פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחלות אוטואימוניות להתעורר עקב אובדן סובלנות עצמית אימונולוגית. בתאי T רגולטוריים (Tregs) הם מתווכים חשובים של סובלנות עצמית אימונולוגית. Tregs מייצג כ 5 - 10% של תת-אוכלוסיית תא CD4 + T הבוגר בעכברים ובבני אדם, עם כ 1 - 2% מאלה Tregs במחזור הדם ההיקפי. תאי גזע מושרים (iPSCs) יכול להיות מובחן לתוך Tregs תפקודית, אשר יש פוטנציאל לשמש עבור טיפולים מבוססי תאים של מחלות אוטואימוניות. כאן, אנו מציגים שיטה לפתח אנטיגן (Ag) Tregs -specific מ iPSCs (כלומר, iPSC-Tregs). השיטה מבוססת על שילוב גורם שעתוק FoxP3 ו קולטן תא Ag-T ספציפי (TCR) לתוך iPSCs ולאחר מכן הבחנה על תאי סטרומה OP9 להביע Notch הליגנדים דלתא דמוית (DL) 1 ו DL4. בעקבות הבידול חוץ גופית, iPSC-Tregs להביע CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, ו Ag ספציפי TCR והם מסוגלים להגיב לגירוי Ag.שיטה זו יושמה בהצלחה לטיפול מבוסס תאים של דלקת אוטואימונית מודל בעכברים. העברת המאמצת של Ag ספציפי iPSC-Tregs אלה לתוך מפרקים הנגרמת Ag (AIA) עכברים -bearing יש את היכולת להפחית דלקת מפרקים ונפיחות וכדי למנוע איבוד מסת העצם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי מכללת מאוניברסיטת פנסילבניה של ועדת טיפול בבעלי חיים רפואה (# פרוטוקול IACUC 45,470) ו נערכים בהתאם להנחיות של האגודה למען הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חיים מעבדה.

1. תרבית תאי גזע

  1. דגירה צלחת 10 ס"מ עם 10 מ"ל של 0.1% ג'לטין 30 דקות לפחות ב 37 ° C (חממה) כדי לצפות את הצלחת.
  2. הסר ג'לטין מצלחת צלחת 3 x 10 6 מוקרן SNL76 / 7 תאים דגירה במשך יום אחד ב 37 ° C (חממה) באמצעות 10% DMEM התקשורת (10% FBS ו סטרפטומיצין פניצילין 1%).
  3. הסר את המדיה מצלחת iPSCs מופשר תרבות על גבי שכבת מזין תאי SNL76 / 7 באמצעות תקשורת iPSC (DMEM תקשורת המכילה סרום עובר עגל 15%, 0.1 מילימול / ליטר חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mmol / L L- גלוטמין, ו 0.1 mmol / L β-mercaptoethanol) 9. העכבר li התא iPS-MEF-NG-20D-17ne, אשר הושרה מ פיברובלסטים עובריים בעכבר על ידי transfection ויראלי רטרו של Oct3 / 4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc, התקבל ד"ר שיניה יאמאנאקה (המכון למדעי הרפואה Frontier, אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן).
  4. שנה את התקשורת ביום 3 עם תקשורת טריה ולבחון מושבות iPSC תחת מיקרוסקופ.
    הערה: מושבות אלה הן קטנים, אשכולות מבריקים או תאים עגולים עם תיחום ברור מראה ביטוי של GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. בשנת בידול במבחנה של Ag ספציפי iPSC-Tregs

  1. צור המבנים לשמש התמרה retroviral ידי גנים תת-שיבוט OT-II TCR ו FoxP3 לתוך פלסמיד MiDR 10 מקושר עם 2A פפטיד ביקוע עצמית על מנת להפוך את מבנה MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
  2. בצע תמרת retroviral 9 של iPSCs באמצעות תאי פלאט E כקו תא אריזה.
  3. ביום 0, זרע OP9-DL1-DL4-IA תאי B Aצפיפות מינימלית ת"א 10 4 תאים / 2 ס"מ באמצעות התקשורת OP-9 (מדיה α-MEM FCS המכיל 20% ו -2.2 גר '/ ל סודיום ביקרבונט. פלייט 1 x 10 6 תאים לכל 10 צלחת ס"מ.
  4. ביום 3, כאשר תאי B OP9-DL1-DL4-IA להפוך ומחוברות 80-90%, להסיר את המדיה וזרעי 0.5 - 1 x 10 5 iPSCs מעל OP9-DL1-DL4 - ב IA התאים התקשורת OP-9.
    הערה: זה קובע את התרבות המשותפת של iPSCs על OP9-DL1-DL4-IA ב תאים נחשב היום 0 של בידול 9.
  5. ביום 5, להסיר את המדיה מצלחת 10 ס"מ על ידי שאיפה, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS 1x, לשאוב PBS. הוסף 4 מ"ל של טריפסין 0.25% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להוסיף עוד 8 מ"ל של התקשורת iPSC לתאים, מחדש להשעות אותם, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 10 מ"ל של התקשורת iPSC. דגירה תאים מחדש מושעה אלה על צלחת 10 ס"מ טריולחזור בחממה במשך 30 דקות.
      הערה: הסר את OP9-DL1-DL4-IA ב מזין תאים ולשמור על iPSCs הבחנה צף בתקשורת. שמור על תאים ב OP9-DL1-DL4-IA ברציפות להשיג 80 - 90% confluency לתרבות שיתוף נוספים.
    2. אחרי 30 דקות, לאסוף את התאים צפו, לסנן אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, ולספור את התאים עם hemocytometer.
  6. זרע 5 x 10 5 של iPSCs על 80 טרי - ומחוברות 90% של OP9-DL1-DL4-IA תאי B במדיה OP9. מוסף בתקשורת עם mFlt-3L בריכוז סופי 5 ng / ml.
  7. ביום 8, לאסוף iPSCs הבדיל באופן חלקי על ידי שטיפת צלחת עם התקשורת מצלחת עצמו בעזרת פיפטה 10 מ"ל. השתמש 5 אחר מ"ל של התקשורת OP-9 בצלחת לשטוף בעדינות את התאים חצי חסיד ידי pipetting זהיר, תקיף כדי לא לשבור את monolayer OP9 בתחתית המנה. חזור על לשטוף עם 10 מ"ל של PBS לקצור כל-מודעת למחצהHerent הבחנת תאים.
    1. שלב שני שוטף, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מחדש להשעות ב 10 מ"ל של התקשורת OP9 המכיל mFlt-3L (5 ng / ml) ו- MIL-7 (1 ננוגרם / מ"ל), ולסנן דרך 70 מסננת תא מיקרומטר.
  8. העברת התאים לתוך צלחת תרבות 6-היטב המכיל 80 - 90% ומחוברות OP9-DL1-DL4-IA ב תאים, כמו בשלב 1.1. העברת התאים שנקטפו מן צלחת אחת 10 ס"מ לתוך אחד טוב של צלחת 6 באר.
  9. ביום 10, שינוי מחצית התקשורת מתאי למדיה OP9 טריים בתוספת mFlt-3L (5 ng / ml) ו- MIL-7 (1 ננוגרם / מ"ל). חזור על שלב זה כל יומיים.
  10. כל 4-6 ימים, בהתאם לצמיחה, מחדש זרע iPSCs הבחנה לצלחות עם שכבה חדשה של תאי B OP9-DL1-DL4-IA, כמתואר בשלב 1.1.

3. הערכת בידול במבחנה Treg והתבגרות

  1. שינויים מורפולוגיים של iPSCs הבחנה.
    1. מוnitor iPSCs שיתוף התרבות של עם תאי B OP9-DL1-DL4-IA היומיום על ידי התבוננות בתאים חיים תחת מיקרוסקופ brightfield קונבנציונלי (20X). במשך היום 5, להתבונן המושבות בעלות מאפיינים דמויים mesoderm, כגון תאים שטוחים. במשך היום 8, להתבונן אשכולות קטנים, עגולים של תאים, אשר מייצגים תאי הבחנה.
    2. השתמש בשיטת ההרחקה הכחולה Trypan לספור את התאים כדי לזהות את המספר והאחוז של תאי חיים. חישוב כדאיות התא כמספר התאים קיימא מחולק במספר הכולל של תאים בתוך ארבע רשתות על hemocytometer. אם תאים תופסים trypan כחול, לשקול אותם מתים או לא-ישים. רשום את מספר תאי חיים שנקטפו מן התרבות.
  2. Cytometry זרימת הניתוח של הבחנת iPSCs.
    1. בימים 5, 7, 11, 15, 19, 21, ו -28 של שיתוף תרבות, להסיר את התאים עם טריפסין 0.25% כמו בשלב 25.
    2. לפני מכתים משטח עם fluorochrome- מצומדות נוגדנים שונים, incubate 1 x 10 6 תאים עם 100 μl של 2.4G2 חוסם Fc מדולל PBS (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי למנוע את הכריכה של נוגדנים לקולטן Fc על פני התא.
    3. בימים 5, 7, 11, 15, 19, 21, ו -28, להשתמש 1 x 10 6 תאים עבור cytometry זרימה עם fluorochrome- מצומדות נוגדנים שונים כדי לזהות סמנים פני התא, כולל CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, ו CTLA4.
    4. בעקבות בלוק Fc, לשטוף תאים עם 10 מ"ל של PBS ואת הכתם עם fluorochrome- מצומדות נוגדנים שונים במשך 20 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן לבצע את ניתוח תזרים cytometric עם צבע 15 לזרום cytometer. השתמש 0.200 מיקרוגרם של נוגדנים לכל 10 6 תאים מדוללים 100 μl של PBS.
    5. ביום 28, לנתח את התאים על ידי זרימה cytometry 11 ושער על תאי CD4 + CD8 + באמצעות CD4 ו- CD8 מכתים fluorochrome מצומדות; לנתח על מנת לתת ביטוי TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, ואת FoxP3 (איור 1). עבור מכתים FoxP3, לתקן את התאים ואת permealize אותם ולאחר מכן לבצע נוגדנים מכתים 11.
  3. בשנת גירוי אנטיגן במבחנה של iPSCs.
    1. ביום 28 של תרבות משותפת, הקציר iPSC-Tregs מתרבויות על ידי איסוף תאים צפים. Trypsinize שאר התאים עם טריפסין 0.25% (כמו בשלב 2.5) מחדש להשעות את התאים 8 מ"ל של התקשורת iPSC. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 XG בטמפרטורת החדר, לשאוב את התקשורת, ושוב מחדש להשעות את התאים ב 10 מ"ל של התקשורת.
      1. דגירה התאים מחדש מושעה בצלחת 10 ס"מ חדש ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאסוף את התאים צף. שוטפים את התאים עם PBS קר.
    2. דגירה 3 x 10 6 splenocytes מן spleens של C57BL / 6 Rag1 - / - עכברים עם פפטיד ovalbumin 5 מיקרומטר 200 μl של התקשורת (OVA 323-339) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך צלחת 96 גם 11.
    3. מערבבים Tregs עם OVA 323-339 splenocytes ביחס של 1: יחס 4 (להשתמש 0.75 x 10 6 Tregs). לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 40 שעות. במהלך 4 השעות האחרונות, להוסיף 4 μl של בדילול Brefeldin לתוך (1,000x הריכוז בפועל, מדולל תקשורת ותרבות 1x) התרבות.
    4. קציר תאים עם טריפסין 0.25% (כמו בשלב 2.5), לשטוף עם 10% NaN 3 ו -0.5 M פתרון EDTA (חיץ FACS), בלוק עם 100 μl של דילול (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ"ל) חוסם Fc 2.4G2, וכתמים עבור סמנים משטח, CD4, CD8, TCRVα2, ו TCRVβ5 כמו צעדים 3.2.3-3.2.4.
    5. תקן את התאים עם פתרון paraformaldehyde 4% ב PBS permeabilize עם 100 μl של חיץ 1x permeabilization לאחר מכתים פני התא. זהירות! Paraformaldehyde הוא אלרגני, מסרטנים, ורעילים.
    6. כתם התאים עם fluorochrome- מצומדות TGF-β ו- IL-10 במשך 20 דקות בחושך. השתמש 0.200 מיקרוגרם של נוגדן / 10 6 תאים dilutאד בשנת 100 μl של PBS. לזהות את הייצור התאי של TGF-β ו- IL-10 עם הצבע 15-לזרום cytometer (איור 2).
    7. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם חיץ קר FACS לפני ניתוח תזרים cytometric 11.
  4. בשנת התמדה vivo של Ag ספציפי iPSC-Tregs.
    1. לאחר 8 ימים של תרבות משותפת על תאי B OP9-DL1-DL4-IA, להעביר iPSC הנגזרות מראש Tregs (Thy1.2) כמו בשלב 3.3.1 לתוך 1.1 עכברים congenic Thy (4-6 שבועות) באמצעות הזרקה לווריד הזנב ללא הרדמה. לפני ביצוע וריד הזרקת הזנב, להרחיב את זנב וריד באמצעות מנורת אינפרא אדומה למשך 5 דקות. לאחר התרחבות וריד הזנב, במקום את העכבר בתוך עוצר ו adoptively העברת 3 x 10 6 תאים resuspended ב 200 μl של PBS על ידי הזרקת דרך וריד הזנב.
    2. שישה שבועות לאחר העברת Treg, להרדים עכברים בחנק CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. ודא כי המילce הוא לא נושם. פתח את חלל הצפק על ידי חיתוך העור החיצוני של הצפק באמצעות מספרי מלקחיים בעדינות שהפיל אותו לחשוף את העור הפנימי רירית חלל הצפק. לבודד את הטחול ובלוטות הלימפה ההיקפית של עכברים congenic 1.1 מוזרק Thy.
    3. אוסף את התאים מן צומת הטחול והלימפה באמצעות שבירה מכאנית להניב השעית תא בודדת. דגירה התאים עם 5 מ"ל של חיץ תמוגה ACK עבור 5 דקות ב RT כדי lyse כדוריות דם אדומות. אסוף ולשטוף splenocytes או לימפוציטים הנותרים עם 10 מ"ל של חיץ FACS קר.
    4. בעקבות לשטוף, לטיפול בתאים עם 2.4G2 חוסם Fc על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כמו בשלב 3.2.2 ואת הכתם עם 100 μl של נוגדנים נגד Thy 1.2 fluorochrome- מצומדות בדילול מלא.
    5. שטפו תאים עם 10 מ"ל של חיץ FACS והמשך לזרום ניתוח cytometric 11.

4. Vivo ההבשלה ודיכוי של דלקת פרקים אוטואימוניות

  • צור את המבנים כמו בשלב 2.1.
  • בצע תמרת retroviral 9 כמו בשלב 2.2.
  • בשנת בידול vivo ואינדוקצית דלקת בעכברים.
    1. להבדיל OT-II TCR / iPSCs-transduced FoxP3 (OT-II-FoxP3 / iPSCs), iPSCs transduced-FoxP3, ו iPSCs transduced DsRed על תאים סטרומה OP9-DL1-DL4-IA ב בנוכחות ציטוקינים mFlt-3L ו MIL-7 8 ימים כמתואר בשלבים 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize את כל שלושת סוגי התאים מהצלחת 10 ס"מ מחדש להשעות תאים כל צלחת 10 ס"מ 10 מ"ל של התקשורת טריים. מוסיף את התאים לצלחת 10 סנטימטרים טריים ולחזור חממה למשך 30 דקות. אחרי 30 דקות, לאסוף צף תאים.
    3. Pass התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר להסיר צבירי תאים לספור באמצעות hemocytometer. התאם את התאים לריכוז של 1.5 x 10 מ"ל 7 תאים / בקור PBS ולסנן שוב במידת הצורך. שמור את התאים על קרח עד תא עברה מאמצת לעכברים. להזריק 200 μl של ההשעיה תא (3 x 10 6 תאים) לשלוש קבוצות שונות של 4 - 6 בן שבוע-נקבה C57BL / 6 עכברים דרך וריד הזנב כמתואר 3.4.1
    4. ביום 10 לאחר העברת תאים, להזריק עכברים עם 100 מיקרוגרם של MBSA לתחליב ב אדג'ובנט המלא של פרוינד בבסיס הזנב באמצעות מזרק 1 מ"ל.
    5. ביום 17, להרדים עכברים באמצעות אידוי isoflurane (על פי הנחיות IACUC). לנצל 4 - 5% isoflurane לזירוז ו 1 - 2% לצורך תחזוקה. להשרות דלקת פרקים על ידי הזרקה תוך-מפרקית של 20 מיקרוגרם MBSA ב 10 PBS μl בברך שמאל משותפת של 20 מיקרוגרם MBSA ו- 100 מיקרוגרם כל OVA ב 10 μl PBS במפרק הברך הימנית. מזון וכן gelpack ניתן להציב על רצפת המצעים לאחר דלקת המפרקים פתחו. עכברים יהיו מורדמים: ציון מצב הגוף (BCS) של 2/5 או גוססת, תשישות חמורה ו / או שכיבה מתמשך (תקופה של 24 שעות), וחומרה להבקיע 4. ציון4, אודם ונפיחות חמורה להקיף את הקרסול, כף הרגל ספרות, או ankyloses של הגפה.
  • אפיון של OT-II TCR / iPSCs-transduced FoxP3.
    1. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי (20X) כדי לחזות מבולבל חי DsRed + GFP + תאים.
    2. לבחון שילוב גנים לידי ביטוי לרוב הוא כתם מערבי וזרימת cytometry 11.
  • פיתוח והתבגרות Treg.
    1. בשבועות 2, 4, ו -6 לאחר העברת תאים, להרדים את העכברים. המתת חסד, בכלוב אחד להשתמש 1 - 2 ליטר של CO 2 בשלב הראשון. לאחר שבעל החיים ואיבד את הכרתו, להגדיל את קצב הזרימה של CO 2 - 4 5 L / min. להרדים עכברים משאיפת CO 2. לבודד את הטחול לנקז בלוטות הלימפה על ידי חיתוך העור החיצוני של הצפק באמצעות מספרי מלקחיים בעדינות שהפיל אותו לחשוף את העור הפנימי רירית חלל הצפק.
    2. אסוף את f השעית תא הבודדהrom הצמתים הטחול הלימפה על ידי שבר מכני באמצעות מסננת התא מזרק 1 מ"ל ב 1% מדיה iPSC. צנטריפוגה צינור החרוטים המכיל התקשורת ב 400 גרם במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 5 מ"ל של חיץ תמוגה ACK כדי lyse כדוריות דם אדומות. Re-צנטריפוגה ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ולשטוף את splenocytes או לימפוציטים הנותרים עם חיץ קר FACS. בצע את השלבים 3.4.4 - 3.4.5 והמשך ניתוח תזרים cytometric.
  • מכתים תאי.
    1. ביום 50-אתגר פוסט, לבודד את הטחול לנקז בלוטות הלימפה של עכברים (כמו בשלב 4.5.1) לאחר euthanization משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. אסוף את ההשעיה תא בודד מן הצמתים הטחול הלימפה על ידי שבר מכני באמצעות מסננת התא מזרק 1 מ"ל. דגירה splenocytes בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות עם 5 מ"ל של חיץ תמוגה ACK כדי lyse כדוריות דם אדומות. אסוף ולשטוף את הים הנותרplenocytes או לימפוציטים עם חיץ FACS קר. בצע את השלבים 3.2.3 - 3.2.4, אבל הכתם עם סמנים משטח CD4, CD8, CD25, ו TCRVβ5.
    3. המשך לתקן תאים מכתים תאיים כמתואר 3.3.5 - 3.3.7 ולנתח ייצור ציטוקינים תאיים (TGF-β ו- IL-10) של Tregs iPSC הנגזרות שער על תאים חיים CD4 + CD25 +.
  • הסתננות של Tregs Ag הספציפי בברך ודיכוי של דלקת פרקים.
    1. בעקבות צעדים (4.3 - 4.3.6) על ימים 7 - 14 אינדוקציה שלאחר דלקת פרקים, להרדים עכברים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם (על פי הנחיות IACUC). הסרת שיער מהברכיים עם גוזז חשמלי, ולהסיר את הברכיים על ידי הליך כירורגי.
    2. הסר את העור מהרגליים ידי ביצוע חתך הרגל האחורית במספריים קהים-end לחתוך את העור לאורך הירך ומטה עד הקרסול. לקלף בעדינות את העור מעל הרגל וכף הרגל כדי לחשוף את השרירים. לְהַסִירשריר מהרגל בזהירות מבלי לפגוע במפרק הברך.
      1. חותכים את הרגל האחורית, ממש מעל לבסיס האגן / ירך וחותכים השוקה באמצעות מספריים לנתח חדה.
    3. תקן את הברכיים בפורמלין 4% למשך 48 שעות. Decalcify הברכיים באמצעות 2.5 חומצה פורמית M; לשטוף שלוש פעמים קסילן במשך 3 דקות, לשטוף פעמיים באתנול 100%, לשטוף פעמיים באתנול 95%, לשטוף פעמיים במים deionized במשך 2 דקות, ו decalcify ב 1 mM EDTA. פנק בטמפרטורה תת-רותחים (90 מעלות צלזיוס) במשך 20 דקות.
    4. מצנן את הרקמה הקבועה למשך 30 דקות. יש לשטוף אותו עם 1x PBS למשך 4 דקות ולהטביע אותו פרפין. מייבשים רקמות באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול לעקור את המים, ולאחר מכן לחדור אותם בשעווה. ואז להטביע את הרקמות הסתננו לגושי שעווה. בצע הוא חתך אנכי ואופקי מכתים. כן 4 מיקרומטר חלקים עם microtome זזה.
    5. בצע מכתים immunofluorescent על הסעיפים לאחר נהלים קבועים של deparaffinization ו התייבשות באמצעות קסילן ואתנול 12.
    6. חסום פעילות peroxidase אנדוגני ידי טבילת שקופיות כמות מספקת של פתרון מי חמצן 3% עבור 3 דקות לאחר שאיבת Ag. שקופיות בלוק ספציפי שאינו מחייב BSA 3% ב PBS בטמפרטורת החדר בתא humidified למשך 60 דקות.
    7. כתם בסעיפים עם 200 μl של נוגדני TCRVβ5 fluorochrome- מצומדות בדילול 1: 100 בתמיסת החסימה. דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר ב 75 - בתא humidified 100%, ולשטוף 5 פעמים ב 1x PBS במשך 5 דקות.
    8. Counterstain השקופיות מכתים גרעיני עם מגיב antifade המכיל DAPI. להוסיף כ 300 μl של הפתרון מכתים בדילול DAPI (300 ננומטר ב PBS 1x) כדי coverslip, ביצוע מסוימים כי הוא מכוסה coverslip כולו. אחסן את השקופיות בחושך ב 4 ° C עד לניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3).
  • assay דיכוי דלקת פרקים
    1. מדוד את הנפיחות של שני הברכיים של העכברים לפני הגיוס מפרק באמצעות קליפר חיוג מד להקים בסיס.
    2. בצע את השלבים (4.3 - 4.3.6) לזירוז מפרקים והעברת Treg. מדוד ברכי עכבר עם העברת קליפר חיוג מד שלאחר Treg.
    3. חשב את אחוז הגידול בקוטר הברך: אחוז הגידול = (קוטר ברך ביום 1 - קוטר ברך ביום 0) / ברך בקוטר ביום 0.
  • מדידת הרס מפרקים וחדיר תא דלקתי בברכיים ידי היסטולוגיה (איור 4).
    1. ביום 7 אינדוקציה שלאחר דלקת פרקים, להרדים את העכברים כפי שתואר לעיל, ולהסיר את הברכיים על ידי הליך כירורגי. ראה שלב 4.7.1 - 4.7.2.
    2. תקן את הברכיים בפורמלין 4%, decalcify ב EDTA, להטביע פרפין. ראה שלב 4.7.3
    3. הסר את שתי הברכיים, לתקן בפורמלין 10%, ו להסתיד ב Formical-4. להטביע הרקמות פרפין, סעיף ב 4 מיקרומטר, ואת הכתם עם hematoxylב ו eosin (H & E) או מכתים Safranin O (כמו בשלב 4.7.7) ולבחון תחת מיקרוסקופ.
    4. השתמש צביעת H & E כדי להעריך שחיקה עצם עם מערכת ניקוד חצי כמותית (0: אין ארוזיות; 4: ארוזיות מורחבת והרס של עצם). השתמש מכתים Safranin O להעריך את אובדן proteoglycans וציון עם מערכת ניקוד חצי כמותית (0: ללא איבוד proteoglycans; 3: אובדן מוחלט של מכתים עבור proteoglycans).
      1. השתמש שיטת ניקוד וכמותיות להבקיע חדירת תא דלקתית בשקופיות מוכתמות H & E (0: אין חדירת תא; 4: משופע חדיר תא). הערכה ציונית על ידי בחינת שני הברכיים באופן עיוור.
  • מדידה 5. של איבוד מסת העצם בברכיים עם טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת ברזולוציה גבוהה (מיקרו CT) מערכת

    1. ביום 10 אינדוקציה שלאחר דלקת פרקים, לטשטש עכברים עם isoflurane 2% ולהתכונן הדמיה.
    2. מיקרופון התפקידדואר עם ברכיים כלפי מעלה בתא.
    3. השתמש במערכת ברזולוציה גבוהה מיקרו-CT לרכוש in vivo הדמיה של אדריכלות העצם סביב הברכיים של העכברים.
    4. לבצע סריקות מיקרו CT עם אורך 2.2 מ"מ, לרבות מפרקים הברך העכבר עם הפרמטרים הבאים: 10.5 מיקרומטר גודל voxel ב 55 KV, 145 מיקרו-אמפר 200 זמן אינטגרציה msec, 211 תמונות.
    5. תמונות ללכוד חזיתית המטוס ייבוא תמונות מיקרו-CT לאחר עיבוד תמונה נוספת (טיוח נפח טרנספורמציה) (איור 5).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    כפי שניתן לראות כאן, ביום 28, Ag הספציפי Tregs משמעותי הביע CD3 ו Ag הספציפי TCR, שני סמנים של תאי T. אוכלוסיית CD3 + TCRVβ5 + הביע CD4. רוב תאי CD3 + TCRVβ5 + CD4 + הביע גם CD25, CD127, ו CTLA-4, אשר באים לידי ביטוי בדרך כלל ברמות גבוהות טבעי ובתקנות T (nTregs) ו בתאי T להביע FoxP3 ectopically. ביטוי FoxP3 בתאי שמקורם iPSC נמשך גם לאחר לטווח ארוך בגירוי חוץ גופייה עם ליגנד Notch, כפי שזוהה על ידי מכתים תאי ונותח על ידי cytometry זרימה (איור 1). בנוסף, Ag הספציפי iPSC-Tregs מיוצר ציטוקינים מדכאים, כגון TGF-β ו- IL-10, כאשר מומרץ במבחנה עם splenocytes Ag-פעם (איור 2), המציין את iPSC-Tregs הייתה פעילות מדכאת פוטנציאלית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי גילה כי יותר FoxP3 + תאים נכחו שטופלו OVA מאשר הברכיים שטופלו PBS; לא היו FoxP3 + תאים קיימים בברכיים בעכברים קבלת iPSCs DsRed +-transduced וקטור. רבים יותר CD4 + FoxP3 + TCRVβ5 + תאים מוצגים בברכיים של עכברים שקיבלו iPSCs transduced עם MiDR-TCR-FoxP3 מאשר MiDR-FoxP3 (איור 3). מקרים אלה מצביעים כי Ag ספציפי iPSC-Tregs להגר הברך AIA לאחר העברת המאמצת לעכברים הנמען. תאי iPSC הנגזרות מועברים באופן משמעותי ירד הברך הדלקתית תופחת כאשר OVA היה נוכח, אבל לא הייתה כל השפעה על הברך המלאה שהוזרקה רק עם MBSA במודל בעכברים (איור 4); אובדן עצם מופחתת בברך תא העברה דמיינו ידי מערכת מיקרו CT ברזולוציה גבוהה (איור 5).

    tp_upload / 54,720 / 54720fig1.jpg "/>
    איור 1:. דיפרנציאציה של Ag ספציפי iPSC-Tregs Murine iPSCs היו transduced עם מבנה: MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 שיישאו את הגנים של OVA ספציפי TCR ו FoxP3. התאים-transduced גן (DsRed +) היו שיתוף תרבותי על תאי B OP9-DL1-DL4-IA בנוכחות mFlt3L ו- MIL-7. (א) מורפולוגיה של T ובתקנות התמיינות תאים ביום 0, 7, 14 ו 22. (ב) ניתוח תזרים cytometric עבור ביטוי החלבון של תאים שמקורם iPSC על CD3 יום 28. + TCRVβ5 + תאים היו מגודרים כמצוין (R1) ונותחו על מנת לתת ביטוי CD4 ו- CD8, עם CD25, CD127, CTLA- 4, ו FoxP3 המוצגים עבור תאים המגודרים כמו CD4 + CD8 - תאים (R2). (קווים כהים, אזורים מוצלים מצביעים שולטים isotype) אנא לחץ כאן כדי להציג largגרסה אה של נתון זה.

    איור 2
    איור 2: ניתוח פונקציונלי של לי n Vitro הבדיל Ag ספציפי Tregs Murine iPSC-Tregs היו מגורה על ידי splenocytes. (נגמ"שים; ובתקנות T / נגמ"שים = 1: 4) ו פעמו עם פפטיד OVA 323-339. ייצור ציטוקינים תאי (TGF-β ו- IL-10) נותחו על ידי זרימת cytometry לאחר gating על חי CD4 + CD25 + תאים. (קווים כהים, אזורים מוצלים מצביעים שולטים isotype) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3:g-ספציפי iPSC-Tregs לחדור לתוך המפרקים בברך. Ag ספציפי iPSC-Tregs הועברו adoptively לעכברים C57BL / 6. זמן קצר לאחר אינדוקציה מפרקים (ימים 7 - 14), הברכיים הוסרו מוכתם עבור immunohistology (ברים בקנה מידה: 20 מיקרומטר). עכברים שקיבלו יש OVA ספציפי iPSC-Tregs מספר גדול של תאים TCRVβ5 + בברכיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4: העברת המאמצת של Ag ספציפי iPSC-Tregs מקילה AIA עכברים iPSCs Murine היו transduced עם מבנה retroviral MiDR, MiDR-FoxP3, או MiDR-TCR-FoxP3 והיו שיתוף תרבותי על OP9-DL1 / DL4 /. תאי B IA. ביום 7, התאים transduced-גן (3 × 10 6 / עכבר) היוdoptively מועבר לתוך עכברות C57BL / 6 שהיו מושרות עם AIA השבועי לאחר העברת התא. על אינדוקצית המפרקים למחרת, חומרת דלקת הפארקים הייתה פיקוח על ידי מדידת קוטר הברך. (AC) אחוז גידול בקוטר ברך. גידול בקוטר ברך חושב על בסיס בקוטר ברך preinjection עבור כל עכבר לפני הזריקה על ציון מפרק יום 0. הוערך על ידי בחינת שני הברכיים באופן עיוור; כל ברך הוצב ציון (0: אין נפיחות או שינוי צבע גלויות; 1: גלוי נפיחות עם או בלי שינוי צבע; 2: מיתון נפיחות עם שינוי צבע; 3: חמור נפיחות עם שינוי צבע). בכל קבוצה, חמישה עכברים שימשו, ונתונים מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים. נתונים מיוצגים כממוצע ± SD. (ד) ממוצע הבקיע ביום 7 עבור שתי הברכיים מחמש עכברים. נתונים מיוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים (** p <0.01, *** p <0.001, דו כיוונית ANOVA). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5:. Ag ספציפי iPSC-Tregs להגר עד הברך מוזרק OVA ולצמצם את איבוד מסת העצם iPSC-Tregs הועברו adoptively לעכברים C57BL / 6. בתוך 21 ימים אינדוקציה שלאחר דלקת פרקים, העכברים היו מורדמים ואת הארכיטקטורה העצם סביב הברכיים העכבר היה צילמו על ידי מערכת מיקרו CT. עכברים שקיבלו OT-II TCR / FoxP3 גן-transduced murine iPSC-Tregs להפגין הפחתה משמעותית של איבוד מסת העצם לעומת לשלוט בעכברים שקיבלו iPSCs-transduced וקטור. (א) סריקות בוצעו עם אורך 2.2 מ"מ, ותמונות נתפסו לאחר עיבוד תמונה נוסף (טיוח וטרנספורמציה נפח;ברים בקנה מידה:. 1 מ"מ) (B) נפח העצם סביב מפרק הברך הוערכה באמצעות שחזור תלת ממדי של התמונות מיקרו-CT, ונפח עצם בתוך נפח של עניין חושבה (ברים בקנה מידה:. 1 מ"מ) נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    בפרוטוקול זה, צעד קריטי הוא בידול במבחנה של iPSCs TCR / FoxP3-transduced הגן. איתות Notch חוץ גופית גורם להתפתחות כלפי השושלת תא T. כדי לבדל iPSCs לתוך CD4 + FoxP3 + Tregs, השתמשנו תאים ב OP9-DL1 / DL4 / IA, אשר מאוד מפורשת MHC II מולקולות (IA ב). רוב iPSCs להתמיין CD4 + תאים. עם זאת, לאחר ביטוי TCR שטח, תאים טרום-T בדיל רבים מאבדים את היכולת להבדיל ובסופו של דבר למות. כתוצאה מכך, את המספר הסלולרי של Tregs הפונקציונלי הנגזרות iPSC מפחית באופן דראמטי לאחר ארבעה שבועות של בידול במבחנה. כדי למנוע זאת, תוספת של IL-2 יכולה לשפר הישרדות תא באותם מועדים לפי שעון. שיטה חלופית לנהוג התבגרות והישרדות של Ag הספציפי מראש Tregs היא להעביר את טרום Tregs כי יש בדיל במבחנה במשך שבוע לעכברים. טרום Tregs אלה יכולים לחיות בדוntinue הבחנה והתבגרות in vivo לעוד שלושה שבועות. באמצעות שיטה זו, אוכלוסיית Ag הספציפית Treg פונקציונלית ניתן להפיק מן iPSCs, שהן nTregs הדמוית ויש להם את היכולת לדכא דלקת אוטואימונית במודל בעכברים.

    כדי לשפר את היעילות של in vivo פיתוח של Ag ספציפי iPSC-Tregs, תרכובות שונות (למשל, חומצה רטינואית, gelectin) 13,14 או ציטוקינים מדכאים (למשל, TGF-β, IL-10) ניתן להשתמש לאחר העברת המאמצת של-Tregs מראש. בנוסף להגדלת הישרדות התא, גישה משולבת זו יכולה לשמור ביטוי FoxP3 14,15 ולשפר את איכות Ag ספציפי iPSC-Tregs.

    בעיה פוטנציאלית שעלולה להתעורר לפיתוח in vivo Treg הוא דיכוי חיסוני הכוללת, וכתוצאה מכך סיבוכים במהלך זיהומים או הרזיה שלאחר מכן. מספר רב של Tregs Ag ספציפי המתפתחות viVO עלולה להחמיר זיהומים. במקרה זה, גן ההתאבדות, caspase המושרה 9 (ICasp9) 15,16, ניתן לשלב לתוך וקטור TCR / FoxP3. גישה זו מאפשרת הסרת תאי גזע שמקורם Tregs ידי הזרקה של מולקולות קטנות bioinert dimerizing סוכן (AP1903) כדי "לכבות" את הדור של תאי גזע שמקורם Tregs, אשר להתגבר על בעיה זו פוטנציאל.

    עצמית Ag הוא חלבון אופייני המוכר על ידי המערכת החיסונית של מארחים סובלים מהפרעת אוטואימונית פרט. עצמית Ag זהו היעד של מערכת החיסון, ואת תאי T בקורלציה אינם נמחקים. כדי ליצור עצמית Ag הספציפי Tregs, שימוש תמרת TCR הוא בחירה טובה. עצמית Ag (למשל, Heat shock protein) הספציפי TCR ניתן transduced לתוך Tregs בוגרת CD4 + CD25 + מתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs), וגישה זו נוצלה בניסויים קליניים. לחלופין, כפי described בפרוטוקול זה, באמצעות תמרת הגן של-Ag העצמי ספציפי TCR עם FoxP3 וגירוי עם Notch signaling, גזע Tregs תאים שמקורם יכול להיות Tregs העצמית Ag הספציפי.

    טיפולים מבוססי תאים למחלות אוטואימוניות ניצול Tregs מהונדסים עשוי להיות שימושי 17. למרות תמרת TCR בתאי T הוכיחה את עצמו בטוח, ריאליים, החלים בניסויים קליניים, יש עדיין חששות בטיחות גדולים בשל אוטואימוניות הנגרמת על ידי תגובתיות צולבת עם רקמות בריאות 18. יתר על כן, באמצעות שיטות קיימות, מהונדסים גנטיים Tregs בדרך כלל יש התמדה לטווח קצר in vivo 19. לחלופין, מקור מבטיח לפיתוח מספר רב של חד השבטי Ag הספציפי Tregs הוא תאי גזע. תאי גזע עובריים (ESCs) יש את pluripotency עצמי התחדשות הטובה ביותר, אבל זה לא ריאלי להשיג אותם מחולים. למרות בקלות לבודד מן הדם ההיקפי, בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הם רבתאי גזע חזק ניתן להרחיבו תרבית תאים בדומה ESCs 20. טכנולוגית הווה iPSC התקדמה דור יעיל יותר של PSC מן התאים הסומטיים של המטופלים על ידי תמרה של גורמי תעתוק שונים. מספר שיפורים מתודולוגיים פותחו בשנים האחרונות לייצר iPSCs ידי צמצום מפגעים פוטנציאליים מקסימאלי כגון immunogenicity ו tumorigenicity. לעומת ESCs, יש iPSCs pluripotency זהה עצמית והתחדשות. כתוצאה מכך, טכנולוגית iPSC עשויה להקנות יתרון בפיתוח PSCs למטופל ו / או ספציפית למחלה. השימוש iPSCs לפתח Ag ספציפי Tregs עשוי לקדם את תחום טיפולים מבוססי תאים למחלות אוטואימוניות 10,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    פרויקט זה מומן בחלקו תחת מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01AI121180, R21AI109239 ו K18CA151798), ה- American Diabetes Association (1-16-IBS-281), ואת מחלקת פנסילבניה הבריאות (קופות להתיישבות טבק) כדי JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics