Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Immunology and Infection

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Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

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Abstract

Autoimmunerkrankungen entstehen aufgrund der Verlust der immunologischen Selbsttoleranz. Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind wichtige Vermittler von immunologischer Selbsttoleranz. Tregs repräsentieren etwa 5 - 10% der reifen CD4 + T - Zell - Subpopulation bei Mäusen und Menschen, mit etwa 1 bis 2% der Tregs im peripheren Blut zirkulieren. Induzierte pluripotenter Stammzellen (iPS) in funktionelle Treg unterschieden werden, die ein Potential für zellbasierte Therapie von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden. Hier präsentieren wir eine Methode Antigen (Ag) -spezifische Tregs von iPS - Zellen zu entwickeln (dh iPS-Tregs). Das Verfahren basiert auf den Transkriptionsfaktor FoxP3 enthält und eine Ag-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) in iPSCs und dann Notch Differenzierung auf Zellen OP9 Stromazellen exprimieren Liganden delta-like (DL) 1 und DL4. Folgende in vitro Differenzierung exprimieren die iPSC-Treg CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 und Ag-spezifischen TCR und können Ag - Stimulation reagiert.Diese Methode wurde zur zellbasierte Therapie von Autoimmun Arthritis in einem Mausmodell erfolgreich angewendet. Adoptive Übertragung dieser Ag-spezifischen iPSC-Treg in Ag-induzierten Arthritis (AIA) -haltigen Mäusen hat die Fähigkeit, Gelenkentzündung und Schwellungen zu reduzieren und Knochenverlust zu verhindern.

Protocol

Alle Tierversuche werden von der Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care Committee (IACUC Protokoll # 45470) zugelassen und werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Vereinigung für die Bewertung und Zulassung von Labortierpflege durchgeführt.

1. Stammzellkultur

  1. Inkubieren einer 10-cm-Schale mit 10 ml 0,1% Gelatine für mindestens 30 Minuten bei 37 ° C (Inkubator), um die Platte zu beschichten.
  2. Entfernen Gelatine aus der Schale und der Platte 3 x 10 6 bestrahlten SNL76 / 7 - Zellen und Inkubation für einen Tag bei 37 ° C (Inkubator) 10% DMEM - Medium (10% FBS und 1% Penicillin - Streptomycin) verwendet wird .
  3. Entfernen Sie die Medien von der Platte und Kultur aufgetaut iPSCs über die SNL76 / 7-Zell Feeder-Schicht unter Verwendung von iPS-Medien (DMEM-Medium, das 15% fötales Kälberserum, 0,1 mmol / l nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mmol / l L-Glutamin und 0,1 mmol / l β-Mercaptoethanol) 9. Die Maus iPS-MEF-Ng-20D-17-Zellen-Line, die aus embryonalen Maus-Fibroblasten durch retroviralen Transfektion von Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc, induziert wurde, wurde von Dr. Shinya Yamanaka (Institut für Frontier Medical Sciences, Universität Kyoto, Kyoto, Japan) erhalten.
  4. Ändern Sie die Medien am Tag 3 mit frischen Medien und beobachten iPSC Kolonien unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Diese Kolonien sind kleine, glänzende Cluster oder runde Zellen mit einer klaren Abgrenzung GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigt.

2. In vitro Differenzierung von Ag-spezifischen iPS-Tregs

  1. Erzeugen , um die Konstrukte in retrovirale Transduktion durch Subklonierung der OT-II TCR - Gene und FoxP3 in das Plasmid Midr 10 mit selbstspaltendes Peptid 2A verbunden verwendet werden , um die Midr-TCR & agr;-2A-TCR & bgr;-2A-FoxP3 - Konstrukt zu bilden.
  2. Führen retroviraler Transduktion von 9 iPSCs Verwendung Plat E - Zellen als die Verpackungszelllinie.
  3. Am Tag 0 seed OP9-DL1-DL4-IA b Zellen ata minimalen Dichte von 10 4 Zellen / cm 2 durch OP-9 - Medium (α-MEM - Medium , das 20% FCS und 2,2 g / l Natriumbicarbonat verwendet wird . Plate 1 x 10 6 Zellen pro 10 cm - Schale.
  4. Am Tag 3, wenn OP9-DL1-DL4-IA b - Zellen 80-90% konfluent werden, um die Medien zu entfernen und 0,5 Saatgut - 1 x 10 5 iPSCs über OP9-DL1-DL4 - IA b Zellen in OP-9 Medien.
    HINWEIS: Damit ist die Co-Kultur von iPS - Zellen auf OP9-DL1-DL4-IA - B - Zellen und betrachtet 9 Tag 0 der Differenzierung zu sein.
  5. Am Tag 5, entfernen Sie die Medien aus dem 10-cm-Schale durch Absaugen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS, und die PBS absaugen. 4 ml 0,25% Trypsin und Inkubation für 10 min bei 37 ° C. Einen weiteren hinzufügen 8 ml iPSC Medien zu den Zellen, resuspendieren sie und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    1. Den Überstand aspirieren und wieder die Zellen in 10 ml iPSC Medien. Inkubieren diese resuspendierten Zellen auf einem frischen 10-cm-Schaleund zurück in den Inkubator für 30 min.
      HINWEIS: Entfernen Sie die OP9-DL1-DL4-IA b Feeder - Zellen und halten die Differenzierung iPSCs in den Medien schweben. 90% Konfluenz für weitere Co-Kultur - Pflegen Sie OP9-DL1-DL4-IA b Zellen kontinuierlich 80 zu erreichen.
    2. Nach 30 Minuten sammeln die schwebenden Zellen, filtern sie durch eine 70 um Zelle Sieb, und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
  6. Seed 5 x 10 5 von iPS - Zellen in ein frisches 80 bis 90% konfluent von OP9-DL1-DL4-IA - B - Zellen in OP9 Medien. Ergänzen die Medien mit MFlt-3L in einer Endkonzentration von 5 ng / ml.
  7. teilweise differenzierte iPS-Zellen Am Tag 8 sammeln, indem die Platte mit den Medien aus der Schale Waschen selbst eine 10 ml Pipette. Verwenden Sie weitere 5 ml OP-9 Medien in der Schale vorsichtig halb anhaftenden Zellen durch eine sorgfältige, kraftvoll Pipettieren zu waschen, um nicht die OP9 Monoschicht an der Unterseite der Schale zu brechen. Wiederholen Sie die Wäsche mit 10 ml PBS alle semi-Anzeige bis zur ErnteHerent differenzierenden Zellen.
    1. Kombinieren beide Wäschen Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur, resuspendieren in 10 ml OP9 enthaltenden Medien MFlt-3L (5 ng / ml) und mIL-7 (1 ng / ml) und filtriere durch einen 70 um Zell Sieb.
  8. Übertragen Sie die Zellen in einer 6-Well - Kulturplatte , enthaltend 80-90% konfluent OP9-DL1-DL4-IA - B - Zellen, wie in Schritt 1.1. Transfer-Zellen aus einer 10 cm Schüssel in eine Vertiefung der 6-Well-Platte geerntet.
  9. Am 10. Tag, ändern die Hälfte der Medien von Zellen an die frische OP9 Medien ergänzt mit MFlt-3L (5 ng / ml) und mIL-7 (1 ng / ml). Wiederholen Sie diesen Schritt alle zwei Tage.
  10. Alle 4-6 Tage, je nach Wachstum, Wieder Saatgut die Differenzierung iPSCs auf Platten mit einer frischen Schicht aus OP9-DL1-DL4-IA - B - Zellen, wie in Schritt 1.1 beschrieben.

3. Bewertung der In - vitro - Treg Differenzierung und Reifung

  1. Morphologische Veränderungen der Differenzierung iPSCs.
    1. MoNitor die Co-Kultur von iPS - Zellen mit OP9-DL1-DL4-IA b Zellen jeden Tag von lebenden Zellen unter einem herkömmlichen Hellfeldmikroskop (20x) zu beobachten. Am Tag 5, beachten Sie die Kolonien mit Mesoderm-ähnlichen Eigenschaften, wie abgeflachten Zellen. Am Tag 8, beobachten kleine, runde Cluster von Zellen, die differenzierenden Zellen repräsentieren.
    2. Verwenden Sie die Trypanblau-Methode, die Zellen zu zählen, um die Anzahl und den Prozentsatz der lebenden Zellen zu erkennen. Berechnen der Lebensfähigkeit der Zellen, wie die Anzahl der lebensfähigen durch die Gesamtzahl von Zellen innerhalb der vier Rastern auf dem Hämocytometer geteilten Zellen. Wenn Zellen Trypanblau nehmen, betrachten sie als tot oder nicht lebensfähig. Aufzeichnen der Anzahl der lebenden Zellen aus der Kultur geerntet.
  2. Durchflusszytometrie-Analyse von iPS-Zellen zu unterscheiden.
    1. An den Tagen 5, 7, 11, 15, 19, 21, und 28 der Co-Kultur, zu entfernen, die Zellen mit 0,25% Trypsin, wie in Schritt 25.
    2. Vor der Oberflächenfärbung mit unterschiedlichen Fluorochrom konjugierte Antikörper, INCUBATe 1 x 10 6 Zellen mit 100 ul 2.4G2 Fc - Blocker in PBS verdünnt (Endkonzentration 10 ug / ml) bei 4 ° C für 20 min , um die Bindung des Antikörpers an den Fc - Rezeptor auf der Zelloberfläche zu verhindern.
    3. An den Tagen 5, 7, 11, 15, 19, 21 und 28, verwendet werden 1 x 10 6 Zellen für die Durchflusszytometrie mit unterschiedlichen Fluorochrom konjugierte Antikörper , die Zelloberflächenmarker zu detektieren, einschließlich CD3, TCR & bgr;, CD4, CD8, CD25, und CTLA4.
    4. Fc folgenden Block, wasche die Zellen mit 10 ml PBS und Flecken mit unterschiedlichen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern für 20 Minuten bei 4 ° C, und dann mit der 15-Farben-Durchflusszytometer die durchflusszytometrische Analyse durchzuführen. Verwenden 0,200 & mgr; g Antikörper pro 10 6 in 100 ul PBS verdünnt Zellen.
    5. Am Tag 28 analysiert die Zellen mittels Durchflusszytometrie 11 und Gate auf CD4 + CD8 + Zellen unter Verwendung von CD4 und CD8 - Fluorochrom-konjugiertem Färbung; Analyse für die Expression von TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4 Und FoxP3 (Abbildung 1). Für FoxP3 - Färbung, um die Zellen zu beheben und permealize sie und dann Antikörper - Färbung 11 durchführen.
  3. In - vitro - Antigen - Stimulation von iPS - Zellen.
    1. Am Tag 28 der Co-Kultur, Ernte iPS-Tregs aus Kulturen durch die schwimmenden Zellen zu sammeln. Trypsinize den Rest der Zellen mit 0,25% Trypsin (wie in Schritt 2.5) und resuspendieren Medien, die Zellen in 8 ml iPSC. Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 × g bei Raumtemperatur, aspirieren die Medien und die Zellen wieder in 10 ml Medium erneut zu suspendieren.
      1. Inkubieren der resuspendierten Zellen in eine neue 10 cm-Schale bei 37 ° C für 30 min und die schwimmenden Zellen zu sammeln. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS.
    2. Inkubieren 3 x 10 6 Splenozyten aus Milzen von C57BL / 6 Rag1 - / - Mäuse , die mit 5 uM Ovalbumin - Peptid in 200 ul Medium (OVA 323-339) bei 4 ° C für 30 min in einer 96 - Well - Platte 11.
    3. Mix Tregs mit OVA 323-339 Splenozyten in einem Verhältnis 1: 4 (Verwendung von 0,75 x 10 6 Treg). Für 40 Stunden in einem CO 2 -Inkubator bei 37 ° C inkubieren. In den letzten 4 Stunden, fügen Sie 4 ul verdünnt Brefeldin A in die Kultur (tatsächliche Konzentration 1,000x in 1x Kulturmedien verdünnt).
    4. Ernte Zellen mit 0,25% Trypsin (wie in Schritt 2.5), wasche mit 10% NaN 3 und 0,5 M EDTA - Lösung (FACS - Puffer), Block mit 100 ul verdünnt (Endkonzentration 10 ug / ml) Fc blocker 2.4G2 und Flecken für den Oberflächenmarker CD4, CD8, TCRVα2 und TCRVβ5 wie in den Schritten 3.2.3-3.2.4.
    5. Befestigen Sie die Zellen mit einer 4% igen Paraformaldehydlösung in PBS und Permeabilisierung mit 100 ul 1x Permeabilisierung Puffer nach Zelloberflächenfärbung. Vorsicht! Paraformaldehyd ist allergen, krebserregend und giftig.
    6. Beflecken die Zellen mit einem Fluorochrom konjugierte TGF-β und IL-10 für 20 min im Dunkeln. Verwenden Sie 0.200 ug Antikörper / 10 6 Zellen verded in 100 ul PBS. Erkennung die intrazelluläre Produktion von TGF-β und IL-10 mit der 15-Farben - Durchflusszytometer (Abbildung 2).
    7. Waschen Sie die Zellen dreimal mit kaltem FACS - Puffer vor der Durchflusszytometrie - Analyse 11.
  4. In - vivo - Persistenz von Ag-spezifischen iPS-Tregs.
    1. Nach 8 Tagen der Co-Kultur auf OP9-DL1-DL4-IA - B - Zellen, übertragen iPSC abgeleitetes vorge Treg (Thy1.2) , wie in Schritt 3.3.1 in Thy 1.1 kongenen Mäusen (4-6 Wochen alt) über einen Schwanzveneninjektion ohne Anästhesie. Vor der Schwanzveneninjektion durchführen, erweitern die Schwanzvene eine Infrarot-Lampe für 5 min mit. Nach Schwanzvene Dilatation, legen Sie die Maus in einem Verzögerer und adoptiv Transfer 3 x 10 6 in 200 ul PBS - Zellen , indem sie durch die Schwanzvene injiziert wird .
    2. Sechs Wochen nach der Treg Übertragung euthanize Mäuse durch CO 2 Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt. Stellen Sie sicher, dass die mice atmen nicht. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch die Außenhaut des Peritoneum Schneiden mit einer Schere und Zange und ziehen Sie sie vorsichtig die innere Haut Auskleidung der Bauchhöhle freizulegen. Isolieren Sie die Milz und peripheren Lymphknoten injiziert Thy 1.1 congenic Mäuse.
    3. Sammle die Zellen aus der Milz und den Lymphknoten mechanisches Brechen unter Verwendung einer Einzelzellsuspension zu ergeben. Inkubieren der Zellen mit 5 ml ACK-Lysepuffer für 5 min bei RT roten Blutkörperchen zu lysieren. Sammeln und waschen restlichen Splenozyten oder Lymphozyten mit 10 ml kaltem FACS-Puffer.
    4. Nach dem Waschen, Behandlung von Zellen mit dem Fc-Blocker 2.4G2 bei 4 ° C für 20 min, wie in Schritt 3.2.2 und Fleck mit 100 ul verdünnt Fluorochrom-konjugiertem anti-Thy 1.2-Antikörpern.
    5. Wasche die Zellen mit 10 ml FACS - Puffer und gehen zytometrische Analyse 11 zu fließen.

4. In vivo - Reifung und Unterdrückung von Autoimmun- Arthritis

  • Generieren Sie die Konstrukte wie in Schritt 2.1.
  • Führen retroviraler Transduktion 9 , wie in Schritt 2.2.
  • In vivo - Differenzierung und Arthritis - Induktion in Mäusen.
    1. Differenzieren OT-II TCR / FoxP3-transduzierten iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs) FoxP3-transduzierten iPSCs und DsRed transduziert iPSCs auf den OP9-DL1-DL4-IA b Stromazellen in der Gegenwart von Cytokinen MFlt-3L und 2.6 - mIL-7 für 8 Tage wie in den Schritten 2.1 beschrieben.
    2. Trypisinize alle drei Arten von Zellen von der 10 cm-Platte und resuspendieren Zellen aus jeder 10 cm-Platte in 10 ml frisches Medium. Fügen Sie die Zellen in ein frisches 10-cm-Platte und zurück zum Inkubator für 30 min. Nach 30 Minuten, sammle schwebenden Zellen.
    3. Pass-Zellen durch einen 70 & mgr; m Zellsieb zu Zellhaufen zu entfernen und zählen eine Zählkammer. Stellen Sie die Zellen in einer Konzentration von 1,5 x 10 7 Zellen / ml in kaltem PBS und das Filter wieder , wenn nötig. Halten Sie Zellen auf Eis, bis adoptiven Zelltransfer in Mäuse. Injizieren 200 ul der Zellsuspension (3 × 10 6 Zellen) in drei verschiedenen Gruppen von 4 bis 6 Wochen alte weibliche C57BL / 6 - Mäusen durch die Schwanzvene , wie in 3.4.1 beschrieben ,
    4. an der Basis des Schwanzes am 10. Tag nach der Zellübertragung, injizieren Mäuse mit 100 ug mBSA in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert, um eine 1 ml Spritze verwendet wird.
    5. Am Tag 17, betäuben Mäuse eine Isofluran Verdampfer mit (gemäß IACUC-Richtlinien). Nutzen Sie 4 - 5% Isofluran für die Induktion und 1 bis 2% für die Wartung. Induzieren Arthritis durch intra-artikuläre Injektion von 20 ug mBSA in 10 ul PBS in der linken Kniegelenk und von 20 ug und 100 ug mBSA ganzen OVA in 10 & mgr; l PBS in den rechten Kniegelenks. Speisen und ein gelpack auf der Bettwäsche Boden platziert werden, nachdem Arthritis entwickelt hat. Die Mäuse werden eingeschläfert: Body Condition Score (BCS) von 2/5 oder moribund, schwere Kachexie und / oder persistent recumbency (eine 24-Stunden-Zeitraum) und dem Schweregrad 4. Partitur4, Rötung und starke Schwellung umfassen den Knöchel, Fuß und Ziffern oder Ankylosen des Gliedes.
  • Die Charakterisierung der OT-II TCR / FoxP3-transduzierten iPS-Zellen.
    1. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop (20x) nicht fixierten Live - DsRed + GFP + Zellen sichtbar zu machen.
    2. Untersuchen Gen Integration und Expression sowohl von Western - Blot und Durchflusszytometrie 11.
  • Treg Entwicklung und Reifung.
    1. Bei Wochen 2, 4 und 6 nach der Zellübertragung, einschläfern die Mäuse. Für Euthanasie, verwenden Sie in jedem Käfig 1 bis 2 L CO 2 in der ersten Stufe. Sobald das Tier das Bewusstsein verloren hat, erhöhen die Durchflussrate von CO 2 bis 4 - 5 l / min. Euthanize Mäuse durch CO 2 Inhalation. Isolieren Sie die Milz und entleeren Sie die Lymphknoten durch die Außenhaut des Peritoneum Schneiden mit einer Schere und Zange und ziehen Sie sie vorsichtig die innere Haut Auskleidung der Bauchhöhle freizulegen.
    2. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension fROM mit der Milz und Lymphknoten durch mechanische Panne eine Zelle Sieb mit und eine 1-ml-Spritze in 1% iPSC Medien. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen, die Medien bei 400 g für 5 min enthält. Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml ACK-Lysepuffer roten Blutkörperchen zu lysieren. Re-Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min. Re-suspend das Zellpellet und waschen Sie die restlichen Splenozyten oder Lymphozyten mit kaltem FACS-Puffer. Führen Sie die Schritte 3.4.4 - 3.4.5 und fahren Sie mit durchflusszytometrische Analyse.
  • Intrazellulärer Färbung.
    1. Am Tag 50 nach der Herausforderung, isolieren die Milz und entleeren Sie die Lymphknoten der Mäuse (wie in Schritt 4.5.1) nach Euthanasie durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte.
    2. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension aus der Milz und Lymphknoten durch mechanische Panne eine Zelle Sieb und eine 1 ml Spritze. Inkubieren Sie die Splenozyten bei Raumtemperatur für 5 min mit 5 ml ACK-Lysepuffer roten Blutkörperchen zu lysieren. Sammeln Sie und waschen Sie die restlichen splenocytes oder Lymphozyten mit kaltem FACS-Puffer. Führen Sie die Schritte 3.2.3 - 3.2.4, aber Fleck mit Oberflächenmarker CD4, CD8, CD25 und TCRVβ5.
    3. Gehen Zellen für die intrazelluläre Färbung zu beheben , wie in 3.3.5 beschrieben - 3.3.7 und analysieren intrazellulären Zytokin - Produktion (TGF-β und IL-10) von iPS-derived Tregs und Tor auf Live - CD4 + CD25 + Zellen.
  • Einschleusung von Ag-spezifische Tregs in den Knien und die Unterdrückung von Arthritis.
    1. Im Anschluss an die Schritte (4.3 - 4.3.6) an den Tagen 7-14 post-Arthritis Induktion, einschläfern Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte (nach IACUC - Richtlinien). Entfernen Sie Haare von den Knien mit einem elektrischen Klipper und auszuschneiden die Knie durch chirurgischen Eingriff.
    2. Entfernen Sie die Haut von den Beinen durch einen Einschnitt in der Hinterbein mit stumpfem Ende Schere und schneiden Sie die Haut über den Oberschenkel und bis zum Knöchel. Ziehen Sie leicht die Haut über das Bein und Fuß, um die Muskeln zu belichten. Entfernender Muskel aus dem Bein vorsichtig, ohne das Kniegelenk zu beschädigen.
      1. Schneiden Sie das Hinterbein knapp über dem Becken / Hüftgelenk und schneiden Sie die Tibia mit scharfen Dissektionsscheren.
    3. Befestigen Sie die Knie in 4% Formalin für 48 Stunden. Entkalken Sie die Knie durch Verwendung von 2,5 M Ameisensäure; spülen dreimal in Xylol für 3 Minuten, spülen Sie zweimal in 100% Ethanol, spülen Sie zweimal in 95% Ethanol, spülen Sie zweimal in entionisiertem Wasser für 2 min und entkalken in 1 mM EDTA. Behandlung bei einer sub-Siedetemperatur (90 ° C) für 20 min.
    4. Kühle das fixierte Gewebe für 30 min. Spülen Sie es mit 1x PBS für 4 min und betten sie in Paraffin. Entwässern das Gewebe durch eine Reihe von Ethanol-Bad, das Wasser zu verdrängen und sie dann mit Wachs infiltrieren. Dann einbetten das infiltrierte Gewebe in Wachsblöcke. Führen Sie sowohl vertikale als auch horizontale Schnitte für die Färbung. Bereiten Sie 4 um Abschnitte mit einem Schlittenmikrotom.
    5. Führen Sie Immunfluoreszenzanfärbung auf den Abschnitten nach Standardverfahren der deparaffinisation und Rehydrierung mit Xylol und Ethanol 12.
    6. Block endogene Peroxidase-Aktivität durch den Schieber in einer ausreichenden Menge von 3% ige Wasserstoffperoxidlösung eingetaucht wird für 3 min nach der Ag Retrieval. Block Folien für nicht-spezifische Bindung in 3% BSA in PBS bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für 60 min.
    7. Fleckenabschnitte mit 200 ul Fluorochrom-konjugiertem TCRVβ5 Antikörper, verdünnt 1: 100 in der Blockierungslösung. Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem 75 bis 100% befeuchteten Kammer und wäscht 5 mal in 1x PBS für 5 min.
    8. Gegenfärbung der Folien für die Kernfärbung mit einem verblassungshemmenden Reagenz DAPI enthält. Hinzufügen, etwa 300 & mgr; l der verdünnten DAPI Färbungslösung (300 nM in 1x PBS) auf dem Deckglas, so dass sicher, dass gesamte Deckglas abgedeckt. Speichern der Objektträger im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 3).
  • Arthritis Unterdrückung Assay
    1. Messen Sie die Schwellung beider Knie der Mäuse vor Arthritis-Induktion durch eine Dial-gauge Sattels mit einer Basislinie zu etablieren.
    2. Führen Sie die Schritte (4.3 - 4.3.6) für Arthritis-Induktion und Treg Übertragung. Messen Sie die Maus Knie mit einem Zifferblatt Spursattel post-Treg Übertragung.
    3. Berechnen Sie die prozentuale Zunahme im Knie Durchmesser: Prozent Zunahme = (Knie Durchmesser am Tag 1 - Knie Durchmesser am Tag 0) / Knie Durchmesser am Tag 0.
  • Die Messung der Gelenkzerstörung und entzündlichen Zellinfiltration in den Knien durch die Histologie (Abbildung 4).
    1. Am Tag 7 nach der Arthritisinduktion, euthanize die Mäuse wie oben beschrieben und die Knie durch chirurgischen Eingriff auszuschneiden. Siehe Schritt 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Befestigen Sie die Knie in 4% Formalin, entkalken in EDTA und in Paraffin eingebettet werden. Siehe Schritt 4.7.3
    3. Entfernen Sie beide Knie, fix in 10% Formalin und verkalken in Formical-4. Einbetten das Gewebe in Paraffin, Schnitt bei 4 um, und Fleck mit hematoxylin und Eosin (H & E) oder Safranin-O-Färbung (wie in Schritt 4.7.7) und unter einem Mikroskop zu beobachten.
    4. Verwenden Sie H & E-Färbung Knochenerosion mit einem semi-quantitativen Scoring-System zu bewerten (0: keine Erosionen; 4: erweiterte Erosionen und die Zerstörung von Knochen). Verwenden Safranin-O-Färbung um den Verlust von Proteoglykanen zu bewerten und mit einer semi-quantitative Bewertungssystem score (0: kein Verlust von Proteoglykanen; 3: vollständiger Verlust der Färbung für Proteoglykane).
      1. Verwenden Sie ein semi-quantitativen Scoring-System zu entzündlichen Zellinfiltration auf H & E gefärbten Objektträger punkten (0: keine Zellinfiltration; 4: wimmelte Zellinfiltration). Bewerten Sie Noten durch beide Knie in einer verblindeten Weise zu untersuchen.
  • 5. Messung der Knochenverlust in den Knien mit dem hochauflösenden Micro-Computertomographie (Mikro-CT) -System

    1. Am Tag 10 nach der Arthritis Induktion, betäuben Mäuse mit 2% Isofluran und Vorbereitung für die Bildgebung.
    2. Position mice mit den Knien nach oben in der Kammer gegenüber.
    3. Verwenden , um eine hochauflösende Mikro-CT - System in vivo - Bildgebung des Knochenarchitektur um die Knie der Mäuse zu erwerben.
    4. Führen Sie Mikro-CT-Scans mit einem 2,2 mm Länge, einschließlich Maus Kniegelenke mit den folgenden Parametern: 10,5 um Voxelgröße bei 55 kv, 145 & mgr; A 200 ms Integrationszeit, 211 Bilder.
    5. Import Mikro-CT - Bilder und capture frontalen Ebene Bilder nach der weiteren Bildverarbeitung (Volume Rendering und Umwandlungs) (Abbildung 5).

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    Representative Results

    Wie hier gezeigt, am Tag 28, Ag-spezifischen Treg ausgedrückt wesentlichen CD3 und Ag-spezifischen TCR, zwei T-Zell-Marker. Die CD3 + TCRVβ5 + Bevölkerung ausgedrückt CD4. Die meisten der CD3 + TCRVβ5 + CD4 + Zellen auch CD25, CD127 exprimiert und CTLA-4, die in erhöhten Mengen exprimiert werden , typischerweise in natürlich T regs (nTregs) und in T - Zellen exprimieren FoxP3 ektopisch auftritt. Foxp3 - Expression in iPSC abgeleiteten Zellen blieb sogar nach einer Langzeit - in vitro - Stimulation mit dem Notch - Liganden, wie durch Durchflusszytometrie (Figur 1) analysiert , indem die intrazelluläre Färbung nachgewiesen. Darüber hinaus erzeugt die Ag-spezifische iPSC-Treg suppressive Zytokine, wie TGF-β und IL-10, wenn in vitro mit Ag-gepulste Splenozyten (Abbildung 2) stimuliert, was anzeigt , das iPSC-Treg Potential suppressive Aktivitäten hatten. Die Fluoreszenzmikroskopie ergab, dass mehr FoxP3 + Zellen in der OVA-behandelten vorhanden waren , als die PBS-behandelten Knie; es gab keine FoxP3 + Zellen in den Knien in Mäusen bestehenden die DsRed + Vektor-transduzierten iPS - Zellen zu erhalten. Viele mehr CD4 + FoxP3 + TCRVβ5 + in den Knien von Mäusen dargestellt Zellen iPSCs mit dem Midr-TCR-FoxP3 transduziert Empfangen als die Midr-FoxP3 (Abbildung 3). Diese Beobachtungen legen nahe, dass Ag-spezifischen iPS-Tregs wandern an die AIA Knie nach dem adoptiven Transfer in Empfängermäuse. Die übertragenen iPSC abgeleiteten Zellen wesentlich verringert die entzündliche Schwellung Knie wenn OVA vorhanden war, hatte aber keine Wirkung auf die Steuer Knie , die nur mit mBSA in dem murinen Modell (Figur 4) eingespritzt wurde; reduzierte Knochenverlust in der Übertragungskniezelle durch die hochauflösende Mikro-CT - System (Figur 5) sichtbar gemacht .

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    Abb . 1: Die Differenzierung der Ag-spezifischen iPS-Tregs Murine iPSCs wurden mit einem Konstrukt transduziert: Midr-TCR & agr;-2A-TCR & bgr;-2A-FoxP3 enthält Gene von OVA-spezifischen TCR und FoxP3. Die Gen-transduzierten Zellen (DsRed +) wurden cokultiviert auf OP9-DL1-DL4-IA - B - Zellen in Gegenwart von mFlt3L und mIL-7. (A) Morphologie der T regs Zelldifferenzierung am Tag 0, 7, 14 und 22 (B) durchflusszytometrische Analyse für die Proteinexpression von iPSC abgeleiteten Zellen am Tag 28 CD3 + TCRVβ5 + Zellen , wie angegeben (R1) gated wurden und für die Expression von CD4 und CD8 analysiert, mit CD25, CD127, CTLA 4 und FoxP3 für Zellen als CD4 + CD8 gated gezeigt - Zellen (R2). (dunkle Linien, schraffierten Flächen zeigen Isotypkontrollen) Bitte klicken Sie hier , um eine larger Version dieser Figur.

    Figur 2
    Abbildung 2: Funktionelle Analyse von I n Vitro Differentiated Ag-spezifischen Treg Murine iPSC-Treg von Splenozyten stimuliert wurden. (APCs; T regs / APCs = 1: 4) und gepulst mit OVA 323-339 - Peptid. Die intrazellulären Zytokin - Produktion (TGF-β und IL-10) durch die Strömung analysiert Zytometrie nach + Zellen , die auf Live - CD4 + CD25 Gating. (Dunkle Linien, schraffierten Flächen Isotypkontrollen angeben) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 3
    Abbildung 3: Ag spezifischen iPS-Tregs Infiltrieren in die Kniegelenke. Ag-spezifischen iPS-Tregs adoptiv in C57BL / 6 - Mäuse übertragen wurden. Kurz nach Arthritis Induktion (Tage 7-14) wurden die Knie entfernt und gefärbt für Immunhistologie (Maßstabsbalken: 20 & mgr; m). Mäuse OVA-spezifischen iPS-Tregs haben eine große Anzahl von TCRVβ5 + Zellen in den Knien zu erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: adoptiven Transfer von Ag-spezifischen iPS-Tregs Verbessert AIA bei Mäusen Murine iPSCs wurden mit dem retroviralen Konstrukt transduziert Midr, Midr-FoxP3 oder Midr-TCR-FoxP3 und waren co-kultiviert auf der OP9-DL1 / DL4 /. IA - B - Zellen. Am Tag 7 werden die Gen-transduzierten Zellen (3 × 10 6 / Maus) wurden adoptively übertragen in weibliche C57BL / 6-Mäuse, die mit AIA zwei Wochen nach der Zellübertragung induziert wurden. Am Tag nach der Arthritis Induktion wurde die Schwere der Arthritis durch Messung des Knies Durchmesser. (AC) Prozent Anstieg der Knie Durchmesser überwacht. Erhöhung der Knie Durchmesser wurde durch die Untersuchung beide Knie in verblindet ausgewertet für jede Maus vor der Injektion am Tag 0 Arthritis-Score basiert auf Voreinspritzung Knie Durchmesser berechnet; jedes Knie wurde eine Punktzahl zugeordnet (0: keine sichtbare Schwellung oder Verfärbung, 1: sichtbare Schwellung mit oder ohne Verfärbung, 2: moderat mit Verfärbung Schwellung, 3: schwere mit Verfärbung Schwellungen). In jeder Gruppe wurden fünf Mäuse verwendet, und die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (D) Der Mittelwert an Tag scoring 7 für beide Knie von fünf Mäusen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt aus drei unabhängigen Experimenten (** p <0,01, *** p <0,001, Zwei-Wege - ANOVA). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 5
    Abbildung 5:. Ag-spezifischen iPS-Tregs Migrate auf die OVA injizierte Knie und reduzieren den Knochenverlust iPS-Tregs wurden adoptiv in C57BL / 6 - Mäuse übertragen. Innerhalb von 21 Tagen post-Arthritis Induktion wurden die Mäuse anästhesiert und der Knochenarchitektur um die Maus Knie wurde durch die Mikro-CT-System abgebildet wird. Mäuse , die OT-II TCR / FoxP3 Gen-transduzierten murinen iPS-Tregs signifikante Reduktion der Knochenschwund aufweisen , im Vergleich Mäuse , die Vektor-transduzierten iPS - Zellen zu steuern. (A) Die Scans mit einem 2,2 mm Länge durchgeführt wurden, und die Bilder wurden gefangen genommen , nachdem weitere Bildverarbeitung (Volumen-Rendering und Transformation;Maßstabsbalken:. 1 mm) (B) Knochenvolumen um Kniegelenk bewertet dreidimensionale Rekonstruktion von Mikro-CT - Bilder verwenden und im Inneren des Volumens von Interesse Knochenvolumen wurde (Maßstabsbalken berechnet. 1 mm) Bitte klicken Sie hier , um die sehen eine größere Version dieser Figur.

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    Discussion

    In diesem Protokoll ist ein kritischer Schritt der in vitro Differenzierung von TCR / FoxP3 - Gen-Transduktion iPSCs. In vitro Notch - Signalweg induziert Entwicklung in Richtung der T - Zell - Abstammungslinie. Um iPSCs in CD4 + FoxP3 + Tregs unterscheiden, haben wir die OP9-DL1 / DL4 / IA b - Zellen, die hoch express MHC II (IA b) Moleküle. Die meisten der iPSCs differenzieren sich in CD4 + -Zellen. Doch nach der Oberfläche TCR-Expression, verlieren viele differenzierte pre-T-Zellen die Fähigkeit zu unterscheiden, und schließlich sterben. Als Ergebnis verringert sich die Zellzahl der iPSC abgeleiteten funktionellen Treg dramatisch nach vier Wochen in vitro - Differenzierung. Um dies zu vermeiden, Zugabe von IL-2 kann das Überleben der Zelle zu diesen Zeitpunkten zu verbessern. Eine alternative Methode , die Reifung und das Überleben von Ag-spezifische Pre-Tregs zu fahren, um die Pre-Tregs zu übertragen , die für eine Woche in Mäuse in vitro differenziert haben. Diese Pre-Tregs können continue Differenzierung und Reifung in vivo für weitere drei Wochen. Mit dieser Methode kann eine funktionelle Ag-spezifischen Treg Population von iPSCs erzeugt werden, die nTregs artig und haben die Fähigkeit zur Unterdrückung von Autoimmun arthritis in dem murinen Modell sind.

    Um die Wirksamkeit der in vivo Entwicklung von Ag-spezifischen iPSC-Treg, verschiedene Verbindungen (beispielsweise Retinsäure, gelectin) 13,14 oder suppressive Zytokine (zB TGF-β, IL-10) verbessern kann nach dem adoptiven Transfer verwendet werden , des vorge Treg. Zusätzlich das Überleben der Zelle zu erhöhen, können diese kombinierte Ansatz FoxP3 Expression 14,15 erhalten und die Qualität der Ag-spezifischen iPSC-Treg verbessern.

    Ein mögliches Problem , das für eine in vivo Treg Entwicklung entstehen könnte , ist insgesamt Immunsuppression, was zu Komplikationen bei Infektionen oder nach Gewichtsverlust. Eine große Anzahl von Ag-spezifische Tregs in vi Entwicklungvo kann Infektionen verschlimmern. In diesem Fall ist ein Suizid-Gen, die induzierbare Caspase 9 (ICasp9) 15,16 kann in den TCR / FoxP3 Vektor eingebaut werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Entfernung der Stammzellen abgeleiteten Tregs durch die Injektion eines bioinerter kleinen Molekül-Dimerisierung Mittel (AP1903) auf "abgeschaltet" die Erzeugung von Stammzellen abgeleiteten Tregs, die dieses Potential Problem überwinden.

    Ein selbst Ag ist ein typisches Protein, das durch das Immunsystem des Wirten erkannt von einer einzelnen Autoimmunerkrankung leidet. Diese Selbst Ag ist das Ziel des Immunsystems und die korrelierten T-Zellen werden nicht gelöscht. Selbst Ag spezifische Tregs, die Verwendung von TCR Übertragung ist eine gute Wahl zu erzeugen. Ein selbst Ag (zB Hitzeschock - Protein) spezifische TCR kann in reifen CD4 + CD25 + Tregs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) transduziert werden, und dieser Ansatz wurde in klinischen Studien verwendet worden. Alternativ kann, wie described in diesem Protokoll können selbst Ag spezifische Tregs, die Gentransduktion der Selbst Ag spezifischen TCR mit FoxP3 und Stimulation mit Notch-Signalweg, Stammzell-abgeleiteten Tregs verwenden.

    Zellbasierten Therapien für Autoimmunerkrankungen entwickelt Treg Verwendung kann 17 nützlich sein. Obwohl TCR Transduktion in T - Zellen , die in klinischen Studien sicher, machbar und anwendbar zu sein, gibt es noch immer große Sicherheitsbedenken wegen der Autoimmunität verursacht durch Kreuzreaktivität mit gesundem Gewebe 18 bewährt hat. Darüber hinaus aktuelle Methoden, genetisch veränderten Tregs haben in der Regel eine kurzfristige Persistenz in vivo 19. Alternativ kann eine vielversprechende Quelle einer großen Anzahl von monoklonalen Ag-spezifischen Treg für die Entwicklung von Stammzellen ist. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) haben die beste Pluripotenz und Selbsterneuerung, aber es ist nicht möglich, sie von Patienten zu erhalten. Obwohl leicht aus dem peripheren Blut isoliert, sind hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) multi-potenten Stammzellen und kann ähnlich wie WSR 20 in Zellkultur expandiert werden. IPSC vorliegenden Technologie zu einer effizienteren Erzeugung von PSC von Patienten somatischen Zellen durch Transduktion von verschiedenen Transkriptionsfaktoren vorgerückt. Eine Reihe von methodischen Verbesserungen wurden in den letzten Jahren entwickelt iPSCs zu erzeugen, indem maximal mögliche Gefahren wie Immunogenität und tumorigenicity reduzieren. Im Vergleich zu WSR haben iPSCs identisch Pluripotenz und Selbsterneuerung. Als Ergebnis kann iPSC Technologie einen Vorteil bei der Entwicklung von Patienten- und / oder krankheitsspezifische PSCs bereitzustellen. Die Verwendung von iPS - Zellen Ag-spezifische Tregs kann vorrücken auf dem Gebiet der zellbasierten Therapien für Autoimmunerkrankungen 10,11 zu entwickeln.

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    Acknowledgments

    Dieses Projekt wurde finanziert, zum Teil unter Zuschüsse aus den National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 und K18CA151798), der American Diabetes Association (1-16-IBS-281) und der Pennsylvania Department of Health (Tobacco Settlement Funds) zu JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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