्रोटोकॉल में, एक महत्वपूर्ण कदम TCR / Foxp3 जीन-transduced IPSCs की इन विट्रो भेदभाव है। इन विट्रो पायदान संकेतन टी सेल वंश की दिशा में विकास लाती है। सीडी 4 + Foxp3 + Tregs में IPSCs अंतर करने के लिए, हम OP9-DL1 / DL4 / आइए बी कोशिकाओं है, जो अत्यधिक एक्सप्रेस एमएचसी द्वितीय (IA ख) के अणुओं का इस्तेमाल किया। IPSCs के अधिकांश सीडी 4 + कोशिकाओं में अंतर। हालांकि, सतह TCR अभिव्यक्ति के बाद, कई विभेदित पूर्व टी कोशिकाओं को अलग और अंत में मर करने की क्षमता खो देते हैं। नतीजतन, IPSC व्युत्पन्न कार्यात्मक Tregs की सेल नंबर नाटकीय रूप से इन विट्रो भेदभाव के चार सप्ताह के बाद कम कर देता है। इससे बचने के लिए, आईएल -2 के अलावा लोगों को समय बिंदुओं पर सेल अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं। एक वैकल्पिक तरीका परिपक्वता और एजी-विशिष्ट पूर्व Tregs के अस्तित्व ड्राइव करने के लिए पूर्व Tregs कि चूहों में एक सप्ताह के लिए इन विट्रो में भेदभाव किया है हस्तांतरण है। इन पूर्व Tregs सह सकते हैंntinue फर्क और एक और तीन सप्ताह के लिए विवो में परिपक्व। इस विधि का प्रयोग, एक कार्यात्मक एजी-विशिष्ट Treg आबादी IPSCs, जो nTregs-तरह हैं और murine मॉडल में स्व-प्रतिरक्षित गठिया को दबाने के लिए की क्षमता है से उत्पन्न हो सकता है।

    एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs के vivo विकास की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए, विभिन्न यौगिकों (जैसे, retinoic एसिड, gelectin) 13,14 या दमनकारी साइटोकिन्स (जैसे, TGF-β, आईएल -10) दत्तक हस्तांतरण के बाद इस्तेमाल किया जा सकता पूर्व Tregs की। सेल अस्तित्व में वृद्धि के अलावा, इस संयुक्त दृष्टिकोण Foxp3 अभिव्यक्ति 14,15 बनाए रखने और एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs की गुणवत्ता में वृद्धि कर सकते हैं।

    एक संभावित समस्या यह है कि इन विवो Treg विकास के लिए पैदा हो सकता है समग्र प्रतिरक्षादमन, संक्रमण या बाद में वजन घटाने के दौरान जटिलताओं में जिसके परिणामस्वरूप है। एजी-विशिष्ट Tregs की एक बड़ी संख्या छठी में विकासशीलVO में संक्रमण और खराब हो सकती है। इस मामले में, एक आत्मघाती जीन, inducible कस्पासे 9 में (ICasp9) 15,16, TCR / Foxp3 वेक्टर में शामिल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण एक bioinert छोटे अणु dimerizing एजेंट (AP1903) स्टेम सेल व्युत्पन्न Tregs की पीढ़ी है, जो इस संभावित मुद्दे को दूर करेंगे "बंद" करने के इंजेक्शन से स्टेम सेल व्युत्पन्न Tregs को हटाने की अनुमति देता है।

    एक स्वयं एजी एक ठेठ प्रोटीन एक व्यक्ति autoimmune विकार से पीड़ित सेनाओं के प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मान्यता प्राप्त है। यह आत्म-एजी प्रतिरक्षा प्रणाली का लक्ष्य है, और सहसंबद्ध टी कोशिकाओं को नहीं हटाया जाता है। आत्म-एजी विशिष्ट Tregs उत्पन्न करने के लिए, TCR पारगमन का उपयोग एक अच्छा विकल्प है। एक स्वयं एजी (जैसे, गर्मी झटका प्रोटीन) विशिष्ट TCR परिपक्व सीडी 4 + CD25 + Tregs में परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से transduced किया जा सकता है, और इस दृष्टिकोण क्लिनिकल परीक्षण में उपयोग किया गया है। वैकल्पिक रूप से, के रूप में डेसइस प्रोटोकॉल में cribed, पायदान संकेतन के साथ आत्म-एजी के जीन पारगमन Foxp3 के साथ विशिष्ट TCR और उत्तेजना का उपयोग, सेल व्युत्पन्न Tregs स्टेम आत्म-एजी विशिष्ट Tregs हो सकता है।

    इंजीनियर Tregs उपयोग स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के लिए सेल आधारित चिकित्सा उपयोगी 17 हो सकती है। हालांकि टी कोशिकाओं में TCR पारगमन, सुरक्षित रूप से व्यवहार्य, और क्लिनिकल परीक्षण में लागू साबित हुई है, वहां अभी भी स्वस्थ ऊतकों 18 के साथ पार जेट की वजह से autoimmunity के कारण प्रमुख सुरक्षा चिंताएं हैं। इसके अलावा, मौजूदा तरीकों का उपयोग कर, आनुवंशिक रूप से संशोधित Tregs आमतौर पर इन विवो 19 में एक अल्पकालिक हठ है। वैकल्पिक रूप से, मोनोक्लोनल एजी-विशिष्ट Tregs की बड़ी संख्या को विकसित करने के लिए एक आशाजनक स्रोत स्टेम सेल है। भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) सबसे अच्छा pluripotency और आत्म नवीकरण किया है, लेकिन यह उन्हें रोगियों से प्राप्त करने के लिए संभव नहीं है। आसानी से परिधीय रक्त से अलग हालांकि, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) बहु हैंशक्तिशाली स्टेम कोशिकाओं और ESCs 20 को इसी तरह से सेल संस्कृति में विस्तार किया जा सकता है। वर्तमान IPSC प्रौद्योगिकी अलग प्रतिलेखन कारक के पारगमन के द्वारा मरीजों के दैहिक कोशिकाओं से पीएससी के एक अधिक कुशल पीढ़ी के लिए उन्नत किया गया है। methodological सुधार की एक संख्या ज़्यादा से ज़्यादा ऐसे प्रतिरक्षाजनकता और tumorigenicity के रूप में संभावित खतरों को कम करने से IPSCs उत्पन्न करने के लिए हाल के वर्षों में विकसित किया गया है। ESCs की तुलना में, IPSCs समान pluripotency और आत्म नवीकरण किया है। नतीजतन, IPSC प्रौद्योगिकी रोगी और / या रोग विशिष्ट पीएससी के विकास में एक लाभ प्रदान कर सकते हैं। IPSCs के उपयोग को विकसित करने के एजी-विशिष्ट Tregs स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों 10,11 के लिए सेल आधारित चिकित्सा के क्षेत्र अग्रिम कर सकते हैं।

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    Acknowledgments

    इस परियोजना के हिस्से में वित्त पोषित किया गया, स्वास्थ्य (R01AI121180, R21AI109239 और K18CA151798), अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान के तहत (1-16-IBS-281), और स्वास्थ्य के पेंसिल्वेनिया विभाग (तम्बाकू निपटान फंड) के लिए जेएस

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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