Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

МС представляет собой человека заболевание, характеризующееся хроническим воспалением и нейродегенеративные ЦНС, которые, как полагают, будут обусловлены аутоиммунного ответа, направленного в сторону миелина. Потеря миелина и аксонов с течением времени приводит к постепенному снижению когнитивной и двигательной функции 1. "Экспериментальная аутоиммунный энцефаломиелит" является общим термином для животных моделях аутоиммунных заболеваний, направленной на ЦНС миелина. Как человека MS, EAE , как правило , характеризуется иммунной клеточной инфильтрацией ЦНС и, в некоторых случаях, демиелинизация 2. Тем не менее, степень, в которой любая данная модель ЕАЕ напоминает человеческую MS частично зависит от вида или штамма, используемых и по сложности нижележащей анти-миелинового аутоиммунного ответа.

Анти-миелина аутоиммунные может быть экспериментально индуцированных несколькими способами, но наиболее распространенный метод, используемый сегодня для иммунизации мышей с коротким пептидом аминокислот, имитирующих иммунодоминантный CD4 35-55), который используется для индукции EAE в C57BL / 6 мышей 3. Тем не менее, для некоторых экспериментальных целей желательно или даже необходимо вакцинировать с более крупными белковых антигенов и в самом деле есть несколько преимуществ этого более короткого иммунизации пептида. Во-первых, из-за ограничения MHC, короткие пептиды, как правило, эффективны лишь в очень ограниченном диапазоне напряжений, в то время как более крупные белковые антигены, представляющие либо весь белок или конкретный домен может быть обработан как правило, для представления в нескольких штаммов инбредных мышей или даже у разных видов 4. Во-вторых, больший белковый антиген, способный индуцировать более сложный иммунный ответ, включающий более типов лимфоцитов в распознавании антигена, а не limitinг распознавание антигена к CD4 + Т - клеток. Например, В-клетки через их B клеточного рецептора (BCR) взаимодействуют непосредственно с целым, а не обработанного белка. Мы и другие показали , что В - клетки активируются MOG 35-55 иммунизации не признают MOG белок 5. Так как В - клетки были недавно продемонстрированы играть патогенную роль в человеческом МС 6, модели EAE , которые включают В - клеток в аутоиммунной патологии приобретают все большее значение.

Несмотря на преимущества использования более крупных белковых антигенов для индукции EAE, остаются несколько коммерчески доступных источников для таких белков. В самом деле, в то время как короткие пептиды , такие как MOG 35-55 , могут быть синтезированы очень быстро и при относительно низкой стоимости, коммерческие варианты белка MOG ограничены , и стоимость значительно больше , чтобы купить. Тем не менее, существует несколько векторов экспрессии , доступных для исследовательских групп для создания MOG внеклеточный домен (MOG 1-125) сами. Howeveг, все системы экспрессии , которые мы определили в литературе, основаны на старых технологиях , которые с тех пор были заменены на более эффективные системы экспрессии 7. Кроме того, большинство из них основаны на крысиной или человеческой MOG 8. Для некоторых исследований аутоиммунные у мышей, антиген на основании мыши MOG аутоантигенов является предпочтительным. И, наконец, все MOG на основе белков , которые мы определили, либо коммерческие или как векторы экспрессии, представляют собой слитые белки , содержащие дополнительные аминокислоты к основанию MOG 1-125. Они включают в себя тег для очистки и, как правило, другие последовательности, а также, многие из которых с функцией мы не смогли определить.

Для устранения этих ограничений, мы получили новый слитый белок на основе мыши MOG внеклеточного домена , слитого с меткой , содержащей тиоредоксин для борьбы с известной нерастворимость MOG белка 5. Последовательность тэгов также содержит последовательность 6xHis для очистки и протеазы TEV НКУсайт Avage, что позволяет полного удаления всех последовательностей тегов, если это необходимо. Это единственный метод , который мы отдаем себе отчет , чтобы генерировать чистый MOG 1-125 белка. Для облегчения производства больших количеств белка, последовательность МОГ 1-125 была оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в бактериях и тег слитый белок МОГ был вставлен в систему экспрессии , пет-32. Здесь мы опишем подробно протокол для получения и очистки MOG тегов белка, и чистый MOG 1-125, используя неспециализированной оборудование , доступное для большинства иммунологических лабораторий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Белок Индукционная

Примечание: В следующих шагах, BL21 Escherichia бактерий палочка трансформирована пет-32 вектор , содержащий последовательность для MOG тег слитого белка (см ссылку 5 и рисунок 1) выращивают до высокой плотности , а затем индуцируют экспрессию метки белка MOG , На рисунке 2 общей шкале времени - обратите внимание , что дни являются ориентировочными и альтернативные точки останова отмечаются в протоколе. Если начиная с очищенной пет-32 MOG тег векторной ДНК, то это будет необходимо химически преобразовать его в компетентные BL21 Е. палочки бактерий с использованием селекции ампициллин, как было хорошо описано 9. Успешное преобразование может быть подтверждена путем очистки ДНК из отобранных бактерий с использованием стандартного коммерческого набора, с последующим расщеплением ферментами рестрикции Age1 и Sac1 производить полосу в 424 п.о. на агарозном геле 10.

    тег раствора в глицерине и инкубировать ее в течение ночи при температуре 37 ° С, 200 оборотов в минуту.
  1. Поместите два 1 колбы L Эрленмейера, содержащих 500 мл стерильного LB бульона в 37 ° C инкубаторе в рамках подготовки к следующему дню.
  2. Добавить 500 мкл 100 мг / мл ампициллина в каждую колбу, содержащую 500 мл БЛ с шагом 1,2 (конечная концентрация 0,1 мг / мл ампициллина). Передача 1 мл ночной культуры, начиная с шага 1.1 к каждой из двух колб LB бульона. Инкубируют при 37 ° С и 200 оборотов в минуту в течение 5 часов или до оптической плотности 0,6.
  3. Принимать одну 1 мл аликвоты от одной из колб и передать его в отдельный 1,5 мл центрифужную пробирку. Гранул клеток при 16000 х г в течение 1 мин и удалить супернатант. Добавьте трубку как T 0 (предварительно индукции) , а затем положить бактериальных гранул в -20 ° C морозильнике для будущего додецилсульфат натрия сульфат электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) анализ (смотри раздел 8 и рисунок 3).
  4. Добавить 0,5 мл 1 М изопропиловый бета-D-1-тиогалактопиранозид, изопропиловый β-D-тиогалактозида (IPTG) в каждую культуральную колбу. Инкубируйте колбах при температуре 37 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 4 ч, а затем при комнатной температуре при 75 оборотах в минуту в течение ночи.

2. Заготовка MOG тег белка

Примечание: На этом этапе, бактерии будут произведены в больших количествах MOG тегов белка. Для сбора MOG тег, бактерии сначала лизируют в буфере Triton X-100 с последующей обработкой ультразвуком. МОГ тег затем высвобождается из телец включения и денатурированный с имидазолом и гуанидина, в результате чего в раствор неочищенного белка , содержащего метку белка MOG.

  1. Принимать одну 1 мл аликвоты от одного из ночных культур от стадии 1.5, и передать его в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Гранул клеток при 16000 х г в течение 1 мин и удалить супернатант. Добавьте в ваннуе T O / N (после индукции) , а затем поместить бактериальных гранул в -20 ° C морозильнике для будущего анализа страниц SDS (Рисунок 3).
  2. Распределите культуры равномерно среди 250 мл бутылки, совместимые с высокой скоростью центрифугирования и держать их на льду с этого момента. Гранул бактериальных клеток при 22000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  3. Удалите супернатант. Хранить Бактериальные осадки при -20 ° С или перейти к шагу 2.4.
  4. Готовят буфер для лизиса (0,1 мг / мл из куриных яиц, лизоцим, 0,1% Triton-X (об / об) в фосфатно-солевом буфере (PBS)) путем добавления 60 мкл тритона Х-100 и 120 мкл 50 мг / мл куриного яйца лизоцима Маточный раствор до 60 мл PBS.
  5. Ресуспендируют и объединить все бактериальные окатышей с шага 2.3 в общей сложности 30 мл буфера для лизиса. Передача этого тома круглым дном 50 мл трубки, способной высокоскоростного центрифугирования. Поместите эту трубку в водяной бане при 30 ° С в течение 30 мин. Во время инкубации, трясти трубкудважды ресуспендирования клеток.
  6. После инкубации передать трубку на лед и разрушать ультразвуком раствор при 20 кГц, амплитуда 70%, пульс на 3 сек, пульс от 3 сек, и пять импульсов за раунд. Разрушать ультразвуком решение в течение шести полных раундов, и дайте раствору остыть на льду в промежутках между раундами.
  7. Центрифуга решение при 24000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант и повторите шаги 2.5-2.7 раз. Хранить гранулы при температуре -20 ° С или перейти к шагу 2.8.
  8. Подготовка буфера А (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ имидазола, рН 7,9), добавляя 0.8766 г NaCl, 0.09456 г Трис-HCl, и 0.01021 г имидазола в химический стакан емкостью 100 мл. Добавить H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 28 мл , затем довести рН раствора до 7,9. Затем перенесите раствор до 100 мл мерный цилиндр и добавляют H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 30 мл.
  9. Ресуспендируют осадок из шага 2.7 в 30 мл буфера А и инкубировать этот раствор при температуре 4 ° С в течение 3 часов. В течение этого времениотвешивают 17,2 г гуанидин-HCl.
  10. Разрушать ультразвуком раствора на льду, используя те же параметры, что и в шаге 2.6. Затем добавляют 17,2 г гуанидин-HCl к раствору. Выдержите это на льду в течение 1 ч до солюбилизации белка MOG тегов.
  11. Центрифуга решение при 24000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатант и не хранить супернатант при температуре 4 ° С до очистки белка.

3. Белок Очистка

Примечание: В следующих шагах тег белка MOG будет очищен через 4 раундов поглощения на заряженной никелевого смолы (через Его тэгом) и элюирования.

  1. Сделайте следующие буферы:
    1. Подготовка буфера В (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ имидазола, 6 м гуанидин-HCl, рН 7,9). Добавить 5,844 г NaCl, 0.6304 г Трис-HCl, 0.0681 г имидазола и 114.64 г гуанидин-HCl в химический стакан емкостью 500 мл. Затем добавьте H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл и доведения рН до 7,9. Передача зольдо социологическое загрязнение 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 200 мл.
    2. Подготовка буфера для элюции (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 0,5 М имидазола, 6 М гуанидин-HCl, рН 7,9). Добавить 5,844 г NaCl, 0.6304 г Трис-HCl, 6.808 г имидазола и 114.64 г гуанидин-HCl в 500 мл химический стакан. Добавить H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл и довести рН до 7,9. Перелить раствор в 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 200 мл.
    3. Готовят Strip буфера (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 100 мМ ЭДТА, рН 7,9). Добавить 5,844 г NaCl, 0.6304 г Трис-HCl, 40 мл 500 мМ ЭДТА до 500 мл химический стакан. Добавить H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл и доведения рН до 7,9. Перелить раствор в 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 200 мл.
    4. Готовят Charge буфер (0,1 М сульфат никеля). Добавить 5,257 г сульфата никеля в химическом стакане емкостью 500 мл и добавляют H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл (осторожно, не обрабатывают никелемСульфат за пределами вытяжкой до сульфата никеля было растворяли в H 2 O). После того , как сульфат никеля растворится, перенесите раствор до 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 200 мл.
  2. Разделить 10 мл никелевой смолы между двумя коническими 50 мл центрифужные пробирки, способных выдерживать центробежные силы свыше 4500 мкг (5 мл в каждую пробирку).
  3. Зарядить и уравновешивают никелевого смолы:
    1. Промыть смолу добавлением 40 мл H 2 O в каждую пробирку , содержащую смолу. Прокладывать трубы горизонтально на качалку и пусть перемешивать в течение 5 мин при 4 ° С. После завершения, центрифужные пробирки при 4500 мкг в течение 8 минут при температуре 4 ° С.
    2. Удалите супернатант с помощью пипетки, чтобы не потревожить осадок. Добавьте 40 мл заряда буфера в каждую пробирку. Передача трубок на качалке, и пусть они перемешивать в течение 15 мин при 4 ° С. После завершения, центрифужные пробирки при 4500 мкг в течение 8 минут при температуре 4 ° С.
  4. Дополнительно: Возьмите 150 мкл солюбилизированного белка, собранной на этапе 2.11 и перенести его на 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Этикетка трубки в качестве предварительной инкубации и заморозить это при -20 ° С для последующего анализа страниц SDS (Рисунок 3, сырой MOG тег).
  5. Очищают MOG тег белка:
    1. Перенести весь объем солюбилизированного белка из стадии 2,11 (~ 40 мл, минус небольшой образец , удаленный на шаге 3.4) к первой трубке (рисунок 2, труба 1) , содержащий никель смолу с шага 3.3, перемешать и поместить в горизонтальном положении на качалку при 4 ° С в течение 1 часа.
    2. Центрифуга трубки на 4,500 х г в течение 8 мин при температуре 4 ° С. После завершения, передавать супернатант ко второмутрубка (рисунок 2, трубка 2) из никелевого смолы и инкубировать , как описано в предыдущем шаге. В то же время, по-прежнему с шагом от 3 до 6 ниже с трубкой 1.
    3. Ресуспендируют никель смолы в трубе 1 в 40 мл буфера для элюции и поместите трубку в горизонтальном положении на качалке при температуре 4 ° С в течение 5 мин. Затем, отцентрифугировать пробирку при 4500 х г в течение 8 мин при температуре 4 ° С.
    4. Передача супернатант , содержащий белок , элюированный МОГ тег в мл флакон 250 меченого 'очищенный МОГ тег белок "и сохранить эту бутылку при температуре 4 ° С. С каждым шагом элюирования, объединяют полученный супернатант в этой бутылке.
    5. Добавить 40 мл буфера полосы к никелевой смолы и разместить в горизонтальном положении на качалке в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    6. Центрифуга трубки на 4,500 х г в течение 8 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант, затем зарядите никель смолы, как указано в пункте 3.3.
    7. После завершения, двигаться вперед со второй трубой, как указано в пункте 3.5. В общей сложности 4 раундаs поглощения солюбилизированного белка из стадии 2,11 на заряженном никелевой смолы и элюирование будет восстановить большую часть белка, хотя, если желательно, дополнительный белок может быть восстановлен в дополнительных раундах поглощения и элюирования.
  6. После того, как четыре (или более) раундов поглощения и элюирования являются полными, хранить и объединял очищенный протеин, при 4 ° С в течение ночи. Никель смола может храниться в 40 мл 20% -ного раствора этанола при температуре 4 ° С до тех пор, пока снова не будет необходимости.

4. Измерение концентрации белка

Примечание: Прежде чем продолжить, необходимо определить количество очищенного белка MOG тега генерируемой в разделе 3. Это значение будет использовано для определения конечного объема до концентрации белка в конце протокола. Мы опишем стандартный Бредфорда здесь. Концентрация очищенного белка MOG тега определяется путем сравнения спектральной поглощательной серийно dilutEd МОГ тег белка со стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина (БСА) в известной концентрации.

  1. Сделать 10x ацетатного буфера путем добавления 23 мл ледяной уксусной кислоты до 8,2 г ацетата натрия в 3 л лабораторный стакан , а затем добавить 1,9 л H 2 O для растворения ацетата натрия. Перенесите этот раствор в 2 л мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 2 L. Затем сохранить его в 2 - литровую бутылку при комнатной температуре. Сделать 1 мл буфера ацетата 1x путем добавления 100 мкл 10х буфера ацетата в 900 мкл H 2 O.
  2. Настройка 96-луночный планшет для разведений путем добавления 30 мкл ацетатного буфера 1х в лунки G2-8 и 60 мкл до G9. Добавить 48 мкл буфера ацетата 1x до H2 и H3.
  3. Настройка начального серийного разведения стандарта БСА в строке G следующим образом: Добавить 216 мкл буфера ацетата 1x и 54 мкл коммерчески доступного 2 мг стандарта / мл БСА в хорошо G1 и тщательно перемешать. Добавить 210 мкл из скважины G1 в лунку G2, тщательно перемешать,а затем добавить 180 мкл скважины G2 хорошо G3. Добавьте 150 мкл скважины G3 до скважины G4, тщательно перемешать, и продолжить эту тенденцию добавления 30 мкл меньше для каждой последующей скважины до скважины G8. (Приведены в таблице 1 для списков эквивалентных коэффициентов разведения).
  4. Настройка трех образцов каждого разведения путем переноса 10 мкл скважины G1 в лунки А1, В1 и С1, а также 10 мкл скважины G2 в лунки A2, B2 и C2, и так далее. Используйте многоканальную пипетку.
  5. Чтобы настроить разведений MOG тега, добавьте 60 мкл очищенного белка MOG тега из шага 3.6 в лунку H1. Добавьте 12 мкл из скважины H1 хорошо H2, тщательно перемешать, а затем добавить 12 мкл скважины H2 хорошо H3, тщательно перемешать (это производит 1x разведение в H1, 1/5 разбавления в H2 и 1/25 разведение в H3) ,
  6. Установка трех образцов для МОГ тегов разведений путем переноса 10 мкл скважин Н1-Н3 по строкам D, E, и F, как описано в пункте 4.4.
  7. Смешайте 2 мл красителя для анализа белковКонцентрат реагента с 8 мл H 2 O. Добавить 200 мкл этой смеси во все лунки с предварительно загруженными в строках А, В, С, D, Е, F и, используя многоканальную пипетку, если таковые имеются. Поп все пузырьки в лунках с помощью иглы, прежде чем читать концентрации белка.
  8. В течение 10 мин после добавления реагента красителя, измерения 595 нм абсорбцию во всех лунках в строках A, B, C, D, E и F.
  9. Используйте Ряды A, B, и C, чтобы установить стандартную кривую, где позиции 1-9 соответствуют 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 и 0 мг / мл БСА. На основе этой кривой, вычислить концентрацию MOG тега белка с помощью разбавления MOG тега , который наилучшим образом соответствует стандартной кривой. Как правило, будет от 200 до 250 мг MOG тега белка из 1 л бактериальной культуры с использованием протокола , описанный здесь.
    Примечание: Для того, чтобы MOG 1-125 перейти отсюда к дополнительному разделу 7 перечисленных в конце протокола. В противном случае перейдите к разделу 5.

Примечание: диализ выполняется , чтобы постепенно удалить гуанидин из раствора , содержащего очищенный денатурированный MOG тег , чтобы белка в повторно сворачивают. Необходимо соблюдать осторожность во время этого этапа, как сама MOG очень нерастворим, и в то время как в этом улучшается за счет присутствия тиоредоксин тега, он по-прежнему склонен к выпадать из раствора. Таким образом, повторную укладку следует проводить постепенно и при концентрации относительно низкой МОГ тега.

  1. Перед началом диализа, разбавить очищенный MOG тег белок буфером В (буфер B может быть выполнен в виде перечисленных в пункте 3.1) , пока концентрация не составляет 0,5 мг / мл или меньше, в расчете на количество MOG тега , рассчитанного в разделе 4.
  2. Отрежьте около 30 см от змеиной диализной трубки и закрепить один конец с фиксирующим кровоостанавливающего путем складывания конец змеиной кожи в три раза и зажима сложенный конец с кровоостанавливающего. Заполните змеиную разведеннымMOG тег белка (от 60 до 90 мл MOG тега белка на пробирку) , затем удалить пузырьки воздуха из змеиной, заставляя их из открытого конца. И, наконец, уплотнение другой конец трубки с помощью второй блокирующей кровоостанавливающего.
  3. Повторите шаг 5.2 , чтобы заполнить дополнительные секции диализной трубки , пока все теги белка MOG не был переведен в змеиной диализной трубки. Убедитесь в отсутствии утечек.
  4. Сделать 1x ацетат с 4 М гуанидин путем взвешивания 382.12 г гуанидина-HCl и добавлением 100 мл 10х ацетатного буфера, сделанных на шаге 4.1 до 2 л лабораторный стакан. Добавить 0,5 л H 2 O в стакан и дайте гуанидин-HCl для растворения. После растворения, переноса раствора до 1 л мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 1 L. Повторите этот рецепт на каждые 2 snakeskins, которые необходимы.
  5. Выполните диализ следующим образом: заполнить большое ведро (минимум 10 л) с 1 л ацетатного буфера 1x с 4 М гуанидин со стадии 5.4. Поместите до тO 2 секции диализной трубки , содержащей MOG тег в ведро, оставляя место для магнитной мешалки , чтобы спина беспрепятственное в нижней части . Поместите ведро в C комнате 4 ° на магнитной мешалке и включите его к медленной скорости вращения (т.е. не является высокой, достаточно просто переместить жидкость):
    Примечание: Выполните следующие шаги, чтобы постепенно уменьшить количество гуанидина в буфере. раз Размешайте приведены в качестве минимумам, но может быть оставлена ​​на ночь. Диализ займет как минимум 3-х дней, но это может быть продлен, если это необходимо. Регулярно проверяйте, чтобы убедиться, что трубка не повреждена и что концы надежно закрыты.
    1. Пусть ведро сидеть и перемешивать в течение 4-5 ч.
    2. Добавить 1 л 1x ацетатного буфера (100 мл 10х ацетатного буфера и 900 мл H 2 O) для каждого сегмента.
    3. Повторите шаги 5.5.1 и 5.5.2 в общей сложности 3 раза в общей сложности на 4 л буфера в ведро.
    4. Выбросьте половину буфера в ведро и залейте 1 л буферного раствора ацетата 1x (100 мл 10x ацетатного буфера и 900 мл H 2 O, нет гуанидин) и установить трубки и мешалку.
    5. Повторите шаги 5.5.1 и 5.5.2 один раз (то есть до тех пор, пока в общей сложности 4 л буфера в ведро).
    6. И, наконец, заменить весь объем 4 л в ведро с 4 л свежего буфера 1x ацетата и перемешивают примерно в течение 4-5 ч. Для достижения наилучших результатов, сделать этот шаг в день концентрации белка.
    7. Осторожно удалите диализной трубки с ренатурирован MOG тег и выбросить ведро буфер.

6. Сосредоточение MOG тег белка

Примечание: На конечной стадии, отогнутый белок тег МОГ концентрируют до готового раствора для хранения. Как МОГ тег очень нерастворимым, она не должна превышать 5 мг / мл. Эта концентрация составляет приблизительно эквимолярное с 0,4 мг / мл MOG 35-55 пептида, который обычно используется для индукции EAE у мышей (смешанный 1: 1 с полным adjuv Фрейндамуравей (CFA)). В процессе концентрирования это не редкость для небольшого количества белка из раствора в виде белого осадка. Чрезмерное количество осадков является проблемой, однако.

  1. Рассчитывают конечного целевого объема для достижения концентрации МОГ тега 5 мг / мл, на основании значения , рассчитанного в разделе 4.
  2. Линия кастрюлю с алюминиевой фольгой и покрывают алюминиевой фольгой с полиэтиленгликолем (ПЭГ) 3350 и ПЭГ 8000 в соотношении 1: 1. ПЭГ 3350 включена в эту смесь , как это может помочь предотвратить агрегацию белка во время концентрирования и является эффективным cyropreservative 11.
  3. Поместите змеиной трубку (с MOG тегом белка внутри) на верхней части алюминиевой фольги и накрыть ПЭГ 8000. Пусть это постоять при комнатной температуре и проверить объем регулярно до тех пор , пока объем не равен или ниже расчетного конечного объема ( в расчете на этапе 6.1), фактический объем будет измеряться в следующем шаге. Если сковорода становитсяперенасыщен водой в процессе концентрации, установите свежий кастрюлю с алюминиевой фольгой и ПЭГ 3350 и ПЭГ 8000.
  4. Вымойте внешнюю сторону snakeskins с H 2 O и передача белка MOG тег в отдельную стеклянную бутылку с использованием серологических пипетки. Следите объема, как белок передается, чтобы обеспечить объем правильно.
    1. Если объем был уменьшен ниже предполагаемого конечного объема, добавьте 1x ацетатный буфер до тех пор, пока не будет достигнут желаемый объем. Если объем выше расчетного конечного объема, передавать метки белка MOG обратно в диализной трубки и продолжают концентрацию (шаги 6,2-6,3).
    2. Распределить тег белка MOG среди 1,5 мл пробирки (0,5 мл на пробирку), хранить трубы при температуре -80 ° С до тех пор , пока это необходимо. Для того, чтобы побудить EAE, смешать этот объем 1: 1 с CFA.
  5. Запуск PAGE гель SDS для подтверждения экспрессии белка тега MOG с использованием образцов , взятых с шагом 1.4, 2,1, 3,4, и очищенный белок МОГ с шага 6.4.

7. Создание MOG 1-125 из MOG тега Использование TEV протеазой (Необязательно)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг продолжается с конца шага 4. Если MOG 1-125 без каких - либо дополнительных последовательностей тегов требуется, последовательности тегов могут быть удалены с помощью TEV протеазы (рисунок 4). Насколько нам известно, не существует другая система экспрессии , способную генерировать чистую MOG 1-125. Тем не менее, следует отметить , что без тиоредоксин тега, МОГ 1-125 очень плохо растворим , и это может вызвать проблемы в процессе очистки и обработки, и по этой причине удалить тег , если это абсолютно необходимо для экспериментальных причинам. Необходимо выполнить несколько шагов для создания чистого MOG 1-125. MOG тег сначала диализуют в буфере TEV расщепления протеазы. После расщепления с TEV протеазы, объем уменьшается, чтобы помочь с очистки позже улEPS, затем подвергают диализу в буфере В, а затем His-метка, содержащая последовательность тег удаляется с использованием никелевой смолы. И, наконец, белок количественно и чистый МОГ 1-125 концентрируют до конечной концентрации.

  1. Сделать 1 л 10х буфера TEV расщепления (500 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА), добавляя 1.861 г ЭДТА, 44,4 г трис-HCl, и 26,5 г Трис до 2 л лабораторный стакан. Добавить H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 990 мл , затем довести рН до 8 , чтобы растворить EDTA. Переносят раствор в 1 л мерный цилиндр и довести объем до 1 л с помощью H 2 O.
  2. Развести MOG тег белка с шагом 3,6 до 0,5 мг / мл с использованием буфера В ( один и тот же буфер , описанный на шаге 3.1), на основе количества белка , рассчитанного в разделе 4. Перенесите 120 мл разбавленного белка MOG тег в змеиной диализной трубке , как описано с шагом 5.2 до 5.3. Объем может быть расширен , однако количество TEV протеазы требуется , чтобы расщепить все тега белка MOG будет substantial.
  3. Следуйте протоколу диализный указанный на шаге 5.5, за исключением замены буфера 10x ацетата с 10x TEV буфера расщепления, сделанные в шаге 7.1.
  4. Перенести MOG тег, в настоящее время в TEV расщепления буфере, к новой бутылке 250 мл стекла и следить за увеличенного объема от диализа. Добавить 1 мкл бета-меркапто-этанола на каждые 2,85 мл MOG тега белка добавляют к бутылке. Добавить по крайней мере , 1 мг TEV протеазы (маточный раствор ТРВ в дозе 5 мг / мл) на каждые 50 мг MOG тега белка (ТРВ протеазы могут быть добавлены до 1:10 ТРВ: соотношение белка MOG) и инкубировать при комнатной температуре, защищенном от света месте в течение по крайней мере 72 часов.
    Примечание: В конце инкубации протеазы TEV, белые преципитаты следует рассматривать в нижней части стеклянной бутылки.
  5. Перед переносом белка в диализной трубке, добавляют гуанидин-HCl к раствору до тех пор, пока белки растворяются, чтобы предотвратить белок выпадает в осадок от прилипания к стеклянной бутылке. Передача 150 мклэто решение для трубки микроцентрифужных 1,5 мл и маркировать трубку как "MOG с ТРВ". Хранить раствор при -20 ° С для последующего анализа в SDS-PAGE.
  6. Передача всей текучей среды со стадии 7.5 в диализной трубке, как указано в пунктах 5.2 до 5.3. Заполните большое ведро с 2 л H 2 O и поместите диализную трубку в ведро. Выдержите это при 4 ° С с легким перемешиванием в течение ночи. Этот шаг важен для разбавления из гуанидина, чтобы концентрация белка происходить быстро и, чтобы начать удаление ЭДТА из раствора, который будет мешать очистки белков.
  7. Концентрат белка в диализной трубке, как указано в пунктах 6.2 до 6.3 (за исключением того, только используют PEG 8000) так, чтобы конечный объем раствора составляет ~ 40 мл. Промыть диализной трубки с H 2 O и удалить любой остаточный ПЭГ 8000 все еще прикреплены к трубке. Это уменьшение объема позволяет соответствовать всем переваренной белка в 50 мл пробирку, содержащую никель повторноГрех, как описано в пункте 3.5.
  8. Диализировать Протеин переваривается в буфер B:
    1. Заполните большое ведро с 1 л буфера В (29.22 г NaCl, 3,152 г трис-HCl, 0.3405 г имидазола, 573.18 г гуанидина-HCl, рН 7,9).
    2. Поместите snakeskins содержащих переваренный белок с шага 7.7 ​​в ведре вместе с перемешивающим магнитом (как описано более подробно на шаге 5.5). Поместите ведро в 4 ° C холодной комнате на мешалке, установленной на медленный размешать и позволить snakeskins диализировать в течение 5 или более часов.
    3. Опорожнить ведро и залейте его с другим 1 л буфера В и пусть это сидеть в 4 ° C холодном помещении на мешалке, установленной на медленный размешать и позволить snakeskins диализировать в течение 5 или более часов.
  9. Выполните очистку MOG 1-125 белка , как описано в разделе 3, с той существенной разницей , что сколотую последовательности тегов будет связано никелевой смолы, оставляя MOG 1-125 в растворе. Опять же, 4 раундов очистки будетвыполняются на том же самом объеме, но в этом случае цель состоит в том, чтобы улучшить чистоту, вместо того, чтобы восстановить как можно больше белка, насколько это возможно. Смотри рисунок 4.
    1. Сделайте буферы очистки белков, перечисленных в пункте 3.1
    2. Зарядка обе трубки никелевой смолы, как описано на стадии 3.3.
    3. Очищают MOG 1-125 протоколом , детально описанной в шаге 3.5, с существенным исключением , что элюат из никелевой смолы , содержащей тег отбрасывается (держать 150 мкл элюата в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для последующего анализа в SDS-PAGE), в то время как раствор , содержащий MOG 1-125 сохраняется в качестве конечного продукта.
  10. Измерить концентрацию MOG 1-125 белка , как описано в разделе 4:
    1. Настройка стандартной кривой разведений БСА, как описано в пунктах 4.2 и 4.4.
    2. Настройте разведений MOG 1-125 , как описано в пунктах 4.5 и 4.6. В качестве альтернативы, он может быть полезным, чтобы создать больший диапазонразведений (1x, 1/2, 1/4, 1/8 и, к примеру). Отрегулируйте объемы 1x ацетатного буфера и MOG 1-125 соответственно.
    3. Выполните Бредфорда , как описано в пунктах 4.7 до 4.9 и вычислить количество MOG 1-125 генерируемой. Ожидаемый выход составляет примерно 4 мг или больше белка.
  11. Рефолдинга MOG 1-125 путем постепенного удаления гуанидина с помощью диализа, как описано в разделе 5.
  12. Концентрат MOG 1-125 белка , как описано в разделе 6. Конечная концентрация должна составлять 2,24 мг / мл, что эквимолярно 5 мг / мл MOG тега.

8. SDS-PAGE гель для подтверждения MOG тегов Производство и чистота

ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы , взятые из шагов 1.4, 2.1, 3.4, 6.4 и анализируют с помощью стандартного SDS-PAGE для подтверждения MOG производства тегов и чистоту. Этот шаг должен быть выполнен после окончательной очистки либо MOG тега или MOG 1-125.

    <li> Сделайте буфер загрузки 2x SDS-PAGE путем добавления 1,576 г Трис-HCl до 2 мл H 2 O и установить рН до 6,8. Добавить 0,4 г SDS в раствор трис-HCl , а затем добавить H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 7 мл.
  1. Добавьте 0,2 г бромфенола синего до 10 мл H 2 O затем прибавляют 1 мл этого раствора к созданной на шаге 8.1. Наконец, добавьте 2 мл глицерина, чтобы закончить буфер загрузки 2x SDS-PAGE. При хранении этого раствора, хранить при температуре 4 ° C и защитить его от света на срок до 3 месяцев.
  2. Растаяйте замороженные аликвоты бактерий из шагов 1.4 и 2.1, а также солюбилизированного MOG тега белка из шагов 3,4 и 6,4 при комнатной температуре.
  3. Удалить соли из растворов, собранных в пунктах 3.4 и 6.4 путем добавления 60 мкл каждого белка в обессоливания колонн. Очищают белки следующие инструкции производителя.
  4. Добавьте 20 мкл бета-меркапто-этанола к 1 мл раствора сделали в шаге 8.2. Добавьте 40 мкл этого к двум BACриал гранулы со стадии 8,3 и 60 мкл до обессоленной белков со стадии 8.4, и инкубируют их при 95 ° С в течение 10 мин.
  5. Сделать 1x SDS PAGE проточном буфере путем взвешивания 5 г Трис, 28,8 г глицина и 1 г SDS. Добавьте их в 1 л лабораторный стакан и добавьте 500 мл H 2 O , чтобы растворить все. После растворения передать раствор до 1 л мерный цилиндр и залейте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 1 л
  6. Установить полиакриламидный гель 12% в устройстве гель затем добавить 1x SDS-PAGE проточном буфере в устройстве гель таким образом, что подвижный буфер чуть выше верхней части лунки в геле. Промыть лунки геля с помощью пипетки 50 мкл рабочего буфера в лунки пять раз каждый.
  7. Нагрузка 10 мкл белка трапу в первую лунку и добавляют 10 мкл отваренных растворов с шага 8.5 отдельных лунках. Запустите гель при 115 V в течение 60 мин.
  8. Удалите гель из устройства и передачи его в небольшой контейнер. Заполните ContàIner 100 мл чистого Н 2 О и передать контейнер медленно вращающейся платформе в течение 8 мин. После 8 мин, сбросить воду и мыть гель два раза больше с H 2 O.
  9. Свалка H 2 O из контейнера и добавьте 100 мл реагента быстрого красителя в контейнер. Позвольте этому сидеть на медленно вращающейся платформе в течение ночи, накрыть алюминиевой фольгой.
  10. Свалка быстрого реагента морилки и добавляют примерно 100 мл H 2 O в контейнер. Позвольте этому сидеть на вращающейся платформе в течение 8 мин. Свалка H 2 O и повторить промывку H 2 O дважды.
  11. Изображение гель с использованием тепловизора для Кумасси синего пятна. Ищите полосы вокруг 31,86 кДа (MOG тег белка) и более слабой полосы в 63,72 кДа (MOG тег димеров).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После того , как очистка завершена, образцы , собранные в пунктах 1.4, 2.1, 3.4, и конечный продукт с этапа 6.4 должен быть запущен на геле белка (фиг.3А). MOG тег должен сначала появляются как 31,86 кДа в образце T O / N, но не T 0, и должна быть единственной группой , в конечном чистого продукта. Для того, чтобы проверить , является ли этот белок тег МОГ правильно сложена, тег белка MOG может быть использован для обозначения MOG-белка Специфическое В - клеток с помощью FACS. Лимфоцитами этикетирование мыши с 1: 1000 разбавлении MOG тег вместе со вторичным антителом , направленным против His-меткой и флуоресцентно-меченного третичной анти-антитела IgG1, MOG-специфические В - клетки могут быть идентифицированы (фигура 3В). В качестве альтернативы, МОГ тег может быть непосредственно конъюгированное с флуорофоров , чтобы уменьшить фоновое окрашивание ( в результате чего из В - клеток , связывающихся с вторичными и третичными антителами) , какописанный в ссылке 5 , чтобы идентифицировать MOG-специфические В - клетки. Это необходимо при попытке идентифицировать MOG-связывающий В - клеток у мышей дикого типа, так как эти клетки обычно очень редко 5. Мышей IgH MOG имеют тяжелую цепь стучусь , что, когда в паре с соответствующей легкой цепи каппа, придает специфичность в отношении MOG. По мере того как связывание MOG тега усиливается среди клеток IgH МОГ В, это подтверждает , что этот протокол генерирует правильно уложенного антиген. Важно отметить, что IgH MOG B - клетки способствуют аутоиммунной патологии в моделях MOG-направленного EAE 12, подтверждая , что MOG тег индуцирует как Т и В - клеток аутоиммунитета.

Перед тем как начать диализ , чтобы повторно сворачивают белок , как описано в разделе 5, необходимо измерять концентрацию белка с использованием анализа Брэдфорда, как это описано в разделе 4. Типичные результаты анализа Брэдфорда, приведены в таблице 1 , рисунке 5.

Генерирование чистого MOG 1-125 осуществляется путем добавления TEV протеазы к MOG теге белка в конечном счете , приводит к расщеплению тега белка MOG в MOG 1-125 и последовательность тегов , как показано на рисунке 6. Очистку Последующее никелем смолы удаляет MOG тег, последовательность тэгов, и примеси протеазы TEV в конечном счете , в результате чистого MOG 1-125 , как показано на рисунке 6.

Рисунок 1
Рисунок 1: MOG тег белка (Дублированный здесь с разрешения Данг и др. 5) . .. Линейная структура, и аминокислоты , и ДНК - последовательности слитого белка MOG тега. Последовательность ДНК для внеклеточного домена MOG мыши (МОГ1-125, нижняя последовательность в синем) была кодон-оптимизированными для экспрессии в клетках бактерий (черный цвет). Эта последовательность была синтезирована и встраивают в вектор , чтобы создать N-концевую слияние с меткой , содержащей тиоредоксин и S-Tag , чтобы противодействовать известной нерастворимости белка MOG 13,14, а также 6 - кратным Его СТП для очистки 15. Сайт расщепления протеазы TEV отделяет MOG 1-125 от последовательностей тегов. ТРВ-опосредованного расщепления между глутамин-164 и глицин-165 с использованием альтернативного консенсуса ТэВ сайт расщепления 16 приводит к удалению всех не MOG аминокислот. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Обзор шагов , необходимых для получения чистого белка MOG тег.генерировать MOG тег белок, бактерии , экспрессирующие белок МОГ тег выращивают до высокой плотности , то индуцируют экспрессию MOG метку , используя IPTG , как указано в разделе 1. После ночной культуры, бактерии лизируют и через серию грануляции шагов белковой фракции , содержащей тела включения, которая содержит тег MOG, извлекается , как указано в разделе 2. MOG тег затем очищают от белковой фракции сырой через четыре цикла поглощения на заряженном никелевого смолы и элюирования тега белка MOG , как указано в разделе 3. часть из Отстоявшийся элюат затем принимается для анализа Брэдфорда , чтобы определить выход MOG тега белка и остальную часть элюата подвергают диализу в ацетатном буфере в течение нескольких дней , как указано в разделах 4 и 5. и, наконец, белок концентрируется с использованием ПЭГ 3350 и ПЭГ 8000 до конечной концентрации 5 мг / мл на основании выхода MOG тега , определенной в BРэдфорд анализ, как указано в разделе 6. Весь процесс может занять минимум 10 дней, со стартового дня для каждого шага указаны в скобках. Тем не менее, альтернативные остановки и запуска точки перечислены в протоколе, и шаги могут быть распределены на большее количество времени , если это необходимо. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Очистка белка MOG тега и оценки его активности (А) Показаны образцы белка , которые были собраны из разных точек по всей процедуры очистки белка и выполняющиеся на геле SDS-PAGE. T 0 = BL21 бактерии до индукции белка (собранной на этапе 1.4), T O / N = BL21 бактерии после индукции экспрессии белка (собранныена шаге 2.1), Crude MOG тег = солюбилизировали MOG тег белка до очистки белка (собранной на этапе 3.4), Pure MOG тег = MOG тег белка после очистки (собранной на этапе 6.4). (Б) Связывание белка MOG тег в CD19 , CD4 поз NEG наивных В - клеток из лимфатических узлов либо из C57Bl 6 мышей дикого типа / или мышей IgH MOG, выражающих тяжелой цепи иммуноглобулина , специфичного для MOG белка 7,17 оценивали с помощью проточной цитометрии , МОГ тег -специфические В - клетки были идентифицированы путем окрашивания клеток лимфоузлов с MOG меткой с последующим вторичным анти-His тегом антитела и флуоресцентным третичной анти-антитела IgG1. Окрашивание клеток из / 6 или IgH MOG мышей C57BL показан вместе с MOG тегом флуоресценции минус один (FMO) управления красителем клеток IgH MOG. Пожалуйста , грлизать здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Обзор шагов для создания MOG 1-125 от MOG тега белка. После сбора тега элюата MOG , как описано в шаге 3.5 протокола, белок тег MOG диализуют в буфере TEV расщепления протеазы. После того , как диализ завершена, ТРВ протеазы добавляют к раствору МОГ тега приводит к расщеплению MOG тега в белок МОГ 1-125. Объем раствора расщепления затем восстанавливают и подвергают диализу в буфере В перед очисткой белка. Примеси из раствора расщепления вытягиваются через четыре последовательных циклов поглощения на заряженном никелевой смолы и элюирование примесей в конечном счете, приводит в растворе чистого MOG < к югу> 1-125. Концентрация MOG 1-125 белка определяют с помощью анализа Брэдфорда , и белок складывают в течение нескольких дней с помощью диализа. После того, как диализ завершена, MOG 1-125 белок концентрируется до 2,24 мг / мл с использованием ПЭГ 3350 и ПЭГ 8000. Этот протокол подробно обсуждается в разделе 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Пример стандартного анализа кривой Брэдфорда для определения концентрации MOG тега белка. стандартные БСА показаний , полученных из таблицы 1 наносили на график , чтобы получить линейную регрессионную формулу для вычисления концентрации тегов MOG , основанную на оптической плотности при длине волны 595 нм.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рис . 6: ТРВ расщепление MOG тега белка и последующей очистки MOG 1-125 Показаны образцы белка работать на очистке гель , демонстрирующих SDS-PAGE из MOG 1-125 Pure MOG тег = MOG белок тег до ТэВ расщепления (собранные. на этапе 6.4), MOG тег ж / TEV = белковая фракция , которая была собрана после 72 ч инкубации MOG тег с TEV протеазы (собранные на этапе 7.5), элюирующий = белковая фракция , которая оставалась связанным с никелем смолы во время MOG 1- 125 протокола очистки (собранные на этапе 7.9), Pure MOG 1-125 = MOG1-125 белка после очистки (собранной на этапе 7.12). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

БСА (мг / мл) 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
1,079 0.998 0,948 0,853 0,769 0.699 0.583 0.493 0,373
1,071 1,014 0,95 0,854 0,777 0,681 0.579 0.484 0.375
1.069 1,017 0,944 0,848 0.781 0,592 0.494 0,374
MOG тег разбавления 1 1/5 1/25
1,327 1,013 0.493
1,332 1.063 0,491
1,367 1,088 0,488

Таблица 1: Типичные значения из анализа Брэдфорда для определения концентрации MOG тега белка БСА dilu.ции в известных концентрациях используются для определения стандартной кривой , показанной на рисунке 5. Разведения очистки тегов белка пост MOG используются для определения конечной концентрации белка MOG тега. Строки содержат оптическая плотность, измеренная при 595 нм, а каждая строка представляет собой одну копировщика в общей сложности 3 повторах в каждой указанной концентрации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описали протокол для производства MOG белка тегов и как генерировать чистую MOG 1-125 из белка MOG тега. Этот протокол основан как на стандартных методах His-меткой на основе очистки белков, а также ранее описанного протокола для генерации старше MOG на основе белка 15. Хотя это и не описано здесь, первичное использование белка MOG помеченной индуцировать EAE путем иммунизации антигеном белка. Протокол описания того, как ЕАЕ индуцируют у мышей, которые совместимы с тегом белка MOG, можно найти в ссылке 3. Ранее мы показали , что иммунизация с MOG тегом или MOG 1-125 , полученного из MOG тега не только вызывает ЦНС аутоиммунное заболевание с большим воспаления спинного мозга и демиелинизации по сравнению со стандартным MOG 35-55 пептида, но и патогенные клетки IgH MOG B ТНАт распознавать МОГ белок активируются для получения зародышевых центров реакции в ответ на MOG тег или МОГ 1-125, но не к MOG 35-55 5. Таким образом, иммунизация с MOG тегом действительно вызывают соответствующую анти-MOG ответ В - клеток.

MOG тег белок очищают путем поглощения на заряженном никелевого смолы (через Его тэгом) и элюирования. Из-за большого количества белка приводило к созданию на предыдущих этапах, несколько раундов поглощения и элюирования требуется, чтобы собрать большую часть белка. Мы обнаружили, что, по крайней мере 4 раунда требуется изолировать большинство белка при использовании соответствующего объема смолы в течение 50 мл пробирки. При желании, этот протокол может быть расширен, чтобы использовать больше или большие трубки и более никеля смолы, чтобы уменьшить количество циклов поглощения. В качестве альтернативы, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с никелевыми колонн может эффективно очистить его-меченных белков 18 </ SUP> и мы действительно обнаружили , что ВЭЖХ может эффективно очистить MOG тег белка (неопубликованные наблюдения). Поскольку ВЭЖХ не доступен для многих стандартных лабораторных иммунологических, протокол, перечисленные здесь разработан, чтобы быть выполнена с использованием общего лабораторного оборудования. В дополнение к очистке His-метку, метка белка MOG действительно содержит S-тег , который совместим с протоколами очистки S-тег , если предпочтительнее 14.

Рекомбинантные белки , основанные на MOG (главным образом человека или крысы), были описаны ранее 8. Они были основаны на старых системах экспрессии, которые с тех пор были заменены систем , управляемых сильными транскрипционных промоторов , способных производить большие количества белка в Escherichia бактерий палочки. Наша система экспрессии тег MOG использует эффективный промотор Т7 в пет-32а (+) вектора, который является значительно более эффективным , чем систем , доступных для собственного производства из MOG белка 19. Тем не менее, Should отметить , что белок тег МОГ описанный здесь, основан на MOG мыши. Иммунизация с белком MOG человека было показано , чтобы вызвать EAE у мышей , которые имеют другие функции по сравнению с болезнью , индуцированной с использованием мышиных MOG 8. Кроме того, крысы МОГ может быть более иммуногенным , чем MOG мыши у мышей в некоторых случаях 20. Поэтому для некоторых экспериментальных целей мыши на основе MOG тега не может быть идеальным. Мы находимся в процессе создания нескольких различных версий тега белка MOG , чем может удовлетворить некоторые цели лучше, и протокол очистки , описанный здесь , будет работать для всех из них. В то же время, вполне возможно, что протокол очистки, описанный здесь, может работать для других систем экспрессии МОГ, или даже другие белки, до тех пор, как они включают 6-кратным Его Тэг для поглощения в никелевой смолы. Тем не менее, без тиоредоксин тега, растворимость белка MOG при более высоких концентрациях может быть проблемой, и, конечно, это не будет возможно ге nerate чисто MOG 1-125 , так как это является уникальным для системы MOG тегов.

Измерение концентрации белка MOG тег перед белка рефолдинга с помощью диализа имеет важное значение для успеха этого протокола очистки. Если концентрация слишком высока, белок может агрегировать и выпадать из раствора вместо складывания на отдельные белки. Это можно увидеть во время протокола диализной в виде белого осадка, образующего на дне диализной трубки. Если это происходит, растворите тег белка MOG снова с 6 М гуанидин и измеряют концентрацию белка. Развести белка до 0,5 мг / мл, затем начинают диализ снова не преципитаты не должен образовывать при дозе 0,5 мг / мл. Для MOG 1-125, преципитаты можно ожидать , чтобы сформировать , как белок очень плохо растворим. Мы обнаружили , что это не повлияет на укладку MOG 1-125 при условии , что этот белок был адекватно ослаблены до диализа.

нт "> Для протеазы TEV эффективно расщеплять тег белка MOG в чистую MOG 1-125 важно использовать достаточное количество TEV протеазы. Более старые версии ТэВ протеаз инактивируется через саморасщепления 21 , однако , более современные версии страдают от нерастворимость выдает 22 , таким образом , важно , чтобы добавить достаточно TEV протеазу для достижения достаточной отщепление тега белка MOG перед инактивацией ТРВ протеазы. поскольку коммерчески доступные ТРВ протеазы может быть дорогостоящим, мы рекомендуем производить и очищающий ТРВ протеазы , как описано в ссылке 22. при использовании чистая мышь МОГ 1-125 белка для экспериментов, важно отметить , что белок очень плохо растворим и может выпадать в осадок из раствора, и , следовательно , должны быть смешаны тщательно перед использованием.

Таким образом, здесь мы описали простой протокол для получения и очистки больших количеств MOG тегов белка. Furthermруда, добавление протеазы сайт расщепления TEV к нашему МОГ тега белка дает возможность получать чистый МОГ 1-125 , если это необходимо. MOG тег белок распознается и связывается анти-миелина аутоиммунных В - клеток и MOG тег индуцированный EAE включает B клеточный патологии 5. Таким образом, MOG тег белок преодолевает основные препятствия , ограничивающие использование широкого распространения белкового антигена для индукции EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics