إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

التصلب العصبي المتعدد هو مرض يصيب الإنسان تتميز التهاب مزمن والتنكس العصبي للجهاز العصبي المركزي والتي يعتقد أن تكون مدفوعة من قبل رد فعل المناعة الذاتية الموجهة نحو المايلين. فقدان المايلين ومحاور مع مرور الوقت تؤدي إلى الانحسار التدريجي لالمعرفية والحركية وظيفة 1. "التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ" هو مصطلح شامل لنماذج حيوانية من أمراض المناعة الذاتية الموجهة نحو الجهاز العصبي المركزي المايلين. مثل MS الإنسان، وعادة ما يتميز EAE بواسطة تسلل الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي، وفي بعض الحالات، إزالة الميالين 2. ومع ذلك، فإن الدرجة التي تشبه أي نموذج EAE نظرا MS البشري في جزء يعتمد على نوع أو سلالة المستخدمة وعلى مدى تعقيد استجابة المناعة الذاتية الكامنة مكافحة المايلين.

المناعة الذاتية مكافحة الميلين يمكن أن يتسبب تجريبيا في العديد من الطرق، ولكن الأسلوب الأكثر شيوعا اليوم هي لتحصين الفئران مع الببتيد قصيرة من الأحماض الأمينية محاكاة CD4 سائد مناعيا 35-55)، والذي يستخدم للحث على EAE في C57BL / 6 الفئران 3. ومع ذلك، بالنسبة لبعض أغراض تجريبية من المرغوب فيه أو حتى من الضروري تحصين مع مستضدات بروتين أكبر وبالفعل هناك العديد من المزايا لهذا على تحصين مع الببتيد قصيرة. أولا، بسبب تقييد MHC، الببتيدات قصيرة وعادة ما تكون فعالة إلا في نطاق محدود جدا من السلالات، بينما أكبر مستضدات البروتين تمثل إما البروتين الكامل أو مجال معين يمكن معالجة عادة لعرضها في عدة سلالات الفئران الفطرية أو حتى في أنواع مختلفة 4. ثانيا، مستضد بروتين أكبر قادر على إحداث استجابة مناعية أكثر تعقيدا تضم ​​أكثر من أنواع الخلايا الليمفاوية في الاعتراف مستضد، بدلا من limitinز مستضد الاعتراف لخلايا CD4 + T. على سبيل المثال، الخلايا البائية عبر من مستقبلات الخلايا البائية (BCR) تتفاعل مباشرة مع كامل بدلا من معالجتها البروتين. نحن وآخرون قد أظهرت أن الخلايا البائية تفعيلها من خلال MOG 35-55 التحصين لا تعترف البروتين MOG 5. منذ تجلت الخلايا البائية مؤخرا للعب دور الممرضة في MS البشري نماذج EAE التي تتضمن الخلايا البائية في أمراض المناعة الذاتية هي ذات أهمية متزايدة.

وعلى الرغم من مزايا استخدام المضادات البروتين أكبر للحث على EAE، لا تزال هناك بعض المصادر المتاحة تجاريا لهذه البروتينات. في الواقع، في حين أن الببتيدات القصيرة مثل MOG 35-55 يمكن توليفها بشكل سريع جدا وبتكلفة منخفضة نسبيا، والخيارات التجارية للبروتين MOG محدودة والتكلفة إلى حد كبير أكثر لشراء. ومع ذلك، هناك العديد من ناقلات التعبير المتاحة للمجموعات بحثية لتوليد MOG نطاق خارج الخلية (MOG 1-125) أنفسهم. Howeveص، وتقوم كل الأنظمة التعبير التي حددناها في الأدب على التقنيات القديمة التي منذ تم استبدال أنظمة التعبير أكثر كفاءة 7. وعلاوة على ذلك، تعتمد في الغالب على الفئران أو الإنسان MOG 8. بالنسبة لبعض التحقيقات من المناعة الذاتية في الفئران، مستضد على أساس مستضد ذاتي الماوس MOG هو الأفضل. وأخيرا، جميع البروتينات على أساس MOG التي حددناها، سواء التجارية أو ناقلات التعبير، هي البروتينات الانصهار التي تحتوي على الأحماض الأمينية إضافية إلى قاعدة MOG 1-125. وتشمل هذه شعارا لتنقية وتسلسل عادة أخرى أيضا، وكثير منها مع وظيفة لم نتمكن من التعرف عليها.

لمعالجة هذه القيود، ولدت لنا بروتين الانصهار رواية تقوم على الماوس MOG نطاق خارج الخلية لتنصهر علامة تحتوي على thioredoxin لمكافحة الذوبان معروفة من البروتين MOG 5. يحتوي على تسلسل العلامة أيضا تسلسل 6xHis لتنقية والبروتياز شركة كلي TEVموقع avage التي تسمح لإزالة كاملة من جميع تسلسل علامة، إذا رغبت في ذلك. هذا هو الأسلوب الوحيد الذي ندرك لتوليد النقي MOG 1-125 البروتين. لتسهيل إنتاج كميات كبيرة من البروتين، وتسلسل MOG 1-125 كان كودون الأمثل للتعبير عن البكتيريا وتم إدراج MOG البروتين العلامة الاندماج في النظام التعبير PET-32. هنا، نحن تصف بالتفصيل بروتوكول لإنتاج وتنقية MOG العلامة البروتين، وزارة النفط والغاز النقي 1-125، وذلك باستخدام المعدات غير المتخصصة المتاحة لمعظم مختبرات علم المناعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. البروتين التعريفي

ملاحظة: في الخطوات التالية، BL21 القولونية بكتيريا القولونية تحولت مع ناقلات PET-32 التي تحتوي على تسلسل للبروتين العلامة MOG الانصهار (انظر المرجع 5) والشكل (1) تزرع على كثافة عالية ومن ثم يتم يسببها للتعبير عن MOG العلامة البروتين . انظر الشكل 2 لجدول زمني العام - لاحظ أن الأيام وأشار نقاط وقف التقريبية وبديلة في البروتوكول. إذا بدءا من تنقية الحمض النووي للحيوانات الاليفة 32 MOG العلامة ناقلات، وسوف يكون من الضروري لتحويل كيميائيا إلى المختص BL21 E. البكتيريا القولونية باستخدام اختيار الأمبيسلين، كما تم وصفها بشكل جيد 9. التحول الناجح يمكن التأكد من تنقية الحمض النووي من البكتيريا المحدد باستخدام مجموعة تجارية القياسية، تليها الهضم مع تقييد الانزيمات AGE1 وSac1 لإنتاج الفرقة 424 نقطة أساس على هلام الاغاروز 10.

    العلامة الجلسرين BL21-MOG واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة.
  1. وضع اثنين 1 قوارير L مخروطي يحتوي على 500 مل من معقم مرق LB في الحاضنة 37 درجة مئوية في إعداد لليوم التالي.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من 100 ملغ / مل الأمبيسلين إلى كل من قوارير تحتوي على 500 مل LB من الخطوة 1.2 (نهائي تركيز 0.1 ملغ / مل الأمبيسلين). نقل 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها من الخطوة 1.1 إلى كل من اثنين من قوارير من مرق LB. احتضان عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعة أو ما يصل إلى الكثافة البصرية من 0.6.
  3. تأخذ واحدة 1 مل قسامة من واحدة من قوارير وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل منفصل. بيليه الخلايا في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف. تسمية أنبوب كما T 0 (قبل الاستقراء) ومن ثم وضع بيليه البكتيرية إلى -20 درجة مئوية الثلاجة لمدة المستقبل الصوديوم دوديسيل هلام كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-باغE) التحليل (انظر القسم 8) والشكل (3).
  4. إضافة 0.5 مل من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside، الآيزوبروبيل β-D-thiogalactoside (IPTG) إلى كل قارورة الثقافة. احتضان قوارير عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة، ثم في درجة حرارة الغرفة في 75 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها.

2. حصاد MOG العلامة البروتين

ملاحظة: في هذه المرحلة، سيكون قد تنتج البكتيريا كميات كبيرة من MOG العلامة البروتين. حصاد العلامة MOG، وهي lysed البكتيريا لأول مرة في منطقة عازلة تريتون X-100 تليها صوتنة. ثم يتم تحرير MOG العلامة من الهيئات إدراج والتشويه والتحريف مع ايميدازول وغوانيدين، مما أدى إلى حل البروتين الخام التي تحتوي على علامة MOG البروتين.

  1. تأخذ واحدة 1 مل قسامة من واحدة من الثقافات بين عشية وضحاها من الخطوة 1.5 وتحويلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بيليه الخلايا في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف. تسمية الحوضالبريد T O / N (بعد الاستقراء) ثم وضع بيليه البكتيرية في الثلاجة -20 درجة مئوية لتحليل صفحة المستقبل SDS (الشكل 3).
  2. توزيع الثقافات بالتساوي بين 250 مل الزجاجات متوافقة مع ارتفاع سرعة الطرد المركزي وإبقاء هذه على الجليد من هذه النقطة إلى الأمام. بيليه الخلايا البكتيرية في 22000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف. تخزين الكريات البكتيرية عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 2.4.
  4. إعداد العازلة تحلل (0.1 ملغ / مل الليزوزيم الدجاجة بيضة، 0.1٪ تريتون-X (ت / ت) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)) وذلك بإضافة 60 ميكرولتر من تريتون X-100 و 120 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الدجاجة بيضة الليزوزيم حل سهم إلى 60 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. و resuspend وتجمع بين كل من الكريات البكتيرية من الخطوة 2.3 في ما مجموعه 30 مل من تحلل العازلة. نقل هذا الكتاب إلى جولة أسفل أنبوب 50 مل قادرة على ارتفاع الطرد المركزي بسرعة. وضع هذا الأنبوب في 30 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة، ويهز أنبوبمرتين لresuspend الخلايا.
  6. بعد الحضانة، ونقل أنبوب على الجليد ويصوتن الحل في 20 كيلو هرتز، السعة 70٪، والنبض في 3 ثانية، نبض من 3 ثوان، وخمسة البقول في كل جولة. يصوتن الحل لمدة ستة مجموع الجولات والسماح للحل لتبرد على الجليد في الفترات الفاصلة بين الدورات.
  7. أجهزة الطرد المركزي الحل في 24000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وكرر الخطوات من 2،5-2،7 مرة واحدة. تخزين بيليه في -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 2.8.
  8. إعداد العازلة ألف (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 7.9) وذلك بإضافة 0.8766 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.09456 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، و0.01021 غرام من ايميدازول إلى دورق 100 مل. إضافة H 2 O حتى يصل إلى حجم 28 مل ثم ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.9. ثم، ونقل الحل إلى 100 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 30 مل.
  9. resuspend الكرية من الخطوة 2.7 في 30 مل من العازلة ألف واحتضان هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. خلال هذا الوقتتزن من 17.2 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك.
  10. يصوتن الحل على الجليد باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 2.6. ثم إضافة 17.2 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى حل. احتضان هذا على الجليد لمدة 1 ساعة لإذابة البروتين العلامة MOG.
  11. أجهزة الطرد المركزي الحل في 24000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف وتخزين طاف في 4 درجات مئوية حتى تنقية البروتين.

3. البروتين تنقية

ملاحظة: في الخطوات التالية سيتم تنقيته من MOG العلامة البروتين من خلال 4 جولات من امتصاص على الراتنج النيكل اتهم (عن طريق صاحب العلامة) وشطف.

  1. جعل المخازن وبعد:
    1. إعداد B الاحتياطي (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 5 ايميدازول ملم، 6 M غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9). إضافة 5.844 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.6304 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.0681 غرام من إميدازول و114.64 ز غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى كوب 500 مل. ثم إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.9. نقل سولution إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 200 مل.
    2. إعداد عازلة شطف (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 0.5 M إميدازول 6 M غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9). إضافة 5.844 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.6304 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، 6.808 غرام من إميدازول و114.64 ز غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى 500 مل دورق. إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.9. نقل الحل إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 200 مل.
    3. إعداد عازلة قطاع (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.9). إضافة 5.844 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.6304 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، 40 مل 500 ملي EDTA إلى 500 مل دورق. إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.9. نقل الحل إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 200 مل.
    4. إعداد المسؤول عازلة (0.1 م كبريتات النيكل). إضافة 5.257 غ كبريتات النيكل إلى مل دورق 500 و إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل (تنبيه، لا تتعامل مع النيكلتم حل كبريتات خارج غطاء الدخان حتى كبريتات النيكل في H 2 O). مرة واحدة وقد حل كبريتات النيكل، ونقل الحل إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى يصل حجم 200 مل.
  2. تقسيم 10 مل من الراتنج النيكل بين اثنين مخروطية 50 مل أنابيب الطرد المركزي قادرة على تحمل قوى الطرد المركزي أكثر من 4،500 x ج (5 مل في كل أنبوب).
  3. تهمة ويوازن الراتنج النيكل:
    1. غسل الراتنج وذلك بإضافة 40 مل H 2 O إلى كل أنبوب يحتوي على الراتنج. وضع أنابيب أفقيا على الكرسي الهزاز والسماح لهم تستنهض الهمم لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء، أنابيب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل طاف قبل pipetting لتجنب إزعاج بيليه. إضافة 40 مل من العازلة تهمة إلى كل أنبوب. نقل الأنابيب على الكرسي الهزاز والسماح لهم تستنهض الهمم لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء، أنابيب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. اختياري: خذ 150 ميكرولتر من البروتين بالفاعلات التي تم جمعها في الخطوة 2.11 وتحويلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تسمية أنبوب ما قبل الحضانة وتجميد هذا في -20 درجة مئوية لتحليل صفحة المستقبل SDS (الشكل 3، العلامة الخام MOG).
  5. تنقية العلامة MOG البروتين:
    1. نقل وحدة التخزين بالكامل من البروتين بالفاعلات من الخطوة 2.11 (~ 40 مل، ناقص عينة صغيرة إزالتها في الخطوة 3.4) إلى الأنبوب الأول (الشكل 2، أنبوب 1) التي تحتوي على الراتنج النيكل من الخطوة 3.3، مزيج، ووضع أفقي على الكرسي الهزاز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. أنبوب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. الانتهاء مرة واحدة، ونقل طاف للثانيأنبوب (الشكل 2، أنبوب 2) من الراتنج النيكل واحتضان كما هو موضح في الخطوة السابقة. في غضون ذلك، متابعة الخطوات 3-6 أدناه مع أنبوب 1.
    3. Resuspend والراتنج النيكل في أنبوب 1 في 40 مل من شطف العازلة ووضع أنبوب أفقيا على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. نقل طاف تحتوي على بروتين مزال العلامة MOG في زجاجة مل 250 المسمى "النقي العلامة MOG البروتين والحفاظ على هذه الزجاجة في 4 درجات مئوية. مع كل خطوة شطف، تجمع طاف الناتجة في هذه الزجاجة.
    5. إضافة 40 مل من العازلة الشريط إلى الراتنج النيكل ووضع أفقي على الكرسي الهزاز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. أنبوب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، ثم إعادة شحن الراتنج النيكل كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    7. بمجرد الانتهاء، المضي قدما في أنبوب الثاني كما هو موضح في الخطوة 3.5. ما مجموعه 4 جولةالصورة من امتصاص البروتين بالفاعلات من الخطوة 2.11 على الراتنج النيكل اتهم وشطف سوف تسترد أكثر من البروتين على الرغم من ذلك، إذا رغبت في ذلك، يمكن استرداد بروتين إضافي في جولات إضافية من امتصاص وشطف.
  6. مرة واحدة أربعة (أو أكثر) جولات من امتصاص وشطف كاملة، وتخزين البروتين المنقى المجمعة في 4 درجات مئوية خلال الليل. الراتنج النيكل يمكنك خزنها في 40 مل من محلول الإيثانول 20٪ في 4 درجات مئوية حتى الحاجة إليه مرة أخرى.

4. قياس كثافة البروتين

ملاحظة: قبل المضي قدما من الضروري قياس كمية من البروتين النقي العلامة MOG ولدت في القسم 3. سيتم استخدام هذه القيمة لتحديد الحجم النهائي للتركيز هذا البروتين في نهاية البروتوكول. نحن تصف برادفورد الفحص القياسية هنا. يتم تحديد تركيز البروتين المنقى العلامة MOG بمقارنة الامتصاصية الطيفي متسلسل مخففإد MOG العلامة البروتين لمنحنى مستوى الزلال المصل البقري (BSA) بتركيز معلوم.

  1. جعل 10X العازلة خلات بإضافة 23 مل حامض الخليك الجليدي إلى 8.2 غ خلات الصوديوم في كوب 3 L ثم قم بإضافة 1.9 L من H 2 O بحل خلات الصوديوم. نقل هذا الحل إلى 2 لتر تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى يصل حجم 2 L. ثم تخزينه في زجاجة 2 لتر في درجة حرارة الغرفة. جعل 1 مل من العازلة خلات 1X بإضافة 100 ميكرولتر من 10X العازلة خلات إلى 900 ميكرولتر من H 2 O.
  2. إعداد لوحة 96-جيدا لالتخفيفات بإضافة 30 ميكرولتر من العازلة خلات 1x إلى الآبار G2-8 و 60 ميكرولتر إلى G9. إضافة 48 ميكرولتر من العازلة خلات 1x إلى H2 و H3.
  3. إعداد التخفيف المتسلسل الأولي للمستوى BSA في الصف G كما يلي: إضافة 216 ميكرولتر من العازلة خلات 1X و 54 ميكرولتر من المتاحة تجاريا 2 ملغ القياسية / مل BSA في G1 جيدا وتخلط جيدا. إضافة 210 ميكرولتر من G1 جيدا ان G2 جيدا، تخلط جيدا،ثم قم بإضافة 180 ميكرولتر من G2 جيدا ان G3 بشكل جيد. إضافة 150 ميكرولتر من G3 جيدا ان G4 جيدا، تخلط جيدا، ويستمر هذا الاتجاه إضافة 30 ميكرولتر أقل على كل بئر لاحقة حتى G8 جيدا. (انظر الجدول رقم 1 لقوائم عوامل التخفيف ما يعادلها).
  4. إعداد العينات ثلاث نسخ من كل تخفيف من خلال نقل 10 ميكرولتر من G1 جيدا ان الآبار A1 و B1 و C1، و 10 ميكرولتر من G2 جيدا ان الآبار A2، B2، و C2، وهلم جرا. استخدام ماصة الأقنية.
  5. لإعداد التخفيفات العلامة MOG، إضافة 60 ميكرولتر من تنقية البروتين العلامة MOG من الخطوة 3.6 إلى H1 جيدا. إضافة 12 ميكرولتر من H1 جيدا إلى ما H2، تخلط جيدا، ثم إضافة 12 ميكرولتر من H2 جيدا إلى ما H3، تخلط جيدا (وهذا ينتج عنه تخفيف 1X في H1 و 1/5 التخفيف في H2، و1/25 التخفيف في H3) .
  6. إعداد العينات ثلاث نسخ للعلامة MOG التخفيفات عن طريق نقل 10 ميكرولتر من الآبار H1-H3 إلى صفوف D، E و F، كما هو موضح في الخطوة 4.4.
  7. مزيج 2 مل من صبغة البروتين مقايسة التركيز كاشف مع 8 مل من H 2 O. إضافة 200 ميكرولتر من هذا الخليط لجميع الآبار التي تم تحميلها مسبقا في صفوف A، B، C، D، E، F و، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إذا كانت متوفرة. البوب ​​أي فقاعات في الآبار باستخدام إبرة قبل قراءة تركيز البروتين.
  8. في غضون 10 دقيقة من إضافة كاشف صبغ، وقياس الامتصاصية 595 نيوتن متر من جميع الآبار في صفوف A، B، C، D، E، و F.
  9. استخدام الصفوف A، B، و C لإنشاء منحنى القياسية حيث المواقف 1-9 تتوافق مع 0.4، 0.35، 0.3، 0.25، 0.2، 0.15، 0.1، 0.05، و0 ملغ / مل BSA. واستنادا إلى هذا المنحنى، وحساب تركيز MOG العلامة البروتين باستخدام التخفيف من العلامة MOG الذي يناسب المنحنى القياسي. عادة، سوف يكون هناك 200-250 ملغ من MOG العلامة البروتين من 1 لتر من ثقافة البكتيرية باستخدام وصف بروتوكول هنا.
    ملاحظة: لجعل MOG 1-125 ننطلق من هنا إلى قسم اختياري 7 المدرجة في نهاية البروتوكول. خلاف ذلك، تابع إلى القسم 5.

معشوقة = "jove_title"> 5. غسيل الكلى

ملاحظة: يتم تنفيذ غسيل الكلى لإزالة غوانيدين تدريجيا من محلول يحتوي على النقاء، التشويه والتحريف العلامة MOG للسماح للبروتين لrefold. يجب توخي الحذر خلال هذه الخطوة كما MOG نفسها غير قابلة للذوبان جدا، وعلى الرغم من هذا هو تحسن من وجود علامة thioredoxin، فإنه لا يزال عرضة للخروج من الحل. لذلك، refolding ينبغي أن يقوم تدريجيا وعلى منخفض نسبيا تركيز العلامة MOG.

  1. قبل البدء في غسيل الكلى، وتمييع المطهرون MOG العلامة البروتين مع العازلة ب (يمكن أن يتم كما هو موضح في الخطوة 3.1 B العازلة) حتى تركيز 0.5 ملغ / مل أو أقل، على أساس كمية من البطاقات MOG المحسوبة في القسم 4.
  2. قطع ما يقرب من 30 سم من جلد الثعبان غسيل الكلى أنابيب وتأمين نهاية واحدة مع مرقئ تأمين من قبل للطي نهاية جلد الثعبان أكثر من ثلاث مرات، وتحامل على نهاية مطوية مع مرقئ. ملء جلد الثعبان مع مخففةالعلامة MOG البروتين (بين 60 الى 90 مل من MOG العلامة البروتين لكل أنبوب) ثم إزالة فقاعات الهواء من جلد الثعبان من قبل اجبارهم على الخروج من نهاية مفتوحة. وأخيرا، ختم الطرف الآخر من الأنبوب باستخدام مرقئ قفل الثاني.
  3. كرر الخطوة 5.2 لملء أقسام إضافية من أنابيب غسيل الكلى حتى يتم نقل جميع MOG العلامة البروتين في أنابيب الثعبان غسيل الكلى. تأكد من عدم وجود تسرب.
  4. جعل خلات 1X مع 4 M غوانيدين وزنها عن طريق 382،12 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك وإضافة 100 مل من العازلة 10X خلات في الخطوة 4.1 إلى دورق 2 لتر. إضافة 0.5 لتر من H 2 O إلى الكأس والسماح للغوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى حل. مرة واحدة حله، ونقل الحل إلى 1 لتر تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى يصل حجم 1 L. كرر هذه الوصفة لكل 2 snakeskins المطلوبة.
  5. أداء غسيل الكلى على النحو التالي: ملء دلو كبير (الحد الأدنى 10 لتر) مع 1 لتر من العازلة خلات 1X مع 4 M غوانيدين من الخطوة 5.4. وضع ما يصل رس 2 أجزاء من أنابيب غسيل الكلى تحتوي على العلامة MOG في دلو، مما يترك مجالا لشريط مغناطيسي تدور دون عوائق في القاع. وضع دلو في غرفة C 4 درجات على لوحة تحريك مغناطيسي وتحويلها إلى معدل دوران بطيء (أي ليست عالية، ما يكفي لتحريك السوائل):
    ملاحظة: نفذ الخطوات التالية للحد تدريجيا من كمية غوانيدين في المخزن المؤقت. وتعطى مرة ضجة كما الحد الأدنى، ولكن يمكن أن تترك ليلة وضحاها. وغسيل الكلى تأخذ ما لا يقل عن 3 أيام، ولكن يمكن تمديد هذه الفترة اذا شئت. تحقق بانتظام للتأكد من أن أنابيب سليمة وأن الغاية مغلقة بإحكام.
    1. السماح للدلو يجلس ويقلب لمدة 4-5 ساعة.
    2. إضافة 1 لتر من العازلة خلات 1X (100 مل 10X العازلة خلات و 900 مل من H 2 O) على كل دلو.
    3. كرر الخطوات من 5.5.1 و 5.5.2 ما مجموعه 3 مرات ليصبح المجموع 4 لتر من العازلة في دلو.
    4. تجاهل نصف عازلة في دلو وإعادة ملء مع 1 لتر من العازلة خلات 1X (100 مل 10X العازلة خلات و 900 مل من H 2 O، لا غوانيدين) وإعداد أنابيب ويقلب شريط.
    5. كرر الخطوات من 5.5.1 و 5.5.2 مرة واحدة (أي حتى يكون هناك ما مجموعه 4 لتر من العازلة في دلو).
    6. وأخيرا، استبدال كامل حجم 4 لتر في وعاء مع 4 لتر من العازلة 1X خلات جديدة والسماح ضجة لمدة 4-5 ساعة. للحصول على أفضل النتائج، القيام بهذه الخطوة في اليوم من تركيز البروتين.
    7. إزالة بعناية أنابيب غسيل الكلى مع العلامة MOG refolded وتجاهل عازلة دلو.

6. التركيز MOG العلامة البروتين

ملاحظة: في الخطوة الأخيرة، ويتركز refolded MOG العلامة البروتين لتخفيف العمل للتخزين. كما MOG البطاقة هي غير قابلة للذوبان جدا، فإنه لا ينبغي أن يتجاوز 5 ملغ / مل. هذا التركيز هو متساوي المولية تقريبا مع 0.4 ملغ / مل MOG 35-55 الببتيد، والذي يستخدم عادة للحث على EAE في الفئران (مختلطة 1: 1 مع كامل adjuv فرويندالنمل (CFA)). وخلال عملية الاعتقال ليس من غير المألوف لكمية صغيرة من البروتين للخروج من الحل في شكل راسب أبيض. هطول المفرط هو المشكلة، ولكن.

  1. حساب الحجم النهائي المطلوب لتحقيق تركيز العلامة MOG من 5 ملغ / مل، استنادا إلى القيمة المحسوبة في القسم 4.
  2. خط مقلاة مع رقائق الألومنيوم وتشمل رقائق الألومنيوم مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG) 3350 وPEG 8000 في نسبة 1: 1. وأدرجت PEG 3350 إلى هذا الخليط لأنها يمكن أن تساعد على منع تراكم البروتين خلال التركيز وغير فعال cyropreservative 11.
  3. وضع أنابيب الثعبان (مع MOG العلامة البروتين داخل) على أعلى من رقائق الألومنيوم، وتغطي مع PEG 8000. ولهذا الاعتصام في درجة حرارة الغرفة والتحقق من حجم بانتظام حتى حجم يساوي أو أقل من الحجم النهائي المقدرة (المحسوبة في الخطوة 6.1)، وسوف يقاس الحجم الفعلي في الخطوة التالية. إذا أصبح عموممشبعة بالماء أثناء عملية الاعتقال، وإنشاء عموم جديدة مع رقائق الألومنيوم وPEG 3350 وPEG 8000.
  4. غسل خارج snakeskins مع H 2 O ونقل البروتين العلامة MOG لزجاجة منفصلة باستخدام ماصة المصلية. تتبع حجم كما يتم نقل البروتين لضمان وحدة التخزين الصحيح.
    1. إذا تم تخفيض حجم أقل من الحجم النهائي المقدرة، إضافة عازلة خلات 1X حتى يتم الوصول إلى حجم المطلوب. وإذا كان حجم فوق الحجم النهائي المقدرة، نقل العلامة MOG البروتين مرة أخرى في أنابيب غسيل الكلى ومواصلة تركيز (الخطوات 6،2-6،3).
    2. توزيع العلامة MOG البروتين بين 1.5 مل أنابيب (0.5 مل لكل أنبوب)، وتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. للحث على EAE، هذا المزيج حجم 1: 1 مع CFA.
  5. تشغيل هلام صفحة SDS لتأكيد التعبير عن العلامة MOG البروتين باستخدام عينات أخذت في 1 الخطوات.4، 2.1، 3.4، وتنقية البروتين MOG من الخطوة 6.4.

7. توليد MOG 1-125 من MOG العلامة عن طريق TEV البروتيني (اختياري)

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية وتستمر من نهاية الخطوة 4. إذا كان مطلوبا MOG 1-125 دون أي سمة تسلسل إضافية، ويمكن إزالتها تسلسل العلامة باستخدام TEV البروتيني (الشكل 4). بقدر ما نعلم، ليس هناك نظام التعبير الأخرى قادرة على توليد النقي MOG 1-125. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه من دون العلامة thioredoxin، MOG 1-125 غير قابلة للذوبان للغاية وهذا قد يسبب مشاكل أثناء تنقية ومعالجة، ولهذا السبب إزالة العلامة عند الضرورة القصوى لأسباب التجريبية. مطلوبة عدة خطوات لتوليد النقي MOG 1-125. ومدال MOG العلامة لأول مرة في TEV عازلة البروتيني الانقسام. بعد الهضم مع TEV البروتيني، يتم تقليل حجم للمساعدة في وقت لاحق تنقية الواحدالعائد على السهم، ثم مدال إلى B العازلة، ثم صاحب العلامة التي تحتوي على العلامة تسلسل وإزالتها باستخدام الراتنج النيكل. وأخيرا، وكميا البروتين ويتركز MOG النقي 1-125 إلى التركيز النهائي.

  1. جعل 1 لتر من العازلة 10X انشقاق TEV (500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 5 ملي EDTA) وذلك بإضافة 1،861 ز EDTA، 44.4 غرام تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 26.5 جم تريس إلى دورق 2 لتر. إضافة H 2 O حتى يصل حجم 990 مل ثم ضبط درجة الحموضة إلى 8 إلى حل EDTA. نقل الحل إلى 1 لتر تخرج اسطوانة وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر باستخدام H 2 O.
  2. تمييع MOG العلامة البروتين من الخطوة 3،6-0،5 ملغ / مل باستخدام B العازلة (المخزن نفسه هو موضح في الخطوة 3.1)، استنادا إلى كمية من البروتين المحسوبة في القسم 4. نقل 120 مل من المخفف البروتين العلامة MOG إلى الثعبان غسيل الكلى أنابيب كما وصفها في خطوات 5،2-5،3. يمكن زيادتها رفع مستوى الصوت ولكن كمية TEV البروتيني اللازمة ليلتصق كل من العلامة MOG البروتين سوف يكون substantial.
  3. متابعة بروتوكول غسيل الكلى المذكورة في الخطوة 5.5، باستثناء استبدال العازلة 10X خلات مع عازلة انشقاق 10X TEV في الخطوة 7.1.
  4. نقل العلامة MOG، الآن في TEV عازلة انشقاق، لزجاجة جديدة زجاج 250 مل ورصد زيادة حجم من غسيل الكلى. إضافة 1 ميكرولتر من β-mercapto الإيثانول في كل 2.85 مل من MOG العلامة بروتين يضاف إلى زجاجة. إضافة على الأقل 1 ملغ من TEV البروتيني (الأسهم حل TEV في 5 ملغ / مل) لكل 50 ملغ من MOG العلامة بروتين (يمكن إضافة البروتيني TEV تصل إلى 01:10 TEV: نسبة البروتين MOG)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء لمدة 72 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: في نهاية البروتيني حضانة TEV، ينبغي أن ينظر إلى رواسب بيضاء في الجزء السفلي من زجاجة.
  5. قبل نقل البروتين لأنابيب غسيل الكلى، إضافة غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى حل حتى تذوب البروتينات لمنع البروتين يترسب من التمسك زجاجة. نقل 150 ميكرولتر منهذا الحل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتسمية أنبوب بأنها "MOG مع TEV". تخزين الحل في -20 درجة مئوية لتحليل SDS-PAGE في المستقبل.
  6. نقل جميع السوائل من الخطوة 7.5 في أنابيب غسيل الكلى كما هو موضح في الخطوات 5،2-5،3. ملء دلو كبير مع 2 لتر من H 2 O ووضع أنبوب غسيل الكلى في دلو. احتضان هذا في 4 درجات مئوية مع ضوء اثارة بين عشية وضحاها. هذه الخطوة مهمة لتخفيف خارج غوانيدين للسماح للتركيز البروتين تحدث بسرعة وتبدأ إزالة EDTA من الحل الذي سوف تتداخل مع تنقية البروتين.
  7. تركيز البروتين في أنابيب غسيل الكلى كما هو موضح في الخطوات 6،2-6،3 (باستثناء استخدام فقط PEG 8000) بحيث الحجم النهائي من الحل هو ~ 40 مل. غسل أنابيب غسيل الكلى مع H 2 O وإزالة أي PEG المتبقية 8000 لا تزال تعلق على الأنبوب. هذا الانخفاض في حجم يجعل من الممكن لتناسب جميع من البروتين المهضوم إلى أنبوب 50 مل تحتوي على النيكل إعادةالخطيئة، كما هو موضح في الخطوة 3.5.
  8. Dialyze على البروتين المهضوم إلى B الاحتياطي:
    1. ملء دلو كبير مع 1 لتر من العازلة ب (29.22 جم كلوريد الصوديوم، 3.152 غرام تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.3405 ز إميدازول 573.18 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9).
    2. وضع snakeskins تحتوي على البروتين المهضوم من الخطوة 7.7 في دلو جنبا إلى جنب مع المغناطيس ضجة (كما هو موضح بمزيد من التفصيل في الخطوة 5.5). وضع دلو إلى 4 درجات مئوية غرفة باردة على طبق من ضجة لتعيين ضجة بطيئة والسماح للsnakeskins إلى dialyze لمدة 5 أو أكثر من ساعة.
    3. تفريغ دلو وإعادة ملء مع 1 لتر آخر من B العازلة وترك هذا الجلوس في غرفة C 4 درجات الباردة على طبق من ضجة لتعيين ضجة بطيئة والسماح للsnakeskins إلى dialyze لمدة 5 أو أكثر من ساعة.
  9. أداء تنقية MOG 1-125 البروتين كما هو مفصل في الباب 3، مع فارق مهم من شأنها أن تكون ملزمة تسلسل العلامة المشقوق من الراتنج النيكل، وترك MOG 1-125 في الحل. مرة أخرى، سوف 4 جولات من تنقية يكونتجرى على نفس الحجم، ولكن في هذه الحالة كان الهدف هو تحسين نقاء، بدلا من استعادة الكثير من البروتين ممكن. انظر الشكل 4.
    1. جعل مخازن تنقية البروتين المذكورة في الخطوة 3.1
    2. توجيه الاتهام كلا أنابيب من الراتنج النيكل كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    3. تنقية MOG 1-125 من مفصل في خطوة 3.5، باستثناء الضروري أن شطافة من الراتنج النيكل التي تحتوي على بطاقة يتم تجاهل بروتوكول (الحفاظ على 150 ميكرولتر من شطافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لتحليل SDS-PAGE المستقبل)، في حين يتم الاحتفاظ محلول يحتوي على MOG 1-125 كمنتج نهائي.
  10. قياس تركيز MOG 1-125 البروتين كما هو موضح في القسم 4:
    1. إعداد BSA التخفيفات منحنى القياسية كما هو موضح في الخطوات 4.2 و 4.4.
    2. إعداد التخفيفات من MOG 1-125 كما هو موضح في الخطوات 4.5 و 4.6. بدلا من ذلك، قد يكون من المفيد أن تولد مجموعة أكبرمن التخفيفات (1X، 1/2، 1/4، 1/8 وعلى سبيل المثال). ضبط كميات من العازلة خلات 1X و MOG 1-125 وفقا لذلك.
    3. أداء برادفورد الفحص كما هو موضح في الخطوات 4،7-4،9 وحساب كمية من MOG 1-125 إنشاؤه. العائد المتوقع هو حوالي 4 ملغ أو أكثر من البروتين.
  11. Refold MOG 1-125 عن طريق إزالة تدريجية من غوانيدين عبر غسيل الكلى، كما هو موضح في المادة 5.
  12. التركيز MOG 1-125 البروتين كما هو موضح في القسم 6. التركيز النهائي يجب أن يكون 2.24 ملغ / مل، وهو متساوي المولية إلى 5 ملغ / مل MOG العلامة.

8. SDS-PAGE جل لتأكيد MOG العلامة إنتاج والطهارة

ملاحظة: عينات مأخوذة من الخطوات 1.4، 2.1، 3.4، و 6.4 يتم تحليلها من قبل القياسية SDS-PAGE لتأكيد MOG إنتاج العلامة والنقاء. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد تنقية النهائية إما MOG العلامة أو MOG 1-125.

    <لى> جعل منطقة عازلة تحميل 2X SDS-PAGE بإضافة 1.576 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك إلى 2 مل من H 2 O وتعيين الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة 0.4 غرام SDS في حل تريس، حمض الهيدروكلوريك ومن ثم إضافة H 2 O حتى يصل إلى حجم 7 مل.
  1. إضافة 0.2 غرام من برموفينول الأزرق إلى 10 مل من H 2 O ثم إضافة 1 مل من هذا الحل في الخطوة 8.1. أخيرا، إضافة 2 مل من الجلسرين لإنهاء العازلة تحميل 2X SDS-PAGE. عند تخزين هذا الحل، والحفاظ على 4 درجات مئوية، وحمايته من الضوء لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. ذوبان الجليد في قسامات المجمدة من البكتيريا من الخطوات 1.4 و 2.1 وكذلك MOG بالفاعلات العلامة البروتين من الخطوات 3.4 و 6.4 في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة الأملاح من الحلول التي تم جمعها في الخطوات 3.4 و 6.4 وذلك بإضافة 60 ميكرولتر من كل الأعمدة البروتين تحلية. تنقية البروتينات التالية تعليمات الشركة الصانعة.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من β-mercapto الإيثانول إلى 1 مل من محلول في الخطوة 8.2. إضافة 40 ميكرولتر من هذا إلى البكالوريا اثنينالكريات البكتيرية من الخطوة 8.3 و 60 ميكرولتر من البروتينات المحلاة من الخطوة 8.4 واحتضان هذه على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. جعل 1X عازلة تشغيل الصفحة SDS وزنها عن طريق 5 غرام من تريس، 28.8 غرام الجلايسين، و 1 غرام SDS. إضافة هذه إلى كوب 1 لتر وإضافة 500 مل H 2 O حل كل شيء. مرة واحدة حله، ونقل الحل إلى 1 لتر تخرج اسطوانة وملء مع H 2 O حتى يصل حجم 1 L.
  6. اقامة هلام بولي أكريلاميد 12٪ في جهاز الجل ثم إضافة SDS-PAGE العازلة 1X تشغيل لجهاز هلام مثل أن المخزن المؤقت تشغيل فقط فوق الجزء العلوي من الآبار في هلام. غسل الآبار من هلام قبل pipetting 50 ميكرولتر من العازلة على التوالي في الآبار خمس مرات لكل منهما.
  7. تحميل 10 ميكرولتر من سلم البروتين في البئر الأول وإضافة 10 ميكرولتر من الحلول المغلي من الخطوة 8.5 لفصل الآبار. تشغيل هلام في 115 فولت لمدة 60 دقيقة.
  8. إزالة هلام من الجهاز ونقلها إلى وعاء صغير. ملء حساب المشتركINER مع 100 مل من H 2 O النقي ونقل الحاوية إلى منصة دوارة ببطء لمدة 8 دقائق. بعد دقيقة 8، تفريغ المياه وغسل هلام مرتين أكثر مع H 2 O.
  9. تفريغ H 2 O من الحاوية وإضافة 100 مل من كاشف وصمة عار السريع إلى الحاوية. نسمح لهذا أن يجلس على منصة دوارة ببطء بين عشية وضحاها، وتغطي بورق الألمنيوم.
  10. تفريغ وصمة عار الكاشف السريع وإضافة حوالي 100 مل من H 2 O إلى الحاوية. نسمح لهذا أن يجلس على منصة دوارة لمدة 8 دقائق. تفريغ H 2 O وتكرار غسل H 2 O مرتين.
  11. صورة هلام باستخدام تصوير لبقع زرقاء coomassie. ابحث عن النطاق حول 31.86 كيلو دالتون (MOG العلامة بروتين) والفرقة خفوتا في 63.72 كيلو دالتون (MOG العلامة dimers).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مرة واحدة في تنقية كاملة، والعينات التي تم جمعها في الخطوات 1.4، 2.1، 3.4، ويجب أن يتم تشغيل المنتج النهائي من الخطوة 6.4 على هلام بروتين (الشكل 3A). العلامة MOG يجب أن تظهر أولا والفرقة كيلو دالتون 31.86 في العينة T O / N، ولكن ليس ر وينبغي أن تكون الفرقة الوحيدة في منتج نقي النهائي. لاختبار ما إذا كانت العلامة MOG البروتين ومطوية بشكل صحيح، العلامة MOG البروتين يمكن أن تستخدم لتسمية MOG-بروتين الخلايا البائية محددة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. بواسطة الخلايا الليمفاوية وسم الفأر مع 1: 1000 تخفيف من العلامة MOG جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد صاحب العلامة والتعليم العالي الأجسام المضادة لمكافحة IgG1 fluorescently المسمى، الخلايا البائية MOG محددة يمكن التعرف عليها (الشكل 3B). بدلا من ذلك، MOG العلامة يمكن مترافق مباشرة إلى fluorophores للحد من تلوين الخلفية (الناتجة من الخلايا البائية ملزم الأجسام المضادة الثانوية والثالثية) كماووصف في إشارة 5 لتحديد الخلايا MOG محدد ب. وهذا أمر ضروري عند محاولة تحديد الخلايا ملزم MOG B في الفئران نوع البرية، وهذه الخلايا هي عادة نادرة جدا 5. الفئران IGH MOG لها knockin سلسلة الثقيل الذي، عندما يقترن مع سلسلة ضوء كابا المناسبة، يضفي خصوصية لMOG. كما تم تعزيز الربط العلامة MOG بين الخلايا IGH MOG B، وهذا يؤكد أن هذا البروتوكول يولد مستضد مطوية بشكل صحيح. الأهم من ذلك، تساهم الخلايا IGH MOG B لأمراض المناعة الذاتية في نماذج من إخراج MOG-EAE 12، مؤكدا أن MOG العلامة تحرض على حد سواء T والمناعة الذاتية الخلايا البائية.

قبل البدء في غسيل الكلى لrefold البروتين كما هو موضح في القسم 5، فمن الضروري لقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد، كما هو موضح في قسم ترد 4. ممثل نتائج فحص برادفورد في الجدول 1 الشكل (5).

ويتم إنجاز توليد MOG النقي 1-125 بإضافة TEV البروتيني لMOG العلامة البروتين مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الانقسام من MOG العلامة البروتين في MOG 1-125 وعلامة تسلسل كما هو مبين في الشكل (6). تنقية الراتنج النيكل اللاحقة يزيل MOG العلامة، علامة تسلسل، والشوائب البروتيني TEV تؤدي في نهاية المطاف النقي MOG 1-125 كما هو مبين في الشكل (6).

شكل 1
الشكل 1: MOG العلامة البروتين (المكررة هنا بإذن من دانغ وآخرون 5.). بنية خطية، والأحماض الأمينية وتسلسل الحمض النووي للبروتين الانصهار العلامة MOG. تسلسل الحمض النووي للمجال خارج الخلية من MOG الماوس (MOG1-125، أقل تسلسل باللون الأزرق) وكودون الأمثل للتعبير في البكتيريا (أسود). تم تصنيعه هذا التسلسل وإدراجها في ناقلات لخلق الانصهار N-محطة للعلامة التي تحتوي على thioredoxin وS الوسم لمواجهة الذوبان معروف من البروتين MOG 13،14، فضلا عن 6X صاحب العلامة لتنقية 15. موقع البروتيني انشقاق TEV يفصل MOG 1-125 من العلامة متواليات. انشقاق بين الجلوتامين-164 والجلايسين-165 TEV بوساطة استخدام بديل إجماع TEV انشقاق الموقع 16 النتائج في إزالة جميع الأحماض الأمينية غير MOG. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: نظرة عامة على الخطوات المطلوبة لإنتاج بروتين نقي العلامة MOG ل.توليد MOG العلامة البروتين، وتزرع البكتيريا التعبير عن بروتين العلامة MOG إلى كثافة عالية ثم يسببها للتعبير عن العلامة MOG باستخدام IPTG كما هو موضح في القسم 1. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، وهي lysed البكتيريا ومن خلال سلسلة من الخطوات التكوير الكسر التي تحتوي على البروتينات الهيئات إدراج، والذي يحتوي على بطاقة MOG، يتم استخراج المدرجة في القسم 2. العلامة MOG ثم يتم تنقيته من الكسر البروتين الخام خلال أربع دورات من امتصاص على الراتنج النيكل اتهم وشطف العلامة MOG البروتين كما هو موضح في القسم 3. جزء من ثم يتم أخذ شطافة المجمعة لفحص برادفورد لتحديد العائد من MOG العلامة البروتين وبقية شطافة ومدال إلى عازلة خلات على مدى عدة أيام كما هو موضح في القسمين 4 و 5. وأخيرا، يتركز البروتين باستخدام PEG 3350 وPEG 8000 إلى تركيز النهائي من 5 ملغ / مل تستند على العائد من العلامة MOG تحديدها في بفحص ردفورد على النحو الوارد في القسم 6. العملية برمتها يمكن ان تستغرق ما لا يقل عن 10 يوما، مع اليوم بداية لكل خطوة هو مبين في أقواس. ومع ذلك، يتم سرد توقف البديل وبدء نقطة في البروتوكول، والخطوات التي يمكن أن تنتشر على كمية أكبر من الوقت إذا رغبت في ذلك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تنقية البروتين العلامة MOG وتقييم نشاطها (A) أظهرت عينات البروتين التي تم جمعها من نقاط مختلفة في جميع أنحاء الإجراء تنقية البروتين وتعمل على هلام SDS-PAGE. T 0 = البكتيريا BL21 قبل الاستقراء بروتين (التي تم جمعها في الخطوة 1.4)، T O / N = البكتيريا BL21 بعد تحريض تعبير البروتين (جمعفي الخطوة 2.1)، الخام MOG العلامة = بالفاعلات MOG العلامة البروتين قبل تنقية البروتين (التي تم جمعها في الخطوة 3.4)، نقي MOG العلامة = MOG العلامة البروتين بعد تنقية (التي تم جمعها في الخطوة 6.4). تم تقييم (B) تجليد البروتين العلامة MOG لCD19 نقاط البيع CD4 NEG الخلايا البائية ساذجة من الغدد الليمفاوية إما من النوع البري C57BL / 6 الفئران أو الفئران IGH MOG أن إبداء المناعي السلسلة الثقيلة محددة للبروتين MOG 7،17 باستخدام التدفق الخلوي . وقد تم تحديد العلامة MOG الخلايا البائية -specific من تلطيخ خلايا العقدة الليمفاوية مع العلامة MOG تليها الثانوية مكافحة له العلامة الأجسام المضادة والفلورسنت العالي الأجسام المضادة لمكافحة IgG1. يظهر تلطيخ الخلايا من C57BL / 6 أو IGH MOG الفئران جنبا إلى جنب مع علامة MOG مضان ناقص واحد (FMO) مراقبة وصمة عار للخلايا IGH MOG. يرجى جلعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): نظرة عامة على خطوات لتوليد MOG 1-125 من MOG العلامة البروتين. بعد جمع العلامة MOG شطافة كما هو موضح في الخطوة 3.5 من البروتوكول، ومدال العلامة MOG البروتين في TEV عازلة البروتيني الانقسام. وبمجرد أن غسيل الكلى كاملة، يضاف TEV البروتيني إلى حل العلامة MOG مما أدى إلى انشقاق العلامة MOG في البروتين MOG 1-125. ثم يتم تقليل حجم حل الانقسام ومدال إلى B العازلة قبل تنقية البروتين. يتم استخراج الشوائب من حل الانقسام من خلال أربع جولات متتالية من امتصاص على الراتنج النيكل اتهم وشطف من الشوائب مما أسفر في النهاية حل MOG النقي < فرعية> 1-125. يتم تحديد تركيز MOG 1-125 البروتين من خلال فحص برادفورد ويتم طي البروتين على مدى عدة أيام من خلال غسيل الكلى. مرة واحدة غسيل كاملة، يتركز MOG 1-125 البروتين إلى 2.24 ملغ / مل باستخدام PEG 3350 وPEG 8000. ويناقش هذا البروتوكول بالتفصيل في قسم 7. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: مثال على برادفورد منحنى الفحص القياسية لتحديد تركيز العلامة MOG تم التخطيط البروتين. القراءات BSA مستوى مأخوذة من الجدول رقم 1 للحصول على صيغة الانحدار الخطي لحساب علامة MOG تركيز على أساس الكثافة البصرية في 595 نانومتر.و = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6: TEV انشقاق من MOG العلامة البروتين وتنقية لاحقة من MOG 1-125 أظهرت هي عينات البروتين تعمل على SDS-PAGE تنقية هلام التظاهر من MOG 1-125 الصرفة العلامة MOG MOG = العلامة البروتين قبل TEV انشقاق (جمعها. في الخطوة 6.4)، والعلامة MOG ث / TEV = البروتين جزء التي تم جمعها بعد 72 ساعة من الحضانة العلامة MOG مع TEV البروتيني (التي تم جمعها في الخطوة 7.5)، شطف = البروتين جزء التي بقيت منضمة إلى الراتنج النيكل خلال MOG 1- 125 بروتوكول المياه (التي تم جمعها في الخطوة 7.9)، MOG النقي 1-125 = MOG1-125 البروتين بعد تنقية (التي تم جمعها في الخطوة 7.12). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

BSA (ملغ / مل) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1،079 0.998 0.948 0.853 0.769 0،699 0،583 0،493 0.373
1.071 1.014 0.95 0.854 0.777 0،681 0.579 0،484 0.375
1.069 1،017 0.944 0.848 0.781 0،592 0،494 0.374
MOG العلامة التخفيف 1 1/5 1/25
1.327 1.013 0،493
1.332 1.063 0.491
1.367 1.088 0،488

الجدول 1: القيم التمثيلية من مقايسة برادفورد لتحديد تركيز MOG العلامة بروتين BSA dilu.وتستخدم ستعقد في تركيزات المعروفة لتحديد المنحنى القياسي هو مبين في الشكل 5. وتستخدم التخفيفات من MOG آخر الوسم بروتين تنقية لتحديد تركيز البروتين العلامة MOG النهائي. الصفوف تحتوي على الكثافة الضوئية تقاس في 595nm، ويمثل كل صف مكررة واحدة من مجموع 3 مكررات في كل تركيز المشار إليها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، التي وصفناها بروتوكول لإنتاج MOG البروتين العلامة وكيفية توليد MOG النقي 1-125 من البروتين العلامة MOG. ويستند هذا البروتوكول على حد سواء على أساس طرق تنقية البروتين القياسية صاحب العلامة، وكذلك بروتوكول سبق وصفها لتوليد البروتين كبار السن على أساس MOG-15. على الرغم من عدم وصفها هنا، واستخدام الرئيسي للبروتين العلامة MOG هو للحث على EAE من خلال تحصين مع مستضد البروتين. بروتوكول يصف كيف هو فعل EAE في الفئران، والذي يتوافق مع MOG العلامة البروتين، ويمكن العثور عليها في المرجع 3. لقد أثبتنا سابقا أن التحصين مع العلامة MOG MOG أو 1-125 المستمدة من العلامة MOG يدفع ليس فقط مرض الجهاز العصبي المركزي الذاتية مع أكبر التهاب النخاع الشوكي وإزالة الميالين مقارنة مع معيار MOG 35-55 الببتيد، ولكن أيضا أن المسببة للأمراض الخلايا IGH MOG B ثار تعترف يتم تنشيط البروتين MOG لإنتاج استجابة مركزية جرثومي ردا على MOG العلامة أو MOG 1-125، ولكن ليس إلى موج 35-55 5. لذلك، وتحصين مع العلامة MOG لا تحفز بالفعل مضاد للMOG استجابة الخلايا البائية المناسبة.

يتم تنقيته MOG العلامة البروتين من خلال امتصاص على الراتنج النيكل اتهم (عن طريق صاحب العلامة) وشطف. ونظرا لكمية كبيرة من البروتين ولدت في الخطوات السابقة، يطلب جولات متعددة من امتصاص وشطف لجمع أكثر من البروتين. لقد وجدنا أن هناك حاجة لا يقل عن 4 جولات لعزل الغالبية من البروتين في حالة استخدام حجم مناسب من الراتنج لمدة 50 مل أنابيب. إذا رغبت في ذلك، يمكن تحجيمها بروتوكول لاستخدام أكثر أو أكبر أنابيب والمزيد من الراتنج النيكل لتقليل عدد جولات من الاستيعاب. بدلا من ذلك، عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) مع الأعمدة النيكل يمكن تنقية فعالة له الموسومة البروتينات 18 </ سوب> وبالفعل وجدنا أن HPLC يمكن تنقية بكفاءة العلامة MOG البروتين (الملاحظات غير منشورة). كما HPLC ليست في متناول العديد من المعامل المناعة القياسية، تم تصميم بروتوكول المدرجة هنا التي يتعين القيام بها باستخدام معدات مختبر المشتركة. بالإضافة إلى تنقية له العلامة، علامة MOG بروتين لا تحتوي على S العلامة متوافق مع بروتوكولات S العلامة تنقية إذا كان يفضل 14.

وقد وصفت البروتينات المؤتلف على أساس MOG (الإنسان غالبا أو الفئران) قبل 8. وتستند هذه النظم التعبير القديمة التي ومنذ ذلك الحين تم استبدال أنظمة يقودها المروجين النسخي أقوى قادرة على إنتاج كميات أكبر من البروتين في البكتيريا القولونية. يستخدم نظامنا MOG العلامة التعبير المروج T7 كفاءة في مكافحة ناقلات PET-32A (+)، والتي هي إلى حد كبير أكثر كفاءة من النظم المتاحة للإنتاج في بيت البروتين MOG 19. ومع ذلك، قتجدر الإشارة hould معها أن MOG البروتين العلامة الموصوفة هنا تقوم على MOG الماوس. وقد تبين التحصين مع البروتين MOG البشري للحث على EAE في الفئران التي لديها ميزات مختلفة بالمقارنة مع المرض الناجم عن استخدام الفئران MOG 8. وعلاوة على ذلك، قد تكون الفئران MOG أكثر مناعة من MOG الماوس في الفئران في بعض الحالات 20. لذلك، بالنسبة لبعض البطاقات MOG مقرها الماوس أغراض تجريبية قد لا تكون مثالية. نحن في عملية توليد العديد من إصدار مختلف من العلامة MOG البروتين من قد تناسب بعض الأغراض أفضل، وسوف بروتوكول تنقية الموصوفة هنا العمل لجميع هذه. في غضون ذلك، فمن الممكن أن البروتوكول تنقية الموصوفة هنا قد تعمل لأنظمة التعبير MOG أخرى، أو حتى البروتينات الأخرى، طالما أنها تشتمل على 6X صاحب العلامة لامتصاص إلى الراتنج النيكل. ومع ذلك، من دون العلامة thioredoxin، ذوبان البروتين MOG بتركيزات أعلى قد يكون مشكلة، وبالطبع فإنه لن يكون من الممكن لشركة جنرال الكتريك nerate النقي MOG 1-125 لأن هذا هو فريد من نوعه لنظام بطاقة MOG.

قياس تركيز البروتين العلامة MOG قبل refolding البروتين عن طريق غسيل الكلى أمر ضروري لنجاح هذا البروتوكول تنقية. إذا كان تركيز عال جدا، والبروتين قد تجميع وتسقط من الحل بدلا من للطي إلى بروتينات الفردية. ويمكن ملاحظة ذلك خلال بروتوكول غسيل الكلى كما راسب أبيض تشكيل أسفل الأنبوب غسيل الكلى. إذا كان هذا يحدث، حل MOG العلامة البروتين مرة أخرى مع 6 M غوانيدين وقياس تركيز البروتين. تمييع البروتين إلى 0.5 ملغ / مل ثم البدء في غسيل الكلى مرة أخرى كما لا ينبغي أن تشكل رواسب عند 0.5 ملغ / مل. لMOG 1-125، ومن المتوقع أن تشكل مثل بروتين غير قابل للذوبان عالية رواسب. لقد وجدنا أن هذا لن يؤثر على للطي من MOG 1-125 شريطة أن يكون البروتين تم تخفيفه بشكل كاف قبل غسيل الكلى.

الإقليم الشمالي "> للالبروتيني TEV ليلتصق بفاعلية العلامة MOG البروتين في الخالص MOG 1-125 من المهم استخدام كمية كافية من TEV البروتيني. والمعطل الإصدارات القديمة من البروتياز TEV من خلال الانقسام الذاتي 21 الإصدارات ولكن أكثر حداثة تعاني من يصدر الذوبان 22 وبالتالي فمن المهم أن نضيف ما يكفي من البروتيني TEV لتحقيق انشقاق كافية للعلامة MOG البروتين قبل تعطيل TEV البروتيني. ومنذ متوفرة تجاريا البروتيني TEV يمكن أن يكون مكلفا، ونحن نوصي إنتاج وتنقية الأنزيم البروتيني TEV كما هو موضح في اشارة 22. عندما تستخدم الماوس النقي MOG 1-125 البروتين للتجارب، من المهم أن نلاحظ أن بروتين غير قابل للذوبان للغاية ويمكن أن يعجل من حل، وبالتالي يجب أن تكون مختلطة على نطاق واسع قبل استخدامها.

وخلاصة القول، هنا وصفناها بروتوكول بسيط لإنتاج وتنقية كميات كبيرة من MOG العلامة البروتين. Furthermيوفر خام، إضافة موقع الانقسام البروتيني TEV لدينا بروتين العلامة MOG الفرصة لتوليد النقي MOG 1-125 إذا لزم الأمر. يتم الاعتراف MOG العلامة البروتين وملزمة الخلايا البائية الذاتية مكافحة المايلين وMOG العلامة -induced EAE يتضمن B-الخلية بوساطة أمراض 5. لذلك، MOG العلامة البروتين يتغلب على العقبات الرئيسية التي تحد من استخدام واسع النطاق للمستضد البروتين للحث على EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics